các đặc điểm sinh trưởng của Navicula Incerta được đánh giá dựa theo khả năng thích nghi với nhiệt độ, độ mặn, ánh sáng,...Ngoài ra các thành phần và hoạt tính chống oxy hóa của tảo cũng được xác định.
Trang 1MỤC LỤC
TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ THÀNH PHẦN PROTEIN CỦA VI TẢO NAVICULA INCERTA CÙNG VỚI KHẢO SÁT VỀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HOÁ TỪ CÁC SẢN PHẨM THUỶ PHÂN BẰNG ENZYME.
Tóm tắt
Vi tảo là nguồn sản xuất chủ yếu các chất hữu cơ trong môi trường nước thông
qua các hoạt động quang hợp của nó Khuê tảo Navicula incerta là thành phần chính
của thực vật phù du và cũng tương đối dễ trồng, sử dụng làm nguồn thức ăn tươi sống trong nuôi trồng thủy sản Các đặc điểm sinh trưởng của N incerta được đánh giá dựa theo khả năng thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ mặn, và ánh sáng Ngoài ra, các thành phần và hoạt tính chống oxy hóa của N.incerta cũng được xác định Mật độ
tế bào đạt tối đa 87 × 105 tế bào/ml trong điều kiện ở 20oC, cường độ chiếu sáng 250 µmol/m2.s, độ mặn 33 ‰, pH=8.3, 12 chu kỳ sáng tối, và môi trường F/2 trong 2 tuần nuôi cấy Các sản phẩm thủy phân từ enzyme có tác dụng chống oxy hóa hiệu quả với các gốc tự do khác nhau: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (pepsin IC50 = 196,0 µg/mL), hydroxyl (α-chymotrypsin IC50 = 102,0 µg/mL) và superoxide (Neutrase IC50
= 169,0 µg/mL) Những kết quả này cho thấy rằng các sản phẩm thủy phân từ enzyme của N incerta được xem như chất chống oxy hóa và có thể được sử dụng như một thành phần thực phẩm chức năng
Trang 21 Giới thiệu
Vi tảo biển chủ yếu được sản xuất và bán như thực phẩm bổ dưỡng, do có hàm lượng cao protein, lipid, vitamin và các chất bổ sung dinh dưỡng khác Hơn nữa, vi tảo còn được sử dụng trong sản xuất dầu diesel sinh học và khí hydro sinh học Đặc biệt được chú ý là khả năng loại bỏ khí CO2 từ khí nhiên liệu Gần đây đã có nhiều bài báo cáo nói về vi tảo là nguồn nguyên liệu mới giàu hoạt tính sinh học Một số loài tảo như Botryococcus braunii, Chlorella sp., Dunaliella primolectal, Nannochloris sp., Neochloris oleoabundans, và Parietochloris có hàm lượng protein trong tế bào cao Do
đó, vi tảo được cho là rất hữu ích như là vật liệu chức năng Trong số vi tảo, tảo cát là thành phần chính của nhiều chuỗi thức ăn và nó có thể biến động theo mùa, sự biến động và tốc độ tăng trưởng nhanh của nó sẽ là một phần quan trọng trong việc nghiên cứu khoa học biển Tảo cát nhận dạng giữa các vi sinh vật ưa nhiệt khác và tác động chính của sự phát triển tảo cát là làm giàu chiết xuất bùn và tạo ra sulfoglycolipid có tác dụng chống viêm Nhiều nỗ lực để tìm kiếm các hợp chất mới có tiềm năng điều trị bệnh và vi tảo được báo cáo có thành phần kháng khuẩn, kháng nấm, và đặc tính chống ung thư Khuê tảo Navicula incerta là thành phần chính của thực vật phù du và cũng tương đối dễ trồng Nó được sử dụng làm thức ăn trực tiếp và là nguồn thức ăn phổ biến trong nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, các thành phần sinh hóa của vi tảo có thể thay đổi cùng với tốc độ sinh trưởng của nó, điều kiện môi trường (bao gồm: nhiệt
độ, tình trạng dinh dưỡng, nồng độ muối, pH, chu kỳ sáng tối và cường độ ánh sáng) cũng như với các giai đoạn phát triển của nó Trong thực tế, một số loài đang sống trong môi trường sống phức tạp với điều kiện khắc nghiệt (Ví dụ như những thay đổi của nồng độ muối, nhiệt độ, và các chất dinh dưỡng), do đó, nó đã được thích nghi với các điều kiện môi trường để tồn tại, sản xuất một loạt các chất chuyển hóa (hoạt tính sinh học), mà không thể được tìm thấy trong các sinh vật khác Nhiệt độ và cường độ ánh sáng là một yếu tố quan trọng kiểm soát sự phát triển của tảo trong môi trường tự nhiên Theo đó, đặc điểm sinh trưởng rất quan trọng trong việc nuôi trồng N.incerta để
sử dụng cho mục đích nuôi trồng thủy sản Tốc độ tăng trưởng, xét về số lượng tế bào hoặc sinh khối; và thành phần sinh hóa, phải được tối ưu hóa về mặt chất dinh dưỡng cần thiết
Trang 3Các gốc tự do và các chất hoạt động chứa oxy (ROS) là các dạng oxy đã được hoạt hoá, quá trình oxy hóa và thường được tạo ra bởi quá trình oxy hóa của các phản ứng sinh học hoặc các yếu tố ngoại sinh Chất chống oxy hóa trong các hệ thống sinh học có nhiều chức năng, bao gồm cả việc bảo vệ chống lại quá trình oxy hóa và tham gia vào các đường dẫn tín hiệu chủ yếu của tế bào Hoạt động chính của chất chống oxy hóa trong tế bào là để ngăn chặn tác hại gây ra bởi các hoạt động của ROS Chất chống oxy hóa tự nhiên đã được tách ra từ nhiều loài thực vật khác nhau Tuy nhiên, vi tảo lại ít được chú ý như là một nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên
Sản phẩm thủy phân của protein xúc tác bởi enzyme đã được báo cáo như là nguồn chất đạm phù hợp cho con người vì nó dễ dàng tiêu hóa, trong đó nó còn hiệu quả hơn cả các protein hoàn chỉnh và các axit amin tự do Do đó, sản phẩm thủy phân của protein đã được sử dụng rộng rãi để cải thiện tính chất dinh dưỡng và chức năng Các nguồn protein phổ biến nhất được sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng là casein và whey protein và các protein từ đậu nành Sinh khối của vi tảo màu xanh lá sẽ đại diện cho một nguồn tài nguyên sinh học để phát triển các sản phẩm thủy phân protein Thế giới hiện nay đang quan tâm đến việc tìm kiếm chất chống oxy hóa mới
và an toàn từ các nguồn tự nhiên như nguyên liệu thực vật để ngăn chặn các hư hỏng
do oxy hóa trong thực phẩm và giảm thiểu thiệt hại do oxy hóa gây ra trong tế bào sống Gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào đặc tính sinh lý và sự hiện diện của các chất có giá trị cao như các hợp chất kháng virus hoặc chất chống oxy hóa có trong tảo Việc hiểu biết về chất lượng protein và tính chất chức năng trong sản phẩm thủy phân từ vi tảo sẽ hữu ích trong việc tìm hiểu để sử dụng chúng như là một chất phụ gia dùng cho thực phẩm và các mặt hàng ăn uống Tuy nhiên, một loạt các chức năng sinh học của vi tảo, hiệu quả ứng dụng của các vi tảo vẫn còn hạn chế vì canh tác kém hiệu quả và chi phí sản xuất cao
Theo đó, nghiên cứu này thảo luận về việc trồng N incerta trong một hệ thống canh tác, với sự nhấn mạnh vào việc sử dụng các kỹ thuật nuôi Và các hoạt tính chống oxy hóa của các sản phẩm thuỷ phân trong N.incerta bởi enzyme (Alcalase, neutrase, pepsin, papain, trypsin, pronase-E, và α-chymotrypsin)
Trang 42 Vật liệu và phương pháp
2.1 Vật liệu:
Khuê tảo, Navicala incerta (loài KMMCC B-001) được sử dụng trong nghiên cứu này đã được cung cấp bởi Trung tâm Văn hóa Hàn Quốc về vi tảo biển Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường tiêu chuẩn F/2 (của Guillard) Enzyme cellulase làm mỏng đi vách tế bào Tất cả các vật liệu khác cần thiết cho nuôi cấy được lấy từ Gibco (Grand Island, NY, USA) và tất cả các thuốc thử khác được sử dụng là loại tốt nhất có sẵn trên thị trường Alcalase Và neutrase được mua từ Công ty Novo (bagsvaerd,Copenhagen, Đan Mạch) Cellulose, pronase-E, α-chymotrypsin, papain, pepsin, trypsin, acid linoleic, ammonium thiocyanate, và hóa chất thử nghiệm gốc trong đó có 1,1-diphenyl-2-pycryl-hydrazyl (DPPH), 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO), FeSO4, H2O2, và riboflabin được mua ở Sigma-Aldrich (St Louis,
MO, Mĩ)
Đặc điểm sinh trưởng với các thí nghiệm nuôi cấy trong phòng thí nghiệm
Xác định điều kiện sinh trưởng tối ưu: Các khảo sát về điều kiện tối ưu cho sự phát triển của N.incerta được thực hiện trong bình tam giác dung tích 250ml với 100ml môi trường nuôi cấy Đối với nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, nuôi cấy N.incerta được thực hiện trong môi trường F/2 (Bảng 1)
Bảng : Thành phần môi trường tiêu chuẩn F/2( Guillard’s)
Dung dịch A: Nitrate và dung dịch phosphat (1 L)
Na2MoO4.2H2O 6.0
Na2EDTA.2H2O 10.0
Dung dịch B: dung dịch Silicat (1L)
Na2SiO3.9H2O 33.0
Dung dịch C: dung dịch có chứa nguyên tố vi lượng (1L)
Trang 5CuSO4.5H2O 1.96
Ma2MoO4.2H2O 1.26
Dung dịch D: dung dịch có chứa vitamin (1L)
(1) Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho N incerta, chỉ cần thêm 2 ml dung dịch A và
B và 1 ml dung dịch C và D trong 1 L nước biển sạch.
Các thí nghiệm thiết lập mối quan hệ giữa sự sinh trưởng và ánh sáng, sự phụ thuộc về nhiệt độ, độ mặn, cường độ ánh sáng, và pH đến sự sinh trưởng N.incerta được xác định bằng cách quan sát dưới kính hiển vi phản pha Zeiss Axioplan (Carl Zeiss,Oberkochen, Đức) tại độ phóng đại x 400
2.2 Phương pháp xác định
2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn tới sự sinh trưởng:
Thí nghiệm nuôi cấy được thực hiện tại 4 nhiệt độ (15, 20, 25 và 300C) kết hợp với 4 độ mặn (23, 27, 33, và 40 ‰) sử dụng phòng tăng trưởng Gradient nhiệt độ Cả hai thí nghiệm được nuôi cấy dưới ánh đèn huỳnh quang (250 μmol/m2.s) trong 12:12
Trang 6chu kì sáng:tối, pH 8,3 ± 0,5 trong 2 tuần Độ mặn <34 được tiến hành bằng cách pha loãng nước biển với nước đã khử ion (Milli-Q; Millipore, Billerica, MA, USA), và độ mặn > 34 đã được chuẩn bị bằng cách làm bay hơi nước biển ở nhiệt độ 500C trong lò sấy.1 mL mẫu được lấy từ mỗi bình nuôi cấy mỗi ngày và cố định bằng dung dịch Lugol
2.2.2 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và độ pH tới sự sinh trưởng:
Thực hiện thí nghiệm với các cường độ ánh sáng (50, 100, 150, 200, và 250 μmol photon/m2.s) và các mức pH (7.5, 8.3, và 9.2) Những ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và pH tới sự sinh trưởng được xác định tại điều kiện tối ưu cho tốc độ sinh trưởng là 200C, 33 ‰, 12: 12 chu kỳ sáng tối pH được thay đổi bằng cách thêm HCl hoặc NaOH nồng độ 0.2M Các tế bào được thêm vào mỗi bình và được đo độ pH 1
mL mẫu được lấy từ mỗi bình nuôi cấy mỗi ngày và cố định bằng dung dịch Lugol
Đánh giá sự sinh trưởng: Tất cả các thí nghiệm được thực hiện trong 3 nhóm và kết
thúc sau thời gian tăng trưởng là 2 tuần Các mẫu được thực hiện 3 lần, cứ mỗi 24h các
tế bào được đếm trong buồng đếm (buồng Sedgewick Rafter) Các tế bào được quan sát bởi một kính hiển vi Leica CTR 6000 (Wetzlar, Đức) Tất cả các nuôi cấy thực nghiệm đã được thu vào cuối pha logarit của quá trình sinh trưởng tại những thời điểm giống nhau trong chu kỳ sáng tối đã được xác định bởi các thí nghiệm sơ bộ, để tránh tổn hao chất dinh dưỡng mẫu sau khi thu được sấy thăng hoa, khối lượng chất khô được ghi nhận lại, các tế bào tảo được lưu trữ ở -700C trước khi phân tích hóa học Tốc
độ tăng trưởng cụ thể (μ) được định nghĩa là sự gia tăng mật độ tế bào/đơn vị thời gian, công thức như sau:
μ(1/ngày)= (ln (X1/X0)/(t1-t0)) Tại đó: X0 và X1lần lượt là mật độ tế bào tại thời điểm ban đầu (t0) và kết thúc (t1) Đối với các đường cong tăng trưởng của từng mẫu, ta đếm những lần lặp lại và sử dụng các giá trị trung bình
2.2.3 Nuôi cấy sinh khối và sấy thăng hoa:
Sự nuôi cấy sinh khối của sinh vật tảo sống dưới đáy biển tảo N incerta đã được thực hiện trong 10 tuần trong chai polycarbonate 5-L và trong thùng polycarbonate
Trang 720-L (10 chu kỳ) với môi trường nước biển nhân tạo đã được thanh trùng và môi trường chất dinh dưỡng F/2 (Na2SiO3) và dung dịch có chứa nguyên tố vi lượng
Hình : Sơ đồ chảy của hệ thống môi trường nuôi cấy liên tục.
Điều kiện nuôi cấy sinh khối được duy trì trong điều kiện sinh trưởng tối ưu đã được xác định từ thí nghiệm trên (điều kiện nuôi ở 200C, độ mặn 33‰, pH 8,3 ± 0,5; 12:12 chu kỳ sáng tối và cường độ chiếu sáng 250 μmol photon/m2.s) Nước cất đã được thêm vào trong chai và thùng nuôi cấy thường xuyên để duy trì độ mặn và sục khí liên tục trong suốt quá trình ủ Sinh khối N.incerta được thu thập bằng cách xử lý trên bọ lọc GF/A Whatman, sử dụng một máy bơm nhu động Millipore Sinh khối được lưu trữ trong tủ đông ở -700C trong 24 giờ Các mẫu sau đó được sấy thăng hoa ở -500C tại 5 phút Torr Các mẫu đã sấy thăng hoa được bảo quản ở -200C cho đến khi thực hiện các phân tích hóa học Thành phần N.incerta được xác định như tổng hàm lượng protein, lipid,carbohydrate, độ ẩm, tro và hàm lượng chất khô
2.2.4 Phân tích thành phần của N.Incerta
Sau khi sấy thăng hoa N.Incerta được phân tích để xác định các thành phần Lipid thô, tro, carbohydrate, hàm lượng protein trong N.incerta theo phương pháp AOAC
2.2.5 Phân tích amino acid của N.Incerta
Lấy 50mg N.incerta đã sấy thăng hoa đi thủy phân trong 24 giờ bằng dung dịch
HCl 6N chứa 0,1% axit thioglycolic ở 1100C trong điều kiện chân không Dẫn xuất acid amin với phenylisothiocyanate đã được xác định và định lượng bằng máy phân tích tự động acid amin (BIOCHROM 20; Pharmacia Biotech, Cambridge, Vương quốc Anh)
Trang 82.2.6 Sản xuất sản phẩm thủy phân từ enzyme
N incerta sau khi sấy thăng hoa được nghiền thành bột mịn, lấy 100g trộn với 5 lít nước cất Cellulase là enzyme phá hủy thành tế bào, được thêm vào với hàm lượng 2% khối lượng bột Nó bị thủy phân ở 500C trong 2 giờ Để trích xuất peptide chống oxy hóa từ N incerta đã sấy thăng hoa, sự thủy phân được thực hiện bởi các enzym khác nhau (Alcalase, α-chymotrypsin, neutrase, papain, pepsin, pronase-E, và trypsin) với điều kiện tối ưu của chúng pH tối ưu của mỗi hỗn hợp phản ứng được điều chỉnh với HCl/NaOH 1M Tỷ lệ enzyme cho vào là 1/100 Sau đó, độ pH của sản phẩm thủy phân đã được điều chỉnh pH=7 với HCl/NaOH 1M Hỗn hợp được ủ trong 8 giờ ở mỗi nhiệt độ tối ưu với sự khuấy trộn và sau đó làm nóng trong bể nước sôi khoảng 10 phút
để làm bất hoạt các enzym Sản phẩm thủy phân được làm khô lạnh và lưu trữ dưới -800C cho đến khi sử dụng
2.3 Phân tích khả năng chống oxy hóa bằng máy quang phổ cộng hưởng spin electron (ESR)
2.3.1 Hiệu quả loại bỏ các gốc tự do DPPH
Hoạt tính loại bỏ các gốc tự do DPPH được xác định bằng phương pháp của Nanjo và cộng sự 30 μL dung dịch thủy phân được thêm vào 30 μl DPPH (60 μM) trong dung dịch ethanol Sau khi khuấy trộn mạnh trong 10 giây, các dung dịch sau đó
đã được chuyển vào một ống mao mạch thạch anh 100 μL, và hoạt tính loại bỏ gốc DPPH của pepide được đo bằng máy quang phổ JESFA ESR (JEOL Ltd., Tokyo, Nhật
Bản) Các sản phẩm spin được đo trên máy quang phổ ESR chính xác sau 2 phút Điều
kiện thí nghiệm như sau: từ trường 336,5 ± 5 mT; điện 5 mW; tần số điều chế 9.41 GHz; biên độ 1×1000; thời gian xử lí 30 giây Khả năng loại bỏ các gốc tự do DPPH
đã được tính toán theo công thức sau:
Hoạt tính loại bỏ các gốc tự do: ( H0
H -1
) x 100 Trong đó H và H0 lần lượt là chiều cao đỉnh của tín hiệu gốc tự do có và không có mẫu
Trang 92.3.2 Hoạt tính loại bỏ các gốc Hydroxyl
Các gốc hydroxyl được tạo ra bằng phản ứng Fenton Haber-Weiss xúc tác là sắt
và các gốc hydroxyl tạo thành nhanh chóng phản ứng với bẫy spin nitrone DMPO Kết quả tạo thành DMPO-OH và được phát hiện bằng máy quang phổ ESR Dung dịch thủy phân (20 μL) được trộn với DMPO (0,3 M, 20 μl), FeSO4 (10 mM, 20 μL), và
H2O2 (10 mM, 20 μL) vào dung dịch đệm phosphat (pH 7.4), và sau đó được chuyển vào một ống mao mạch thạch anh 100 μL Sau 2.5 phút, máy quang phổ ESR sẽ phát
ra phổ và được ghi lại Điều kiện thí nghiệm như sau: từ trường 336,5 ± 5 mT; công suất 1 mW;tần số điều chế 9.41 GHz; biên độ 1 × 200; thời gian quét 4 phút Khả năng loại bỏ các gốc tự do Hydroxyl được tính toán theo công thức sau:
Hoạt tính loại bỏ các gốc tự do(%) = ( H0
H -1
) x 100 Trong đó H và H0 lần lượt là chiều cao đỉnh của tín hiệu gốc tự có và không có mẫu
2.3.3 Khả năng loại bỏ các gốc Superoxide
Các gốc anion superoxide được tạo ra bằng cách chiếu tia cực tím (UV) vào hỗn
hợp riboflavin/ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Hỗn hợp phản ứng có chứa 0,3 mM riboflavin, 1.6mM EDTA, 800mM DMPO và một phần dung dịch thủy phân, hỗn hợp được đem đi chiếu xạ trong 1 phút dưới tia UV ở bước sóng 365 nm Hỗn hợp phản ứng được chuyển sang ống mao mạch thạch anh 100μL của máy quang phổ ESR
để đo lường Các điều kiện thí nghiệm như sau: từ trường 36,5 ± 5 mT; điện 10 mW; tần số điều chế 9.41 GHz; biên độ, 1 × 1000; thời gian quét 1 phút Khả năng loại bỏ các gốc tự do Superoxide được tính toán theo công thức sau:
Hoạt tính loại bỏ các gốc tự do (%) = ( H0
H -1
) x 100 Trong đó H và H0 lần lượt là chiều cao đỉnh của tín hiệu gốc tự có và không có mẫu
Phân tích thông kê: Điều kiện tối ưu dữ liệu nuôi cấy hàng loạt trong phòng thí
nghiệm được thể hiện dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) của 3 xác định thực nghiệm của sinhviên đã được sử dụng để xác định mức độ ý nghĩa (p <0,05)
Trang 103 Kết quả và thảo luận
3.1 Điều kiện nuôi cấy tối ưu của N incerta
3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn đến sự tăng trưởng của N incerta
Các khảo sát về đặc tính tăng trưởng đã được thực hiện để tìm ra những điều kiện
để phát triển tốt nhất cho nuôi cấy sinh khối của chúng Thí nghiệm đầu tiên, được thực hiện ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau N.incerta tăng trưởng trong mọi điều kiện, nhưng mật độ tế bào cực đại khác nhau Từ nuôi cấy, mật độ tế bào ban đầu là 3,4 × 105 Nói chung, mật độ tế bào tối đa và tốc độ tăng trưởng cụ thể bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ Ở 20oC, các N.incerta biểu diễn đường cong tăng trưởng theo kiểu chữ S (Hình 2A) Như được biểu diễn ở hình 2A, mật độ tế bào là lớn nhất tại điều kiện nhiệt
độ 20oC theo sau đó là 25, 30 và 15oC Mật độ tế bào tối đa (8,9 × 106 tế bào/mL) xảy
ra trong 11 hoặc 12 ngày sau khi nuôi cấy Tốc độ tăng trưởng cao nhất ở 20oC (µ=0,57/ngày), trong khi thấp nhất ở 15oC (µ=0,42/ngày) Mật độ tế bào tối đa và tốc
độ tăng trưởng ở 25oC là 8,5 × 106 tế bào/mL, 0,50/ngày (Hình 2B) Tốc độ tăng trưởng ở mức 20 và 25oC trong nuôi cấy sinh khối gần như tương tự
Trong thí nghiệm thứ hai, nghiên cứu về các tác động của các độ mặn khác nhau (23, 27, 33 và 40‰) đối với tốc độ tăng trưởng đã cho thấy sự khác biệt đáng kể (p<0,05) giữa các nhóm độ mặn Mật độ tế bào ban đầu của N.incerta là 3,1 × 105 tế bào/ml Trong 4 độ mặn được khảo sát, mật độ tế bào tối đa (8,1 × 106 tế bào/ml) và tốc độ tăng cụ thể (µ=0,60/ngày) N.incerta đã thu được ở độ mặn 33‰ Mặt khác, tốc
độ tăng trưởng thấp nhất được biểu diễn ở độ mặn 23‰ (4,3 × 106 tế bào/ml, 0,44/ngày) (Hình 2C,2D) Ở độ mặn 27‰, tỉ lệ tăng trưởng đã được quan sát là 7,7 ×
106 tế bào/ml, 0,58/ngày Trong thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào được tăng lên trong vòng 10 ngày và sau đó giảm Tại độ mặn 40‰, tốc độ tăng trưởng là 6,7 × 106 tế bào/ml, 0,53/ngày Điều kiện tối ưu của nhiệt độ và độ mặn cho sự phát triển của N.incerta được thực hiện ở nhiệt độ là 20oC và độ mặn 33‰
