Thiết kế vector baculor virus mang gen HA của virus cúm a h5n1 phục vụ cho việc phát triển vaccine thế hệ mới bằng công nghệ virus like particle

N S2 là protein được dịch mã từ hai đoạn gen, khối lượng phân tử khoảng 14 kDa, đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt viru

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G IA H À N Ộ I

T R Ư Ờ N G Đ Ạ I H Ọ C K H O A H Ọ C T ự N H IÊ N• • • •

Đ à o T h ị N h ư H oa

THIÉT KẾ VECTOR BACULOR VIRUS MANG GEN HA

PHÁT TRIỀN VACCINE THÉ HỆ MỚI BẰNG

CÔNG NGHỆ VIRUS LIKE PARTICLE

C h u y ê n n g à n h : V i sin h v ậ t h ọ c

M ã số: 6 0 4 2 4 0

L U Ậ N V Ă N T H Ạ C S Ỹ K H O A H Ọ C

N G Ư Ờ I H Ư Ớ N G D Ả N K H O A H Ọ C : T S Đ Ồ N G V Ã N Q U Y Ê N

LÒI CẢM ON

Trước hết, tôi xin bậy tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tói Tố Dồng Văn Quyền , ngưòi đã tận tỉnh chỉ bảo, quan tâm, giúp đỡ vả dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, vả hoàn thành luận văn, giúp tôi có được nhiều kiến thức, kinh nghiệm quỷ báu

Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được <sự giúp đ õ tận tỉnh, <Bự ủng hộ động viên của các anh, chị, em đổng nghiệp tại Phòng Vi sinh vệt học phân tử, đặc b iệt là PGỔ.T& Dinh D u / Kháng, CN Nguyễn Thị Phương, CN Ngu/ễn Thanh Tùng,những ngưòi đỗ chỉ bảo, giúp đ õ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn thạc

&ỹ. Tôi cung nhận được sự giúp đõ, tạo nhiểu điều kiện thuận lợi của phòng Vi sinh vật học Phân tử, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm quốc gia vổ công nghệ gen, Viện Công nghệ ổinlì học

Tôi cũng xin được b ồ / tỏ lòng b iế t ơn sâu (Sắc tới các thầy, cô trong b ộ môn Vi sinh vật học, Khoa ỗinh học, Trường Dại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điểu kiện vả giúp đõ tôi trong quố trình học tập vồ nghiên cứu tại trường

Cuối cùng tôi xin gửi lòi cảm ơn sâu sắc tỏi những ngưòi thân trong gia đình và bạn b ẻ đã ủng hộ, động viên giúp đõ bôi cả về vật chất và tinh thần đ ể tôi có thể hoàn thành bản luận văn nồ/

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa

MỤC LỤC

Đ Ặ T VÁN Đ È 1

C hương 1: TỎNG QUAN TÀ I L IỆ U 3

1.1 Tổng quan về virus c ú m 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus c ú m 3

1.1.2 Đặc điểm các phân đoạn gen của v ir u s 4

1.1.3 Các kháng nguyên quan trọng của virus c ú m 6

1.1.4 Tình hình dịch bệnh H 5 N 1 10

1.2 Vaccine phòng chống c ú m 11

1.2.1 Đại cương về v a c c in e 11

1.2.2 V accine truyền th ố n g 13

1.2.3 V accine thế hệ m ớ i: 13

1.3 Hạt giả virus - V L P s 14

1.3.1 Phương pháp tạo V L P s 14

1.3.2 Các hệ thống biểu hiện tạo V L P s 15

1.3.3 V accine V L P s 16

1.3.4 Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của V L P s 21

C hương 2: VẬT LIỆU VÀ PH Ư Ơ NG PH Á P N G H IÊN c ứ u 24

2.1 Đối tượng nghiên cứ u 24

2.2 Vật l i ệ u 24

2.2.1 V ector tách dòng 24

2.2.2 V ector biểu hiện trong tế bào côn trù n g 25

2.2.3 Hóa chất và sinh p h ẩ m 25

2.2.4 Trang thiết b ị : 26

2.3 Phương pháp nghiên c ứ u : 27

2.3.1 Tách chiết RN A tổng s ổ 27

2.3.2 K iểm tra RN A bằng quang phổ k ế 27

2.3.3 Tổng hợp c D N A 27

2.3.4 Thiết kế hộp gen HA của virus cúm A /H 5 N 1 28

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N h u Hoa

2.3.5 Thiết kế các vector trung gian baculovirus mang hộp gen H A 28

2.3.6 Biến nạp DNA plasm id vào tế bào E c o li 29

2.3.7 Tách chiết DNA plasm id từ vi khuẩn E co li 30

2.3.8 K iểm tra DNA plasm id bằng enzym giới h ạ n 31

2.3.9 Thu đoạn DN A từ gel agarose 31

2.3.10 Chọn lọc các dòng plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen HA32 2.3.11 Chuẩn bị tế bào SÍ9 cho quá trình đồng chuyền n ạ p 32

2.3.12 Đ ồng chuyển n ạ p 33

2.3.13 Tách chiết DNA tổng số từ baculovirus tái tổ h ợ p 34

2.3.14 Kiểm tra sự có mặt gen HA trong tế bào côn trùng Sf9 bằng P C R 34

C H Ư Ơ N G 3: KÉT QUẢ VÀ TH Ả O L U Ậ N 35

3.1 T h iết kế D N A bộ khung của baculovirus tái tổ hợp m ang hộp gen HA 35 3.1.1 Thiết kế hộp gen H A 35

3.1.2 Tách dòng hộp gen HA vào vector p C R 2 1 35

3.1.3 Thiết kế vector trung gian baculovirus m ang hộp gen H A 37

3.2 N uôi cấy và bảo quản tế bào côn trùng Spodoptera/rugiperda (S f9 ) 39

3.3 Đ ồng chuyển nạp tạo baculovirus tái tổ hợp m ang hộp gen H 5 40

3.4 Kiểm tra sự có mặt của gen HA trong virus tái tổ hợp bằng phương pháp P C R 41

K ÉT L U Ậ N VÀ K IẾN N G H Ị 43

K Ế T L U Ậ N 43

K IẾN N G H Ị 43

TÀI L IỆ U TH AM K H Ả O 44

PH Ụ L Ụ C 51

Luận văn thạc s ĩ sinh học• • • Đào Thị N hư Hoa

ĐẶT VẤN ĐÊ

Cúm gia cầm đã và đang tiếp tục là mối đe dọa đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu Theo thông báo của Tổ chúc Y tế thế giới (W HO), tính từ năm 2003 đến năm 2012, tổng số ca mắc cúm gia cầm đã lên tới 610 trường hợp, trong đó có 360 trường hợp tử vong [24], Điều đặc biệt nguy hiểm là các chủng virus cúm gia cầm này luôn biến đổi, làm tăng khả năng lây nhiễm sang người cũng như độc lực của virus Con người đang phải chạy đua trong việc tìm và phát triển các liệu pháp mới nhằm phòng, chống lại sự biến đổi liên tục của loại virus giết người này Phương pháp hữu hiệu nhất là tiêm chủng vaccine

Với sự tiến bộ của khoa học, chúng ta đã phát triển được vaccine cúm A/H5N1 và đã phần nào kiểm soát được sự lây nhiễm trong cộng đồng Các loại vaccine cúm gia cầm chính hiện nay đang được sử dụng đều sản xuất trên trứng gà

có phôi và có những hạn chế nhất định như đỏi hỏi thời gian sản xuất lâu, hiệu suất thấp, chi phí c ao đặc biệt trong trường hợp đại dịch xẩy ra sẽ không thể đáp ứng

đủ yêu cầu

Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng thành công công nghệ virus-like particles (V LPs) để phát triển các vaccine thế hệ mới Đây là m ột hướng nghiên cứu mới đầy triển vọng, đang được triển khai nghiên cứu ứng dụng tại nhiều phòng thí nghiệm tiên tiến và các công ty dược phẩm hàng đầu trên thế giới, nhằm

bổ sung cho các công nghệ truyền thống V accine VLPs viêm gan B và vaccine VLPs ung thư cổ tử cung là 2 vaccine đầu tiên được sản xuất bằng công nghệ tiên tiến này và đã được Cục quản lý thực phẩm & dược phẩm H oa kỳ (FDA) chứng nhận Các nghiên cứu mới nhất cho thấy, vaccine VLPs cúm gia cầm tạo đáp ứng miễn dịch phòng vệ m ạnh hom, kéo dài hơn so với vaccine cùng loại sản xuất bằng công nghệ truyền thống

Việt N am là m ột trong hai quốc gia có tỷ lệ m ắc và tổn thất cao nhất do cúm gia cầm [2, 5, 24] Vì thế nhu cầu vaccine này là rất lớn và cấp thiết Xuất phát từ các cơ sở trên, chúng tôi nghiên cứu đề tài: “Thiết k ế vector bacuỉor virus m ang

Luận văn thạc sĩsin li học_•_ • _ _ » Đào Thỉ N hư Hoa •

gen HA của virus cúm A/H 5N 1 ph ụ c vụ cho việc p h á t triển vaccine thế hệ m ới bằng công nghệ Virus li ke p a rtic le ”

Đe tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Luận văn thạc s ĩ sinh học• _ • • Đào Thị N hư Hoa

C hương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về virus cúm

1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm

Bệnh cúm là bệnh của loài chim và động vật có vú do virus dạng RNA thuộc

họ Orthomyxoviridae gây ra Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện, bao gồm 4 nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm c và nhóm Thogotovirus Các nhóm virus khác nhau bởi kháng nguyên bề m ặt capsid, ở virus cúm A và B là

H em agglutinin, ở virus cúm c là H em agglutinin Esterase Fusion, và ở Thogotovirus là G lycoprotein [4, 6]

Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hoặc hình khối đa diện, đôi khi cũng có dạng hình sợi, đường kính 80 - 120 nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da (H ình 1.1 A) K ết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy m ột hạt virus có chứa khoảng 0,8-1,1% RNA; 70-75% protein; 20-24% lipid và 5-8% carbonhydrate[23]

Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đon âm (-) ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt, m ã hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (M I và M2), NP,

NS (NS1 và N S2), PA, PB1, PB1 - F2 và PB2[6] Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn a đổi xứng, dài 50-100 nm, đường kính 9-10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein có bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.1 B) M ỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym polym erase chịu trách nhiệm trong quá trình phiên m ã và sao chép RNA của virus Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bàng các cầu nổi peptide tạo dạng vòm tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất

có tổng độ dài từ lOkb - 15 kb (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa khoảng 13,5 kb thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn a bên trong vỏ virus[6]

Bao bọc hạt virus là m ột lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ m àng tế bào nhiễm được gắn protein m àng của virus, đóng vai trò bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus Bề mặt ngoài của vỏ được bao phủ bởi các glycoprotein phân bố dày đặc Mỗi glycoprotein có kích thước dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm Virus

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa

cúm có hai loại protein kháng nguyên đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus là haem agglutinin (HA) và neuram inidase (NA) Các phân tử HA

và NA phân bố không đồng đều (cứ 4-5 phân tử HA thì có 1 phân tử NA) Ngoài ra trên bề mặt vỏ còn có protein M2 nằm xuyên qua m àng lipit kép và hoạt động như kênh vận chuyển ion Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M l (matrix) [6],

Influenza virus RNP

(■) sense ssRNA

3 polymerase subunits NP

H ình 1.1: Virus cúm A /H IN I chụp băng kính hiên vi (A) và hình ảnh mô phỏng

câu trúc ribonucleoprotein (B) (nguôn internet)

1.1.2 Đặc điểm các phân đoạn gen của virus

Virus cúm cỏ hệ gen là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt

m ang tên từ 1-8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử, mã hóa tổng hợp cho

11 protein (Hình 1.2) Trong hệ gen các phân đoạn 1; 2; 3; 5; 7; 8 có độ dài tương đối ổn định và có tính bảo thủ cao Hai phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein bề mặt của virus (HA và N A ) có độ dài không ổn định và đặc trưng theo từng chủng virus [1,6]

> Phân đoạn 1 có kích thước 2431 bp, m ã hóa tổng hợp protein enzym PB2 Enzym này có khối lượng phân tử khoảng 84 kDa, là tiểu đom vị thành phần trong phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA của virus Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ có liên quan đến vị trí am ino axít 627 ở protein PB2

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa

Hình 1.2: Mô hình cấu trúc virus cúm A /H 5 N 1

> Phân đoạn 2 có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzym P B 1 P B 1 có khối lượng phân tử khoảng 87 kDa, là tiểu đon vị xúc tác của phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trong quá trình tổng hợp RNA virus Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một protein P B 1 - F2 được m ã hóa bởi m ột khung đọc m ở khác của phân đoạn 2

> Phân đoạn 3 có kích thước 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA

PA có khối lượng phân tử khoảng 83 kDa, là m ột tiểu đơn vị của enzym polym erase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RN A trong quá trình tổng hợp RN A của virus Phân đoạn gen này có tính bảo tồn cao

> Phân đoạn 4 chịu trách nhiệm m ã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên

bề m ặt virus cúm Phân đoạn này gồm hai tiểu phần là H A I và HA2 có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm A, ở A/H1N1 là 1778 bp Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63 kDa, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus và có khả năng gây ngưng kết hồng cầu Vùng nổi giữa H A I và H A 2 là

m ột số am ino axít m ang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide

V ùng này chứa vị trí nhận biết và cắt đặc hiệu của một số enzym protease của vật chủ và là vùng quyết định độc lực của virus

> Phân đoạn 5 có kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP) Protein NP là thành phần của phức hệ phiên mã chịu trách nhiệm vận chuyển

Luận văn thạc s ĩ sinh học> • • Đào Thị N hư Hoa

RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ, có khối lượng phân tử khoảng 56 kDa, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA trong hệ gen virus tạo cấu trúc nucleocapsid đổi xứng xoắn bền vững

> Phân đoạn 6 mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid của virus Chiều dài phân đoạn gen này thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở cúm A /H6N2 là 1413 bp, ở cúm A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp) Cùng với kháng nguyên HA, N A đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự lây nhiễm của virus trong tế bào vật chủ, giúp quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn và giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào bị nhiễm

> Phân đoạn 7 có kích thước khoảng 1027 bp, m ã hóa cho protein M củavirus gồm hai tiểu phần là M I và M2 được dịch m ã từ những khung đọc mở khác nhau của cùng m ột phân đoạn RNA Protein M I là protein nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus Protein M2 là chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử là

11 kDa Đây là protein xuyên màng cần thiết cho quá trình lây nhiễm của virus vàchịu trách nhiệm cởi áo virus trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ

> Phân đoạn 8 m ã hóa tổng hợp protein không cấu trúc Phân đoạn này có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein NS1 và NS2 có vai trò bảo vệ hệ gen của virus Protein NS1 có khối lượng phân tử khoảng 27 kDa, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch m ã của tể bào chủ, ức chế sự cắt dán tiền RNA thông tin Ngoài ra, NS1 có thể ức chế đáp ứng interferon trong các tế bào nhiễm virus, làm cho sự sinh sản virus không bị cản trở N S2 là protein được dịch mã từ hai đoạn gen, khối lượng phân tử khoảng 14 kDa, đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới

1.1.3 Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm

1.1.3.1 H em agglutinin (HA)

HA là kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm và là đích để kháng thể

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa

trung hòa Nó đóng vai trò gắn virus vào thụ thể tế bào vật chủ, hòa tan m àng tế bào, giải phóng RNA hệ gen để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào cảm nhiễm Có tới 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của virus Mỗi phân tử có dạng hình trụ, dài khoảng 130 A°, cấu tạo gồm ba đom phân Mỗi đơn phân được tạo thành dưới hai đơn vị H A I và HA2 liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide Tiểu phần HA2 có dạng sợi, đóng vai trò gắn kháng nguyên vào m àng virus Phần đầu tự

do hình chỏm cầu được tạo bởi tiểu đơn vị H A I Tiểu phần này có chứa những thụ thể đặc hiệu, đóng vai trò gắn virus vào m àng tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm Đoạn polypeptide liên kết giữa hai tiểu phần H A I và HA2 là trình tự nhận biết của một số protease trong tế bào vật chủ Đổi với chủng virus thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza, HP AI), vị trí liên kết hai tiểu phần HA thường là một chuỗi am ino acid kiềm, dễ dàng bị cắt bởi các protease thông thường có mặt trong nhiều loại mô tế bào và các cơ quan khác nhau trong cơ thể (H ình 1.3) Do đó, virus

có thể nhân lên trong toàn bộ cơ thể, gây nguy hiểm tới tính m ạng vật chủ [3,4]

Hình 1.3: M ô hình cấu trúc phân tử HA Các nhà khoa học đã phát hiện 17 loại HA gây bệnh ở gia cầm và vật nuôi, nhưng chỉ có 3 loại là có khả năng gây bệnh ở người (H l, H2 và H3) Sự phù hợp cấu hình không gian giữa thụ thể chứa axít sialic của tế bào đích với vị trí gắn thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus đối với các loài vật chủ khác nhau Ở hầu hết các loại virus cúm lưu hành trong tự

Luận văn thạc s ĩ sinh học • • » Đào Thị N hu Hoa

nhiên, vị trí am ino axít 226 và 228 của tiểu phần H AI quyết định khả năng liên kết của protein HA với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào chủ Sự thay đổi các amino axít trên làm thay đổi thụ thể đặc trưng của virus, giúp virus vượt qua rào cản loài

và thích ứng với m ột loại vật chủ mới Protein HA của virus cúm gia cầm chứa gốc Glutamine 226 và Glycine 228 hình thành nên một dạng hốc hẹp phù hợp để gắn thụ thể axít sialic dạng a2,3- Trong khi đó, chủng virus gây bệnh ở người chứa Leucine 226 và Serine 228 hình thành nên m ột dạng hổc rộng để thích hợp với axít sialic dạng a2,6 Do đó, đột biến điểm trên HA có thể chuyển đổi đặc tính gắn thích hợp sang axít sialic dạng a2,6 Đây chính là điều kiện cần để chúng tiến hóa thành

m ột chủng có khả năng gây nên dịch cúm ở người [39]

ỉ 1.3.2 N eurom inidase (NA)

Protein neuram inidase còn gọi là sialidase là một protein có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, m ang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type N A [4,6] Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA trên bề m ặt capsid hạt virus Phân tử N A có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 tiểu phần dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một m ặt phẳng, và phần kị nước gẳn vào vỏ capsid Protein N A

có vai trò là m ột enzym cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của m àng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi m àng tế bào vật chủ, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên m àng tế bào M ặt khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa m àng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn Ngoài ra, N A còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuram inic acid làm tan loãng m àng nhầy bề m ặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu C ùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của N A đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ Do đó, N A là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virus không

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thi N hư Hoa

đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là O seltam ivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzym này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ Bên cạnh

đó, NA còn là một kháng nguyên bề m ặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA [4], N hư vậy, kháng nguyên N A cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A, và là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhàm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người

M en neuram inidase có dạng nút lồi hình nấm trên bề m ặt virus Nó có một đầu gồm 4 bán đơn vị hình dạng gần hình cầu trên cùng mặt phẳng, và một vùng kị nước gẳn vào bên trong m àng virus Đây là gen mã hóa tổng họp protein NA, kháng nguyên bề m ặt capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 5 0 103 Dal Các nghiên cứu phân tử gen N A của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau Đặc trưng biến đổi của gen

N A trong virus cúm A là hiện tượng đột biến trượt-xóa m ột đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho độ dài vốn có trước đây của NA(N1) là

1410 bp còn 1350 bp [4,6],

1.1.3.3 M atrix protein ( M l) của virus cúm

Protein nền M I là thành phần chính của virion virut, nó bao quanh vRNP, liên kết vRN P với vỏ virut và kênh ion M I là m ột protein khá bền vững gồm 252

am ino acid N ó có hai vùng hình cầu (từ acid amin 1 đến 164 và từ 165 đến 252) liên kết với nhau qua một vùng nhạy cảm với protease c ấ u trúc của protein M I chủ yếu là dạng xoắn

Protein M l không chỉ là thành phần cấu trúc cần thiết của virion mà còn đóng vai trò quan trọng trong chu trinh sống virut:

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa

> Tương tác với vRN P và NS2 và vận chuyển vRN P ra vào nhân M l là yếu

tố điều chỉnh quá trình xuất nhập này Sau khi virut đi vào endosome dưới tác dụng của pH thấp do sự vận chuyển của ion H+ qua kênh ion M2 của virut và phức hợp

M l-vR N P bị phân tách hoàn toàn cho phép vRN P đi vào nhân N gược lại, khi các vRNP mới được tạo thành trong nhân thì M I và NS2 sẽ đi vào nhân và kết họp với vRNP cùng được vận chuyển ra khỏi nhân Sự tương tác của M I với RNP đã được nghiên cứu khá rõ Hai domain trong M I bám vào RNA được xác định ở hai vùng dộc lập: ngón tay kẽm (a zinc finger motif, ở vị trí am ino acid 148 tới 162) và một chuỗi am ino acid RK LK R (ở vị trí amino acid 101 tới 105) Điều hoà sao chép vRNP; vRN P chỉ được sao chép khi tách khỏi M l

> Tương tác với protein vỏ của virut: HA, NA, M2 trong quá trình nảy chồi Huy động các thành phần của virut tới vị trí lắp ráp và khởi đầu nảy chồi M l là yếu

tố trung tâm trong việc lắp ráp các thành phần của virut Phân tử M I liên kết với vRNP, m àng tế bào qua các đuôi hướng tế bào chất của cả hai glycoprotein bề mặt

HA và NA, các phân tử M 1 khác thì tạo thành m ột lớp dưới lớp vỏ bọc của virut Liên kết của M I với m àng dựa vào sự tổ hợp của cả hai tương tác tĩnh điện và kị nước cũng như sự tương tác của protein đặc hiệu với protein vỏ Huy động các thành phần tế bào chủ cho việc hoàn thành nảy chổi và giải phóng virut Tỉ lệ

M l/N P của phân tử virut ảnh hưởng đến hình thái của virion và sự lan truyền của virut khi được giải phóng

1.1.4 Tình hình dịch bệnh H5N1

Sự bùng phát của các chủng virus cúm A/H5N1 độc lực cao gần đây và khả năng lây lan của loại virus chết người này sang người, đang làm tăng thêm mối lo ngại về một trận đại dịch cúm mới có thể tái hiện như đại dịch cúm lịch sử H IN I xảy ra vào năm 1918 tại Tây Ban N ha giết chết hơn 50 triệu người trên toàn thế giới Theo thông báo mới nhất của tổ chức Y tế thế giới (W HO), tính đến thời điểm hiện tại, cúm gia cầm đã lan tràn trên 100 quốc gia Tại các nước Đông N am Á, cúm H 5 N 1 đã và đang gây tổn thất to lớn cho ngành chăn nuôi Hàng trăm triệu gia

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thi N hư Hoa

súc, gia cầm bị chết hoặc bị thiêu hủy do nhiễm virus này Điều đặc biệt nguy hiểm

là các chủng virus cúm gia cầm này đã có biến đổi lớn về mặt di truyền, tăng khả năng lây nhiễm và gây tử vong cho người Các số liệu thống kê gần đây cho thấy,

đã có hơn 400 ca lây nhiễm trên người và tỷ lệ tử vong lên đến hơn 60%, cao hơn rất nhiều so với tỷ lệ tử vong 2.5-5% của dịch cúm lịch sử Tây Ban N ha năm 1918 [7, 8, 23, 46, 48] Năm 1997, 18 người đầu tiên được phát hiện nhiễm cúm A/H5N1

và 6 người trong số đó đã tử vong [46] Đợt dịch tái diễn vào năm 2003 làm 4 người nhiễm bệnh và cả 4 người sau đó tử vong Trong giai đoạn từ năm 2003-2005, cúm A/H5N1 bùng phát trên diện rộng ở 9 nước châu Á làm 19 ca nhiễm ở Thái Lan, 91 ca ở V iệt N am , 7 ca ở Indonesia và 4 ca ở Cam puchia giết chết 62 người [54] Đến năm 2009, số trường hợp lây nhiễm H5N1 đã lên đến 417 người và làm tử vong 257 người trong số đó [24] Theo thông báo của Tổ chức thú

y quổc tế (OIE), đến tháng 03 năm 2010, bảy tỉnh thành tại V iệt N am công bố cúm gia cầm tái suất hiện làm chết hom 6 nghìn v à làm tiêu hủy hơn 14 nghìn gia cầm

Số trường hợp nhiễm và tử vong do H 5 N 1 vẫn không ngừng gia tăng Ca tử vong gần đây nhất liên quan đến H5N1 được ghi nhận tại Việt N am là một bệnh nhân nữ, phát hiện vào tháng 2 năm 2010 [24]

1.2 V accine phòng chống cúm

1.2.1 Đ ại cưong về vaccine

M ỗi khi dịch cúm bùng phát, các quốc gia thường có những biện pháp kiểm soát vệ sinh như đeo khẩu trang, rửa tay bằng xà phòng đặc biệt là sau khi ho, hắt hơi vì vi rút cúm A/H5N1 có sức đề kháng yếu, dễ bị bất hoạt bởi bức xạ m ặt trời, tia cực tím và các chất tẩy rửa thông thường (xà phòng, chất tẩy Natri hypochlorite0,05% , cồn ethanol 70% .) Đồng thời tiến hành tiêu hủy gia súc bị nhiễm bệnh hoặc nghi là bị nhiễm tại khu vực có dịch Tuy nhiên, việc làm này là chưa đủ để ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh, đặc biệt là những khu đông dân cư và có m ật độ động vật nuôi cao vì virus cúm A/H5N1 có thể tồn tại hàng giờ ở ngoại cảnh, đặc biệt khi thời tiết lạnh Ngoài ra còn ảnh hưởng nặng nề tới nền kinh tế mỗi quốc gia

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Tlti N hư Hoa

và đặc biệt là người nông dân, môi trường sinh thái bị ô nhiễm ảnh hưởng tới sức khỏe con người Trên thực tế, thế giới đã sử dụng phổ biến một số loại thuốc dùng trong điều trị cúm A, cơ chế hoạt động của thuốc dựa trên chu trình hoạt động của virus cúm Cụ thể là:

> Amantadine và Rimantadine: Đây là hai loại thuốc cản trở sự hoạt động của kênh ion M 2 Dan tới ức chế quá trình cởi bỏ lớp vở ngoài của virus vRNP không được đưa vào nhân cài xen vào gem one của tế bào chủ Ở nồng độ nhỏ Am antadine gây hiệu quả cao với virus cúm A song kém hiệu quả với virus cúm B và c ( do sự khác biệt về kênh ion) Am antadine còn hoạt động như một bazơ yếu, trung hòa H+ trong endosom e và bộ máy golgi Trong hai loại thuổc này thì Rim antadine được sử dụng phổ biến hốn vì gây ít tác dụng phụ Tuy nhiên thực tế chúng đều gây tác đông phụ tới hệ thần kinh đồng thời cũng xuất hiện những chủng cúm kháng thuốc Sự kháng thuốc này chủ yếu liên quan tới các đột biến xảy ra trong trình tự nucleotid

mã hóa cho kênh M2

> Leptomycine B: Cơ chế của loại thuốc này là ngăn cản sự vận chuyển vRNP ra khỏi nhân tế bào

> Zanamivir (Relenza) và Tamiflu (Oseltmavir): hai loại này có cấu hình không gian tương tự như NA Do vậy chúng ngăn cản sự liên kết của NA với các thụ thể sialic acid, cản trở quá trình giải phóng virus, ức chế sự lan nhiễm virus

V iệc tiêm phòng được xem là lựa chọn đầu tiên để chống lại sự xâm nhiễm

và lây lan của dịch cúm Trên thế giới có nhiều quốc gia tham gia vào việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng cúm , chủ yếu tập trung ở những nước phát triển như:

Mỹ, Pháp, Đức, H à L a n , Với mỗi loại vaccine, yêu cầu cơ bản là phải có tính miễn dịch bảo hộ, tính kháng nguyên, tính đặc hiệu và tính không độc Việt N am đang trong giai đoạn tập duyệt sản xuất vaccine để phòng cúm H5N1 Các vắc-xin ngừa bệnh cúm m ùa trước đây không có hiệu quả đối với cúm A /H5N1 mới Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa

1.2.2 V accine truyền thống

- Vaccine bất hoạt:

Vaccine này được tạo ra từ các chủng virus ngoài tự nhiên, đã bị làm bất hoạt bằng các tác nhân lý hóa khác nhau và không còn khả năng nhân lên trong vật chủ Hiện nay, phương pháp tạo vaccine này được sử dụng phổ biến nhất là nuôi virus trong trứng rồi làm bất hoạt bằng các tác nhân vật lý như: nhiệt độ, sóng siêu âm, tia

tử ngoại, hay các tác nhân hóa học như: các loại thuổc nhuộm , axít, formol Loại vaccine này có ưu điểm dễ sản xuất và bảo quản, giá thành rẻ, độ an toàn cao Tuy nhiên, nhược điểm lớn của loại vaccine này là gây đáp ứng m iễn dịch ngắn hạn, cần tiêm nhắc lại nhiều lần, khả năng sinh đáp ứng miễn dịch chậm , lượng vaccine tiêm mỗi lần nhiều và hiệu quả không cao [2]

- Vaccine giảm độc lực:

Là loại vaccine đã được làm nhược độc hoặc vô độc nhưng vẫn bảo toàn tính kháng nguyên Thường vaccine được tạo từ các loại virus đã bị làm m ất các gen quy định tính độc, do đó không còn khả năng gây bệnh nhưng vẫn còn khả năng gây đáp ứng m iễn dịch Vaccine này có khả năng sinh đáp ứng m iễn dịch nhanh chóng và tốt hơn vaccine bất hoạt, tác dụng bảo vệ phòng bệnh hiệu quả, không phải tiêm nhắc nhiều lần Theo m ột số nghiên cứu, loại vaccine này có khả năng bảo vệ chéo giữa các chủng virus cúm A khác nhau Tuy nhiên, mức độ an toàn của loại vaccine này thấp hơn so với vaccine bất hoạt do có khả năng biến đổi thành kiểu hoang dại

sử dụng làm vaccine Vaccine TrovacA IV - H5 của hãng M erial (Pháp), được tạo

ra từ gen H5 của chủng A/Turkey/IrelD N A /83 (H5N2) là m ột ví dụ về loại vaccine

Luận văn thạc s ĩ sinh họcI • _ • Đào Thi N hư Hoa • _

tái tổ hợp Loại vaccine này được sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi và có khả năng bảo vệ trong hơn 20 tuần, hiện được sử dụng rất rỗng rãi Tại Việt Nam , vaccine TrovacAIV-H5 được áp dụng tiêm phòng cúm cho gà từ năm 2006 [2]

- Vaccine DNA:

Gen mã hóa kháng nguyên gây bệnh của virus được gắn vào m ột vector biểu hiện cùng với một prom oter mạnh có khả năng biểu hiện tốt trong tế bào vật chủ Khi biến nạp thành công vào vật chủ, protein kháng nguyên sẽ được tổng hợp ra từ gen m ã hóa cho kháng nguyên và kích thích cơ thể sinh miễn dịch chống lại protein

đó V accine DNA rất gọn nhẹ, an toàn, phương thức gây miễn dịch đơn giản do chỉ chứa D N A thuần khiết nên bền với nhiệt độ [2],

- V accine virus nhược độc nhân tạo sản xuất bằng kĩ thuật di truyền ngược:Phương pháp này được áp dụng cho virus có hệ gen gồm một sợi RNA gồmnhiều phân đoạn nhỏ Các phân đoạn được lắp ghép tạo thành virus với đầy đủ hệ gen Trong đó, các gen kháng nguyên H5 có vùng độc được biến đổi bằng kỹ thuật gen Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (W HO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay đó

là N IBRG - 14 (NIBSC), VN /04xPR8 - rg (SJCRH) và VNH5N1 - PR8/CDC - rg (CDC) [2]

- V accine dưới đơn vị:

Là loại vaccine chỉ sử dụng m ột phần của hạt virus để kích thích đáp ứng

m iễn dịch Do các kháng nguyên đã được tinh chế khi sử dụng làm vaccine nên có

độ an toàn cao, không gây các phản ứng phụ Quy trình sản xuất lượng lớn vaccine dưới đơn vị khá đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp và đắt tiền [2]

1.3 H ạt giả virus - VLPs

1.3.1 Phương pháp tạo VLPs

Để tạo ra các VLPs, người ta thường sử dụng các protein có tính sinh miễn dịch cao của virus gây bệnh, thông thường là các protein bề mặt Các gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng của virus sẽ được thiết kế vào baculovirus

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa

transfer vector Các vector này sau đó được đồng chuyển nạp (co-transfect) với DNA của baculovirus đã được xử lý với enzym e Bsu36 I để loại bỏ đầu c của ORF 1269, prom oter polyhedrin và polyhedrin ORF Việc xử lý với Bsu36 I đã loại

bỏ các thành phần quan trọng cho sự tổng họp và nhân lên của baculovirus trong tế bào chủ Cách duy nhất để DNA của baculovirus có thể tổng hợp lên virus khi được đưa vào trong tế bào nuôi cấy là chúng phải được bổ sung lại vùng bị loại bỏ này

Do đó khi đồng chuyển nạp với baculovirus transfer vector, các vùng thiết yếu (ORF 1629) sẽ được bổ sung từ vector này bằng cơ chế tái tổ hợp trình tự tương đồng tạo lên các virus tái tổ họp biểu hiện ra protein cần nghiên cứu (gen o f interest

1.3.2 Các hệ thống biểu hiện tạo VLPs

Có nhiều hệ thống biểu hiện để sản xuất VLPs bao gồm: các dòng tế bào động vật có vú; tế bào côn trùng; các chủng nấm m en khác nhau như

Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris, Escherichia coli và vi khuẩn khác

V accine VLP theo đường m iệng (vaccine HBV, vaccine virus N orw alk) đã được tạo

Luận văn thạc s ĩ sinh học • _ • • Đào Thị N hư Hoa

ra từ các loài thực vật khác nhau bao gồm thuốc lá, rau diếp và khoai tây [26, 31, 47] Các hệ thống biểu hiện này đều có những ưu và nhược điểm riêng Việc dễ dàng trong biểu hiện, khả năng mở rộng quy mô và chi phí sản xuất thấp đã khiến nấm men là một lựa chọn phổ biến, tuy nhiên xét về các yếu tố khác như glycosyl hóa, gấp nếp (folding) chính xác các protein tái tổ hợp biểu hiện ra và quá trình lắp ráp thành các hạt giả virus cũng như tối ưu hóa c o d o n h ệ thống này vẫn bộc lộ những hạn chể, vì vậy đòi hỏi cần có hệ thống sản xuất thay thế tối ưu hơn

Escherichia coli có un điểm là dễ dàng nuôi cấy, đòi hỏi thiết bị và môi trường nuôi cấy rẻ tiền n h ư n g protein biểu hiện ở hệ thống này không được glycosyl hóa, trong khi nấm men và baculovirus bị hạn chế bởi khả năng sửa chữa sau dịch mã đặc biệt là với các glycoprotein có m annose cao và khả năng này đôi khi không ổn định

V LP sản xuất trên hệ thống biểu hiện baculovirus mang nhiều ưu điểm như khả năng sửa chữa sau dịch mã, quá trình gấp nếp p ro te in tuy nhiên hệ thống này cũng tạo ra các thách thức trong việc tinh sạch các VLP ra khỏi baculovirus, vì cả hai đều có kích thước tương tự nhau 80-120 nm [40] Hệ thống nuôi cấy tế bào động vật có vú đang được ưa chuộng bởi khả năng sửa chữa sau dịch mã và lẳp ráp các VLP chính xác, nhưng chúng lại là hệ thống khó kiểm soát và tốn kém cho sản xuất Hệ thống Retrovirus có xu hướng m ang các protein màng tế bào không m ong

m uốn trong vỏ của chúng trong quá trình lắp ráp virus Hướng nghiên cứu sản xuất tương lai có thể là việc lắp ráp VLPs từ các protein của virus trong ống nghiệm bằng phương pháp hóa học [37]

1.3.3 V accine VLPs

Các vaccine được sản xuất theo công nghệ truyền thống đều dựa vào việc tạo

ra virus nhược độc (attenuated) hoặc virus bất hoạt (inactivated) Cả hai loại vaccine này đều tạo ra các đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, tuy nhiên đều có những hạn chế nhất định Với vaccine nhược độc, khả năng virus suy yếu hồi tính trở thành virus độc lực còn đối với vaccine bất hoạt nguy cơ ẹn sót các virus chưa được bất hoạt

Luận văn thạc s ĩ sinh học• • • Đào Thị N hu H oa

hoàn toàn là những vấn đề lớn đặt ra các với các nhà sản xuất Ngoài ra, việc tạo ra được m ột lượng lớn virus cung cấp cho sản xuất vaccine ỉà vấn đề rất khó khăn, đặc biệt khi không có hệ thống nuôi cấy mô phù hợp cho phép virus sao chép hiệu quả Với sự tiến bộ của công nghệ tái tổ hợp, người ta tổng hợp được các thành phần riêng lẻ của virus và sử dụng các cấu phần virus này để sản xuất các vaccine tái tổ hợp Tuy nhiên các vaccine dựa vào các protein đom lẻ có hiệu quả quá thấp so với vaccine virus toàn phần Các vaccine dưới đơn vị thường hỏi liều kháng nguyên cao, m ang tính lập lại thường xuyên và cần phải kết hợp với các tá chất khác Bên cạnh đó, việc tổng hợp được các protein tái tổ hợp có tính sinh miễn dịch giống với virus tự nhiên cũng rất khó khăn mặc dù hiện nay đã phát triển được các hệ thống biểu hiện ở tế bào bậc cao cho phép protein tái tổ hợp biểu hiện ra có thể được sửa chữa sau dịch mã, gấp nếp để tổng hợp ra các protein có cấu trúc giống với cấu trúc

tụ nhiên của chúng

Với sự tiến bộ của công nghệ D NA tái tổ hợp, các nhà khoa học đã phát triển được các vaccine mới như dùng công nghệ D NA tái tổ hợp loại bỏ các vùng độc của virus tạo ra các chủng virus sản xuất vaccine an toàn trên trứng gà có phôi (ví dụ vaccine cúm A/H5N1), hay tạo chủng vaccine bằng kỹ thuật di truyền ngược Đ ây được coi là bước đột phá trong công nghệ sản xuất vaccine Mặc dù vậy, tương tự như vaccine sản xuất bằng công nghệ truyền thống như đã nêu ở trên, cả 2 loại vaccine này đều có những m ặt hạn chế cần khắc phục Vaccine sản xuất trên trứng

gà có phôi đỏi hỏi thời gian lâu, hiệu suất th ấp đ ặ c biệt trong trường hợp đại dịch xẩy ra sẽ không thể đáp ứng đủ yêu cầu Vaccine sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược đã khắc phục được những hạn chế trên Tuy nhiên, vẫn còn nhiều lo ngại về tính an toàn cũng như khả năng chủng vaccine này có thể tái tổ hợp với chủng đang lưu hành tạo ra loại virus mới với những đặc tính mà chúng ta chưa kiểm soát được

Q uan sát thực nghiệm cho thấy nhiều protein cấu trúc của virus có khả năng

tự lắp ghép lại với nhau hình thành các hạt giả virus (VLPs) có cấu trúc giống với các virus lây nhiễm tự nhiên, hoặc trong một số trường hợp tạo thành các hạt dưới virus Quan sát này đã m ở ra m ột hướng nghiên cửu riầy triển v ọ n g tron g phát triển

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa

các vaccine thế hệ mới đó là tạo các vaccine VLPs Vaccine VLPs kết hợp các ưu điểm của vaccine virus toàn phần và các vaccine dưới đơn vị tái tổ hợp VLPs có cấu trúc tương tự như virus tự nhiên nhưng do thiếu vật liệu di truyền (axit nucleic) của virus nên chúng hoàn toàn không có khả năng lây nhiễm (Hình 1.5) VLPs có thể được tạo ra bàng công nghệ tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện mà không phụ thuộc vào sự sao chép của virus Ví dụ, VLPs của virus gây ung thư cổ tử cung

ở người (hum an papillom avirus-H PV ) không chỉ được tạo ra trong tế bào động vật

có vú mà còn ở nhiều hệ thống nuôi cấy khác như vi khuẩn, nấm men, thực vật chuyển gen và baculovirus/tế bào côn trùng [13, 22, 35, 53] Do cấu trúc đồng nhất, các hạt VLPs có thể dễ dàng được tinh sạch bàng phương pháp ly tâm siêu tốc gradient hoặc bàng phương pháp sắc ký phân tách dựa vào kích thước (size- exclusion chrom atography)

Hình 1.5: Sơ đồ m inh họa cấu trúc của hạt virus tự nhiên (native virus) và hạt giả virus (virus-like particles) Virus tự nhiên có m ang vật liệu di truyền (các axit nucleic) nên có khả năng sao chép, trong khi đó VLPs chỉ được tạo ra bởi các protein cấu trúc của virus và thiếu vật liệu di truyền do đó chúng không có khả năng

tự sao chép và lây nhiễm

Đ iều quan trọng nhất là VLPs có tính sinh miễn dịch cao Với các ưu điểm trên, vaccine VLPs được xem là vaccine tiềm tàng trong việc phòng chống một số bệnh virus mà cho đến nay con người chưa tìm hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp,

ví dụ như HIV ở người Hiện trên thị trường có hai loại vaccine VLPs đã được

Luận văn thạc s ĩ sinh liọc_ • i_ _ _ _ _ _ _ _ _ Đào Thị N hư Hoa

thương mại hóa đó là vaccine VLP viêm gan B và vaccine VLP ung thư cổ tử cung

V accine VLP viêm gan B với tên thương mại Recombivax (M erck & Co., Inc.) và Energix (G laxoSm ithK line [GSK]), được FDA thông qua vào những năm 1980, là những hạt dưới virus có kích thước 22 nm tạo ra bởi sự tự lắp ghép của kháng nguyên bề m ặt chính của virus viêm gan B (HBsAg) Trong khi đó, vaccine VLP ung thư cổ tử cung được tạo ra bởi các hạt giả virus cấu tạo từ protein lõi L I của HPV Cả hai vaccine này đều có độ an toàn lý tưởng, hiệu lực cao và tạo ra đáp ứng kháng thể lâu dài Sau 4 năm, qua các thử nghiệm lâm sàng của M erck và GSK, đã chứng m inh được rằng vaccine VLP ung thu cổ tử cung có khả năng bảo vệ vật chủ lâu dài chống lại sự lây nhiễm của HPV và tạo ra lượng kháng thể ổn định và cao hơn ít nhất 10 lần so với lượng kháng thể được tạo ra do lây nhiễm tự nhiên [20, 30] K ết quả tương tự cũng được quan sát thấy sau 10 năm tiêm vaccine VLP viêm gan B [16]

Tại sao VLPs lại có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh như thế? Câu hỏi này có thể được lý giải do VLPs được tạo ra bởi m ột hoặc nhiều protein được sắp xếp về phương diện hình học thành m ột dãy protein tập trung, dầy đặc và lập lại Đ ây là cấu trúc độc đáo và duy nhất của các kháng nguyên vi sinh vật; trải qua hàng triệu năm tiến hóa hệ thổng miễn dịch của động vật có vú đã được huấn luyện

để nhận biết và phản ứng mạnh mẽ lại cấu trúc kháng nguyên này giúp bảo vệ chúng khỏi sự tấn công của các tác nhân gây bệnh vi sinh vật Ví dụ tế bào B có thể nhận biết đặc hiệu và tạo đáp ứng miễn dịch m ạnh mẽ đổi với các tác nhân gây bệnh được sắp xếp theo dãy có tổ chức, liền kề nhau và lập lại, m ột dạng cấu trúc đặc thù của bề m ặt virus [10, 18] Người ta tin rằng các kháng nguyên có tính lập lại cao (highly repetitive antigens) kích thích các phân tử globulin m iễn dịch liên kết m àng gắn lại với nhau tạo chuỗi oligo hình thành thụ thể tế bào B (B cell receptor-BCR)[10] Sự liên kết chéo của globulin m iễn dich Ig thông qua kháng nguyên đa phân (m ultivalent antigens) dẫn đến sự hình thành của các tiểu vùng tín hiệu-BCR bền vững [49] Tín hiệu này kích thích sự sinh trưởng và di chuyển của tế bào B, kích hoạt cả M HC lớp II các phân tử truyền tải tín hiệu cho phép tế bào B tương tác với

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa

các tế bào trợ bào T (T-helper cells) làm tiết ra IgG và tạo ra các tế bào ghi nhớ B tồn tại lâu dài (long-lived m em ory B cells) Kết quả là các kháng nguyên đa phân có thể kích thích tế bào B ở nồng độ thấp hơn rất nhiều so với các kháng nguyên đơn phân (m onom eric antigens) [12, 14, 33] M ặt khác, rất nhiều loại VLPs bao gồm cả VLP HPV không cần phải kết hợp với các tá chất khác để gây ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ [21, 55]

Ngoài khả năng kích thích đáp ứng tế bào B, VLPs còn gây ra đáp ứng tế bào

T hiệu quả thông qua sự tương tác với các tể bào trình diện kháng nguyên (APC), đặc biệt là tế bào đuôi gai (dendritic cells-DCs) Sử dụng các hạt nano cộng hợp, người ta đã chứng minh được rằng các tế bào đuôi gai tiếp nhận tốt nhất các các kháng nguyên có đường kính sấp sỉ 40 nm, kích thước phổ biển của hầu hết các virus [19] H ơn nữa, một số loại VLPs thường hướng tới các tế bào đuôi gai tốt hơn với các tế bào khác Ví dụ chỉ trong 90 phút sau khi tiêm VLP parvovirus lợn qua tĩnh m ạch thì khoảng một nửa tế bào đuôi gai đã tiếp nhận các VLP này [34] M ột khi đã được tiếp nhận bởi tế bào trình diện kháng nguyên, cũng giống như các kháng nguyên ngoại lai khác, VLPs sẽ bị xử lý và được trình diện bởi các phân tử MHC lớp II và hoạt hóa các tế bào trợ bào T Ngoài ra, chính các VLPs chứ không phải các protein dưới đơn vị của chúng có thể đi vào dịch nội bào tế bào đuôi gai, tại đó chúng được xử lý và trình diện tới các lympho bào T độc (CTLs) bởi các phân tử M HC lớp I [9,42], M ột số loại VLPs có khả năng kích thích trực tiếp làm cho tế bào gai trở lên thành thục cả về chức năng và hình thái Ví dụ trong trường hợp của V LPs virus ung thư cổ tử cung, chính các VLPs chứ không phải protein lõi

L 1 tái tổ hợp riêng rẽ, đơn vị cấu tạo lên VLPs này, có thể trực tiếp hoạt hóa các tế bào đuôi gai [28,44] dẫn đến sự biểu hiện của các phân tử điều khiển đáp ứng miễn dịch (costim ulatory m olecules) và cytokine Đây là các chất đóng vai trìí quan trọng trong việc hoạt hóa tế bío T CD 8+ Các VLP HIV [50], virus Ebola [11] và virus PPV [34] được thông báo là có thể kích thích sự thuần thục tế bào đuôi gai Q ua đây

ta thấy, hệ thống miễn dịch có nhiều cơ chế phân tử khác nhau giúp chúng có thể đáp ứng m ạnh mẽ lại các virus lây nhiễm

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thi N hư Hoa

1.3.4 C ơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của VLPs

Để tạo đáp ứng miễn dịch hiệu quả với hiệu giá kháng thể cao, các kháng nguyên đích phải bộc lộ trên bề mặt VLPs với m ật độ cao Nhờ sự tiến bộ của các ngành khoa học sinh học khác, đặc biệt là ngành sinh học cấu trúc, rất nhiều protein của virus đã được phân tích cấu trúc do đó chúng ta có được lượng thông tín rất lớn

về các protein cấu trúc của virus và từ đó có thể cải biến VLPs theo hướng xác định, tạo ra các VLPs hoạt động như những giàn trình diện kháng nguyên Phương pháp phổ biến nhất để tạo các VLPs m ang cùng m ột lúc nhiều quyết định kháng nguyên (epitopes) đó là dùng kỹ thuật gen để chèn các các gen kháng nguyên khác nhau vào VLPs R ất nhiều loại VLPs đã được cải biến để đạt mục đích trên và nhiều vaccine VLPs đã được thử nghiệm thành công trên mô hình động vật chống lại các bệnh virus như virus sốt xuất huyết (malaria) [45] và virus cúm [36] Ưu điểm của kỹ thuật lai ghép kháng nguyên này đó là khi đã chèn thành công gen kháng nguyên ngoại lai vào VLPs thì đảm bảo kháng nguyên này sẽ được biểu hiện với cấu hình tương tự với cấu hình tự nhiên của chúng và với m ật độ cao trên bề m ặt của VLPs

M ặc dù vậy cũng có những khó khăn trong việc tạo các VLPs lai (chim eric VLPs) Các peptit được chèn vào VLPs chỉ m ang lại hiệu quả khi chúng được bộc lộ trên bề

m ặt V L Ps và không cản trở quá trình gấp nếp (folding) và lắp ghép của các protein Trong rất nhiều trường hợp, để có thể chèn các kháng nguyên ngoại lai và biểu hiện được chúng trên bề m ặt VLPs người ta thường thay thế các kháng nguyên này vào đúng vị trị các epitop thiết yếu của virus mẹ Tuy nhiên chúng ta không thể dự đoán trước được liệu các peptit chèn vào này có tương thích với VLPs hay không và liệu chúng có tính sinh m iễn dịch không M ột hạn chế khác của kỹ thuật tạo VLPs lai đó

là chỉ chèn được các peptit có kích thước từ 20 đến 30 axit amin hoặc ít hơn, mặc dù cũng có một số trường hợp ngoại lệ chèn được các peptit có kích thước lớn hơn [27]

V LPs còn có thể được sử dụng như các giá đỡ để gắn các hợp chất có bản chất không phải là protein nhờ phản ứng cộng hóa trị Khả năng các họp chất phi protein có thể gắn vào VLPs là nhờ các nhóm amin hoặc sulfuhydryl trên bề mặt của V LPs

Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thi N hư Hoa

Phương pháp phổ biến nhất mà các nhà nghiên cứu sử dụng đó là gắn các hợp chất này vào các axit amin lysine trên protein vỏ bộc lộ trên bề m ặt VLPs Ví

dụ, bằng việc sử dụng các cầu nối liên kết chéo lưỡng chức (bifunctional cross­linker) với “tay” hoạt động là các amin và sulfuhydryl, các peptit mang cysteine có thể được gắn vào VLP MS2 hoặc VLP Qị3 bacteriophage hoặc các hạt HbsAg [15, 25] Tương tự, các axit amin lysine bộc lộ trên bề m ặt VLPs có thể được biotin hóa

và sau đó gắn vào các kháng nguyên đích đã biotin hóa nhờ phân tử “cầu nổi” streptavidin [15, 29] Ngoài ra người ta còn có thể cải biến tạo thêm các vị trị gắn kết trên bề mặt VLPs Bằng phương pháp này người ta đã tạo ra các VLP MS2 và VLP virus cow pea m osaic chỉ chứa một axit am in cystein bộc lộ trên bề mặt [38, 52], Các VLPs m ang cystein này có thể gắn kết dễ dàng với các kháng nguyên đã biến đổi có các nhóm m aleim it hoạt hóa sulfhydryl Nói chung, kỹ thuật này được

áp dụng linh hoạt tùy vào nguồn gốc và đặc điểm của các VLPs khác nhau

Đ iều quan trong nhất là chúng ta phải xác định được các quyết định kháng nguyên quan trọng của các virus gây bệnh và biểu hiện được chúng ở cấu hình giống với cấu hình tự nhiên của chúng Ưu điểm nổi bật của việc gắn các hợp chất phi protein vào VLPs bằng phản ứng cộng hóa trị là chúng ta có thể gắn nhiều loại kháng nguyên với các kích thước khác nhau Ví dụ điển hình là người ta đã gắn thành công toàn bộ interleukin-17, m ột phân tử có khối lượng khoảng 35 kDa, lên

bề m ặt V LPs bằng phương pháp này [43] Các hợp chất có kích thước lớn hơn sẽ làm tăng khả năng tạo đáp ứng miễn dịch phổ rộng hom với các epitop mạch thẳng cũng như m ạch vòng trên phân tử đích Đây là yếu tố rất quan trọng của hệ miễn dịch trong việc nhận biết các chất gây bệnh Bởi vì hầu hết các chất gây bệnh đều trải qua sự biến đổi kháng nguyên ở m ột vài mức độ, kháng thể tạo ra chỉ bởi một epitop đơn lẻ tế bào B thường có hiệu quả thấp Phản ứng cộng hợp ngoài việc cho phép gắn các hợp chất phi protein còn cho phép gắn các hapten lên bề m ặt VLPs[41] M ột dẫn chứng gần đây nhất là vaccine cai nghiện thuốc lá phát triển bởi

C ytos Biotechnology, vaccine này được tạo ra bàng cách gắn nicotine, một dạng