Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất kháng nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens CP16 04

Đây là những loài vi khuẩn an toàn, sở hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh chất kích thích sinh trư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ

VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ

VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TRỊNH THÀNH TRUNG

TS TRẦN THỊ THANH HUYỀN

Hà Nội – 2016

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luận văn cao học này, tôi xin chân thành cảm ơn TS Trịnh Thành Trung và TS Trần Thị Thanh Huyền đã động viên, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trính học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị đang làm việc tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học nói riêng và Khoa Sinh học nói chung đã dạy dỗ tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ, hỗ trợ để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 05 năm 2016

Học viên

Nguyễn Phương Liên

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

1 Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Vi khuẩn Bacillus 3

1.1.1 Giới thiệu chung về chi vi khuẩn Bacillus 3

1.1.2 Hệ thống phân loại chi vi khuẩn Bacillus 4

1.1.3 Hệ thống phân loại Bacillus hiện đại 5

1.1.4 Phương pháp phân lập và phân loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus 7

1.2 Chất kháng sinh từ vi khuẩn Bacillus 12

1.2.1 Lipopeptide mạch vòng mang điện tích dương 13

1.2.2 Lipopeptide mạch vòng không mang điện tích dương 15

1.2.3 Lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương 17

1.3 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus 18

1.4 Mục đích nghiên cứu 19

2 Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Chủng vi sinh vật 20

2.1.2 Môi trường nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Xác định khả năng sinh chất kháng nấm và chất kháng khuẩn 22

2.2.2 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào 22

2.2.3 Xác định khả năng phân giải phosphate khó tan 23

2.2.4 Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 23

2.2.5 Dấu vân tay rep-PCR và phân tích tính tương đồng kiểu gen 23

2.2.6 Phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại 24

2.2.7 Tách chiết chất kháng nấm và kháng khuẩn 24

2.2.8 Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn 25

2.2.9 Xác định đặc tính sinh hóa lý của chất kháng nấm và kháng khuẩn 26

2.2.10 Thử nghiệm tính an toàn của chất kháng nấm và kháng khuẩn 27

3 Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Lựa chọn chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum và đánh giá các đặc tính sinh học của chủng nghiên cứu 28

3.1.1 B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam 28

3.1.2 Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn 28

3.1.3 Enzyme ngoại bào 32

3.1.4 Khả năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 33

3.2 Phân tích đa dạng kiểu gen của các chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum 34

3.2.1 Phân tích dấu vân tay rep-PCR 34

3.2.2 Phân tích trình tự đa gen 36

3.3 Tách chiết, tinh sạch và xác định bản chất sinh học của chất kháng nấm và

chất kháng khuẩn từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 39

3.3.1 So sánh hiệu quả tách chiết chất kháng nấm và chất kháng khuẩn 39

3.3.2 Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn 40

3.3.3 Xác định các tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn 41

3.4 Thử nghiệm tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn 46

3.4.1 Thử nghiệm nẩy mầm hạt 47

3.4.2 Thử nghiệm khả năng sinh trưởng của cây 47

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thông tin cơ bản của 15 chủng B amyloliquefaciens subsp

plantarum

Bảng 3.2 Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn

Bảng 3.3 Khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào

Bảng 3.4 Khả năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh

trưởng IAA

Bảng 3.5 Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn của dịch chiết thô

Bảng 3.6 Khả năng bền nhiệt của chất kháng nấm và kháng khuẩn

Bảng 3.7 Khả năng bền pH của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn

Bảng 3.8 Khả năng bền với các enzyme thủy phân

Bảng 3.9 Khả năng nẩy mầm của hạt khi xử lý với chất kháng sinh

Bảng 3.10 Khả năng sinh trưởng của cây non khi xử lý với chất kháng sinh

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại của các loài Bacillus nhóm

lớn

Hình 1.2 Kết quả phân loại vi khuẩn Bacillus trên phần mềm ApiwebTM

Hình 1.3 Cấu trúc chuỗi peptide của chất kháng sinh polymyxin

Hình 1.4 Cấu trúc chất kháng sinh iturin

Hình 1.5 Cấu trúc nhóm kháng sinh fengysin

Hình 1.6 Cấu trúc lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương ceraxin

Hình 3.1 Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu

vân tay rep - PCR sử dụng mồi ERIC

Hình 3.2 Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu

vân tay rep - PCR sử dụng mồi GTG5

Hình 3.3 Mối quan hệ giữa chủng SP 1901 và CP 1604 trên cây phát sinh chủng

loại và các loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis

Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn tinh sạch

từ dịch nuôi cấy chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IAA: Hóc môn thực vật IAA (Indole-3-Acetic Acid)

KBT: Khoảng biến thiên

MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) MS: Khối phổ (Mass Spectrometry)

NA: Thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar)

NRPSs: Enzyme sinh tổng hợp peptide không phụ thuộc ribosome

(NonRibosomal Peptide Synthetases) PCR: Phản ứng khuếch đại ADN

PDA: Thạch khoai tây (Potato Dextrose Agar)

loại hiện nay, chi Bacillus có khoảng gần 300 loài và các loài phụ dưới loài Trong

số đó, Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum (hay còn gọi là B velezensis, B methylotrophicus và B oryzicola) là một trong tám loài vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis Đây là những loài vi khuẩn an toàn, sở hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho

cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có khả năng tăng cường tính miễn dịch của cây chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi

sinh vật gây bệnh Do sở hữu các đặc tính quý, vi khuẩn B amyloliquefaciens subsp plantarum được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ từ

giải mã hệ genome đến nghiên cứu các chất trao đổi, nghiên cứu phân loại, nghiên

cứu ứng dụng trong nhà kính và ngoài thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens subsp plantarum đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có lợi

và ứng dụng trong đấu tranh sinh học để phòng ngừa các loại dịch bệnh hại cây

trồng Một số chủng như B amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 cũng đã

được sản xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học và chế phẩm phòng

trừ bệnh cây Nhiều báo cáo đã công bố hiệu quả sử dụng các chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum trong phòng trừ và làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh

cũng như mức độ nhiễm bệnh của cây do vi khuẩn và nấm gây bệnh cây gây ra Sản

lượng nông sản thu hoạch cũng tăng lên đáng kể khi bổ sung chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 vào phân bón

B amyloliquefaciens subsp plantarum sản sinh ra nhiều loại chất trao đổi

bậc hai có hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây Các chất trao đổi

đó bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore và protein kháng khuẩn

Đa số các chất này được tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally synthesized

peptide) nhờ sự có mặt của nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) Nhiều chất trong số này đã được nghiên cứu tỉ mỉ về cấu trúc hóa học, đặc tính sinh học cũng như tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và y - dược học

Nhằm tìm kiếm, đánh giá và lựa chọn các chủng vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp xanh và bền vững, trong luận văn này, chúng tôi

trọng tâm nghiên cứu các đặc tính có lợi cho cây trồng từ các chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens subsp plantarum có trong bộ sưu tầm vi khuẩn Bacillus thu thập

tại các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam Bên cạnh việc tìm hiểu các điều kiện nuôi cấy thích hợp, chúng tôi còn tiến hành tách chiết, tinh sạch và xác định đặc tính sinh học cũng như tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn sinh ra

từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604

1 Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Vi khuẩn Bacillus

1.1.1 Giới thiệu chung về chi vi khuẩn Bacillus

Định nghĩa khái quát

Bacillus là nhóm vi khuẩn khá quen thuộc, hay được nhắc đến trong các tài liệu vi sinh vật học Trước kia, Bacillus được biết đến như những vi khuẩn hình

que, bắt màu thuốc nhuộm Gram (+), sinh nội bào tử, sống hiếu khí hoặc kỵ khí

không bắt buộc Tuy nhiên, khái niệm đó giờ đây bao quát cho cả Bacillus nhóm lớn (Bacillus sensu lato) gồm ít nhất 37 chi thuộc 3 họ Bacillaceae, Paenibacillaceae

và Alicyclobacillaceae Chi Bacillus chỉ là một chi trong Bacillus nhóm lớn và thường được gọi là Bacillus nhóm nhỏ (Bacillus sensu stricto)

Môi trường phân bố

Vi khuẩn Bacillus phân bố ở mọi nơi trong sinh quyển Chúng ta có thể bắt

gặp các loài vi khuẩn này trong bất kỳ công bố nào về đa dạng vi sinh vật ở các khu

hệ sinh thái, từ trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn, từ vùng ven bờ

đến đáy các Đại Dương [14, 48] Trong các hệ sinh thái trên cạn, vi khuẩn Bacillus

có thể phân bố ở các vùng đất chua, đất kiềm hay đất trung tính Một số loài có thể tìm thấy trong các loại đất nhiễm kim loại nặng hay nhiễm asen Một số loài có khả

năng sống ký sinh và gây bệnh cho người, động vật và côn trùng như B cereus, B anthracis và B thuringiensis Một số loài là vi sinh vật vùng rễ hay sống cộng sinh

trong rễ của một số loại thực vật Gần đây, một số loài vi khuẩn mới thuộc chi

Bacillus còn được tìm thấy ở độ cao từ 24 đến 41 km trong tầng bình lưu của khí

quyển [44]

Các đặc điểm phân loại đặc trưng của chi Bacillus

Bacillus là vi khuẩn hình que, bắt màu thuốc nhuộm Gram (+), sinh nội bào

tử, có thể di động bằng tiêm mao, đa số sống hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc

Tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ, xếp đôi hay nối với nhau tạo thành các chuỗi dài

Hầu hết các loài vi khuẩn Bacillus có thể sinh sống trên môi trường thạch dinh

dưỡng (nutrient agar; NA) hay thạch máu (blood agar) Hình thái và kích thước khuẩn lạc rất khác nhau giữa các loài khác nhau hay thậm chí giữa các chủng khác

nhau trong cùng một loài Bacillus có phản ứng catalase dương tính nhưng phản

ứng oxydase khác nhau giữa các loài khác nhau

1.1.2 Hệ thống phân loại chi vi khuẩn Bacillus

Lược sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn Bacillus

Bacillus là một trong những vi khuẩn đầu tiên được con người biết đến sau

phát minh về kính hiển vi của Anton van Leeuwenhoek Các sự kiện nghiên cứu về

vi khuẩn Bacillus bắt đầu từ năm 1835 khi Ehrenberg mô tả và đặt tên một loài vi khuẩn là Vibrio subtilis [14] Đến năm 1872, Ferdinand Cohn lần đầu tiên phát hiện

loài vi khuẩn mà Ehrenberg đã mô tả có khả năng sinh nội bào tử để chống chịu lại các điều kiện khắc nghiệt của môi trường sống Ông đặt lại tên cho loài vi khuẩn

này là Bacillus subtilis Trong cùng khoảng thời gian này, Robert Kock cũng phân lập và mô tả tác nhân gây bệnh than là Bacillus anthracis Ông cũng quan sát thấy

loài vi khuẩn này có khả năng sinh nội bào tử như loài Cohn đã mô tả Kock đã mô

tả chu trình hình thành nội bào tử từ các tế bào dinh dưỡng tới bào tử và ngược lại [14, 18] Đó là những mốc thời gian quan trọng bắt đầu đánh dấu tiến trình phân lập

và phân loại các loài vi khuẩn Bacillus

Sau gần một thế kỷ, rất nhiều các chủng vi khuẩn sống hiếu khí và sinh nội bào tử đã được phát hiện và phân loại Tuy nhiên, dựa vào các phương pháp phân loại cổ điển như hình thái tế bào mang bào tử (phình ra khi mang bào tử hoặc ngược lại), vị trí bào tử trong tế bào mang bào tử (ở giữa hay ở phía đầu tế bào), hình thái bào tử (hình cầu, hình elip, hay hình trụ), các đặc tính sinh hóa (khả năng đồng hóa các nguồn cacbon hay sản sinh enzyme như catalase, amylase…vv) sinh lý (nhiệt

độ và pH tối ưu cho sinh trưởng), số lượng các loài Bacillus được mô tả chỉ nằm

trong con số khoảng 30 loài [18]

Đến những thập niên 80 của thế kỷ 20, khi phương pháp phân tích trình tự gien mã hóa riboxôm 16S được ứng dụng vào phân loại vi khuẩn thì số lượng các

loài Bacillus bắt đầu tăng lên đáng kể Thời điểm này cũng bắt đầu đánh dấu sự đổi hoàn toàn hệ thống phân loại vi khuẩn Bacillus [18] Năm 1991, Ash cùng cộng sự

đã xây dựng cây phát sinh chủng loại của 51 loài vi khuẩn Bacillus dựa trên trình tự

đoạn gene 16S rDNA và kết luận rằng có ít nhất 5 nhóm vi khuẩn khác nhau trong

chi Bacillus (kí hiệu từ nhóm 1 đến nhóm 5) [3] Ông đề xuất rằng 5 nhóm này có thể là 5 chi khác nhau trong Bacillus nhóm lớn (Bacillus sensu lato) Loài B subtilis

mà Cohn đã mô tả năm 1872 được xếp vào nhóm 1 cùng với các loài thường gặp

khác là B licheniformis, B amyloliquefacien, B megaterium, B cereus, B anthracis, B thuringiensis Đây là nhóm có ít thay đổi nhất trong hệ thống phân loại

và đến nay vẫn được xếp vào chi Bacillus hay còn được gọi là Bacillus nhóm nhỏ (Bacillus sensu stricto) Đến năm 2002, các loài trong nhóm 3 được chuyển sang chi mới là Paenibacillus, các loài trong nhóm 4 được chuyển sang chi mới là Brevibacillus Một số các loài khác trong Bacillus nhóm lớn này được chuyển sang các chi khác như Alicyclobacillus, Halobacillus, Gracilibacillus và Virgibacillus

[48]

1.1.3 Hệ thống phân loại Bacillus hiện đại

Đến những năm đầu thế kỷ 21, với sự gia tăng số lượng nghiên cứu đa dạng

vi sinh vật trong các vùng sinh thái đặc biệt, số lượng các loài vi khuẩn trong nhóm

Bacillus lớn tăng lên đáng kể Khoảng thời gian từ năm 2004 đến 2006, trung bình mỗi tuần có một loài mới thuộc Bacillus nhóm lớn được mô tả trên các tạp chí phân

loại chuyên ngành [18] Sự gia tăng đột biến về số lượng loài cũng dẫn đến sự thay đổi nhanh chóng hệ thống phân loại của nhóm vi khuẩn này Đến nay, có khoảng

37 chi mới trong Bacillus nhóm lớn (Bacillus sensu lato) Các chi này được nhóm

vào 3 họ: Bacillaceae, Paenibacillaceae, Alicyclobacillaceae (Hình 1.1.) cùng với 7

họ khác (như Thermoactinomycetaceae, Staphylococcaceae, Pasteuriacea) tạo nên

bộ Bacillales [18]

Hình 1.1 Mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại của các loài Bacillus nhóm

lớn Cây được thiết lập dựa trên trình tự gen 16S rRNA

Trong Bacillus nhóm lớn, Bacillus là chi có số lượng loài nhiều nhất Đến nay, có khoảng 150 loài vi khuẩn Bacillus đã được mô tả Loài chuẩn của chi vẫn là

B subtilis mà Cohn đã mô tả năm 1872 Có 2 nhóm quan trọng nhất trong chi Bacillus là nhóm B subtilis và nhóm B cereus Nhóm B subtilis có khoảng 10 loài

và các loài phụ có quan hệ gần gũi với nhau và có nhiều loài như B subtilis, B licheniformis và B amyloliquefaciens được ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm thương mại trên quy mô công nghiệp B subtilis gồm 3 loài phụ dưới loài là B subtilis subsp subtilis, B subtilis subsp spizizenii và B subtilis subsp inaquosorum Nhóm B cereus gồm 6 loài có quan hệ gần gũi với nhau Trong chi

Bacillus, nhóm B cereus là nhóm có khả năng gây bệnh cho người, động vật và côn trùng B anthracis là tác nhân nguy hiểm gây bệnh than trên người và động vật; vi

khuẩn này được trung tâm kiểm soát và phòng trừ dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) liệt vào bảng A trong danh sách các loài vi sinh vật nguy hiểm có thể dùng làm vũ khí sinh học (http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp) B cereus là tác nhân gây bệnh tiêu chảy trên người Nội độc tố của B thuringinensis có thể gây chết một

số loài côn trùng

1.1.4 Phương pháp phân lập và phân loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus

Phương pháp phân lập

Chi Bacillus là một nhóm vi khuẩn đa dạng về thành phần loài cũng như các

đặc tính sinh lý và sinh hóa (như ưa nhiệt hay khả năng sống ở các giải nhiệt độ khác nhau, ưa hay khả năng chịu pH axít hay bazơ, ưa hay khả năng chịu muối) Vì vậy, tùy vào mục đích nghiên cứu khác nhau mà chúng ta áp dụng các quy trình phân lập khác nhau để tìm kiếm các loài mong muốn Chi tiết quy trình phân lập

cho từng loài được viết chi tiết trong các cuốn sách Bergey’s manual of systematic bacteriology và The prokaryotes Tuy nhiên, Bacillus là những loài vi khuẩn sinh

nội bào tử và nội bào tử có khả năng chịu nhiệt, khô và một số loại dung môi hữu cơ nên người ta thường có các bước xử lý mẫu trước khi tiến hành phân lập

Phương pháp xử lý mẫu thông dụng nhất hiện nay là phương pháp nhiệt hóa Dịch chiết vi khuẩn từ các mẫu đất, mùn, bùn hay trầm tích lắng đọng được xử lý nhiệt ở 80oC trong 10 phút trước khi cấy gạt lên các môi trường nuôi cấy thông dụng như môi trường NA hoặc môi trường TSA Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, vi khuẩn mọc trên môi trường nuôi cấy được tinh sạch, lưu giữ và bảo quản trên các ống môi trường thạch nghiêng, đông khô, lạnh sâu hay nitơ lỏng

Phương pháp phân loại các loài thuộc chi Bacillus

Quan sát hình thái khuẩn lạc

Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus rất đa dạng và phong phú giữa các

loài khác nhau hay thậm chí giữa các chủng khác nhau trên cùng một loài [48] Một

số chủng còn tạo nên nhiều kiểu hình thái khuẩn lạc khác nhau trên cùng một đĩa nuôi cấy hay thậm chí có các kiểu hình thái khuẩn lạc khác nhau giữa các lần nuôi cấy khác nhau, giữa các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau và giữa các môi trường nuôi cấy khác nhau Tuy nhiên, nếu có nhiều kinh nghiệm làm việc trên nhóm vi khuẩn

này thì lại rất dễ dàng phân biệt được khuẩn lạc của các loài vi khuẩn Bacillus với

khuẩn lạc của các loài thuộc các nhóm vi sinh khác, đặc biệt là những kiểu khuẩn

lạc quen thuộc của các loài trong 2 nhóm B subtilis và B cereus Bề mặt khuẩn lạc của các loài trong nhóm B subtilis nhăn nheo và hơi khô; kích thước khuẩn lạc khoảng 2 - 4 mm Trong khi đó, bề mặt khuẩn lạc của các loài trong nhóm B cereus

phẳng, có cấu trúc lăn tăn dạng hạt; khuẩn lạc dẹt, phát triển lan trên mặt thạch tạo cho kích thước khuẩn lạc lớn (2 - 7 mm) sau 2 ngày nuôi cấy

Phương pháp nhuộm soi

Dựa vào các hình thái khuẩn lạc ta có thể đánh giá sơ bộ chủng cần nghiên

cứu thuộc nhóm B subtilis hay B cereus Tuy nhiên, nếu chúng ta tiến hành soi các

loài này dưới kính hiển vi với vật kính dầu thì chúng ta có thể có những bằng chứng

để bước đầu kết luận chủng đó thuộc nhóm nào Tế bào nhóm vi khuẩn B subtilis

kích thước khoảng 0,7 - 0,8 × 2,0 - 3,0 µm, đầu tế bào tròn, đứng riêng rẽ, xếp

thành đôi hay thành các chuỗi ngắn trong khi đó tế bào nhóm vi khuẩn B cereus có

kích thước 1,0 - 1,2 × 3,0 - 5,0 µm, đầu tế bào vuông, xếp thành chuỗi dài Hơn

nữa, khi nhuộm soi tế bào ta có thể dễ dàng phân biệt được B cereus và B thuringiensis do sự xuất hiện của tinh thể độc ở B thuringiensis Tuy nhiên, tính chất này cũng chỉ tương đối vì nhiều chủng B thuringiensis thuộc các tuýp kháng

huyết thanh khác nhau cũng không sinh tinh thể độc trong điều kiện nuôi cấy thông

thường [33]

Phương pháp nhuộm Gram

Đây là phương pháp nhuộm soi đầu tiên bắt đầu định hướng phân loại các

loài vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Bacillus nói riêng Đầu tiên, vi khuẩn được cố

định trên lam kính và được nhuộm với dung dịch tím kết tinh (2 g tím kết tinh, 20

ml cồn 95o, 0,8 g ammonium oxalate và 100 ml nước cất) trong 1 phút Sau đó, mầu nhuộm tím kết tinh trong tế bào được cố định với dung dịch iốt (2 g KI, 1 g I2 và

100 ml nước cất) Sau khi tẩy bằng cồn 95o

, tế bào được nhuộm với dung dịch safranin (0,4 g safranin O, 20 ml cồn 95o và 80 ml nước cất) Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím của thuốc nhuộm tím kết tinh, vi khuẩn Gram (-) bắt mầu hồng của thuốc nhuộm safranin Ngoài phương pháp nhuộm Gram thì còn có một phương pháp thường dùng khác để phân biệt chủng vi khuẩn nghiên cứu thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) hay (-) là phương pháp KOH Theo phương pháp này, một lượng tế bào vi khuẩn cần nghiên cứu (khoảng một vòng que cấy) được hòa đều vào một giọt KOH 3% trên lam kính sạch Sau 1 phút, dùng que cấy kéo nhẹ dịch tế bào lên để kiểm tra

độ nhớt Nếu dung dịch tạo thành có xuất hiện nhớt thì chủng vi khuẩn nghiên cứu thuộc nhóm vi khuẩn Gram (-) và ngược lại Nhớt xuất hiện trong dung dịch là do tế bào vi khuẩn Gram âm bị phá vỡ trong môi trường kiềm của KOH, dẫn đến sự giải phóng ADN vào trong dung dịch [38]

Trong quá trình nhuộm Gram, một số loài vi khuẩn Bacillus thường bắt mầu

thuốc nhuộm tím kết tinh không rõ ràng Hơn nữa, nhuộm soi tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau cũng có thể cho kết quả nhuộm Gram khác nhau Tế bào thường bắt màu nhuộm Gram (+) khi tế bào còn non và Gram (-) sau vài ngày nuôi cấy Vì vậy,

để tiến hành nhuộm Gram trên các vi khuẩn Bacillus, chúng ta nên nhuộm tại các

thời điểm nuôi cấy khác nhau Thời điểm tế bào còn non (tức khoảng 16 giờ nuôi cấy trên các điều kiện nuôi thích hợp) sẽ phản ánh đúng tính chất bắt màu thuốc nhuộm cũng như hình dạng tế bào, kiểu liên kết giữa các tế bào (đứng riêng rẽ, kết đôi hay tạo thành chuỗi) Thời điểm tế bào già (tức khoảng 48 giờ sau nuôi cấy trên), các cấu trúc xếp đôi hay xếp chuỗi bị phá hủy, tính chất bắt màu thay đổi và tế bào thường bắt màu Gram (-) Giai đoạn này chúng ta thường nhìn thấy các cấu trúc

tế bào đã bị phá vỡ và nội bào tử được giải phóng ra bên ngoài Hơn nữa, chúng ta

có thể quan sát được hình dạng tinh thể độc giải phóng ra từ các tế bào B thuringiensis

Phương pháp nhuộm bào tử

Đây là phương pháp nhuộm nhằm xác định hình dáng, kích thước nội bào tử

của vi khuẩn Bacillus Hơn nữa, chúng ta cũng quan sát được vị trí hình thành bào

tử trong tế bào mang bào tử Theo phương pháp này, vi khuẩn được cố định trên lam kính và được nhuộm với dung dịch xanh malachite (0,5 g malachite green pha trong 100 ml nước cất) trên dòng hơi nước nóng trong khoảng 8 phút Sau khi rửa dưới vòi nước, tế bào được nhuộm với dung dịch safranin (2,5 g safranin O pha trong 100 ml cồn 95%) trong 1 phút Dưới vật kính soi dầu, nội bào tử của vi khuẩn bắt mầu xanh của thuốc nhuộm xanh malachite; tế bào vi khuẩn bắt mầu hồng của

thuốc nhuộm safranin [38]

Để có một hình ảnh nhuộm soi nội bào tử đẹp thì việc xác định thời điểm tế bào sinh nội bào tử rất quan trọng Nếu nhuộm khi tế bào còn quá non thì sẽ không quan sát được nội bào tử; nếu nhuộm khi tế bào quá già thì đa số nội bào tử đã được giải phóng ra bên ngoài tế bào Chính vì vậy, chúng ta cần tiến hành phương pháp nhuộm soi nội bào tử ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau như nhuộm soi sau 16, 20,

24, 28 và 32 giờ nuôi cấy

Phương pháp phân loại dựa trên các đặc tính sinh hóa API

Sản sinh các loại enzyme trong quá trình trao đổi chất hay khả năng đồng hóa các nguồn cacbon khác nhau là những đặc tính sinh hóa quan trọng trong phân loại vi sinh vật Năm 1970, hãng Biomerieux (Pháp) đã phát triển các loại thanh thử (strip test) đơn giản để kiểm tra các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật Từ kết quả sinh hóa thu được giữa các nhóm vi sinh vật dưới dạng chữ, dữ liệu được chuyển hóa sang dạng số và các số đó được sử dụng để mã hóa cho từng nhóm vi sinh vật khác nhau Vì vậy, mỗi nhóm vi sinh vật có các mã số phân loại đặc trưng hay còn gọi là API (Anatical Profile Index) Năm 1984, Logan và Berkeley đầu tiên ứng

dụng hệ thống API vào phân loại các loài vi khuẩn Bacillus Phương pháp này cần

dùng thanh thử API 50 CH (mã hàng 50300) và API 50 CHB/E medium (mã hàng

50430) để xác định khả năng sinh axit từ 49 nguồn cacbon khác nhau; thanh thử

API 20 E (mã hàng 20100) để xác định khả năng sinh các loại enzyme khác nhau

Kết quả của các phản ứng thử dưới dạng +/- được nạp vào phần mềm ApiwebTM

Phần mềm sẽ tự động phân tích kết quả sinh hóa của chủng nghiên cứu với kết quả

sinh hóa của các loài hay chủng có trong cơ sở dữ liệu (database) và cho ra kết quả

phân loại như Hình 1 2

Hình 1.2 Kết quả phân loại vi khuẩn Bacillus trên phần mềm ApiwebTM Bốn

thông tin chính để kết luận về kết quả phân loại được ký hiệu là i, ii, iii và iv

Có 4 thông tin chính khi phân tích kết quả phân loại API: (i) “significant

taxa” hiển thị kết quả phân loại của chủng nghiên cứu với đơn vị phân loại là nhóm

loài, loài hay dưới loài, (ii) “% ID” hiển thị độ tương đồng sinh hóa của chủng

nghiên cứu với đơn vị phân loại hiển thị tại thông tin “significant taxa”, (iii) “T”

hiển thị mức độ tương đồng sinh hóa của chủng nghiên cứu với kết quả sinh hóa

hay gặp nhiều nhất trong đơn vị phân loại hiển thị tại thông tin “significant taxa”,

giá trị T càng tiến đến 1 thì tương đồng sinh hóa càng cao, và (iv) kết luận phân loại

cuối cùng, kết luận này được đưa ra dựa trên các chỉ số sau:

 “Excellent identification” kết quả phân loại chính xác: % ID ≥ 99,9% và T ≥ 0,75

 “Very good identification” kết quả phân loại rất tốt: % ID ≥ 99,9% và T ≥ 0,50

iv

 “Good identification” kết quả phân loại tốt: % ID ≥ 90,0% và T ≥ 0,25

 “Acceptable identification” kết quả phân loại chấp nhận được: % ID ≥ 80,0% và

T ≥ 0

Phương pháp phân loại dựa trên kỹ thuật giải trình tự DNA

Năm 1991, Ash cùng cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật giải trình tự đoạn 16S

rDNA vào phân loại các loài Bacillus [3] Theo phương pháp này, DNA được tách

chiết từ tế bào vi khuẩn và đoạn 16S rDNA được khuếch đại sử dụng cặp mồi 27F

(5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-Tuy nhiên, trình tự đoạn 16S rDNA nhiều khi không thể phân tách các loài,

đặc biệt là các loài trong nhóm B subtilis và B cereus Nhiều gene khác như gyrA, rpoB, purH, polC và groEL đang được sử dụng để phân loại các loài Bacillus [40]

Gần đây, nhiều nghiên cứu đã tiến hành rà soát và nghiên cứu lại hệ thống phân loại

các loài B subtilis dựa trên so sánh toàn bộ hệ genome của các chủng đã được giải

mã Qua đó, nhiều quan điểm về phân loại cũng như kết quả phân loại đã được thay đổi [13]

1.2 Chất kháng sinh từ vi khuẩn Bacillus

Thực tế, chất kháng sinh từ Bacillus đã được phát hiện và công bố sau khi Alexander Fleming phát hiện ra penicillin từ nấm sợi Penicillium notatum [26] Tuy

nhiên, tại thời điểm đó có rất nhiều chất kháng sinh mới từ xạ khuẩn có hiệu quả cao và an toàn trong điều trị lâm sàng được phát hiện và công bố nên chất kháng

sinh từ vi khuẩn Bacillus chưa thực sự được quan tâm nhiều [36] Tuy nhiên, một số

chất kháng sinh từ Bacillus đã được sử dụng trong lâm sàng để điều trị các bệnh truyền nhiễm như gramicidin (từ Brebacillus brevis), bacitracin (từ nhóm Bacillus subtilis) và polymyxin (từ Paenibacillus polymyxa) Bên cạnh một số chất có hoạt

tính kháng khuẩn có cấu trúc giống bacteriocin, phần lớn các chất kháng sinh sản

sinh từ Bacillus thường là các lipopeptide [1, 34] Nhiều chất gần đây đã được phát

hiện và được chứng minh là các ứng cử viên tiềm năng cho phát triển các loại kháng sinh mới trong lâm sàng để điều trị các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn kháng thuốc gây ra Các chất này bao gồm polymyxin, octapeptin, polypeptin, iturin, surfactin, fengycin, fusaricidin, tridecaptin hay kurstakin Chất kháng sinh lipopeptide có phổ hoạt tính rộng có khả năng kháng nấm, vi khuẩn, virus và tế bào ung thư [11]

Lipopeptide là các peptide mạch thẳng hoặc mạch vòng liên kết với mạch acid béo tại vị trí đầu N của peptide Đây là các chất trao đổi chất bậc hai được sản sinh từ các enzyme sinh tổng hợp peptide không phụ thuộc ribosome (nonribosomal peptide synthetases; NRPSs) [34] Chuỗi peptide trong lipopeptide chứa hỗn hợp các amino acid dạng D và dạng L, qua đó giúp cho chất kháng sinh bền với các protease thủy phân Phần đầu N của lipopeptide thường được acylated với mạch acid béo chứa nhóm β - hydroxyl Dựa vào cấu trúc hóa học, các loại lipopeptide từ

vi khuẩn Bacillus được chia ra thành 3 lớp chính sau đây:

1.2.1 Lipopeptide mạch vòng mang điện tích dương

Hầu hết các lipopeptide sản sinh từ vi khuẩn Bacillus và Paenibacillus được

xếp trong lớp này Phần peptide được vòng hóa tại đầu C bởi liên kết este hoặc liên kết amide và phần lipid được gắn vào đầu N của amino acid nhờ quá trình acylate hóa bởi enzyme NRPS Điện tích dương của phân tử lipopeptide được tạo ra nhờ sự

có mặt của amino acid 2,4 - diaminobutyric acid (Dab) [11] Dựa vào cấu trúc, lớp này được chia ra thành các nhóm sau đây:

Polymyxin

Polymyxin là một trong những lipopeptide đầu tiên được phát hiện từ

Bacillus (nay là Paenibacillus polymyxa) vào năm 1947 [36] Cho đến nay, nhiều

loại polymyxin đã được phát hiện như polymyxin A, B, E (colistin) và M (mattacin) Cấu trúc tự nhiên chung của phần peptide trong phân tử polymyxin là chuỗi chứa 10 amino acid, có từ 5 đến 6 phân tử Dab và đóng vòng ở vị trí Dab 4 Các phân tử Dab tạo cho polymyxin có chứa nhiều điện tích dương Polymyxin có tính kháng mạnh vi khuẩn Gram âm do tương tác với lipiA của lipopolysacchride, quá đó phá hủy màng tế bào Polymyxin gây độc tính với tế bào thần kinh và thận Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy polymyxin không độc như đã từng công bố Vì vậy, cơ quan thực phẩm và dược phẩm Mỹ gần đây đã cấp phép sử dụng một số loại polymyxin trong điều trị bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Gram âm

đa kháng thuốc gây nên như Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, và Klebsiella pneuomoniae [11]

Hình 1.3 Cấu trúc chuỗi peptide của chất kháng sinh polymyxin

Octapeptin

Octapeptin là một dạng giống polymyxin nhưng có chuỗi peptide ngắn hơn (chứa 8 amino acid) Chuỗi peptide của hai loại kháng sinh này đều khép vòng tạo nên vòng có 7 phân tử amino acid Octapeptin A và B có hoạt tính kháng nấm sợi, nấm men và động vật nguyên sinh Gần đây, octapeptin B5 (battacin) phát hiện từ

loài P tianmuensis được chứng minh có khả năng kháng vi khuẩn Gram âm toàn

kháng thuốc như P aeruginosa và E coli Battacin có độc tính nhỏ hơn gấp 3 lần

so với polymyxin B nên đây được xem là chất kháng sinh tiềm năng có thể ứng dụng trong lâm sàng

Polypeptin

Đây là nhóm có 2 loại kháng sinh với tên gọi là polypeptin và pelgipeptin Phần peptide chứa 9 amino acid trong kháng sinh này được khép vòng hoàn toàn Đây là kháng sinh có phổ rộng, kháng cả vi khuẩn Gram âm, Gram dương và một

số loại vi khuẩn kỵ khí [11] Pelgipeptin A và B cũng có khả năng kháng một số

loại nấm gây bệnh hại cây như Fusarium graminearum và Rhizoctonia solani

1.2.2 Lipopeptide mạch vòng không mang điện tích dương

Phần lớn các lipopeptide còn lại sản sinh từ vi khuẩn Bacillus được xếp vào

lớp này Chúng bao gồm các nhóm kháng sinh chính sau đây:

Surfactin và lichenysin

Giống như iturin, surfactin và lichenysin có chuỗi peptide 7 amino acid khép vòng hoàn toàn bằng liên kết este thay vì liên kết amide ở iturin Hơn nữa, thành phần amino acid của kháng sinh nhóm này khác hoàn toàn với kháng sinh nhóm iturin và cấu hình amino acid là LDLLDL Surfactin khác với lichenysin ở vị trí amino acid số 1 là Glu thay vì Gln Đây là chất kháng sinh có hoạt tính bề mặt

mạnh, tấn công tế bào đích thông qua cơ chế phá hủy màng tế bào Khi có mặt ở nồng độ cao, chất kháng sinh này hoạt động như một chất tẩy rửa; khi ở nồng độ thấp, chúng tạo nên các lỗ trên màng tế bào, làm thoát vật chất và làm chết tế bào [11] Surfactin có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ký sinh trùng và kháng viêm Tuy nhiên, chất kháng sinh này có hoạt tính dung giải máu cao nên đã hạn chế việc ứng dụng của chất này vào thực tế

Hình 1.4 Cấu trúc chất kháng sinh iturin

Fengycin

Nhóm này bao gồm fengysin và plipastatin Đây là nhóm có 10 amino acid trong thành phần chuỗi peptide được vòng hóa giữa phân tử phenol của Tyr 3 với đầu C (Hình 1.5) Đây là nhóm lipopeptide có hoạt tính kháng nấm mạnh, đặc biệt

là các loại nấm sợi Ngoài ra, nhóm kháng sinh này có khả năng kìm hãm sự tăng

sinh của các tế bào ung thư phổi dòng 95D in vitro và in vivo [11] Fengycin có độc

tính tế bào thấp hơn 40 lần so với surfactin

Fusaricidin

Fusaricidin có chuỗi peptide gồm 7 amino acid, vòng hóa bằng liên kết este giữa L-Tyr1 và D-Ala ở đầu C Phần đầu N được acylate hóa với phân tử 15-guanidino-3-hydroxypentadecanoic acid của acid béo Fusaricidin có hoạt tính

kháng vi khuẩn Gram dương, nấm Fusarium và Aspergillus nhưng có hoạt tính

kháng yếu với vi khuẩn Gram âm [11] Một số nghiên cứu gần đây cho thấy,

fusaricidin có hiệu quả trong phòng trừ nấm Fusarium hại dưa hấu, nấm Leptosphaeria maculans hại cây cải dầu và nấm Phytophthora gây hại cây hồ tiêu

đỏ

Hình 1.5 Cấu trúc nhóm kháng sinh fengysin

1.2.3 Lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương

Lớp lipopeptide cuối cùng của vi khuẩn Bacillus là lớp mạch thẳng mang

điện tích dương Rất ít các nghiên cứu tiến hành trên lớp kháng sinh này mặc dù những kháng sinh này có thể dễ dàng tổng hợp hơn vì không có cấu trúc dạng vòng Saltavalin và jolipeptin thuộc lớp này, chúng thường được gọi là những kháng sinh lipopeptide mang điện tích dương mặc dù cấu trúc hóa học chưa xác định Một

nhóm kháng sinh khác trong lớp này là cerexin sản sinh từ B cereus 60-6 và Gp-3

Cerexin có chuỗi peptide gồm 10 amino acid dạng L hoặc D, acylate hóa với nhóm β-hydroxyl của đuôi acid béo Cerexin có hoạt tính kháng lại vi khuẩn Gram dương

bao gồm Staphylococcus aureus và Streptococcus pneumoniae Tridecaptin sản sinh

từ P polymyxa cũng đã được công bố Đây là những kháng sinh có hoạt tính kháng

vi khuẩn Gram âm mạnh nhưng kháng Gram dương yếu

Hình 1.6 Cấu trúc lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương ceraxin

1.3 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus

Bacillus có rất nhiều ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm thương mại trên

quy mô công nghiệp Khoảng 50% enzyme đang bán trên thị trường có nguồn gốc

từ Bacillus [18] Các enzyme có nguồn gốc từ Bacillus sở hữu nhiều đặc tính quý

như khả năng chịu nhiệt, chịu pH kiềm hay axít nên được sử dụng nhiều trong các ngành công nghiệp như trong các quá trình thủy phân tinh bột và chế biến thực phẩm (α-acetolactate, α-amylase, β-galatosidase, glutaminase, xylanase), trong công nghiệp dệt may (β-amylase, protease ưa kiềm) và trong nghiên cứu và sản xuất các loại dược phẩm (β-lactamase, penicillin acylase, cyclodextrin glucanotransferase)

Trong công nghệ tái tổ hợp ADN, giống như E coli và S cerevisiae, B subtilis được sử dụng như là các chủng cải biến gien để tạo ra các chủng năng suất

cao cho sản xuất các sản phẩm thương mại trên quy mô công nghiệp

Bacillus còn được dùng để sản xuất một số tiền chất của vitamin như

(riboflavin); các polyme sinh học như polyhydroxybutyrate, poly-γ-glutamic acid; streptovidin ứng dụng trong công nghệ microarrays

Trong nông nghiệp, B thuringinensis, B sphaericus được dùng để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học diệt trừ các loài sâu bệnh hại cây trồng Một số loài Bacillus

khác có khả năng sinh các hóc môn sinh trưởng thực vật, các chất kháng sinh, các enzyme như phytases để kích thích sự phát triển của thực vật [18, 28]

Trong chăn nuôi, một số loài như B subtilis, B megaterium và B licheniformis được sử dụng làm chế phẩm probitotic

1.4 Mục đích nghiên cứu

Trong số các loài Bacillus đã được ứng dụng trong các lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp và y dược học, B amyloliquefaciens subsp plantarum là những loài sở

hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm

và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có khả năng tăng cường tính miễn dịch của cây chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi sinh vật gây bệnh Chính vì vậy, nhiều

chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum đã được ứng dụng trong đấu tranh

sinh học hoặc bổ sung vào các loại phân bón hữu cơ sinh học Nhằm tìm kiếm các chủng vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp xanh và bền vững, luận văn này trọng tâm nghiên cứu 4 vấn đề chính sau:

(i) Đánh giá đặc tính có lợi cho cây trồng của các chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam (ii) Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum

(iii) Nuôi cấy, tách chiết, tinh sạch và xác định đặc tính sinh học chất kháng nấm

và chất kháng khuẩn sinh ra từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum

CP 1604

(iv) Thử nghiệm tính an toàn của của chất có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn

từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604

2 Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi sinh vật

Từ bộ vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào tử phân lập tại 4 vườn Quốc gia Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin và Côn Đảo, chúng tôi tiến hành so sánh tính tương đồng cao nhất của đoạn gen 16S rRNA so với các chủng chuẩn của các loài trong cơ sở dữ liệu Eztaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/) Dựa trên số liệu so sánh, chúng tôi lựa chọn các chủng có trình tự gen 16S rRNA tương đồng cao nhất

với các loài B velezensis, B amyloliquefaciens subsp plantarum, B methylotrophicus và B oryzicola Từ ống lưu giữ lạnh sâu ở -70oC, các chủng vi khuẩn lựa chọn được ria hoạt hóa trên môi trường thạch NA và được nuôi cấy ở

30oC Sau 24 giờ, tế bào hoạt hóa thu được sẽ dùng cho các thử nghiệm mô tả ở phần dưới

Bên cạnh đó, chúng tôi cũng sử dụng các chủng vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh thực vật đang lưu giữ tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Các chủng đó bao gồm nấm

Fusarium oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani và Phytophthora capsici; vi khuẩn Xanthomonas oryzae Ngoài ra, chúng tôi cũng sử dụng một số loài nấm kiểm định khác nữa là Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Saccharomyces cerevisiae

2.1.2 Môi trường nghiên cứu

Trong quá trình thực hiện luận văn, chúng tôi đã sử dụng các môi trường nuôi cấy chính sau đây:

 Môi trường thạch NA (Becton, Dickinson and Company, Pháp; g/L)

 Môi trường dịch thể TSB (Becton, Dickinson and Company, Pháp; g/L)

Đậu tương thủy phân 5 g

NaCl 0,2 g

MnSO4 H2O 0,002 g FeSO4 7H2O 0,002 g Hòa lần lượt các khoáng chất vào 1000 ml nước cất Chia đều 100 ml vào bình tam giác 250 ml Hấp vô trùng môi trường ở 121oC trong 21 phút

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định khả năng sinh chất kháng nấm và chất kháng khuẩn

Từ các tế bào đã hoạt hóa, các chủng vi khuẩn được cấy trải đều trên mặt thạch TSBA (Becton, Dickinson and Company, Pháp) và được ủ ở 30oC Sau 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn sinh trưởng trên bề mặt thạch sẽ tiết các chất có hoạt tính sinh học vào trong môi trường thạch Hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán thạch Theo đó, khoanh thạch được đục bằng ống nhựa vô trùng (Ø = 6 mm) và được đặt lên môi trường PDA (g/L: khoai tây) đã cấy

sẵn các loài nấm kiểm định gây bệnh thực vật là Fusarium oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani và Phytophthora capsici hoặc đặt lên môi trường

NA đã cấy vi khuẩn kiểm định gây bệnh thực vật là Xanthomonas oryzae Ngoài ra,

phổ hoạt tính kháng nấm cũng được kiểm tra trên các chủng nấm kiểm định là

Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Saccharomyces cerevisiae

2.2.2 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào

Từ các tế bào đã hoạt hóa, chủng vi khuẩn được cấy vào bình tam giác 250

ml chứa 100 ml môi trường TSB (Becton, Dickinson and Company, Pháp) dịch thể Sau 48 giờ nuôi cấy lắc 160 v/p ở 30oC, dịch nuôi cấy được ly tâm ở 8.000 v/p trong

10 phút nhằm loại bỏ tế bào vi khuẩn Khả năng sinh enzyme ngoại bào được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch Theo đó, dịch nuôi cấy vi khuẩn được nhỏ vào các giếng (Ø = 6 mm) đã đục lỗ trong đĩa thạch chứa 0,1% các loại cơ chất

là tinh bột tan, CMC, xylan, chitin, casein và tributyrin Sau 24 giờ ủ đĩa thạch cơ chất ở 37oC, hoạt tính amylase và CMCase được xác định dựa trên vòng trong phân

giải cơ chất tinh bột tan và CMC xung quanh khoanh thạch khi nhuộm với dung dịch lugo; hoạt tính xylanase và chitinase được quan sát khi nhuộm cơ chất xylan và chitin với dung dịch đỏ công gô; hoạt tính protease và lipase được quan sát trực tiếp trên cơ chất casein và tributyrin

2.2.3 Xác định khả năng phân giải phosphate khó tan

Từ các tế bào đã được hoạt hóa, chủng vi khuẩn được cấy vào bình tam giác

100 ml chứa 25 ml môi trường dịch thể Sau 48 giờ nuôi lắc 160 v/p ở 30oC, dịch nuôi cấy vi khuẩn được ly tâm ở 8.000 v/p trong 10 phút để loại bỏ tế bào Hàm lượng phosphate vô cơ giải phóng từ Ca3(PO4)2 vào môi trường nuôi cấy được xác

định bằng phương pháp xanh molybdenum như Holman et al (1943) mô tả dựa trên

đường chuẩn phosphate xây dựng từ KH2PO4

2.2.4 Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA

Chủng vi khuẩn hoạt hóa được cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường dịch thể NA có bổ sung với L-tryptophan (Merck, Đức) có nồng độ cuối là 5

mM Sau 48 giờ nuôi lắc 160 v/p ở 30oC, dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm ở 8,000 v/p trong 10 phút để loại bỏ tế bào Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic acid (IAA) được xác định dựa trên phản ứng tạo mầu với thuốc thử Salkowski [17] Hàm lượng IAA sinh ra được xác định dựa trên đường chuẩn xây dựng từ IAA (Merck, Đức)

2.2.5 Dấu vân tay rep-PCR và phân tích tính tương đồng kiểu gen

Từ các khuẩn lạc thuần khiết, ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp của [16] Mức độ tinh sạch của ADN được kiểm tra dựa trên chỉ số bước sóng

A260/A280 (xấp xỉ 1,8) Sau đó, 50 ng ADN của từng chủng vi khuẩn được đưa vào ống PCR có thể tích phản ứng cuối cùng là 25 µl chuẩn bị từ DreamTaqTM

PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) Phản ứng PCR được thực hiện với mồi ERIC và GTG5 theo chu trình nhiệt Freitas và cộng sự (2008) đã mô tả [15] Sản phẩm PCR được điện di trong 2 giờ tại 65 V trên bản gel agarose 2% có bổ sung với chất nhuộm ADN RedSafe (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc) Hình ảnh điện di

được chụp lại trên hệ thống soi gel (BioRad, Mỹ) Mô hình băng ADN (hay kiểu gen) tạo ra từ mỗi chủng vi khuẩn được phân tích và được mã hóa sang hệ ma trận nhị phân 1/0 Tính tương đồng về kiểu gen được tính toán theo hệ số Dice Mối quan hệ về kiểu gen của các chủng được thể hiện theo sơ đồ cây sử dụng thuật toán UPGMA Tất cả các bước phân tích tính tương đồng kiểu gen được thực hiện trên phần mềm NTSYSpc 2.1

2.2.6 Phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Phản ứng PCR khuếch đại và giải trình tự 6 đoạn gen gyrase subunit A

(gyrA), RNA polymerase subunit B (rpoB), amide formyltransferase (purH), DNA polymerase III subunit alpha (polC), 60 kDa heat-shock protein groEL (groEL) và 16S rRNA được thực hiện với các cặp mồi

phosphoribosylaminoimidazolecarbox-theo mô tả của Rooney và công sự (2009) [40] Trình tự của 6 gen được gửi lên ngân hàng gen với các số hiệu lần lượt là KU904810, KU904811, KU904812 KU904813, KU904814 và KU904810 Trình tự đa gen của chủng vi khuẩn nghiên

cứu có chiều dài 5.547 bp được kết nối theo thứ tự đoạn 928 bp của gen gyrA, đoạn

964 bp của gen rpoB, đoạn 875 bp của gen purH, đoạn 777 bp của gen polC, đoạn

835 bp của gen groEL và đoạn 1,168 bp của gen 16S rRNA Trình tự đa gen của các

loài quan hệ gần gũi trong nghiên cứu của Kubo và cộng sự (2011) được tải về từ ngân hàng gen NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [29] Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép toán Tamura - Nei với độ lặp lại 1,000 lần trên phần mềm MEGA phiên bản 5.05

2.2.7 Tách chiết chất kháng nấm và kháng khuẩn

Từ dịch nuôi cấy đã loại bỏ tế bào, chất kháng nấm và chất kháng khuẩn được tách chiết bằng 4 phương pháp là sử dụng dung môi hữu cơ, hấp phụ với hạt amberlite-XAD7, đông khô dịch nuôi cấy kèm tách chiết bằng ethanol và tủa ở pH thấp Các phương pháp tách chiết được lặp lại 2 đến 3 lần theo quy trình như sau:

i Phương pháp tách chiết bằng dung môi hữu cơ: dịch nuôi cấy đã loại bỏ tế bào được lần lượt đưa vào các dung môi có độ phân cực khác nhau là

benzen, 1-butanol, chloroform, ethyl acetate, hexan, 2-pentanol và tuluene theo tỷ lệ 1 : 1 Sau khi đảo trộn mẫu trong 10 phút, hỗn hợp dung dịch được

ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 20 phút nhằm tách rõ 2 lớp dịch nuôi cấy và dung môi Phần dung môi phía trên được thu lại và cô quay ở nhiệt độ

60oC Sau đó, cặn kháng sinh thô được hoàn nguyên với nước cất và được thử hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn kiểm định

ii Phương pháp hấp phụ với hạt amberlite-XAD7: hạt amberlite-XAD7 được đưa vào dịch nuôi cấy theo tỷ lệ 1 : 5 Hỗn hợp này được khuấy nhẹ qua đêm trên máy khuấy từ ở nhiệt độ 4oC Sau đó, hạt amberlite được thu lại và rửa liên tiếp 3 lần với nước cất, 1 lần với ethanol 30% Hạt amberlite được khuấy nhẹ với ethanol 75% trong 4 giờ Chất kháng sinh thô thôi ra trong ethanol được thu lại và cô quay ở nhiệt độ 60oC Sau đó, cặn kháng sinh thô được hoàn nguyên với nước cất và được thử hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn kiểm định

iii Phương pháp đông khô: tiến hành đông khô hoàn toàn dịch nuôi cấy Sau đó, đưa một lượng thể tích ethanol 100% tương đương với lượng mẫu ban đầu vào cặn đông khô và lắc ở 160 vòng/phút trong 2 giờ nhằm chiết rút chất kháng sinh thô Phần ethanol được thu lại và cô quay ở nhiệt độ 60oC Sau

đó, cặn kháng sinh thô được hoàn nguyên với nước cất và được thử hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn kiểm định

iv Phương pháp tủa ở pH thấp: dịch nuôi cấy được chỉnh về pH 3,0 sử dụng HCl 6N và được ủ qua đêm ở 4oC Sau đó, dịch nuôi cấy được ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 10 phút Phần cặn tủa được thu lại và hoàn nguyên với nước cất Hoạt tính kháng sinh thô trong cặn tủa được thử với nấm và vi khuẩn kiểm định

2.2.8 Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn

Chất kháng nấm và chất kháng khuẩn được tinh sạch bằng kỹ thuật HPLC sử dụng cột Zorbax Eclipse XDB - C18 (4,6 × 250 mm, 5 µl, Agilent Technologies, USA) Phương pháp tinh sạch HPLC được thực hiện theo mô tả của He và cộng sự

(2007) [23] Theo đó, pha động sử dụng methanol và nước chứa 0,05% trifluoroacetic acid Sau khi cân bằng cột với tỷ lệ 20% methanol, 30 µl dịch kháng sinh tách chiết theo 2 bước bằng dung môi 1 - butanol và hạt amberlite-XAD7 được tải lên cột Dung môi hệ động được thay đổi tuyến tính theo nồng độ methanol từ 20% lên 40% trong 10 phút, từ 40% lên 60% trong 5 phút và từ 60% lên 70% trong

10 phút Tốc độ dòng của cả quá trình sắc ký là 0,5 ml/phút Sắc ký đồ được ghi nhận tại bước sóng 220 nm Sau khi bị thôi ra khỏi cột, các phân đoạn sắc ký (0,5 ml/phân đoạn) được thu nhận, cô quay loại bỏ dung môi và thử hoạt tính kháng nấm

và kháng khuẩn Sau đó, các phân đoạn có hoạt tính được trộn lại với nhau và được tinh sạch lại một lần nữa theo chu trình sắc ký mô tả như trên Phân đoạn có hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn được gửi sang Trung tâm các Phương pháp Phổ Ứng dụng - Viện Hóa Học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ để xác định phổ khối (MS)

2.2.9 Xác định đặc tính sinh hóa lý của chất kháng nấm và kháng khuẩn

Khả năng bền nhiệt độ, bền pH và bền với các enzyme thủy phân của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn được thử nghiệm như sau:

i Khả năng bền nhiệt: dịch tách chiết chất kháng sinh được xử lý ở các nhiệt

độ 60o

C, 80oC và 100oC Sau thời gian xử lý là 30 phút, 60 phút, 90 phút và

120 phút, hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch như mô tả ở trên

ii Khả năng bền pH: dịch tách chiết chất kháng sinh được xử lý ở các pH từ 3,0 đến 7,0 trong đệm citrate-phosphate và pH 8,0 đến 9,0 trong đệm Tris-HCl Sau 24 giờ ủ ở 4oC, hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch như mô tả ở trên

iii Khả năng bền với các enzyme thủy phân: 5 enzyme là trypsin, chymotrypsin, amylase, lipase và proteinase K được pha trong đệm phosphate 25 mM (pH 7,0) tới nồng độ cuối cùng là 1 mg/ml Sau đó, dịch tách chiết chất kháng sinh được lần lượt trộn đều với các dung dịch enzyme

α-theo tỷ lệ 1 : 1 và được ủ ở 37oC Sau 2 giờ xử lý, hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch như mô

tả ở trên

2.2.10 Thử nghiệm tính an toàn của chất kháng nấm và kháng khuẩn

Tính an toàn của chất kháng nấm và kháng khuẩn sản sinh từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 bước đầu được thử nghiệm trên khả

năng nảy mầm của hạt thóc, hạt lạc và hạt ngô; và thử nghiệm khả năng sinh trưởng của các loại cây lúa, cây lạc và cây ngô Qua đó, chất kháng nấm tách thô được pha loãng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng nước cất và các loại hạt kể trên được ngâm trong 3 giờ trong dung dịch pha loãng này Sau đó, hạt được đưa lên lớp bông

ẩm nhằm tạo điều kiện thuận lợi nẩy mầm ở 25oC Độ ẩm của bông được kiểm tra hàng ngày và kích thước (cm) hạt nẩy mầm được đo lại sau 4 đến 6 ngày ủ mầm Đối chứng là các hạt ngâm trong nước cất trước khi ủ mầm

Nhằm đánh giá tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn lên sự sinh trưởng của cây non, mầm hạt cây tại các mẫu đối chứng được trồng ra đất Sau

5 - 7 ngày khi cây đã phát triển ổn định, chất kháng nấm tách thô được pha loãng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được phun đều lên bề mặt các lá Đối chứng là nước cất phun đều lên bề mặt lá Màu sắc lá được quan sát hàng ngày Sau 5 ngày thử nghiệm, kích thước lá 1 và 2 được ghi lại và so sánh