Nghiên cứu một số dược liệu có tác dụng trên ký sinh trùng, côn trùng và ung thư từ nguồn tài nguyên thực vật việt nam bằng kết hợp sàng lọc sinh học và nghiên cứu hóa học

Hiện nay, xu hướng chung trong nghiên cứu cây thuốc là kết hợp giữa việc sàng lọc các cây thuốc được sử dụng trong dân gian bằng các thử nghiệm sinh học với nghiên cứu chiết xuất phân lậ

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

Nghiên cứu một số dược liệu có tác:

dụng trên ký sinh trùng,

từ nguồn tời nguyên thực vột Việt nam

bằng kết hợp sòng lọc sinh học vò

nghiên cứu hóa học

CƠ QUAN CHỦ TRÌ Trường Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh

BAN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS Ngô Vân Thu PGS PTS Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ

CÁN BỘ NGHIÊN CỨU CHÍNH

PGS Ngô Vân Thu - Trưởng bộ môn Dược - ĐH Y Dược Tp HCM

PGS PTS Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ - Phó phòng NCKH - ĐHYD Tp HCM

TS Trần Hùng - Trưởng ban Sau ĐH, Giảng viên BM Dược liệu

ThS Vương Văn Ảnh - Phó phòng TCCB, Giảng viênBM Dược liệu

DS CKY Võ Văn Lẹo - Phó CN BM Dược liệu

DS CKI Võ Thị Bạch Huệ - Phó CN BM Kiểm nghiệm

DS CKI Huynh Ngoc Thuy - Giảng viên bộ môn Dược liệu

Ths Phạm Đông Phương - Phó trưởng Khoa Dược, Giảng viên BM Dược liệu PTS Nguyễn Viết Kình - Giảng viên BM Dược liệu

10 PTS V6 Van Chi - Giảng viên bộ môn Dược liệu

11.PTS Nguyễn Văn Thanh - Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh

PHAN |

DAT VAN DE

iz dna ƒ - Det van dé

}

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, nhu cầu về các thuốc đùng trong điều trị ký sinh trùng và chống ung thư trên thế giới và trong nước là rất lớn Các thuốc hiện có trên thị trường còn có những hạn chế về mặt tác dụng, nên các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang phải tiếp tục nghiên cứu tìm ra các thuốc trị ung thư và sốt rét có hiệu quả hơn để bổ sung vào các phác đồ điều trị Các nhà khoa học biện đang rất chú ý đến kho tàng y dược học cổ truyền của các dân tộc nhằm tìm ra những phân tử thuốc mới có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng trị liệu để đưa vào sử dụng, cũng như làm mô hình cho việc bán tổng hợp những dẫn xuất

có tác dụng trị liệu cao Nước ta có hệ thực vật rất phong phú và có rất nhiễu bài thuốc

dân gian Việc nghiên cứu thử nghiệm tac dụng trị ung thư, ký sinh trùng và côn trùng

để làm sáng tỏ giá trị của nguồn (ài nguyên thiên nhiên, tìm ra các cây thuốc quí để đưa vào khai thác sử dụng là cần thiết Nhu cầu-về thuốc nói chung và thuốc điều trị ký sinh trùng, ung thư v.v nói riêng ở nước ta hiện nay rất lớn Phần lớn các thuốc này đều phải nhập nội Nhiều loại thuốc rất đắt tiền (như các thuốc trị ung thư) mà đa số nhân dân lao động không đáp ứng được Việc tìm ra các nguồn thuốc tại chỗ, đi từ nguồn gốc tự nhiên để bổ sung hay thay thế một phần các thuốc nhập nội ngoài ý nghĩa khoa học còn góp một phần không nhỏ trong việc bảo vệ sức khỏe nhân dan

Việc nghiên cứu tìm ra thành phần hoạt chất của cây thuốc đòi hỏi nhiều thời gian và công sức Trước đây, được liệu nghiên cứu thường được chọn các một cách ngẫu nhiên

và các nghiên cứu thường được tiến hành độc lập giữa nghiên cứu hoá học và thử tác dụng sinh học nên tiêu tốn nhiễu thời gian và tiên của Hiện nay, xu hướng chung trong

nghiên cứu cây thuốc là kết hợp giữa việc sàng lọc các cây thuốc được sử dụng trong dân gian bằng các thử nghiệm sinh học với nghiên cứu chiết xuất phân lập các hoạt chất

nhằm định hướng vào các thành phần có tác dụng sinh học đỂ rút ngắn thời gian, tránh

mò mẫm trong nghiên cứu Kết qủa nghiên cứu trong những năm gần đây đã chứng tỏ

hướng nghiên cứu này rất có hiệu quả Thời gian nghiên cứu được rút ngắn, giảm kinh phí và tăng hiệu quả trong việc âm kiếm các thuốc mới Việc tìm ra các hợp chất chống

ung thư như podophyllin, taxol là những ví dụ chứng minh cho tính đúng đắn của việc

kết hợp đó

Trừớc đây, các thử nghiệm sinh học, đặc biệt là các thử nghiệm tác dụng chống ung thư

phải thực hiện in vivo r&t tốn thời gian và tiên của Gần đây nhiều tác giả đã nghiên

cứu các mô hình thử nghiém sinh hoc in vitro nhu 1a cdc tht nghiém ban dau (pretest)

cho việc sàng lọc nhanh và it tốn kém một lượng lớn mẫu nghiên cứu Bằng những thử nghiệm này, từ một số lượng lớn các mẫu cây thuốc được thu thập đựa vào kinh nghiệm

dân gian (Ethnopharmacology) qua sang lọc sinh học, các nhà nghiên cứu có thể tập

trung vào một vài cây thuốc có tác dụng tốt nhất Từ các cây thuốc này, cũng bằng kết

hợp các thử nghiệm sinh học và nghiên cứu hóa học có thể định hướng tới các hoạt chất

của cây thuốc, bỏ qua các thành phần không có tác dụng

Brine shrimp va Crown gall tumour scréening tests; thử nghiệm trên entamoeba,

Phén 1 Dat vain dt 2

plasmodium in vitro 14 nhitng thit nghiém nhu vay Cac thứ nghiệm sinh học này đã được các nhà nghiên cứu của các viện nghiên cứu lớn sử dụng và hoàn thiện Ngày nay

chúng được chấp nhận rộng rãi trên thế giới trong sàng lọc ban đầu các cây thuốc Viện

Nghiên cứu Ung thư Hoa Kỳ đã quyết định chỉ sử dụng các thử nghiệm in vivo (P-388,

9-KB ) những chất nào cho kết quả tốt trên các thử nghiệm sàng lọc trên

Trong nước đã có một số công trình nghiên cứu riêng lẻ về sàng lọc các cây thuốc trị giun sán như các công trình của GS Đăng Văn Ngữ và các cộng tác viên (1960), sốt rét của GS Ngô Vân Thu và Cs (1976) và ly amib của GS Nguyễn Vĩnh Niên, GS Ngô Vân Thu và Cs (1988) Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu trước đây chỉ mới thực

hiện trên một số nhỏ các cây thuốc Chưa có công trình nào nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc hướng tới tác dụng trị ung thư, một trong những mối quan tâm hàng đầu của

các nhà nghiên cứu những dược phẩm tương lai cũng chưa nghiên cúu các tác dụng kể trên trong mối liên hệ : kháng sốt rét - trị ly amib - độc đối với tế bào / trị ung thư như

một số công trình nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh

Các nghiên cứu khác chỉ thực hiện trên từng được liệu riêng lẻ

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI :

Tìm ra những cây thuốc thực sự có tác dụng trị bệnh nhằm đưa các cây thuốc đó vào sử dụng nhằm tăng nguồn thuốc phòng và chữa bệnh cho nhân dân

Để thực hiện mục tiêu này, để tai sit dung mét s6 thi nghiém in vitro ding Artemia

salina và các thử nghiệm trên ký sinh trùng và côn trùng khác v.v sàng lọc một số cây

thuốc được sử dụng trong dân gian và những loài tương cận nhằm tầm ra những cây

thuốc có tác dụng trên các bệnh ký sinh trùng, côn trùng ung thư Từ đó tìm ra những

nhóm hoạt chất hay hoạt chất tinh khiết từ những cây thuốc đã được lựa chọn qua kết

quả sàng lọc ban đầu làm tiễn để triển khai các nghiên cứu sâu hợn vệ dược lý và đạng

bào chế các chế phẩm từ một vài cây có tác dụng tốt nhất đối với các bệnh nói trên

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

(cho đề tài hoàn chỉnh nghiên cứu trong nhiều năm)

1 Nghiên cứu Được lý dân tộc học (ethnopharmacology) : Thu thập tài liệu về các cây

thuốc, bài thuốc kinh nghiệm dân gian; tham khảo các tài Hiệu về sử dụng cây thuốc

của các nước; các dân tộc trên thế giới; các nghiên cứu được lý hiện đại để lập nên một danh sách cây thuốc trị các bệnh ly, ký sinh trùng và côn trùng v.v

2 Chọn ra nhũng cây thuốc được xem là có tác dụng tốt, có tần suất sử đụng cao trong

dan gian, được nhiều dân tộc sử dụng, hoặc đã có các thử nghiệm dược lý chứng mỉnh tác dụng để phục vụ cho nghiên cứu sàng lọc

3 Thu thập mẫu dược liệu từ đanh sách cây thuốc nêu trên

4 Chiét cao MeOH và cao nước toàn phần của các mẫu được liệu đãthu thập

5 Thử độc tính của các dịch chiết trên ấu trùng Arfermia salina.

Phén | - Dat véin dé 3

10

Thử độc tính trên trùn chỉ 1ữmnodrilus hofmoistery

Thit déc tinh trén Tam Bombyx mori

Thử độc tính trên ấu trùng muỗi Aedzs

Thử tác đụng gây chán ăn trên Tằm Bormbyx mmori

"Thử tác động chống phân bào trên mơ phân sinh rễ hành Ailiur ascalonicum

Từ các thử nghiệm trên lựa chọn những cây thuốc cĩ tác dụng mạnh nhất để nghiên cứu tiếp các bước

Chiết cao chiết tồn phân của dược liệu Dùng các kỹ thuật hố thực vật (chủ yếu

là các kỹ thuật sắc ký) để phân tách hoạt chất tồn phần thành những phân đoạn

đơn giản hơn

Kiểm tra tác dụng sinh học của các phân đoạn đã tách được

Định hướng vào các phân đoạn cĩ tác dụng sinh học tốt, kết hợp với kỹ thuật hĩa thực vật để chiết tách các hoạt chất tinh khiết phục vụ cho nghiên cứu cấu trúc,

nghiên cứu tác dụng dược lý, chiết xuất lớn, bào chế và tiêu chuẩn hĩa

Nghiên cứu các đặc tính lý hĩa của các chất phân lập được và xác định cấu trúc

của chúng bằng các phương pháp phổ hiện đại như MS, NMR, X-ray

Song song với giai đoạn 14, 15 là nghiên cứu bước đầu độc tính và dạng bào chế

của cây thuốc cĩ tác dụng tốt nhất

4 NỘI DUNG CỤ THỂ CỦA ĐỀ TÀI

chứng minh tác dụng để phục vụ cho nghiên cứu sàng lọc

_ Thu thập mẫu dược liệu từ danh sách 50 cây thuốc nêu trên

Chiết cao MeOH và cao nước tồn phần của các mẫu dược liệu đãthu thập

Thử độc tính của các dịch chiết trên ấu trùng Artemia salina

Thử độc tính trên trùn chi Limnodrillus hofmoistery

Thử độc tính trên Tăằm Bombyx mọi

Thử độc tính trên ấu trùng muỗi Aedes

Thử tác dụng gây chán ăn trên Tằm Bombyx mori.

ha i Dat van 4

10 Thử tác động chống phân bào trên mô phân sinh rễ hành Alium agealonicuma

Từ các thử nghiệm trên lựa chọn những cây thuốc có tác dụng mạnh nhất để nghiên cứu tiếp các bước

11 Phân tích thành phần hóa thực vật của cây thuốc bằng các phương pháp hoá học, sắc ký (Sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng cao ấp ) để định hướng cho chiết xuất và phân lập các hoạt chất

12 Chiết cao chiết toàn phân của dược liệu Dùng các kỹ thuật hoá thực vật (chủ yếu

là các kỹ thuật sắc ký) để phân tách hoạt chất toàn phần thành những phân đoạn

đơn giản hơn

13 Kiểm tra tác đụng sinh học của các phân đoạn đã tách được

14 Định hướng vào các phân đoạn có tác dụng sinh học tốt, kết hợp với kỹ thuật hóa

thực vật để chiết tách các hoạt chất tĩnh khiết phục vụ cho nghiên cứu cấu trúc, nghiên cứu tác dụng dược lý, chiết xuất lớn, bào chế và tiêu chuẩn hóa

15 Nghiên cứu các đặc tính lý hóa của các chất phân lập được và xác định cấu trúc

của chúng bằng các phương pháp phổ hiện đại như MS, NMR, X-ray.

PHAN II

PHUONG PHAP NGHIEN CUU

hdr M huenag php nghien ate 2

1 LỰA CHỌN MẪU NGHIÊN CỨU

Mẫu nghiên cứu được lựa chọn theo các nguyên tắc sau :

Được sử dụng trong dân gian, được ghi nhận trong các sách y học cổ truyền của các dân

tộc dùng để điều trị các bệnh giun sán, ký sinh trùng (chấy, rận), ly, tiêu chảy, sốt rét

(sốt cách nhật, ngã nước, sốt rét rừng, nghịch tật), ung thư, Các dữ liệu này được thu thập từ các tài liệu trong và ngoài nước, các kinh nghiệm thực tế thu thập trong các

chuyến đi điều tra thu thập mẫu (Nghiên cứu dược lý dân tộc học -

Ethnopharmacology)

Được biết có tác dụng trên giun sán, chấy rận, ly, sốt rét, ung thư và có tác dụng tác

dụng trên đơn bào, côn trùng khác qua các thử nghiệm sinh học, dược lý, lâm sàng công bố trên các tạp chí khoa học, các hội nghị về-cây thuốc trong và ngoài nước

Có mối quan hệ họ hàng gần gũi về mặt thực vật với những cây thuốc đã được biết là

có tác đụng sinh học, được lý lâm sàng theo hướng đang thử nghiệm (nghiên cứu dựa trên Hoá phân loại học - chemotaxonomy) hoặc với những cây thuốc được sử dụng

nhiều trong dân gian để điều trị các bệnh nói trên Đặc biệt chú ý tới các cây chưa hoặc

ft được nghiên cứu và những loài đặc hữu (cndemic plants) của Việt nam hay Đông dương

Từ các dữ liệu thu thập từ 3 nguồn trên, lập nên một Đanh sách các cây thuốc có nhiều

triển vọng cho nghiên cứu Từ danh sách này, chọn ra những cây thuốc có tần suất sử

dụng cao trong dân gian, được sử dụng bởi nhiều dân tộc, nhiễu vùng địa lý khác nhau,

có hoạt tính cao trong các thử nghiệm sinh học và dược lý lâm sàng và có thể thu thập

mẫu cho nghiên cứu để lập nên Danh sách các mẫu nghiên cứu ,

Các cây thuốc trong Danh sách mẫu nghiên cứu được tổng quan về các mặt : Thực vật, hóa học, được lý, công dụng và kinh nghiệm sử dụng làm định hướng cho nghiên cứu phòng thí nghiệm

2 CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU

2.1 Thu hái dược liệu

Phần lớn các dược liệu được thu hái tại thực địa Khi có thể, mẫu vật được thu thập riêng từ tất cả các bộ phận chính của cây (1á, thân, vỏ thân, gỗ, rễ, vỏ rễ, lõi rễ, hoa,

* quả, hạt) đặc biệt chú ý tới bộ phận được sử dụng làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian Một số dược liệu được thu mua tại các cửa hàng dược liệu

Các mẫu vật được giám định về thực vật và dược liệu để dam bảo chính xác vềể mặt thực vật học

khi đã khô xay thành bột bằng máy xay hoặc tần bằng thuyền tán, Bột dược liệu được

rây bột qua rây có lỗ 0,5mm, để đầm bảo các mẫu được liệu đồng nhất về kích cỡ Bột

dược liệu được giữ trong lọ kín có đán nhãn để tên nguyên liệu, ngày hái, nơi hái và

lượng mẫu

3 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT CÁC MẪU

Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của các dược liệu đuợc thực hiện theo quy trình

phân tích của Trường Đại học Dược khoa Roumani Các định tính xác nhận từng nhóm

hoạt chất được thực hiện bằng cách chiết riêng biệt theo nhóm hoạt chất và định tính bằng các thuốc thử đặc hiệu

4 CHUẨN BỊ CÁC CAO CHIẾT CHO THỬ SINH HỌC

4.1 Xác định độ ẩm

Dược liệu trước khi chiết được xác định độ ẩm để tính toán hàm lượng cao chiết được

trên lượng dược liệu khô tuyệt đối

Dụng cụ : Cân xác định độ ẩm Moisture Balance EB-340 MOC (Shimadzu)

Kết quả tính trung bình trên 3 lân đo

4.2 Cao methanol cho thử nghiệm sinh học

Cân chính xác 5g dược liệu, sau khi ngâm dược liệu qua đêm với 40 ml methanol, hỗn hợp được để trong bể siêu âm ở nhiệt độ 40°C trong 12 phút Gạn lấy dịch chiết, Bã

dược liệu được chiết trong bể siêu âm ở nhiệt độ 402C trong 12 phút thêm 3 lần nữa, mỗi lần với 30 ml methanol Gộp chung dịch chiết, Lọc qua giấy lọc Cô địch lọc trên bếp cách thủy đến cao khô Cân xác định khối lượng cao toàn phần và tính tỉ lệ % lượng cao methanol chiết được

* -Bảo quần cao trong chai thủy tỉnh nhỏ, có nắp đậy và để trong các bình hút ẩm Cao này được sử dụng để thử sinh học

4.3 Chuẩn bị cao nước cho thử nghiệm sinh học

Tiến hành các giai đoạn chiết tương tự như cao methanol nhưng thay methanol bằng

nước cất.

TH Il - Phuong phdp nghien citt 3

Quy trình chung để chiết các cao thử nghiệm được trình bày ở hình 1

NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT (10g)

Đung môi, ngâm qua đêm

Siêu âm ở 409/15 phút - Loc |

[| Siên Âm & 409/15 nhất - Ï.nec

Dung môi

[TT | Siêu âm 8 407/15 phút - Lọc F—| DICH CHIET BA DUGC LIEU

Hình 1 : Sơ đồ chung chiết các cao thử sinh học

5 THỬ ĐỘC TÍNH CÁC CAO CHIẾT TRÊN MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM

Các thử nghiệm sinh hoc in vitro được thực hiện theo các tài liệu đã công bố (Thử nghiệm brine shrimp, thử nghiệm trên ấu trùng muỗi, thử nghiệm chống phân bào trên

mô phân sinh rễ hành) Những thử nghiệm mới (Thử độc tính trên tầm, thử độc tính trên trùn chỉ, thử tác động gây chán ăn trên tầm) được thăm dò điều kiện thử nghiệm theo

nguyên tắc thử nghiệm chung của các mô hình thử nghiệm tương cận đã được chấp

nhận

5.1 Thử độc tính trên mô hình brine shrimp

5.1.1 Nguyên tắc

Xác định độc tính của các cao chiết được liệu trên ấu trùng Brine shrimp, một loài giáp

xác sống trong nước biển có tên khoa học là Arfemia salina Leach

Hầu hết các chất có hoạt tính sinh học đều có độc tính ở liều cao Vì thế, một thử

nghiệm xác định độc tính của các chất trên các động vật bậc thấp có thể được sử dụng

như một thử nghiệm nhanh, đơn giản để định hướng nghiên cứu các hợp chất có tác

‘Bhan i Phuong phdp nghien ctu 8

dụng sinh học Thử nghiệm trén brine shrimp (Artemia salina Leach) 14 một trong

những thử nghiệm như vậy

Brine shrimp đã từng được sử dụng trong nhiều thử nghiệm sinh học khác nhau như để

xác định dư lượng các chất diệt côn trùng, các chất độc từ nấm, ô nhiễm môi trường,

thử nghiệm các thuốc tê, các chất gây ung thư v.v Năm 1982, McLaughin và các cộng

sự đã triển khai thử nghiệm này cho việc nghiên cứu sàng lọc ban đầu các chất chống ung thư trước khi thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư, cũng như cho việc định

hướng chiết xuất phân lập các hoạt chất chống ung thư trong cây cỏ

Các nghiên cứu thực hiện tại của nhóm McLaughin tại Đại học Purdue (Mỹ) và của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã cho thấy giữa độc tính của cây thuốc trên Brine shrimp và tác dụng trên các dòng tế bào ung thư có mối tương quan thuận chiểu Đa số các chất có tác dụng trên tế bào ung thư đều có tác dụng trên brine shrimp Nhiều chất

có tác dụng trên các thử nghiệm chống tế bào ung thu in vivo da được phân lập nhờ định hướng của thử nghiệm brine shrimp Các tác giả đã để nghị sử dụng mô hình thử nghiệm này như một thử nghiệm sàng lọc sơ bộ các chất có hoạt tính sinh học từ các

dịch chiết sinh học và đùng như một thử nghiệm để định hướng trong việc chiết xuất và

phân lập các hoạt chất có tác dụng trong nguyên liệu thử nghiệm

De đơn giản, không đòi hỏi trang bị đắt tiền và điểu kiện vô trùng như nuôi cấy tế bào; thời gian thử nghiệm ngắn (24 giờ) nên hiện nay thử nghiệm brine shrimp được sử dụng rất phổ biến, như những công việc hàng ngày tại các phòng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên

5.1.2 Dụng cụ và hóa chất thử

Tring Brine shrimp (Artemia salina Leach)

Trứng bào xác Artemia Vĩnh Châu (Artemia cystis) do khoa Sinh, Đại học Cần Tho sản

xuất Loại hộp thiếc 200g trứng, tiêu chuẩn chất lượng :

e Kích thước trứng : 230 + 2.5m

© Số lượng trứng : 398000/gram

e Độ ẩm :3.5-4%

« Tỷ lệ nở: Sau 24h ở 26 °C : 78% (310000 ấu trùng/g)

Sau 48h ở 26 °C : 84% (335000 ấu irùng/g)

« Hàm lượng acid béo không no (HUFA) 17mg/gram

DMSO (dimethyl sulfoxid) : Prolabo, loại tỉnh khiết phân tích

Muối biển nhân tạo : Marinemix, Singapore

Hộp ap tritng brine shrimp :

Hộp nhựa nhỏ có một vách ngăn ngang ở một phần ba chiều đài hộp, trên vách ngăn có đục các lỗ nhỏ để ấu trùng sau khi nở có thể đi qua Ngăn rộng của hộp được che kín

Phan ll -Rhuong phdo nghien atu 9

tránh ánh sáng

Khay thử Cooke microtiter 96 lỗ, có nắp đậy Mỗi lỗ (giếng thử) có thể tích là 0,3mI

Nguyên liệu thi :

Cao dược liệu để thử nghiệm (cao methanol và cao nước, theo quy trình chiết ở mục II- 4.2 và II-4.3)

được sử dụng để đánh giá hoạt tính của dược liệu

Kết quả được đánh giá dựa trên số trung bình Brine Shrimp chết ở mỗi nông độ:

- Không có tác dụng nếu không có con ấu trùng nào chết (-)

- Có tác dụng nếu có từ 1-5 ấu trùng chết (+)

- Có tác dụng mạnh nếu có từ 6-10 con chết (++)

5.2 Thử độc tính trên ấu trùng muỗi

8.2.1 Sinh lý của muỗi - Phương pháp nuôi muỗi và ấu trùng để thử

nghiệm

5.2.1.1 Sinh lý của muỗi

Muốỗi là loài côn trùng rất được quan tâm trong y tế cộng đồng Là một nhóm phổ biến gồm 3.000 loài phân tán khắp nơi trên thế giới Muỗi hút máu người và truyền các tác

nhân gây bệnh nguy hiểm cho người như : sốt rét, sốt vàng, sốt xuất huyết, bệnh giun

chỉ Bancroft, viêm não

Muỗi thuộc họ Culicidae, bộ Diptera, là loại côn trùng nhỏ, chân dài, có 2 cánh Chu kỳ sinh sống của muỗi gôm 4 giai đoạn : trứng, ấu trùng, nhộng và muỗi trưởng thành Ba giai doan đâu sống trong nước, con trưởng thành năng động, bay được và sống nhờ hút

máu (con cái), hay hút mật hoa và nhựa cây (con đực) .

han It “Rhuong pháp nghien clu 10

Giai đoạn trứng

Trứng khi mới để ra có mầu trăng, sau 1 - 2 giờ thì sẵm lại

Trứng mới đẻ cần nước hay độ ẩm đây đủ, nhưng sau 48 giờ, nếu điều kiện khô thì trứng vẫn có thể tổn tại một thời gian lâu, chờ khi có nước sẽ nở cho ấu trùng Trứng của một vài loại muỗi có khả năng tổn tại 3 - 4 năm trong điều kiện khô, Bình thường trứng sẽ nở sau 2 - 3 ngày

Au tring của tất cả các loài muỗi đều sống trong nước : ao hỗ, đầm lầy ẩm ướt hay các

vũng nước đọng trong rừng, hốc cây, hõm đá hay những vật chứa nước dùng trong

nhà nhưng chúng không sống được trong các môi trường có nước chảy mạnh như: suối, thác, hê, cạnh thác và nước biển Thời gian ấu trùng kéo đài 4 - 10 ngày gồm có 4 giai đoạn lột xác để phát triển, thời gian từng giai đoạn thay đổi tùy theo yếu tố môi trường

đặc biệt là nhiệt độ, ở lần lột xác thứ 4 thì ấu trùng thành nhộng

Giai đoạn nhộng kéo dài từ một ngày đến vài tuần tùy điều kiện Cuối giai đoạn, ở

nhộng nứt ra cho muỗi trưởng thành

Muỗi trưởng thành

Muỗi trưởng thành nhỏ, phần bụng mang một đôi cánh hẹp và 3 đôi chân đài mỏng

mảnh, đầu dài thay đổi từ 1.6 - 12.5 mm Cấu tạo cơ thể gồm 3 phần: đầu , ngực, bụng Đầu tròn gồm một cặp mắt kép, 1 đôi râu, 1 đôi xúc biện và vòi Râu dài, mỏng, gồm

15 đốt có thể thấy được, những đốt cuối mang lông ngắn, thưa (con cái), day ram rap

(con đực) Râu có nhiệm vụ xúc giác, xúc biện gồm 5 đốt

5.2.1.2 Muỗi Aedes

Còn gọi là muỗi đốm, muỗi vẫn, muỗi có tầm vóc nhỏ, màu sậm, có những đốt trắng

bạc trên thân và trên chân Bụng muỗi có những băng ngang màu trắng Xúc biện hàm

đài hơn vòi ở con đực và ngắn hơn ở con cái Muỗi đậu với tư thế song song chỗ đậu

Aedes gồm hơn 500 loài phân bố khắp nơi từ miễn cực đến những vùng nhiệt đới Để trứng đơn độc trên đất ẩm, trong hốc cây hay những vật chứa nước khác, trong trứng đã

có phôi Trứng tổn tại một thời gian dài trong điều kiện khô ráo

Giống Aedes acgypti là vector đáng chú ý của bệnh sốt vàng, sốt xuất huyết và viêm não Loài này để trứng ở nước dơ, dễ thích nghỉ Mỗi lần để khoảng 10 - 100 trứng Cách 4 hay 5 ngày đề 1 lần Tổng cộng số trứng trong một vòng đời là 300 - 750 trứng

Ấu trùng khi nổi lên mặt nước để thở, chúng nằm xiên và thở bằng ống thở Ống này ngắn và rộng bể ngang Ấu trùng cần có đầy đủ thức ăn để phát triển thành nhộng

Bhan Phuong phdp nghien atu i

trong vòng khoảng 5 - 7 ngày với nhiệt độ của nước là 25 - 30°C Nước lạnh dudi 10°C

sẽ làm chết ấu trùng, cũng như nhiệt độ càng nóng thì tỉ lệ chết của ấu trùng càng cao

Nhiệt độ của nước là 32°C sẽ ức chế sự phát triển và nếu hơn 36oC thì ấu trùng bị tiêu diệt Ấu trùng Aedes øegypii ưa nước sạch, nhưng chúng vẫn có thể tổn tại được trong

các môi trường hơi acid, hơi kiểm hoặc hơi mặn Đa số ấu trùng bị chết trong điều kiện khô cạn, chỉ có một số rất ít ẩn trong lá cây ẩm ướt thì tổn tại

Giai đoan nhộng hoàn tất trong 1 - 5 ngày với nhiệt độ của nước là 27 - 32°C, trung bình nhộng đực cân 44 giờ, nhộng cái cần 60 giờ để phát triển, Nhộng có thể tổn tại 24 giờ trên giấy thấm ẩm và chỉ nở thành muỗi khi gặp nước Nhộng thành muỗi bằng một đường nứt trên lưng, sau 15 phút, muỗi ra khỏi thân nhộng và nằm yên trên xác nhộng

khoảng 1 giờ mới bay được Ở nhiệt độ môi trường 6°C, muỗi sẽ bị giết chết trong 24 giờ, 7 - 9°C, muỗi có thể tổn tại lâu hơn

5.2.1.3- Phương pháp nuôi muỗi và ấu trùng

Aedes aegypti

Muỗi Aedes aegypti được nuôi trong lổng lưới kín, lưới 1mm, có cửa bằng vải lưới được cột kỹ Muỗi đực được nuôi bằng nước đường (dùng bông gồn tẩm nước đường, đặt vào đĩa petri trong lổng) Cho muỗi cái hút máu từ chuột bạch bằng cách cho hút máu trên

thân hay trên đuôi chuột

Muỗi cái đẻ trứng trên tờ giấy thấm ẩm quấn quanh mặt trong của bocal chứa nước

Sau khi tờ giấy đầy trứng, lấy ra để khô và có thể giữ được trứng như vậy trong thời -

gian dài Nếu số lượng muỗi ít, có thể cho muỗi đẻ trên tờ giấy thấm cắt tròn, đặt trên bông thấm nước trong đĩa petri

Đặt giấy thấm có trứng vào đĩa hay bocal nước để nở thành ấu trùng Khi loạt ấu trùng đầu tiên được nở, lấy giấy ra cho vào đĩa khác để nở tiếp đợt 2

Nuôi ấu trùng tốt nhất bằng nước mưa, có thể dùng nước máy để bay hết chlor khoảng

1 - 2 ngày Thức ăn cho ấu trùng là loại thức ăn đành cho súc vật thí nghiệm, ngâm bánh thức ăn trong nước cho mềm rồi thả vào đĩa

Au tring Aedes aegypti ưa nước sạch, nên trong qúa trình nuôi cần thay nước thường ˆ xuyên Nước đục do chất thải của ấu trùng và thức ăn có thể lên men để đóng thành

một lớp màng phía trên ngăn cẩn không khí Thay nước bằng cách hút ấu trùng (dùng

ống đếm giọf) sang 1 đĩa mới có sẵn nước và thức ăn

Ấu trùng thử nghiệm đủ tiêu chuẩn nhất là ấu trùng giai đoạn lột xác thứ 3 (vào khỏang

ngày thư 5) Đây là giai đoạn ấu trùng trưởng thành nhất và tính để kháng cũng cao

hơn so với các giai đoạn trước

Nhộng để riêng trong một chén nước sạch và cho vào léng Mudi lần lượt được nở ra

trong vòng 1 đến 2 ngày

Culex :

Au tring Culex sinh sống và thích nghỉ trong môi trường nước cống rãnh độ hữu cơ cao

Phan ll _ lubMg pháp nghi2n clu 12

5.2.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

Dụng cụ và vật liệu thủ nghiệm

Au tring mudi Culex va Aedes (Culicidae) giai đoạn lột xác thứ 3

Hộp petri, ống đếm giọt

Bocal nuôi ấu trùng

Burette và một số dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm

Cao được liệu: cao nước và cao methanol

DMSO

Diéu kién

Trước khi thí nghiệm, ấu trùng được chuyển sang nước cất để loại bổ ảnh hưởng của thức ăn, tạp chất và một số sản phẩm hữu cơ trong nước đến kết qủa thí nghiệm

Thực hiện trong phòng thí nghiệm nhiệt độ thường

Tiến hành đối chiếu với mẫu chứng trong cùng điều kiện của mẫu thử

Tiến hành

Dung dịch thử được pha trhành những nồng độ 1mg/ml; 0,1 mg/ml và 0,01 mg/ml Đối với cao chiết methanol pha trong DMSO rỗi tiếp tục hòa tan nước cất, hàm lượng DMSO không quá 0,5%

8.2.3 Nguyên tắc thử nghiệm và cách tính kết qủa

Nguyên tắc :

Xác định tỉ lệ tử vong của ấu trùng thí nghiệm trong dung địch cao thử ở các nỗng độ

khác nhau Từ đó sơ bộ đánh gía độc tính đối với ấu trùng và tác dụng sinh học của được liệu

Cho 20 mi dung dịch thử vào đĩa petri thêm vào mỗi hộp petri mỗi hộp 10 ấu trùng Thực:hiện những mẫu chứng song song với thử nghiệm trong những điều kiện tương tự nhưng thay dung dịch thử bằng dung môi dùng để pha dung dịch thử Đếm số ấu trùng

chết sau 6, 12, 24 giờ

Cao nước và cao methanol của được liệu được thử ở nông độ 1; 0.5 và 0.1 mg/ml Mỗi dung dịch thử được thực hiện trên 3 hộp petri với tổng số 30 ấu trùng

Tính toán kết qủa

xác định % ấu trùng chết trong thử nghiệm ở mỗi nồng độ thử Nếu mẫu chứng có số

ấu trùng chết từ 5 - 20% thì kết qủa sẽ được điều chỉnh theo công thức Abbott :

Tổng số chết trong lô thử - Tổng số chết trong lô chứng

Tỉ lệ chết = x 100 ?

(Tổng số thử của lô chứng - số chết của lô chứng)

Bhan ll Phuong phd nghién atu 13

5.3 Độc tính trên trùn chỉ

5.3.1 Nguyên tắc chung

Thông thường, để khảo sát các thuốc có tác dụng trên giun sán, có hai mô hình thực

nghiệm :

1 Mô hình tiếp xúc : là một mô hình thử nghiệm đơn giản bằng cách cho giun thử

nghiệm tiếp xúc trực tiếp chất cần thử trong điểu kiện sống bình thường của giun Xác định độc tính của thuốc (gây chết, làm tê liệt v ) với giun ;

2 Thử nghiệm 3 mite d6 té bao : Nghién giun sdn để được hỗn dịch tế bào Những tế

bào này sẽ được tiếp xúc với thuốc và đánh giá tác đụng bằng máy Warburg

Tuỳ theo loại giun cần thử nghiệm mà điều kiện-thí nghiệm có thể được thay đổi cho phù hợp Những mô hình thử nghiệm như vậy phản ánh đúng tác dụng của thuốc trên

loại ký sinh trùng muốn tiêu diệt Tuy nhiên để thử nghiệm với một lượng lớn các mẫu

chưa biết rõ tác dụng, phục vụ cho việc sàng lọc các cây thuốc thì nhửng mô hình như vậy tổ ra không thích hợp vì việc nuôi các ký sinh trùng gây bệnh trên động vật đòi hỏi

những điều kiện đặc biệt về môi trường đinh đưỡng và nhiệt độ để duy trì sự sống của

ký sinh trùng Vì thế việc tìm ra một mô hình thử nghiệm đơn giản hơn, dễ thực hiện và

có thể tiến hành hàng loạt trong phòng thí nghiệm mà vẫn có mối liên hệ với tác dụng

trị giun là một điều cần thiết

Đã có những công trình nghiên cứu sử dụng các loài giun đất cho những thử nghiệm

ban đầu này Tuy nhiên việc sử dụng giun đất để thử nghiệm vẫn còn nhiễu trở ngại

trong điều kiện phòng thí nghiệm Qua tìm hiểu, chúng tôi đã khảo sát việc sử dụng một loại giun tròn nhỏ sống trong nước thường được gọi là “trùn chỉ” có tên khoa học là Limnodrilus hofaoisiery đỂ phục vụ cho thử nghiệm

Trùn chỉ là loài giun tròn nhỏ màu đỏ nâu, sống trên bể mặt lớp bùn của các dòng

sông, kênh rạch có dòng nước chảy, không sống được ở những nơi ao tù, nước đọng

Chúng bám vào bể mặt lớp bùn hoặc tụ với nhau thành đám Thức ăn là đất bùn có lẫn réu va 14 muc

Kết quả khảo sát (xem phần II-5.3.3 và II-5) cho thấy đây là một mô hình có đáp ứng

tốt với các hóa chất điểu trị gìun, có mối tương quan giữa tác dụng và nỗng độ hoá chất

sử dụng, thích hợp cho việc sàng lọc các cao chiết từ được liệu

Ưu điểm của việc sử dụng trùn chỉ là :

- Kích thước nhỏ (đường kính thân từ 0,1 - 0,5 mm, chiêu đài con trưởng thành từ 3 - 6cm) nên thuận tiện cho việc thử trong hộp petri với một lượng lớn mẫu thử và sinh vật thử (10 con hay nhiều hơn), đễ dàng cho việc tính toán thống kê

- Sống trong nước nên rất thuận tiện cho việc thử nghiệm với mô hình thử tiếp xúc

- Kích thước trùn nhỏ nên thể tích đung dịch thử nhỏ, ít tốn hoạt chất

- Trùn chỉ sống rất tốt trong điều kiện nuôi tại phòng thí nghiệm (trên 2 tháng) nên chủ?

Phan i Phuong phap nghien atu 14

động về sinh vật thử nghiệm Hơn nữa, rất dễ dàng mua được trùn chỉ tại các cơ sé mua

bán cá cảnh

5.3.2 Dụng cụ và phương tiện và vật liệu thử

—_ Trùn chỉ được mua tại các cơ sở nuôi cá cảnh tại Tp HCM Chọn lô trùn mới được vớt từ đưới sông Trùn mua về được nuôi trong nước sạch có đòng nước động thường xuyên Trùn chỉ sau khi đã được nuôi ổn định và khỏe mạnh trong vòng từ 2 tuần được dùng cho thử nghiệm

— Mebendazol : Viên nén chứa 500mg mebendazol

— Vinacor : Viên nén chứa 150mg levamisol

—_ Dung dịch thử là các cao chiết dược liệu được c pha và dùng ngay hoặc bảo quản

trong tủ lạnh trong vòng 12 giờ

- DMSO : Prolabo loại tinh khiết phân tích

—_ Các dụng cụ khác : đĩa petri có nắp đậy, pipet, bình định mtfc 50, 100 ml v.v

8.3.3 Phương pháp thử

Khảo sát sự đáp ứng của mô hình thử nghiệm

Để khảo sát sự đáp ứng của trùn chỉ với chất thử nghiệm và khả năng tương thích với các thử nghiệm trên các loài giun ký sinh trên người, thử nghiệm được tiến hành với hai

hoạt chất trị giun thông thường là mebendazoli và levamisol

Mebendazol được chiết bằng methanol trên bếp cách thủy trong vòng 15' ở 40°C lọc

và điều chỉnh thể tích dung dịch bằng methanol để có nông độ 10mg/ml Lấy chính xác 10ml dung dịch này vào chén sứ và cô trên bếp cách thủy đến khô Thêm vào cắn 0,5ml DMSO để giúp hoà tan và sau đó là 70 mÌ nước cất Cho dung địch vào bình định

mức 100ml, tráng chén sứ bằng nước cất và cho địch tráng vào bình định mức, bổ sung

nước cho đủ 100ml Dung dịch thu được có nồng độ 1mg/ml Lấy dung dich này pha loãng thành dung địch có các nồng độ : 0,1mg/ml; 0,01mg/ml và 0,001mg/mI

Dung dịch levamisol được chuẩn bị tương tự như dung dịch mebendazol

Cả hai loại thuốc này được thử trên trùn chỉ so sánh với dung dịch chứng là nước có

nỗng độ DMSO tương tự như dung dịch thử

Kết quả Xem phần II- 5) cho thấy trùn chỉ có đáp ứng với hai loại thuốc trên, vì thế

nó được sử đụng để sàng lọc các hoạt chất trong được liệu

Thử tác dụng của các cao chiết trên trùn chỉ

Chuẩn bị dung dịch thử

Cao chiết methanol của dược liệu được pha thành dung địch có néng d6 1 mg/ml trong nước cất có 0,5% DMSO (dimethyl sulfoxid) gitip cho sy hoa tan TY dung dich Img/ml

‘Rhian Nt -Rhuong phdp nghien atu 15

pha loãng 10 lần để được dung dịch 0,1mg/ml Dung dich 0,lmg/ml duoc pha loãng thêm 10 lần để có dung dịch 0,01mg/ml

Các cao chiết được thử ở 3 nồng độ lmg/mi; 0.img/ml và 0.01mg/ml trong các đĩa

petri Mỗi đĩa thử chứa 30ml dung dịch thử (cao chiết methanol, cao chiết nước và mẫu

trắng chỉ gồm dung môi, không có cao chiết) và 10 trùn chỉ

Mỗi nỗng độ được thử trên 3 đĩa petri với tổng số 30 con trùn chỉ Chọn những con trùn

trung bình, kích thước đều nhau, khoẻ mạnh, không bị đứt, không có phần thân mới tái

sinh, đùng giấy thấm gạt nhẹ những giọt nước bám theo Thả trùn vào các đĩa petri có chứa dịch thử Đậy hờ nắp, để yên nơi mát

Thử nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ phòng Các đĩa petri được đặt ở nơi mát, thoáng khí, không bị ánh nắng trực tiếp

Đánh gía kết quả

Đếm số lượng ấu trùng chết sau 6, 12 và 24 giờ Những số liệu này được sử dụng để

đánh giá hoạt tính của dược liệu Màu sắc và hình dạng của trùn bị chết cũng được ghi nhận

Kết quả % trùn chỉ chết ở mỗi nộng độ thử nghiệm được tính toán từ số lượng trùn chỉ chết trong mẫu thử và mẫu trắng theo công thức Abbott :

Tổng số chết trong lô thử - Tổng số chết trong lô chứng

Số còn sống trong lô chứng Các được liệu được xem là có tác dụng mạnh tai néng độ thử nghiệm khi trên 60% trùn chỉ bị chết sau 24 giờ

5.4 Thử độc tính và tác dụng gây chán ăn trên tằm

5.4.1 Đại cương

Cũng như các mô hình thử nghiệm trên Ar/eria salina; ấu trùng muỗi; giun tròn, một số

loài côn trùng cũng được sử dụng trong việc sàng lọc các cây thuốc Thử nghiệm sinh học trên côn trùng ngoài việc tìm hiểu độc tính chung của các cao chiết dược liệu tương

tự như các mô hình sàng lọc độc tính khác còn giúp định hướng cho việc tìm các loài?

Rhdn Ul -Rhuong phdp nghién atu 16

thực vật có tác dụng trên các loài côn trùng truyền bệnh hoặc côn trùng gây hại trong

nông nghiệp Trong để tài này chúng tôi thử tác dụng của các cao thuốc trên tăm với 2

hướng :

- Thử nghiệm độc tính của các cao thuốc trên tim như các mô hình thử nghiệm trên

Artemia salina, trên trùn chỉ và trên ấu trùng muỗi Thử nghiệm loại này chưa thấy

được sử đụng trong các mô hình thử nghiệm của các tấc giả trước đây

- Thử nghiệm tác dụng gây chán ăn (antifeedant) của các cao thuốc trên tầm

Thứ nghiệm tác dung gây chán ăn của các chất đã được nhiều tác giả trên thế giới thực hiện Các tác giả Yasuhifo Kojima và Natsuki Kato (1981) đã thử nghiệm hoạt tính gây

chán ăn trên ấu tring Spodoptera litura F Blaney và cộng sự (1988) đã thử nghiệm khả năng gây chán ăn của chất excelsin (phân lập từ cây Ailanthus excelsa) trên Spilosoma obliqua (loài sâu hại phát triển trên cây thâu đầu) Các tác giả Steven V Ley; James

C Anderson (1989) đã thử nghiệm khả năng ức chế tăng trưởng và gây chán ăn của chất azadirachtin và vài ñmonoid (được phân lập từ cây Azadirachta indica) trên các ấu

trùng Spodoptera litoralis và Spodoptera frugiperda Kubo và cs ở Đại học California thì dé nghị sử dụng các loài Pectinophora gossipiella (Sauder) (một loài sâu hại bông ở

nhiều vùng củ nước Mỹ) và Heliothis virescens (Fabr.) (loài sâu hại trên nhiều loại cây trồng như bông, thuốc lá, cà chua, đậu v.v ) cho các thử nghiệm antifeedant Các loại

sâu khác cũng được sử dụng trong thử nghiệm antifeedant là : Epilachna varivests, Spodoptera exempta, Eldana saccharina, Heliothis zea, Spodoptera eridania, Tribolium castaneum (ấu trùng của một loài sâu lúa) và Siophylus zeamais Người ta cũng sử

dụng Epilachna varivestis - loài bọ cánh cứng Mexico hay ấu trùng loài đế Locusia migratoria lam sinh vat thi nghiém

Theo Kubo, khéng có giới hạn trong việc chọn loại côn trùng thử nghiệm Tuy nhiên,

có 3 yếu tố cần được quan tâm khi chọn là : (1) Có ý nghĩa về mặt kinh tế - kết qủa

khảo sát có thể sử dụng vào thực tế; (2) Dễ thu thập trứng hoặc nuôi giữ côn trùng - nguồn sinh vật thử có sấn và ổn định, việc nuôi côn trùng trong phòng thí nghiệm qua

nhiều thế hệ có thể dẫn tới những thay đổi về mặt di truyển; và (3) Nhạy cảm với nhiều loại hoá chất Một điều cũng không kém quan trọng trong việc chọn côn trùng là

chúng không mang vào phòng thí nghiệm bệnh truyền nhiễm và các ký sinh trùng gây

bệnh

Tất cả các tác giả trên đều không ding tim Bombyx mori (L.) lam cén tring thiv nghiém Tuy nhién, theo Kubo, tim có thể được đùng để nghiên cứu các chất khác như

chất dẫn dụ sinh học hoặc chất kích thích ăn ở côn trùng

* Trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi khảo sát việc sử dụng tầm cho việc thử độc tính

và khả năng gây chán ăn của các cao chiết dựa trên những ưu điểm sau :

- Tầm là loài côn trùng đã được thuần hóa, không gây hại cho người

- Sinh vật thử nghiệm rất ổn định về mặt sinh học : giống tầm, quy trình nuôi dưỡng, tuổi tầm

- Có thể có một lượng lớn và ổn định tầm từ các cơ sở nuôi tầm phục vụ cho thi”

Phan Phuong pha nghien atu 17

nghiệm cùng một lúc nhiễu mẫu thử

8.4.2 Giới thiệu Tằm Bombyx mori L

Đặc điểm chung của tằm

Tầm là loại côn trùng được nuôi để lấy tơ - vòng đời của tầm từ 6-8 tuần lễ, tùy theo điều kiện khí hậu từng vùng nuôi và từng giống tầm lai khác nhau

Mọi giống tầm đều trải qua bốn giai đoạn biến thái rõ rệt gọi là vòng đời của tầm: Trứng tăm -> tăm => nhộng => ngài => trứng tầm

Mỗi giai đoạn biến thái, tầm có thời gian sống và đặc điểm hình thái khác nhau

Đặc điểm sinh học của Tằm

Tim có đạng một con sâu tổn tại trong khoảng từ 22 đến 23 ngày, và được chia làm 5

độ tuổi khác nhau : tuổi 1, 2, 3, 4, 5 Toàn thân con tăm được phủ một lớp kidn mồng, đẻo, có khả năng căng đài ra một cách đáng kể khi tầm lớn nhanh giữa các độ tuổi

Tầm có 6 đốt đầu; 3 đốt ngực và 11 đốt thân

* Ở phân đầu: các đốt thứ 2; 4; 5 mang các phần phụ, biến dạng tuân tự thành: râu, ham trén ham đưới và môi Hàm trên phát triển rất khỏe

* Ở phân ngực: về phía bụng, mỗi đết mang một cặp chân hình nón Mỗi chân có 3 đốt

và mang một cái vuốt sắc nhọn ở đốt cuối :

* Ở phần bụng: 3 đốt cuối lẫn vào nhau hình thành đốt thứ 9 Đốt thứ 8, mặt lưng có

mang gai đuôi Phần bụng mang 4 đôi chân

Tầm thể thông qua 9 đôi lỗ thở nhỏ nằm đọc hai bên hông ở giữa các đốt

Thức ăn của tằm là lá dâu tầm ( Morus aiba L.) Tăm phát triển rất nhanh từ tuổi này

sang tuổi khác Giữa hai độ tuổi kế nhau là một thời kỳ ngủ và lột xác (Bảng 1)

5.4.3 Thử nghiệm độc tính của cao dược liệu trên tằm

rổ nhựa để theo dõi Kết quả theo đõi được ghi nhận tại các thời điểm 30 phút, 60 phút,

6 giờ, 12 giờ và 24 giờ sau khi nhúng tằm xong.

‘Bhan Il -Rhuong phdp nghien atu 2

Becher, pipet khắc độ 1ml, pipet chinh x4c 5ml, 10ml; bình định mức 50ml, 100ml,

phếu, chai đựng dịch pha, đũa khuấy

* Cao nào có tác dụng gây chết sinh vật thử nghiệm ở nồng độ 2mg/ml, được pha loãng

tiếp thành các nông độ 1mg/ml; 0,5mg/ml; 0,1mg/ml; 0,01mg/ml để tiếp tục thử

* Số lượng mẫu thử nghiệm : 108 mẫu cao methanol và 113 mẫu cao nước từ các bộ phận khác nhau của 42 cây thuốc

Chọn phương pháp thử nghiệm

Qua khảo sát nhiều phương pháp gây độc cho tầm bằng các dung địch thử nghiệm, phương pháp nhúng được chọn sử dụng để thử cho tất cả các mẫu thử

Dùng vợt nhúng tầm (với mỗi lô 10 con tằm) ngập hẳn trong dung địch thử, nhúng vào

10 lần, mỗi lân 5 giây, thời gian nghỉ giữa hai lần nhúng kế tiếp là 5 giây Sau đó cho tầm lên tờ giấy lọc khô đặt trong rổ nhựa Đặt rổ vào đĩa nhựa rồi để lên kệ theo dõi

Đây là phương pháp khả thí nhất trong các phương pháp đã thử vì tỉ lệ tầm chết do chịu -

Khảo sát tính đáp ứng của mô hình thử nghiệm

Tầm được thử với các dung dịch chứng như nước cất và DMSO 0,5%, cùng với ¡ dung môi dùng để chiết xuất là methanol 50% và 2 chất bảo vệ thực vật thông dụng là dung địch rotenon và wofatox ở những nông độ khác nhau để khảo sát tính đáp ứng của tầm

với chất thử, tính phụ thuộc của độc tính vào nồng độ sử dụng của các chất thử Kết quả (xem phần II — 6) cho thấy mô hình thử nghiệm có đáp ứng tốt với chất thử nghiệm Tầm không bị chết trong các dung dịch chứng và khả năng gây độc của rotenon và - wofatox trên tầm phụ thuộc vào nồng độ dung dịch thử

Khảo sát ảnh hướng của tuổi tầm lên mô hình thử nghiệm

Để chọn tuổi tầm thích hợp nhất sử đụng cho thử nghiệm, tầm ở các độ tuổi 1, 2, 4, 5 được sử đụng để thử trong cùng một điều kiện Kết quả (Phần II - 6) cho thấy tầm tuổi

1 hoặc tuổi 2 có đáp ứng tốt nhất trên mô hình thử độc tính Trong các thử nghiệm về

sau tằm tuổi 1 (tầm sau khi nở 2 ngày) được sử đụng chính thức cho mô hình thử

Đánh gía kết quả

Trong thử nghiệm độc tính, kết quả thử nghiệm được ảnh giá theo quy ước như sau :

— : không có đáp ứng của sinh vật thử nghiệm (Tầm không bị chết, hoạt

động bình thường)

‘Phan ll Phuong phdp nghien atu 20

+ đáp ứng không rõ (có biểu hiện ngộ độc: tầm gục đầu; kém linh hoạt

hoặc bất động; ói dịch mầu vàng lục; hoặc không nhưng tất cả đều không

chết)

+: Tầm chết với tỷ lệ < 2/10 trong lô thử

++ : Tầm chết với tỷ lệ từ 3/10 đến 5/10 trong lô thử

+++ : Tầm chết với tỷ lệ từ 6/10 đến 10/10 trong lô thử

5.4.4 Thử nghiệm tác động gây chán ăn của cao dược liệu trên tằm

theo dõi, khi thức ăn ở lô chứng bị giảm khoảng 50%, đồng loạt bắt tầm ra khỏi tất cả các lô Cân xác định khối lượng lá dâu còn lại ở các lô, suy ra lượng lá dâu bị tầm ăn ở từng lô Trên cơ sở đó rút ra kết luận cho mục đích thử nghiệm

5.4.4.3 Vật liệu thử nghiệm

Nguyên liệu thử

Sử dụng 79 mẫu cao methanol, 80 mẫu cao nước và 2 mẫu cao chloroform từ các bộ

phận khác nhau của 35 cây thuốc

Bhd l| -9lupug pháp nghiếm alt 21

methanol khó tan, đùng chất trợ tan DMSO pha trước Lượng DMSO không quá 0,5%

trong dịch thử nghiệm

Khảo sát ảnh hưởng của tuổi tằm trên mô hình thử nghiệm

Khảo sát tăm ở các độ tuổi khác nhau trong cùng một điều kiện cho kết quả là tầm tuổi

5 là thích hợp nhất cho thử nghiệm tính gây chán ăn của các mẫu thử Tằm ở tuổi này

khỏe mạnh và ăn nhiều nên đáp ứng tốt hơn với thử nghiệm

Chuẩn bị thức ăn thử nghiệm

Lá dâu tươi mới hái về, sạch sẽ không bị sâu, không bị ướt được cắt thành những

khoanh tròn đường kính 25mm bằng đổ khoan nút chai Cân và xác định khối lượng cụ

thể cho từng lô thức ăn trên, với độ chính xác 0,01g

Ở mỗi lô thử nghiệm cũng như các lô chứng, sử dụng 15 phiến lá tròn đã cắt ở trên để làm thức ăn cho tầm -

Ngâm từng lô lá dâu trên trong từng dịch thử 2mg/ml hoặc đung dịch chứng (nước cất hoặc DMSO 0,5%) trong 30 phút Sau đó vớt ra và trải trên từng đĩa nhựa riêng biệt có đánh dấu Để táo nước một cách tự nhiên trong phòng thoáng

Tiến hành thử nghiệm

Khi lá dâu đã ráo nước, đồng loạt cho vào mỗi lô 5 tăm tuổi 5 được xác định khối lượng trung bình và không cho ăn trong thời gian 8 giờ trước khi thử nghiệm Ngoài các lô thử

, ba mau chứng được tiến hành song song là :

- Chứng nước: lá dâu ngâm nước cất và cho tằm ăn trong cùng điều kiện thử nghiệm

- Chứng DMSO 0,5%: ngâm lá dâu trong dung dịch DMSO 0,5% rồi cho tim ăn

- Chứng trắng: là lô lá đâu ngâm nước cất nhưng không cho tằm ăn để xác định độ hụt khối lượng tự nhiên của lá dâu trong điều kiện thử nghiệm

Mỗi loại cao chiết dược liệu và các mẫu chứng tiến hành trong cùng đợt thử nghiệm

được thực hiện 3 lô trong cùng một điều kiện

Theo dõi cho đến khi lá đâu ở lô chứng bị nước ăn khoảng 50% thì đẳng loạt bắt tầm ra

ở tất cả các lô Cân khối lượng lá dâu còn lại trong từng lô Tính lượng lá dâu tương ứng đã bị con tầm ăn trong mỗi lô Khối lượng thức ăn bị giảm được tính theo giá trị

trung bình của 3 lô thử nghiệm của mỗi mẫu thử

5.4.4.5 Đánh giá kết quả

Một cao dược liệu được đánh giá là có khả năng gây chán ăn, nếu chỉ số gây chán ăn

C-T,

C+T,

% > 75% Chỉ số này được xây dựng như sau :

k: hệ số giảm khối lượng tự nhiên của lá dâu

C¿: khối lượng lá dâu của lô chứng trắng trước khi ngâm nước (lô không cho tằm ăn).

‘Dhan I -Phuong phap nghién atu 22

C¡: khối lượng lá dâu của lô trắng ở thời điểm kết thúc thử nghiệm: k= =

9

Cọ: là khối lượng thức ăn của lô chứng nước đã bị ăn

C =kCoT—Ct

Toọ.¡: là khối lượng lá dâu của lô thử trước khi ngâm cao 1

T¡¡: là khối lượng lá đâu của lô thử cao ¡ ở thời điểm kết thúc thử nghiệm

T¡ : là khối lượng thức ăn của lô thử cao i đã bị ăn:

Ti =kTo4 - Tri

Để tiện theo đõi,trong các bắng kết quả, quy ước:

(+) : Mẫu thử có tính gây chán ăn đối với tầm thử nghiệm trong mô hình nay

(-) : Mau thử không có tinh gây chán ăn đối với tầm thử nghiệm trong mô hình này

(*) : thức ăn hoàn toàn không bị ăn

(**) : sinh vật ngộ độc và chết 100%

k: hệ số giảm khối lượng tự nhiên của thức ăn

C : khối lượng thức ăn ở lô chứng nước bị ăn

Ti : khối lượng thức ăn ở lô thử dược Hệu i bi an

M, : khối lượng trung bình của 5 tầm trong các lô

8.5 Thử tác dụng chống phân bào trên mô phân sinh rễ hành

Ung thư là một loại bệnh nan y mà y học thế giới cho đến ngày nay tuy đã có nhiều

thành tựu trong điều trị bệnh, nhưng số người mắc bệnh và chết vì bệnh ung thư còn rất

cao, chiếm tỉ lệ 20% tổng số trường hợp tử vong vì bệnh tật Theo thống kê của WHO, mỗi năm có khoảng 7 triệu người trên thế giới mắc bệnh ung thư và khoảng 5 triệu

người chết vì ung thư Ở Việt Nam ước tính vào khoảng 70.000 — 100.000 người mắc bệnh ung thư hàng năm

Các phác đồ điều trị ung thư hiện nay thường là kết hợp giữa phẫu thuật và hóa trị liệu hoặc 3a trị và hóa trị để tăng hiệu quả chống lại tế bào ung thư Các thuốc dùng để

điểu trị ung thư biện tại có hai loại chính :

Các chất độc đối với tế bào : Thuốc ngăn chặn sự sinh trưởng hoặc sự sinh sản của tế bào với nhiều cơ chế khác nhau trong đó có ngăn chặn sự phân bào (như các chất

chống phân bào : colchicin, vinblastin, vincristin)

Các thuốc kích thích miễn địch : Kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chống lại các

tế bào ung thư

Để nghiên cứu các thuốc trị ung thư bằng cơ chế độc với tế bào, các mô hình thử

nghiệm tác dụng của thuốc trên các dòng tế bào, các tổ chức của cơ thể sinh vật được

sử dụng Một trong những thử nghiệm đơn giản trên sự sinh sản tế bào được sử dụng :

trong những nghiên cứu các chất chống phân bào được sử dụng từ lâu là thử nghiệm

Rhan ll Phuong phdp nghién atu 23

trên tế bào mô phân rễ hành So với những mô hình thử nghiệm xây dựng sau này, phương pháp này có ưu điểm là rất đơn giản và dễ thực hiện trong các phòng thí

nghiệm mà không đòi hỏi trang thiết bị, điểu kiện phòng thí nghiệm hay con người được đào tạo đặc biệt

5.5.1 Dai Cuong

Chu trình sinh sản và phát triển của tế bào

Các tế bào sinh dưỡng động vật và thực vật đều trải qua quá trình sinh sản giống nhau

để hình thành thế hệ tế bào mới giống hệt tế bào mẹ, đảm bảo thông tin di truyền được

ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác Tế bào ung thư cũng có cùng chu trình sinh sản

như vậy nhưng sinh sản, vô tổ chức và không theo nhu cầu của cơ thể, tạo nên khối tế

bào ung thư chèn ép và xâm lấn các mô, các tổ chức xung quanh, làm ảnh hưởng đến

các chức năng sinh lý bình thường của các tổ chức này

Quá trình sinh sản của tế bào gồm một chuỗi các sự việc lặp lại được gọi là chu kỳ tế

bào (Hình 2)

(i) Pha Gy

Pha G¡ là pha nghỉ của chu trình tế bào sau khi tế bào thực hiện sự phân chia thành hai

tế bào con ở pha M Thời gian kéo dài của pha này là yếu tố chủ yếu để xác định thời gian của một chu kỳ tế bào Trong suốt pha G¡ không có sự tổng hợp ADN, nhưng sự g hợp ARN và protein diễn ra bình thường và sau đó tế bào chuyển sang pha S

Bhan il “Rhuong phdp nghicn ctu 24

(iii) Pha Go

G2 la một pha nghỉ tiền phân bào xây ra ngay sau pha S Sự tổng hợp ADN đã dừng lại trong khi sự tổng hợp ARN và protein vẫn tiếp tục

(iv) Pha M (nguyean phaan)

La giai đoạn tế bào phân chia thành hai tế bào con Trong suốt quá trình nguyên phân mức độ tổng hợp ARN và protein giảm Nhiễm sắc chất tụ lại thành nhiễm sắc thể và

sợi tiên nhiễm sắc thể tách ra, tế bào phân chia Tế bào thực hiện xong một chu trình tế

(v) Pha Go

Sau giai đoạn nguyên phân các tế bào có thể bước vào một giai đoạn nghỉ khác gọi là pha Go Pha này thực ra không phải là một pha thực sự của chu trình tế bào Ở giai đoạn này, tế bào không phân chia, không chuyển hóa tích cực nhưng vẫn có khả năng tăng sinh Các thuốc chống ung thư ít tác động vào giai đoạn này Để có thể tác động lên tế bào ở pha Gọ, các thuốc chống ung thư phải kích thích các tế bào này bước vào giai

đoạn phân chia bằng cách giết một lượng tế bào đang phân chia

Các thuốc có độc tính trên tế bào khác nhau có thể ảnh hưởng lên các pha khác nhau

của vòng tế bào

Giai đoạn nguyên phân (gián phân) - pha M là quá trình tế bào tách ra thành hai tế bào con, pha này được chia thành : tiền kỳ (prophase), biến kỳ (metaphase); tiến kỳ

(anaphase) và hậu kỳ (telophase)

Tién kỳ : nhiễm sắc chất trong nhân đần dần rõ dạng, đầu giai đoạn này có dang chấm nhuyễn mịn đều, sau là chấm sậm hoặc dấu phẩy sợi đài tương ứng với nhiễm sắc thể Mỗi nhiễm sắc thể gồm 2 thành phần gọi là nhiễm sắc tử (chromatid) sát nhau ở vùng đặc biệt gọi là tâm động, vị trí tâm động rõ vào cuối tiền kỳ, nhiễm sắc thể xoắn tương đối xoắn nhiều Nhân còn đạng tròn, hạch nhân mờ dân, màng nhân biến mất và có sự thành lập thoi vô sắc

Biến kỳ: các nhiễm sắc thể nằm cùng một mặt phẳng thẳng góc với thoi vô sắc gọi là tấm xích đạo Nhiễm sắc thể ở trạng thái cực xoắn có hình thái đặc trưng nhờ vị trí eo thắt

Tiến kỳ : giai đoạn này bắt đầu lúc tâm động tách đôi Hai nhiễm sắc tử của mỗi nhiễm

sắc thể hoàn toàn tách rời hẳn nhau và mỗi nhiễm sắc tử trở thành một nhiễm sắc thể

* Các nhiễm sắc thể con trượt trên thoi vô sắc di chuyển về một trong hai cực mỗi cực có đúng số nhiễm sắc thể mà tế bào có Sau đó thoi vô sắc biến mất dân

Hậu kỳ : tế bào có 2 bộ nhiễm sắc thể là hai bộ giống nhau, có sự hình thành trở lại

màng nhân bao quanh mỗi bộ nhiễm sắc thể tạo hai tế bào con Hạch nhân rõ đạng dần Màng tế bào mới xuất hiện khoảng giữa tế bào và ngăn tế bào mẹ thành hai tế bào con

Nhờ những cơ chế đặc biệt, mỗi tế bào con nhận được số lượng nhiễm sắc thể đứng như

‘Bhan II - lu pháp mạ hiền atu 25

của tế bào mẹ Tuy nhiên, vì một lý do nào đó (như hóa chất, tia xạ v.v ) có thể xẩy ra

những bất thường trong quá trình phân bào làm cho số lượng nhiễm sắc thể ở tế bào con nhiều hơn hay ít hơn so với tế bào mẹ Khi đó sẽ dẫn đến những sai lệch rõ rệt chức năng tế bào so với bình thường, thậm chí có thể dẫn tới làm chết tế bào

Những bất thường xảy ra trong quá trình phân cắt tế bào thực vật và mối liên

quan đến việc tìm ra các chất chống phân bào

Hai bất thường thường gặp trong qúa trình gián phân là : nội gián phân và phân bào

chậm

Nội gián phân

Trong nhiều tế bào, nhất là tế bào đang biệt hóa, nhiễm sắc chất tăng lên vì một sự phân cắt đặc biệt của nhân Màng nhân vẫn nguyên song nhiễm thể tự chẻ một hay nhiều lân Nhân nội gián phân chứa số nhiễm sắc thể là 4n, ồn,

Sự phân bào chậm

Sự phân bào chậm dẫn đến sự hình thành nhân đa bội bởi một cơ chế đặc biệt mà chủ

yếu là việc không hình thành thoi vô sắc

Sự phân bào chậm được biết lần đầu tiên ở mô động vật hay thực vật dưới tác động của colchicin Sau đó, người ta đã tìm ra những chất khác có khả năng gây bất thường tương

tự như colchicin Chúng được gọi là “chất làm phân bào chậm” hay “chất phá hủy

phân bào”

Dưới tác dụng colchicin, nhiễm sắc thể trong tiến trình phân bào vẫn tái bẩn và hình

thành nhiễm sắc tử Tuy nhiên, do thoi vô sắc không xuất hiện khi bước vào biến kỳ

nên dù có tâm động các nhiễm sắc thể vẫn nằm rải rác khắp tế bào Các nhiễm sắc tử vẫn nằm kể cận có dạng song song từng đôi gọi là giả tiến kỳ Vào giai đoạn cuối,

màng nhân được hình thành bao quanh bộ nhiễm sắc thể đã nhân đôi nên nhân tứ bội

có kích to chiếm gần hết tế bào

Dưới tác dụng của colchicin quá trình này được lặp lại Nhân tứ bội phân chia như trước

đó và một nhân bát bội hình thành Người ta có thể quan sát và đếm được l6n nhiễm

sắc thể, nhân này tăng lên thành đa bội và nhân này thường là không đều, có thùy hay đạng amib

Ngoài ra còn có thể quan sát những rối loạn khác : ở tiền kỳ 1 thoi vô sắc thô sơ tạo

thành, tế bào có 2 nhân nối nhau bởi cầu nhiễm sắc thể, hay thoi có 3 cực tạo nên tế

bào với 3 nhân không đều sau phân chia, hay vách ngăn không hình thành giữa các

„nhân khác nhau tạo tế bào có 2 nhân đính và tạo các tế bào với 2 nhân hoặc 3 nhân, Song song với những bất thường phân bào này, người ta quan sát thấy rễ ngắn lại, đầu

rễ phổng to hơn dạng lưỡng bội, là do tế bào lẽ ra phải kéo dài song song với trục rễ lại

phát triển ra mọi hướng như nhau

Tất cả các hiện tượng trên đều có thể phục hổi ngay sau khi ngưng tác động của hoạt

chất chống phân bào Sự phân bào chậm có thể lấy lại nhịp độ bình thường.

‘Phan ll Phuong phap nghien atu 26

Các tác nhân vật lý hay hoá học còn có thể ra gây ra sự thay đổi nhiễm sắc thể như đứt

đoạn ngẫu nhiên, đứt ở điểm cuối hoặc khoảng giữa nhiễm sắc thể, hay gây ra dồn và

dính nhiễm sắc thể do ảnh hưởng đến sự giải trùng hợp ADN làm cản trở sự phân chia

của nhân

Tìm kiếm những chất có tác đụng chống phân bào, người ta có thể hy vọng đến việc sử dụng những chất ức chế phân bào trong việc chống lại bệnh ung thư, bệnh bạch huyết Colchicin, podophylEn, các dẫn chất amin, trimethylen melanin là những chất đã cho kết qủa đáng khích lệ

5.5.2 Thử nghiệm tác dụng chống phân bào của các cao chiết dược liệu

trên mô phân sinh rễ hành ta Allium ascalonicum L

Phương pháp và điều kiện thử nghiệm

Sử dụng mé phan sinh ré hanh ta Allium ascalonicưn L để thử tác dụng của các cao chiết được liệu trên sự phân bào theo phương pháp Deysson Củ hành ta sau khi được chọn lọc cẩn thận cho vào lọ nuôi với dung dịch nuôi dưỡng Knop 1⁄2 trong 24 giờ cho những rễ có chiểu dài thích hợp để thử nghiệm (khoảng 1-1.5 cm) những cao chiết metanol hay nước của các được liệu được thử nghiệm ở các nồng độ : Img/ml,

0 1mg/ml, 0.01mg/ml Mỗi mẫu thử nghiệm đều có mỗi đối chứng song song Mỗi nồng

độ và mỗi thử / nghiệm được thử trên nhiều bụi hành Những củ được chọn là những củ

cho ra nhiều rễ đều nhau và khi quan sát sinh mô không thấy có những tế bào bất bình

thường

Các thử nghiệm được thực hiện trên tế bào mô phân sinh rễ hành ta ở điều kiện nhiệt

độ phòng thí nghiệm và pH của các dung dịch cho phép từ 5 - 5.5 (đo bằng chỉ thị vạn năng)

Ở mỗi thứ nghiệm củ hành được đặt vào lọ nuôi đựng dung dịch thử Sau 4 giờ, 24 giờ

cắt mô phân sinh chóp rễ đem nhuộm trong orcéin rồi quan sát, nhận xét sự phân bào đông thời quan sát hình thái và đo chiều dài của rễ Sau thời gian tác động của thuốc, mẫu được nuôi lại trong dung dịch Knop 1⁄2 để quan sát lại sự phân bào sau khi ngừng tác động của thuốc

Phương pháp của Deysson sử dụng có các ưu điểm :

— Đơn giản, không đồi hỏi trang thiết bị, dụng cụ phức tạp

— Nhanh

~ C6 thể áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm của trường

—_ Đủ chính xác để chỉ rõ mối liên quan giữa các thành phân và tác dụng tới tế bào sinh vật

Củ hành ta được chọn để thử là do dễ kiếm, số lượng nhiễm sắc thể ít (2n = 16), nhiễm -

sắc thể to nên đễ đàng quan sát, rễ mọc nhanh (sau 24 giờ đạt chiều dai 1-1.5cm) .

Bhan il -Phuong phao nghién alu 27

Cach tién hanh

Dụng cụ và nguyên liệu thử nghiệm

—_ Cao được liệu (cao chiết methanol và nước)

—_ Củ hành, được chọn lọc cẩn thận cho phù hợp với yêu cầu thứ nghiệm

—_ Lọ nuôi bằng thủy tỉnh

— Chén sứ nhỏ

—_ Kính hiển vi

—_ Một số dụng cụ khác như : bình định mức, pipette 1ml; 5ml; 10ml, giấy thấm, giấy

bìa cứng, thước đo phân vạch đến ram

—_ Metanol: loại công nghiệp ( Singapore ), được cất lại theo phương pháp thường, lấy

ở phân đoạn có nhiệt độ sôi là 64-67°C Bỏ phân đoạn đầu và cuối

~ DMSO (dimethyl sulfoxide ) S& dung loai tinh khiét phan tich (Fluka A.G)

— Tween 80: loai ding trong bao ché

—_ Các muối: canxi nitrat, kali nitrat, kali đihydro phosphat, magie sulfat, kali clorid, s&t III clorid

—_ Nước cất

— Phẩm nhuộm orcein

- Acid acetic, acid clohydric

Chuẩn bị các vật liệu thử

Thanh phan cho i lit dung dịch Knop nguyên

Kali nitrat 0.25¢ SAt III clorid 5% 1 giot

Kali dihydro phosphat 0.25g Nuc cat vd 1 lít

Magie sulfat 0.25g PH = 5-5.5 (chi thi van nang)

Pha thuốc nhuộm theo công thúc

Orcéin 1g

Acid acetic 45ml

Nước cất 54ml

+ Chuẩn bị củ hành

Củ hành được chọn lựa xong, lột vỏ bao bên ngoài, rửa sạch, rửa lại 3 lần với nước cất

và 2 lần trong Knop 1⁄2 Đặt trong bình nuôi với dung dịch Knop 1⁄2 24 giờ sau chọn

những củ hành có đa số rễ dài từ 1-1.5cm và trong sinh mô quan sát không thấy tế bào

bất thường để thử

Pha dung dịch thử và dung dịch chứng

Tả ll Phuong pha nghien cay - 28

Cao metanol : cân chính xác 50mg cao trên mặt kính đồng hỗ, thêm 0.25mi DMSO,

khuấy kỹ cho đến khi cao tan hết Cho vào bình định mức 50ml, thêm nước cất vừa đủ 50ml, lắc đều được dung địch có nông độ 1mg/ml Nếu cao khó tan diing Tween 80 để héa tan (lugng cho vao 1a 0.1% so theo thể tích) Từ dung dịch Img/ml pha lofng vdi nước cất để được các dung địch có nồng độ loãng 0 1mg/ml và 0.01mg/mI

Cao nước : chuẩn bị như cao metanol, nhưng không có DMSO hoặc Tween 80

Dung dich ching : có nồng độ DMSO hay Tween 80 tương ứng với nông độ của chúng

trong dung dịch thử

Tiến hành th nghiệm

Các mẫu được thử ở nễng độ 1mg/mI, nếu có tác dụng sẽ được thử ở nồng độ thấp hơn

Củ hành được đặt vào đung địch thử ở nồng độ quy định Sau 4 và 24 giờ, quan sát hình thái và đo chiểu dài rễ so với chiều dài rễ trước khi thử nghiệm Cắt ít nhất là 3 chóp rễ

ở mỗi mẫu thử nghiện, nhuộm với 0.5ml dung dich orcéin va 1 giot HCl IN trong 1-2 giờ Quan sát sự phân bào dưới kính hiển vi quang học (soi trong dung dich orcein) Đếm tổng số tế bào ở metaphase và ở anaphase, đếm tổng số những tế bào có bất thường ở metaphase và ở anaphase Quan sát những bất thường khác trong sự phân chia

tế bào Sau thử nghiệm, củ hành được nuôi lại trong dung địch knop 1⁄2 và theo đối sự hồi phục của rễ

Tiến bành tương tự với mẫu trắng

Đánh giá kết quả

- Xác định tỉ lệ tăng trưởng của rễ ở mẫu thử so với mẫu trắng không chứa cao thử

- Đánh gía sự phục hồi của rễ sau khi nuôi lại trong dung dịch Knop 1⁄2 và những bất thường về hình thái của rễ, nếu có, trong quá trình thử nghiệm

- Xác định tỉ lệ tế bào bất thường ở metaphase và ở anaphase của mẫu thử so với tổng

số tế bào của mẫu thử ở metaphase và ở anaphase So sánh tỉ lệ này với mẫu trắng

không chứa cao thử

- Đánh giá những bất thường của tế bào trong quá trình phân bào

6 NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC

Sau khi thử nghiệm và đánh giá tác động của các cao chiết trên các mô hình thử sinh

“học iz viro, chọn những cây thuốc có tác dụng tốt, có nhiễu hứa hẹn để tiếp tục nghiên

cứu hóa học

Các cây thuốc được chọn được chiết thành các phân đoạn dựa vào độ phân cực của chúng với các dung môi có độ phân cực khác nhau Các phân đoạn chiết này được thử tác dụng sinh học Trên hai mô hình thử nghiệm là brine shrimp và chống phân bào trên rễ hành để định hướng vào các phân đoạn có tác dụng l

Rhdn it _ P9Jpwg pháp nghien atu 29

Các phân đoạn có tác dụng được tiếp tục phân tách thành những phân đoạn đơn giản

hơn và sau cùng là các chất tinh khiết băng các phương pháp sắc ký như sắc ký cột, sắc

ký lớp mỏng điều chế v.v trên silica gel và các vật liệu đảo pha (Quy trình chiết xuất

và phân lập các hợp chất sẽ được mô tả cụ thể trong phan IV 9)

Các chất tỉnh khiết được xác định cấu trúc bằng các phương pháp quang phổ như quang phổ tử ngoại, hỗng ngoại, khối phổ và cộng hưởng từ hạt nhân (chỉ tiết các thiết bị được trình bày ở phần kết quả)

PHAN III

KET QUA NGHIEN CUU

‘Bhan ll - Ket gud nghien atu 30

1 DANH SÁCH MẪU NGHIÊN CỨU

Các dược liệu được sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê theo thứ tự tên Việt nam

gồm: Tên Việt nam, tên la tỉnh, họ thực vật, nơi và thời gian thu thập mẫu, bộ phận dùng trong thử nghiệm và đặc điểm bột được liệu

Ba dót - Eupatorium triplinerve Vahl., Asteraceae (Tp HCM 3/ 1998)

Cành mang lá - Bột màu xanh rêu

Ba bénh - Euricoma longifolia Jack Subsp longifolia, Simaroubaceae (Mua tai Tp

Rễ - Bột màu đỏ nâu, mùi hắc, buôn nôn

Bach trinh - Hymenocallis speciosa Salisb., Amarillidaceae (Tp HCM - 3/ 1997)

Muối berberin chlorid, Bột khô tơi màu vàng

Bi d6 - Cucurbita maxima Duch ex Lam., Cucurbitaceae (Tp HCM - 6/1997)

Thân lá - Bột màu nâu, có nhiều xơ

Hạt - Bột màu xám nhạt

Binh bat - Annona reticulata L., Annonaceae (TpHCM - 3/1998)

Lá - Bột màu xanh rêu

Vỏ thân - Nâu, ít xơ

Vỏ rễ - Màu nâu

Gỗ thân - Mầu vàng

Gỗ rễ - Màu vàng

Hạt - Màu nâu, đính ướt

Binh Véi Bién - Stephania pierrei Diels, Menispermaceae (Phan thiét - 1990)

Củ — Bột màu trắng xám nhạt

Bình Vôi Đồng Nai - Stephania sp., Menispermaceae (Đồng Nai - 4/1988)

Lá — Bột màu lục nâu

Phan i Ket gud nghien ou 31 Thân - Bột màu vàng

Củ — Bột màu vàng xám

Béng né - Fluggea virosa Wall., Euphorbiaceae

+4 - Bột màu lục nhạt

Thân - Bột màu nâu nhạt

Bễ kết tây (Còng) — Albizia lebbeck (L.) Benth., Fabaceae (Tp HCM ~ 3/1998)

Lá — Bột mau nâu đậm, nhiều xơ

"Thân cành - Bột màu nâu đỏ

Bưởi - Cữrus grandis Osbeck, Rutaceae (Bến tre ~ 3/1998)

Thân - Bột nhiễu xơ, vị hơi ngọt

Cam thảo nam - Scoparia dulcis L., Scrophulariaceae (Tp HCM - 6/1997)

Phần cây trên mặt đất - Bột màu lục nâu

Rễ - Bột màu vàng nâu.

Quy Ni - Ket gud nghien atu 32

Cu Ding - Uncaria sp., Rubiaceae (An giang - 8/1 996)

Thân có móc câu - Bột có màu nâu đồ

Cau ding — Uncaria sp., Rubiaceae

Than — Bột màu nâu dé (mua tai Tp HCM — 3/1998, Xuất xứ : Trung quốc)

Thân — Bột màu nâu đỏ (mua tại An giang - 7/1995, Xuất xứ : Việt nam)

Chanh - Citrus aurantifolia Swingle, Rutaceae (Bén tre ~ 3/1998)

Chó đẻ răng cưa - Phyllanthus urinaria L Euphorbiaceae (Thủ Đức - 3/1997),

Toàn cây cả rễ - Bột có màu xanh lá với nhiều xơ

Chim ruét - Phyllanthus acidus (L.) Skeels, Euphorbiaceae (An Giang - 3/1997)

Vỏ thân chùm ruột - Bột có màu nâu đỗ có mùi thơm,

Vỏ rễ chàm ruột - Bột có mầu nâu đen

Gỗ rễ chùm ruột - Bột có mầu xám nâu,

Gỗ thân chàm ruột - Bột có mầu nâu nhạt

Cò sen - Miiliusa velutina (Dunal) Hook et Thoms., Annonaceae (An giang - 7/ 1995)

Gỗ thân - Bột màu vàng

Gỗ rễ - Bột màu nâu nhạt

Cô lào (Yên bạch) - Eupatorium odoratum L., Asteraceae (Tp HCM - 6/1997)

Lá - Bột màu nâu nhạt, thơm nhẹ

Thân - Bột màunâu nhạt

Rễ - Bột màu vàng nhạt

Có seo gà (Cổ luỗng) — Peris ensformis Burm., Pteridaccae (Tp HCM -~ 3/1998)

Lá - Bột màu lục

Có sữa 14 16n - Euphorbia hirta L Euphorbiaceae (TPHCM - 3/1997)

`_ Toàn cây cả rễ - Bột có màu xanh lá nhạt

Cổ sữa lá nhỗ - Euphorbia thymifolia L Euphorbiaceae (TPHCM - 3/1997)

Toờn cây cả rễ - Bột có mầu nâu nhạt

Có xước — Achiranthes aspera , Acanthaceae (mua tại Tp HCM)

Rễ củ - Nâu nhạt

Cổ xước bông dé - Cyathula prostrata L., Amaranthaceae (Tp HCM 7/1997)

Toàn cây trên mặt đất - Bột có màu lục.

Phan Il Ket gua nghien cu 33

Thân - Bột có nhiều xơ, vị đắng

Dén gai - Amaranthus spinosus L., Amaranthaceae (Tp HCM - 5/1997)

Thân - Bột màu nâu nhạt, vị đắng

Âễ - Bột màu nâu, vị đắng

Đừng lạc - Pisonia umbellifera (J et G Forst.) Seem., Nyctaginaceae (An giang - 5/1997)

Thân - Bột có màu vàng chanh, nhiều xơ

Lá - Bột có màu lục nâu

Đa đa — Harrisonia perforafa , Simaroubaceae (Đồng nai — 3/1998)

Lá —- Bột màu đỏ nâu

Thân - Bột màu nâu

Đại bí (Từ bì) - Buunea balsamifera D.C., Asteraceae (Tp HCM - 3/1997)

Lá - Bột màu vàng lục, mùi băng phiến

Thân - Bột màu nâu, nhiều xơ

Đại hoa d6 - Plumeria rubra Apocynaceae (Tp HCM - 7/1997)

[4 - B6t mau nau, vi hoi ngot

Vỏ thân - Bột có nhiều xơ, vị đắng

Hoa - Bột màu đỏ sậm, rất thơm

Đại hoa trắng - Plumeria rubra var acutifolia Apocynaceae (Tp HCM - 7/1997) :

+4 - Bột màu nâu, vị hơi ngọt

Rhdn I Ret gud nghicn ott 34

Võ thân - Bột có nhiều xơ, vị đắng

Hoa - Bot rat thom

Đại Phong Tu - Hydnocarpus anthelmintica Pierre ex Laness, Flacourticaceae (Mua tai

Tp HCM — 3/1998)

Vỏ hạt - Bột mầu nâu

Nhân hạt - Bột nhiều đầu, màu vàng nâu, mùi đạc biệt

Dầu hạt ~ Dầu sánh mầu vàng, mùi đặc biệt

Don ld 46 — Excoecaria cochichinesis , Euphorbiaceae (An giang — 3/1998)

La

Đơn lá đỏ -Excoecaria bicolor Hass Euphorbiaceae (L4i Thiéu - 4/1997)

Lá đơn lá đỏ : bột có mầu xanh đồ lẫn lộn

Thân cành : bột có mầu nâu

Du di - Carica papaya L., Caricaceae (Tp HCM - 4/1997)

Phiến lá - Bột màu lục

Thân - Bột màu vàng nhạt, có xơ

Rễ - Bột trắng ngà, có xơ

Hạt - Bột màu nâu đen

Eicus sp Moraceae (Quảng ngãi)

Gáo vàng - Nauclea orientalis Rubiaceae (Hải Dương - 5/1997)

Vỏ thân - Bột có nhiều xơ, vị đắng

Giác đế - Goniothalamus giabracianus (Baill.) Ast., Annonaceae (An giang - 5/1995)

Lá - Bột màu nâu

Rễ - Bột màu vàng đậm

Gối hạc - Leea rubra Leaceae (Tp HCM - 6/1997)

Lá - Bột mau lục, không mùi vị

Hà thủ 6 dé - Poligonum multiflorum Thunb., Polygonaceae (Mua tại Tp HCM - 5/1997)

‘Rhdn il Ket gud nghién ctu 35

Lá - Dùng dạng tươi

Hoa - Dùng dạng tươi

Hạt - Bột màu xám

Hoàng bì - Murraya koenigii (L.) Spreng., Rutaceae (Tp HCM — 7/1997)

Lá - Bột màu rêu, có mùi thơm đặc trưng, vị đắng hơi cay

Vỏ thân - Bột mầu xám nâu vị đắng hơi cay

Hoàng lan (Ngoc Ian tay, Ylang y lang) - Cananga odorata (Lam.) Hook f Et Thoms.,

Annonaceae (Tp HCM - 5/1997)

Lá - Bột màu nâu đen, có mùi thơm

Vỏ thân - Bột màu nâu đen, có mùi thơm

Vỏ rễ - Bột mầu nầu đen, có mùi thơm

Hoang lién - Coptis chinensis., Ranulculaceae (Mua tai Tp HCM - 5/1997)

Ké đầu ngựa — ÄXanthium strumarium L., Asteraceae (mua tai Tp HCM)

Quả - Bột màu nâu

Khién nguu (Bin bim, Hic stu) - Ivomea hederaceae J: acq., Convolvulaceae (An giang - 5/1997)

Hạt - Bột màu nâu đen, nhiều chất béo

Lưỡi rắn (Tp HCM - 1/1997)

Toàn cây - bột màu lục nhạt

Mạn kinh tử - Vitex trifolia Lin Verbenaceae

Hat - (Trung tâm dược liệu Quận 5, Nha Trang - 4/1997)

Mãng cẫu ta - Annona squamosa L., Annonaceae (TpHCM - 3/1998)

+ Lá Màu xám

Vỏ thân Mầu nâu, nhiều xơ

V6 ré Màu nâu, có xơ

Gỗ thân Vàng nhạt

Gỗ rễ Màu vàng nhạt

Hạt Xám trắng, dính tay

Mãng cầu xiêm - Annona reticulataL., Annonaceae (Bến tre - 4/1998)

Lá - Xanh lá, mùi thơm

Vỏ thân - Màu nâu, nhiều xơ

Bhan lil Ket gud nghién atu 36

Vỏ rễ - Màu nâu, nhiều xơ

Gỗ thân - Màu nâu xám

Gỗ rễ - Màu xám

Hạt - Nâu đen, ướt

Me - Tamarindus indica L., Fabaceae (Tp HCM - 6/1997)

Rễ - Bột màu nâu, mùi thơm gắt

Miu u - Calophyllum inophyllum , (Tp HCM — 3/1998)

Lá - Bột lá màu lục

Vỏ thân

Nhân hạt

Murdania — Muzdania sp , Comeliaceae (Kiên giang — 8/1997),

Toàn cây trên mặt đất — Bột màu lục nâu

Mướp đắng - Momordica charamia L., Cucurbitaceae (Tp HCM - 3/1997)

Lá - Dùng dạng tươi

Thân - Dùng dạng tươi

Quả - Dùng dạng tươi

Hạt - Dùng dạng tươi

Náng hoa đồ - Crinum defixum Ker Gawl, Amaryllidaceae (Tp HCM - 3/1997)

Lá - Bột màu xanh nâu

Thân hành - Bột màu trắng hơi nâu

Nang hoa Trang (Đại tướng quân) - Criun Asiaticum L Amaryllidaceae (Tp HCM - 3/1997)

Lá - Bột màu xanh nâu

Thân hành - Bột màu trắng hơi nâu

Nga truật - Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe, Zingiberaceae (Mua tai Tp HCM -

3/1997)

Than ré - B6t mau vang chanh, c6 mii dac trung, vị hơi đắng

Ngai luc binh - Zurycies amboinensis (L.) Loudon, Amarillidaceae (An giang - 7/1995)

Thân hành - Bột màu trắng ngà

Nghệ - Curcuma longa L., Zingiberaceae (Tién giang - 3/1997)

Thân rễ - Bột màu nghệ, mùi thơm đặc trưng :