Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)

Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)

ĐẶT VẤN ĐỀ

HIV gồm có 2 týp sinh học đó là 1 và 2, trong đó

HIV-1 đang lan tràn và gây đại dịch phạm vi toàn cầu HIV-HIV-1 có đặc tính

đa dạng di truyền cao được phân thành các nhóm (Groups), các phân týp (Subtypes), các dạng dưới phân týp (Sub-subtypes) và các dạng tái

tổ hợp (Circuling recombinant forms - CRFs) HIV-1 gồm có 4 nhóm:

M, O, N và P, trong đó nhóm N và O chỉ thấy ở Tây Trung Phi Nhóm

P mới phát hiện ở Cameroon là nhóm rất hiếm Nhóm M có tính đa dạng di truyền cao phổ biến nhất, đã và đang lây lan nhanh phạm vi toàn cầu Nhóm M được chia làm 10 phân týp gồm: A, B, C, D, E, F,

G, H, J và K nhưng chỉ có 7 phân týp hay gặp nhất từ A đến G Ngoài

ra còn phát hiện khoảng 51 dạng tái tổ hợp và nhiều biến thể chưa xác định được phân týp Điều đặc biệt là các phân týp phân bố mang tính trội cho từng vùng địa lý khác nhau trên bản đồ toàn cầu và mỗi phân týp lại có tính trội theo đường lây truyền nhất định, kết quả thu được

từ vùng Sahara châu Phi cho rằng phân týp A, C, D và E của HIV-1 thích nghi lây truyền qua đường tình dục khác giới, còn phân týp B lại

ít hiệu quả truyền qua con đường này; ở Bắc Mỹ, Tây Âu, Đông Nam

Á phân týp B lại hiệu quả truyền qua tiêm chích ma tuý và giữa cá nhân đồng tính; ở Thái Lan, phân týp B trội ở những đối tượng tiêm chích ma túy, phân týp E trội ở những trường hợp lây nhiễm qua đường tình Vì vậy nghiên cứu về phân bố các phân týp, các dạng tái

tổ hợp của HIV-1 có giá trị giám sát dịch tễ học tầm khu vực và toàn cầu liên quan đến chiến lược dự phòng, phát triển vaccine thích hợp cho từng khu vực, làm cơ sở cho việc lựa chọn liệu pháp kháng virus, triển vọng phát triển vaccine dự phòng và dữ liệu cho các nghiên cứu sau này thiết lập bản đồ dịch tễ phân týp HIV-1 lưu hành tầm quốc gia

và trong khu vực

Hiện nay có nhiều phương pháp xác định phân týp HIV, trong đó multiplex PCR (mPCR) hay còn gọi là PCR đa mồi là kỹ thuật dùng

xác định nhiều phân týp HIV-1 trong cùng một tube phản ứng với nhiều vòng phản ứng, mPCR là kỹ thuật có nhiều ưu điểm, phù hợp với điều kiện của Việt Nam và Lào hiện nay Vì vậy chúng tôi tiến

hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV-1 ở Hà Nội và Viêng Chăn (2007- 2011) ” với mục tiêu:

1 Tối ưu hóa qui trình multiplex PCR để xác định các phân týp chủ yếu HIV-1 ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn

2 Xác định các phân týp chủ yếu của HIV-1 trên các đối tượng ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn bằng kỹ thuật multiplex PCR

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI VỀ MẶT KHOA HỌC

Đây là đề tài đầu tiên nghiên cứu về phân týp HIV-1 ở Lào

Nghiên cứu đã đề xuất được qui trình thích hợp cho việc xác định phân týp HIV-1 áp dụng ở Lào bằng multiplex PCR phù hợp trong điều kiện hiện tại Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy phân týp dạng tái

tổ hợp CRF01-AE của HIV-1 là phân týp chủ yếu ở cả hai khu vực (98,57 % ở khu vực Hà Nội và 85% ở khu vực Viêng Chăn) Khu vực Viêng Chăn có tỷ lệ phân týp HIV phức tạp và đa dạng hơn, ngoài dạng CRF01-AE còn có cả các phân týp A, B, C phát hiện được với tỷ

lệ thấp (0,7 % - 2,14%) ở các đối tuợng nghiện chích ma túy và gái mại dâm

CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN

Luận án gồm 118 trang, đặt vấn đề 3 trang, tổng quan 26 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 36 trang, kết quả nghiên cứu 31 trang, bàn luận 18 trang, kết luận 2 trang, 33 bảng, 03 biểu đồ, sơ đồ

06, 25 hình, 160 tài liệu tham khảo và 6 phụ lục

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nhiễm HIV/AIDS

1.1.1 Tình hình nhiễm HIV ở Việt Nam

Theo Bộ y tế Việt Nam, trường hợp phát hiện đầu tiên vào năm

1990 ở Thành phố Hồ Chí Minh Qua các số liệu giám sát cho thấy

dịch HIV/AIDS đã xuất hiện ở 100% tỉnh, thành phố từ năm 1998, đến cuối năm 2011 đã có 98% số quận, huyện, thị xã và 77% số xã, phường, thị trấn có người nhiễm HIV được báo cáo

1.1.2 Tình hình nhiễm HIV ở Lào

Theo trung tâm phòng chống HIV/AIDS và Bệnh lây truyền qua đường tình dục - Bộ y tế Lào, trường hợp nhiễm HIV đầu tiên ở Lào phát hiện vào năm 1990 Tính đến đầu năm 2012, qua điều tra trong phạm vi cả nước phát hiện 4.942 trường hợp nhiễm HIV, 3.650 trường hợp bị AIDS và 1.290 trường hợp tử vong liên quan AIDS Tỷ lệ nhiễm trung bình là 0,2% ở người độ tuổi từ 15- 49 tuổi, ước tính số nhiễm HIV mới trong năm khoảng 10.350 trường hợp, trong đó Savannakhet 34% có tỷ lệ nhiễm HIV cao nhất so với tổng số cả nước, tiếp theo là Viêng Chăn 33% và thứ 3 là tỉnh Champasak 9% HIV/AIDS có xu hướng gia tăng theo từng năm

1.2 Các phân týp HIV

Hiện nay, HIV đươc chia thành 2 týp: HIV-1 và HIV-2, trong đó HIV-1 được chia thành 4 nhóm: M, N, O, P trong đó nhóm M lại chia thành 10 phân týp: A, B, C, D, E, F, G, H, J và K Phổ biến nhất là các phân týp từ A đến G; phân týp H, J, K hiếm gặp hơn Ngoài ra còn có khoảng 51 dạng tái tổ hợp đã được công nhận, và nhiều biến thể chưa xác định phân týp

Nghiên cứu về phân bố của các phân týp HIV, thực chất đồng nghĩa với tìm hiểu sự biến đổi di truyền của HIV ở cấp độ khu vực trên toàn cầu

là cần thiết, không chỉ để tìm hiểu nguồn gốc và giám sát dịch tễ học của

HIV, mà còn giám sát sự xuất hiện của các biến thế mới, trong nội bộ các

phân týp và những thay đổi đặc tính sinh học của chúng để đảm bảo cho

chẩn đoán, liệu pháp kháng virus cũng như dự đoán sự phát triển vaccine

của HIV/AIDS trên toàn cầu

1.3 Đặc điểm phân týp HIV-1 ở một số khu vực

1.3.1 Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Phi

1.3.2 Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Âu

1.3.3 Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Mỹ

1.3.4 Đặc điểm phân týp HIV-1 ở Trung Đông

1.3.5 Đặc điểm phân týp HIV-1 ở Liên Bang Nga

1.3.6 Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Úc

1.3.7 Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Á

1.3.8 Đặc điểm phân týp HIV-1 tại Việt Nam

1.3.9 Đặc điểm phân týp HIV-1 tại Lào

Hiện chưa có nghiên cứu về phân týp HIV tại Lào

1.4 Một số kỹ thuật xác định phân týp HIV-1

1.4.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể peptide đặc hiệu HIV-1

Ưu điểm: có thể nghiên cứu với số lượng mẫu lớn, kỹ thuật không

phức tạp Nhược điểm: hay có phản ứng chéo nên độ tin cậy thấp

1.4.2 Kỹ thuật Heteroduplex Mobility Assay (HMA):

Ưu điểm: có thể phát hiện được gen kháng thuốc, phát hiện được

hiện tượng đồng nhiễm các phân týp, có thể áp dụng với số mẫu lớn,

giá thành vừa phải Nhược điểm: hay có phản ứng chéo và đòi hỏi kỹ

thuật viên chuyên sâu

1.4.3 Kỹ thuật giải trình tự gen (Sequancing)

Được coi là phương pháp chuẩn mực nhất Tuy nhiên phương

pháp này tiến hành phức tạp, mất nhiều thời gian, đòi hỏi thiết bị và

hoá chất đắt tiền và nhân viên được đào tạo bài bản, chuyên sâu

1.6.4 Kỹ thuật multiplex PCR hay mPCR (PCR đa mồi)

Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện, thời gian nhanh, áp

dụng với số lượng mẫu lớn, kết quả chính xác, giá thành thấp Nhược điểm là không phát hiện được các dạng đột biến hoặc tái tổ hợp mới Đây là phương pháp phù hợp cho việc xác định các phân týp của HIV

ở các quốc gia đang phát triển và là kỹ thuật được lựa chọn cho nghiên cứu phân týp HIV-1 ở Lào, nơi chưa có điều kiện triển khai các kỹ

thuật giải trình tự gen

Bảng 2.1: Các ký hiệu cho các đối tƣợng nghiên cứu theo khu vực

Khi vào mã nghiên cứu ghép thêm ký hiệu khu vực để phân biệt (A01 của khu vực Hà Nội ký hiệu là HNA01, A01 của khu vực Viêng Chăn ký hiệu là VCA01…)

Cỡ mẫu nghiên cứu được áp dụng theo công thức (WHO, 1991),

Nhóm đối tượng (NĐT) Khu vực

Hà Nội

Khu vực Viêng Chăn

Tổng

số Nhóm A: A1 đến A50

Nghiện chích ma túy (NCMT) 50 50 100 Nhóm B: B1 đến B50

Nhóm C: C1 đến C40

Trong đó: Z1-  /2 = 1,96 với độ tin cậy α ≥ 95%

p: Tỉ lệ phân týp trội trong những trường hợp HIV (+), khoảng 90% d: Sai số tuyệt đối mong muốn (d = 0,05)

n: Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt được

Căn cứ công thức trên, thì cỡ mẫu tìm được là 140 cho mỗi khu vực (tổng số 280 cho cả hai khu vực)

2.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Các sinh phẩm hoá chất chính

2.2.2 Các máy và thiết bị chính

2.2.3 Các mồi dùng trong nghiên cứu

Tham khảo tác giả Fumihiro (2005), như sau:

2.2.3.1 Phản ứng PCR1: Dùng cặp mồi chung để khuếch đại đoạn

gen gp 41 đặc hiệu cho HIV-1, mồi có trình tự như sau:

) 1 (

d

p p

Z



Khi sản phẩm PCR2.1 có kích thước 441 bp có thể là phân týp B hoặc

D, để phân biệt giữa hai phân týp cần tiến hành phản ứng PCR 2.3, với sản phẩm có kích thước 645 bp có thể là phân týp A hoặc E hoặc G, cần tiến hành phản ứng PCR 2.2, để phân biệt giữa các phân týp này, nếu sản phẩm

có kích thước 697 bp sẽ được xác định là phân týp C và sản phẩn kích thước 778 bp là phân týp F

2.2.3.4 Phản ứng PCR 2.3: Để phân biệt phân týp D và B, sử dụng

cặp mồi D5’- D3’ có trình tự như sau:

 D5’(8037 - 8058): 5’ACCACTAATGTGCCCTGGAACT 3’

 D3’(8356 - 8386): 5’AGGAGGGTCTGAAATGACAGA 3’

Sản phẩm PCR2.3 có kích thước 350 bp là phân týp D, không có sản phẩm là phân týp B

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học cắt ngang và phân tích labo để tối ưu hóa phản ứng mPCR và tìm hiểu phân týp HIV-1 trên các đối tượng nghiên cứu

Sử dụng phiếu theo dõi để thu thập các thông tin về đối tượng nghiên cứu, phân tích tìm các yếu tố liên quan

Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê y học để tìm ý nghĩa và mối liên quan thông qua phần mềm Excel 2007 và SPSS

13.0 Đối với các biến định tính sử dụng kiểm định χ2, các biến định lượng

sử dụng kiểm định T-student; các giá trị p < 0,05 được xem như là có ý

nghĩa thống kê

Các bước tiến hành xác định phân týp HIV-1

2.3.2 Tách chiết acid nucleic (RNA hoặc DNA)

Do RNA không bền, không thể lưu giữ lâu và thực hiện với nhiều mẫu đồng thời nên nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách DNA

từ khối bạch cầu (Buffy coat) Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA bằng kit QIAGEN

2.3.3 Các bước tối ưu chu trình nhiệt và các thành phần của phản ứng mPCR

2.3.3.1 Tối ưu hoá nhiệt độ gắn mồi thích hợp

Chuẩn bị 8 ống phản ứng giống nhau về thành phần, ứng với 8 mốc nhiệt độ trên máy PCR gradient nhiệt, chạy đồng thời cùng một điều kiện chỉ khác nhau về nhiệt độ, chọn nhiệt độ cho phản ứng với kết quả rõ nhất, không có băng phụ; kết quả lặp lại tối thiểu 2 lần để kiểm tra

2.3.3.2 Tối ưu hóa thời gian duy trì nhiệt độ gắn mồi

Chọn ngẫu nhiên 3 mẫu cùng 1 chứng âm để chuẩn bị 16 ống phản ứng giống hệt nhau về thành phần ứng với 4 mốc thời gian 30 giây, 45 giây, 60 giây, 90 giây, mỗi mẫu đặt 4 ống phản ứng theo 4 mốc thời gian ở trên cùng 1 mẫu chứng âm, sau đó tiến hành chạy phản ứng mPCR với nhiệt độ gắn mồi tối ưu đã tìm được ở trên và lần lượt đặt mốc thời gian gắn mồi: 30 giây,45 giây, 60 giây, 90 giây

2.3.3.3 Tối ưu hóa nồng độ MgCl 2

Chuẩn bị 6 ống phản ứng (tương ứng với 6 nồng độ MgCl2), ký hiệu từ 1 đến 6 và 1 ống chứng âm, các thành phần giống nhau, có thể điều chỉnh lượng nước khử ion cho đủ tổng thể tích 25 µl tùy theo lượng MgCl2 cho vào mỗi phản ứng Nồng độ MgCl2 (50mM) được thử ở các mức độ từ 1 đến 3,5 µl cụ thể là 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5µl /25µl thể tích phản ứng

2.3.4 Chạy kiểm tra quy trình sau khi tối ưu

Chạy lại 10 mẫu đã chọn sau khi tối ưu hóa quy trình, nếu đạt cả 10 mẫu thì tiến hành cho toàn bộ các mẫu nghiên cứu còn lại; nếu chưa đạt tiếp tục tối ưu lại theo trình tự trên

2.3.5 Giải trình tự gen đối chiếu kết quả với kỹ thuật mPCR

Để khẳng định kết quả của kỹ thuật mPCR, chọn một số mẫu ngẫu nhiên đại diện cho tất các các phân týp đã được xác định bởi kỹ thuật mPCR tiến hành giải trình tự xác định phân týp để đối chiếu, nếu không phù hợp thì giải trình tự toàn bộ các mẫu và kiểm tra lại mPCR,

nếu phù hợp thì sử dụng kết quả của mPCR cho các phân tích tiếp theo

2.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.4.1 Địa điểm nghiên cứu: Học viện Quân y, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương

2.4.2 Thời gian nghiên cứu: 10/2007 đến tháng 10/2011

Chương 3 KẾT QUẢ

3.1 Tối ưu hóa qui trình multiplex PCR để xác định phân týp HIV-1 ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn

3.1.1 Lựa chọn quy trình phản ứng PCR

Kết quả 10 mẫu áp dụng theo quy trình của tác giả Fumihiro:

M (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ghi chú

M:Marker 100bp (-):

Chứng âm 1-10: Các mẫu từ1 đến 10

Hình 3.1: Ảnh điện di sản phẩm PCR2.1 trước khi tối ưu quy trình

Qui trình của Fumihiro áp dụng nguyên bản trong điều kiện hiện tại của phòng xét nghiệm chỉ đạt 50% hiệu quả phát hiện

645 bp

500 bp

3.1.2 Kết quả tối ưu hoá quy trình mPCR xác định phân týp HIV-1

3.1.2.1 Kết quả tìm nhiệt độ gắn mồi thích hợp

Hình 3.2: Ảnh điện di kết quả PCR2.2 tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Với dải gradient nhiệt từ 54,80C đến 680

C kết quả mPCR được đánh giá tốt nhất ở nhiệt độ 63,90

C cho cả phản ứng PCR 2.1 và 2.2

3.1.2.2 Kết quả tìm thời gian duy trì nhiệt độ gắn mồi

Tiến hành mPCR với nhiệt độ gắn mồi là 63,90C với lần lượt thời gian gắn mồi 30 giây, 45 giây, 60 giây, 90 giây

Kết quả tối ưu hoá thời gian duy trì nhiệt độ được tóm tắt tại như sau:

30 giây 45 giây 60 giây 90 giây

Ghi chú

(-) 1 2 3 (-) 1 2 3 (-) 1 2 3 (-) 1 2 3 M

M: Marker 100bp (-):

Chứng âm 1: mẫu số 1 2: mẫu số 2 3: mẫu số 3

Hình 3.3: Ảnh điện di kết quả PCR tối ưu hoá thời gian duy trì nhiệt

độ gắn mồi

M (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 Ghi chú

M:Marke 100bp (-): Chứng âm 1: 54,80C (+) 2: 56,80C (+) 3: 58,80C (+) 4: 60,80C (+) 5: 62,50C (++)

6: 63,9 0 C (+++)

7: 65,10C (++) 8: 680C (+)

500 bp

554 bp

554 bp

500 bp

Tại mốc thời gian 60 giây cả 3 mẫu đều có band DNA đặc hiệu và rõ

3.1.2.3 Kết quả tối ưu hoá nồng độ MgCl 2

Thiết lập 6 phản ứng mPCR giống hệt nhau, cùng nhiệt độ gắn mồi 63,90C, thời gian duy trì là 60 giây, chỉ khác nhau về nồng độ MgCl2 Kết quả tìm được nồng độ MgCl2 tối ưu là 2,5μl (50mM)

M ( - ) 1 2 3 4 5 6 Ghi chú

M:Marker 100bp (-): Chứng âm 1: 1μl (+) 2: 1,5μl (+) 3: 2μl (++)

4: 2,5μl (+++)

5: 3μl (++) 6: 3,5μl (-)

Hình 3.4: Ảnh điện di kết quả PCR tối ưu nồng độ MgCl 2

Tại nồng độ 2,5μl ứng với ống số 4 có band DNA đặc hiệu và rõ

3.1.3 Quy trình xác định phân týp HIV-1 trên các đối tượng nhiễm

ở khu vực Hà Nội và khu vực Viêng Chăn

Trong quá trình tối ưu lại phản ứng cho phù hợp với điều kiện thực tế, nhóm nghiên cứu nhận thấy nếu sử dụng các cặp mồi xác định phân týp A, E, G ngay sau PCR1 thì hầu hết các mẫu có kết quả ngay

mà ít phải dùng đến các vòng sau, tiết kiệm được nhiều hóa chất cũng như thời gian và công sức Vì vậy nhóm nghiên cứu đã đưa ra qui trình phù hợp cho các mẫu khu vực Hà Nội và Viêng Chăn như sau:

554 bp

500 bp

500 bp