Nghiên cứu khả năng kháng pepsin của một số đột biến điểm trên bề mặt phytase từ bacillus subtilis

===**=== Qua một thời gian làm việc tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, tôi đã hoàn thành luận văn thạc sĩ: “Nghiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

===============

VŨ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PEPSIN

CỦA MỘT SỐ ĐỘT BIẾN ĐIỂM

TRÊN BỀ MẶT PHYTASE TỪ Bacillus subtilis

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

HÀ NỘI - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

===============

VŨ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PEPSIN

CỦA MỘT SỐ ĐỘT BIẾN ĐIỂM

TRÊN BỀ MẶT PHYTASE TỪ Bacillus subtilis

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60.42.01.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN THỊ THÚY

HÀ NỘI - 2015

Lời cảm ơn!

===**===

Qua một thời gian làm việc tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, tôi đã hoàn thành

luận văn thạc sĩ: “Nghiên cứu khả năng kháng pepsin của một số đột biến điểm

trên bề mặt phytase từ Bacillus subtilis”

Để hoàn thành được công trình này, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, chỉ bảo và đóng góp ý kiến quý báu từ các thầy cô, gia đình và các bạn đồng nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Thúy, người đã dạy dỗ

em trong quá trình học tập, người đã dìu dắt em những bước đi đầu tiên trong con đường khoa học và luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài

Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy, cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, những người đã dạy dỗ, luôn quan tâm, động viên khuyến khích và

có những ý kiến đóng góp quý báu cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Hồng – cán bộ Bộ môn Hóa sinh Tế bào cùng các bạn trong nhóm nghiên cứu Sinh học phân tử và tất cả các anh, chị,

em nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên của Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học – Vi sinh đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẻ với em trong suốt thời gian qua

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tình yêu thương tới gia đình, những người luôn sát cánh, động viên tôi vượt qua khó khăn trong suốt thời gian học tập

và nghiên cứu Cảm ơn con gái bé nhỏ Thùy Dương của mẹ

Ngoài ra, các nội dung nghiên cứu của luận văn được tài trợ bởi Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.06 – 2012.86 Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến quỹ NAFOSTED

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Vũ Phương Liên

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Axit phytic và phytate 3

1.1.1 Axit phytic 3

1.1.2 Phytate 4

1.2 Phytase 5

1.2.1 Phân loại phytase 6

1.2.2 Đặc tính lí hóa của phytase 8

1.3 Phytase kiềm (β-propller phytase-BPP) từ Bacillus sp 10

1.3.1 Vài nét về chi Bacillus 10

1.3.2 Phytase từ Bacillus 10

1.4 Ứng dụng của phytase 12

1.5 Một số thành tựu nghiên cứu gây đột biến điểm trên phytase 14

1.6 Pepsin 15

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu và hóa chất 19

2.1.1 Hóa chất 19

2.1.2 Thiết bị 19

2.1.3 Chủng giống vi sinh vật 20

2.1.4 Plasmid 20

2.1.5 Môi trường nuôi cấy và dung dịch đệm 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp tin sinh học 21

2.2.2 Phương pháp vi sinh 22

2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử 23

2.2.4 Phương pháp hóa sinh 28

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Thiết kế các cặp mồi mang đột biến điểm trên bề mặt của phytase kiềm 34

3.2 Tách chiết plasmid tái tổ hợp mang gen phyC từ E coli NovaBlue 36

3.3 Sinh tổng hợp gen đột biến bằng phản ứng PCR 38

3.4 Chuyển plasmid mang cấu trúc đột biến vào tế bào biểu hiện E coli BL21(DE3) 39

3.5 Kiểm tra sự có mặt của điểm đột biến trên gen phyC 41

3.6 Biểu hiện phytase kiềm từ Bacillus subtilis 42

3.7 Đánh giá sự biểu hiện gen phyC thông qua hoạt tính phytase 43

3.7.1 Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp được biểu hiện ở E coli BL21(DE3) mang cấu trúc phyC không đột biến 43

3.7.2 Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp được biểu hiện ở E coli BL21(DE3) mang đột biến Y143P trên gen phyC 44

3.7.3 Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E coli BL21(DE3) mang đột biến E189P trên gen phyC 45

3.7.4 Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E coli BL21(DE3) mang đột biến E297P trên gen phyC 46

3.8 Đánh giá tính kháng pepsin của các phytase kiềm đột biến 48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Tên đầy đủ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại phytase theo Hiệp hội các nhà hóa sinh học Quốc tế 6

Bảng 1.2 Phân loại một số phytase đã được nghiên cứu 7

Bảng 1.3 Nhiệt độ và pH tối ưu của một số phytase 9

Bảng 2.1 Xử lý sản phẩm PCR đột biến 24

Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR tuyển chọn 27

Bảng 3.1 Các vị trí có khả năng bị thủy phân cao bởi enzyme pepsin trên phytase kiềm từ Bacillus subtilis 34

Bảng 3.2 Các axit amin cần đột biến và bộ ba mã hóa thay thế 36

Bảng 3.3 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR gây đột biến 36

Bảng 3 4 Phản ứng PCR sinh tổng hợp các plasmid mang đột biến trên gen phyC 38

Bảng 3.5 Kết quả cô đặc enzyme 49

Bảng 3.6 Kết quả thử nghiệm điều kiện tiếp xúc của phytase kiềm chưa đột biến với pepsin 49

Bảng 3.7 Khả năng kháng pepsin của các cấu trúc phytase kiềm trước và sau đột biến 50

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử phytate liên kết với các ion kim loại và protein 5

Hình 1.2 Phản ứng thủy phân phytate bởi phytase 6

Hình 1.3 Cấu trúc của BPP phytase 11

Hình 1.4 Sơ đồ minh họa cơ chế tác dụng của các protease với cơ chất 16

Hình 2.1 Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng BSA (μg/ml) với độ hấp thụ quang A595 29

Hình 2.2 Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ NaH2PO4 hay Pvc (mM) với độ hấp thụ quang A700 32

Hình 3.1 Minh họa các điểm trên bề mặt phân tử 1POO có khả năng bị cắt bởi pepsin bằng phần mềm Pymol 35

Hình 3.2 Kiểm tra plasmid mang gen mã hóa phytase kiềm tách chiết từ E coli NovaBlue 37

Hình 3.3 Sản phẩm PCR sinh tổng hợp các cấu trúc đột biến 39

Hình 3.4 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen phyC trong các dòng E coli BL21(DE3) đã được biến nạp các cấu trúc đột biến 40

Hình 3.5 Kết quả điện di tách các mẫu plasmid mang cấu trúc đột biến 41

Hình 3.6 Kết quả đọc trình tự các cấu trúc đột biến 42

Hình 3.7 Đồ thị sinh trưởng của các dòng tế bào E coli mang và không mang đột biến 43

Hình 3.8 Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E coli BL21(DE3) mang cấu trúc phyC không đột biến 44

Hình 3.9 Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E coli BL21(DE3) mang đột biến Y143P trên gen phyC 44

Hình 3.10 Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E coli BL21(DE3) mang đột biến E189P trên gen phyC 45

Hình 3.11 Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E coli BL21(DE3) mang đột biến E297P trên gen phyC 46

Hình 3.12 Sự biểu hiện gen phyC ra ngoài môi trường nuôi cấy được đánh giá trên bản điện di SDS- PAGE 47

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Phytase là enzyme được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi nhằm loại

bỏ chất kháng dinh dưỡng - phytate trong các loại bột ngũ cốc, thành phần chính của thức ăn chăn nuôi

Phytate (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphosphate) trong các hạt

ngũ cốc và các loại hạt đậu là nguồn dự trữ phốt pho chính yếu của hạt (chiếm 60% tổng số phốt pho của hạt) [33] Mặc dù đóng vai trò quan trọng trong quá trình chín, nảy mầm của hạt, phytate (dạng muối của axit phytic) lại tạo liên kết chặt chẽ với axit amin, protein, tinh bột và các khoáng kim loại quan trọng (như kẽm, sắt, canxi, magiê…) gây ra hiệu ứng kháng dinh dưỡng, làm giảm giá trị dinh dưỡng của các chất này [13] Đường ruột của động vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và cá không có khả năng chuyển hóa phytate, do vậy, việc bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi nhằm giảm lượng axit phytic, sẽ giúp tận dụng tối đa nguồn phốt phát, ion kim loại và protein sẵn có trong thức ăn; đồng thời giảm thiểu ô nhiễm môi trường do phốt phát thải ra từ phân động vật nuôi [24]

Phytase là loại enzyme xúc tác thủy phân đặc hiệu phytate thành các

myo-inositol phốt phát bậc thấp và các gốc phốt phát vô cơ (Pvc) tự do, giúp động vật hấp thu một cách dễ dàng [24] Các phytase thương mại hiện nay

chủ yếu là các phytase axit (từ nấm mốc, nấm men và vi khuẩn E coli), chúng

hoạt động tốt ở pH thấp của dạ dày nhưng hoạt động kém ở pH trung tính và hơi kiềm của ruột non, đặc biệt không chịu được nhiệt độ cao [24, 49]

Phytase kiềm (từ Bacillus và phấn hoa của một số loài thực vật) hoạt động

tốt ở môi trường trung tính và hơi kiềm của ruột non; enzyme này chịu nhiệt và pH axit (chịu được nhiệt độ cao trong quá trình ép viên thức ăn

công nghiệp và môi trường axit trong dạ dày), tuy nhiên, chúng hoạt động kém ở pH dạ dày và thường nhạy cảm với pepsin, loại enzyme tiêu hóa có trong dạ dày [46] Do vậy, cần có các nghiên cứu nhằm tăng cường các đặc tính của phytase kiềm cho phù hợp với ứng dụng của ngành chăn nuôi (bền nhiệt, hoạt động ở dải pH rộng, kháng lại các enzyme trong đường tiêu hóa của động vật nuôi)

Pepsin là enzyme tiêu hóa quan trọng và chủ đạo trong dạ dày người và động vật dạ dày đơn, chúng thủy phân đặc hiệu đối với các cấu trúc dạng vòng xoắn trên bề mặt phân tử protein có chứa các axit amin kị nước [30] Loại bỏ được các điểm nhạy cảm này trên bề mặt phytase kiềm sẽ giúp nâng cao khả năng kháng lại pepsin cho phytase kiềm khi đưa chúng vào thức ăn

và vào đường tiêu hóa của động vật nuôi

Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng

kháng pepsin của một số đột biến điểm trên bề mặt phytase từ Bacillus subtilis”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Sinh tổng hợp được một số cấu trúc mang đột biến điểm trên bề mặt

phytase từ Bacillus subtilis và đánh giá được khả năng kháng pepsin của các

phytase đột biến này

3 Nội dung nghiên cứu

1/ Tổng hợp 3 cấu trúc ADN tái tổ hợp mã hóa phytase kiềm từ

Bacillus subtilis mang một điểm đột biến

2/ Tách và kiểm tra các plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa cho phytase kiềm đột biến

3/ Biến nạp các plasmid tái tổ hợp mang đột biến điểm vào E coli, tiến

hành biểu hiện các phytase đột biến

4/ Đánh giá hoạt tính và tính kháng pepsin của các phytase đột biến

Khoảng hơn 60% lượng phốt pho trong các loại hạt ngũ cốc tồn tại

dưới dạng axit phytic (myo-inositolhexadihydrogenphosphate) Đây là hợp chất rất khó hấp thu [15] bởi vòng myo-inositol của nó liên kết với 6 gốc phốt

phát, tích điện âm trong phổ pH rộng

Ở pH sinh lý, axit phytic là một chất kiềm mạnh, nó trở thành dạng đa ion tích điện âm, dễ dàng kết hợp với các ion kim loại như Fe, Mg2+, Ca2+,

Zn2+, ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không no, làm giảm khả năng tiêu hóa các kim loại thiết yếu này trong thức

ăn của động vật, gây ra hiệu ứng kháng dinh dưỡng Điều này dẫn đến sự thiếu hụt một số loại dinh dưỡng khoáng cho nhu cầu cơ thể con người, đặc biệt là thiếu sắt và kẽm [10, 11] Thiếu sắt, kẽm là bệnh thường gặp ở trẻ em, phụ nữ mang thai đây là nguyên nhân dẫn đến tình trạng thiếu máu nếu tình trạng này kéo dài sẽ làm cho cơ thể suy yếu, gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cơ thể, thậm chí có thể gây tử vong [7] Mặt khác, do không hấp thu được lượng phốt pho có sẵn trong axit phytic nên thức ăn cho

động vật dạ dày đơn thường phải bổ sung thêm Pvc Lượng phốt phát không được động vật tiêu hóa hết bị thải ra ngoài theo phân gây ô nhiễm phốt phát trong môi trường, là nguyên nhân gây bùng phát hiện tượng tảo nở hoa, ảnh hưởng đến sự phát triển của các loài thủy sinh [39]

1.1.2 Phytate

Phytate (myo - inositol (1,2,3,4,5,6) hexakis phosphate), là dạng

muối của axit phytic Phytate thường chiếm từ 1 đến vài phần trăm trọng lượng khô của hạt, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chín, nảy mầm của hạt [25, 15] Không có hạt trưởng thành nào mà không có phytate mặc dù nó

có thể không có ở một số mô hạt nhất định nào đó Phytate cũng được tìm

thấy ở hạt phấn, bào tử túi và mô sinh dưỡng như rễ, cuống và lá Phytate

chứa 14 - 25% phốt pho; 1,2 - 2% canxi; 1 - 2% kẽm và sắt Trong các loại hạt ngũ cốc, các loại hạt đậu chứa hàm lượng phytate cao nhất (5,92 – 9,15%); tiếp đó là hạt ngô/bắp (0,83 – 2,22%) [33] Phytate làm giảm khả năng hấp thụ protein, tinh bột và lipit vì chúng tạo phức với protein làm cho protein kém tan và kháng lại sự phân giải protein trong đường tiêu hóa của động vật nuôi và người Ở pH thấp 4,0 - 5,0; axit phytic mang điện tích âm mạnh do các nhóm phốt phát không phân ly hoàn toàn Trong điều kiện này, axit phytic gây ảnh hưởng đến khả năng hòa tan protein vì liên kết ion giữa các nhóm phốt phát của chúng với các gốc axit amin bị ion hóa (lysyl, histidyl, arginyl) Ở pH 6,0 - 8,0; axit phytic và protein thực vật đều có điện tích âm nhưng phức hợp giữa axit phytic và protein vẫn được hình thành thông qua cầu nối liên kết với các ion kim loại, làm giảm giá trị dinh dưỡng của protein trong thực phẩm [27]

Phytate còn có khả năng ảnh hưởng đến sự tiêu hóa tinh bột, protein thông qua sự liên kết với tinh bột và canxi tham gia hoạt hóa enzyme

amylase Phytate tạo phức với protein (Hình 1.1) và ức chế trypsinogen Vì

vậy, phytate được coi là chất kháng dinh dưỡng (Anti-nutrient factor, ANF) trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử phytate liên kết với các ion kim loại và protein [52] 1.2 Phytase

Phytase là enzyme thủy phân đặc hiệu phytate; do vậy, nó có khả năng làm giảm tính kháng dưỡng của thức ăn có hàm lượng phytate cao Phytase tồn tại ở vi sinh vật, thực vật và mô động vật Enzyme này được phân lập chủ yếu từ thực vật [33] vi khuẩn [35] và nấm [31] để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, làm tăng hiệu quả hấp thụ phốt phát, canxi thêm khoảng 60% Do đó, enzyme này đóng vai trò quan trọng trong cải thiện tốc độ tăng trưởng của vật nuôi và tăng cường hiệu quả hấp thu thức ăn

Phytase xúc tác quá trình thủy phân các liên kết ester của phytate

(myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexakisphosphate; IP6), lần lượt tạo ra các dẫn xuất ít

phốt phát hơn của myo-inositolphosphate, đồng thời giải phóng Pvc (Hình

1.2)[24] Các chất này dễ dàng được hấp thụ bởi các động vật dạ dày đơn

Chính vì vậy, việc bổ sung phytase vào thức ăn cho vật nuôi không những cho phép chúng đồng hóa tốt thành phần phốt phát sẵn có trong thức ăn, mà còn làm tăng hấp thu protein và các nguyên tố khoáng [16]

Hình 1.2 Phản ứng thủy phân phytate bởi phytase [24]

1.2.1 Phân loại phytase

Theo Hiệp hội các nhà hóa sinh học thế giới (The International Union

of Biochemists), có 2 loại phytase chủ yếu là: 3-phytase (EC 3.1.3.8) và phytase (EC 3.1.3.26) Chúng khác biệt nhau ở vị trí của gốc phốt phát trên vòng inositol mà chúng bắt đầu tấn công để xúc tác thủy phân

6-Bảng 1.1 Phân loại phytase theo Hiệp hội các nhà hóa sinh học Quốc tế

myo- inositolhexakis

phosphate - 6 – phosphohydrolase

vô cơ

D- myo- inositol- 1,2,3,4,5-

pentakis phosphate và phốt phát vô cơ

Đối tượng

Phytase có nguồn gốc từ

vi sinh vật (ngoại trừ phytase từ đậu nành là 3- phytase

Phytase có nguồn gốc thực vật

và nấm mốc (ngoại trừ

phytase từ E coli là 6-

phytase)

Một số tổ chức nghiên cứu và các nhà khoa học khác như Trung tâm thông tin sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) đã phân chia phytase thành 3 nhóm [47]

Nhóm thứ 1 (EC 3.1.3.2): bao gồm các axit phosphatase hoặc histidin axit

phosphatase (HAPs) Đặc điểm chung có trung tâm hoạt động là RHGXRXP và quá trình thủy phân phosphomonoester gồm các bước giống nhau

Nhóm thứ 2 (EC 3.1.3.8) là các β-propeller phytase (BPP), chủ yếu là

các enzyme của Bacillus Cho đến nay, việc phân lập, xác định các gen

điều khiển hoạt động của phytase thuộc nhóm này chưa đầy đủ Hiện có 2

loại phytase của Bacillus thuộc nhóm này đã được xác định là phyC [19] và

TS-phy [21]

Nhóm thứ 3 (EC 3.1.3.2) bao gồm các purple axit phosphatase (PAP)

Gmphy được chiết tách từ lá mầm của đậu nành nảy mầm thuộc nhóm

enzyme này Người ta đã xác định được cấu trúc không gian 3 chiều và cơ chế

xúc tác của Gmphy [8]

Bảng 1.2 Phân loại một số phytase đã được nghiên cứu [47]

2 phyA Aspergillus ficuum Histidin acid phosphatase

4 Gmphy Đậu nành (Glycine soja) Purple acid phosphatase

5 KBPAP Đậu trắng (Phaseolus vulgaris) Purple acid phosphatase

8 TS-phy Bacillus amyloliquefaciens Beta-propeller phytase

9 168phyA Bacillus subtilis 168 Beta-propeller phytase

1.2.2 Đặc tính sinh lí, sinh hóa của phytase

Phytase từ vi nấm, E coli, Klebsiella terrigena, Bacillus subtilis đã

được xác định là các enzyme đơn phân tử Kích thước phân tử của phytase từ

vi khuẩn thường dao động trong khoảng từ 35 đến 50 kDa Phytase của

Klebsiella aerogenes có hai dạng khác nhau, một dạng có kích thước khoảng

700 kDa, dạng còn lại có kích thước phân tử từ 10 – 13 kDa nhưng vẫn đảm bảo chức năng của một enzyme, trong đó các gốc glycosyl hóa chiếm phần lớn khối lượng của enzyme [17]

Phytase của các sinh vật nhân thực có kích thước phân tử lớn hơn vi khuẩn, kích thước phân tử phytase của nấm men khoảng 500 kDa; ở thực vật

và động vật enzyme được hình thành từ nhiều tiểu đơn vị có kích thước từ

50-150 kDa Hạt ngô trong quá trình nảy mầm sinh ra phytase được xác định gồm 2 tiểu đơn vị có kích thước 38kDa Phytase được tinh sạch từ đường ruột của chuột thể hiện thành 2 loại protein trên bản điện di SDS - PAGE với kích thước 70 và 90 kDa [17]

Phytase có nguồn gốc từ các đối tượng khác nhau sẽ có khoảng nhiệt

độ tối ưu khác nhau nhưng trung bình dao động từ 45 đến 77°C Phần lớn các

phytase đều bị bất hoạt ở nhiệt độ 40-65°C [29] Phytase của A niger có khả

năng chịu nhiệt rất kém, ở nhiệt độ khoảng 50 - 55°C, enzyme không còn giữ

được cấu trúc và hoạt độ giảm 70 - 80% Phytase của A fumigatus cũng

không có khả năng chịu nhiệt, tuy nhiên, sau khi bị biến tính ở 90°C thì enzyme có khả năng hồi tính khi trở lại nhiệt độ tối ưu, hoạt độ enzyme được phục hồi không đổi so với ban đầu Phytase của một số vi sinh vật có nhiệt độ

tối ưu rất cao như: phytase từ Schwanniomyces castelii là 77°C, từ Bacillus

sp MD2 là 73°C [46], từ Bacillus amyloliquefaciens DS11 là 70°C [21]

pH tối ưu của phytase nằm trong khoảng từ 2,2 đến 8,0 Đối với vi sinh vật pH tối ưu của phytase trong khoảng 4,5 – 5,6 (ở nấm) Phytase của

A fumigatus có phổ pH tối ưu khá rộng pH từ 4,0 – 7,3 Đối với các hạt

thực vật pH tối ưu dao động từ 4,0 - 7,5; ngoại trừ ở hạt đậu và phấn hoa

Lily, phytase có pH là 8,0 Đối với đa số động vật thì phytase hoạt động ở

pH kiềm từ 7,4 - 8,7 Bảng 1.3 nêu một số ví dụ về khoảng nhiệt độ và pH tối ưu của một số phytase

Bảng 1.3 Nhiệt độ và pH tối ưu của một số phytase [21,46,42]

TT Nguồn cung cấp phytase pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu ( o C)

Các ion kim loại được xem là các tác nhân ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt độ phytase Tuy nhiên, rất khó để xác định rõ ảnh hưởng của các kim loại khác nhau vì sự liên kết trực tiếp của chúng với enzyme hoặc các ion kim loại ở dạng hợp chất liên kết với axit phytic và do đó làm giảm mức độ hoạt

động của cơ chất Phytase của Enterobacter sp 4 bị ức chế bởi các ion Zn2+,

Ba2+, Cu2+ và Al3+[48]

Theo nghiên cứu của Wyss và cs (1999), ion Cu2+ được xác định có khả

năng làm giảm hoạt độ của phytase có nguồn gốc từ E nidulans và A terms Phytase của A fumigatus bị ức chế bởi một số ion kim loại thông thường Hoạt độ phytase của A fumigatus bị giảm 50% dưới tác dụng của EDTA,

ngược lại, EDTA không phải là yếu tố chính tác động lên hoạt độ phytase có

nguồn gốc từ nấm như E nidulans, A niger, A Terrus [51] Những chất hóa

học khác có khả năng kìm hãm hoạt độ phytase là flor và molypdate

1.3 Phytase kiềm (β-propller phytase-BPP) từ Bacillus sp

1.3.1 Vài nét về chi Bacillus

Bacillus là nhóm vi khuẩn được nghiên cứu rất kĩ cứu về đặc điểm, sinh

lý cũng như khả năng cảm ứng, sinh tổng hợp các loại enzyme Chúng bao gồm các vi khuẩn gram dương, hình que, sống hiếu khí, có khả năng sinh bào

tử và hình thái tế bào không bị biến dạng khi sinh bào tử [1, 2] Bào tử hình elip hoặc hình viên trụ, tròn đầu Bào tử có màng mỏng và không dễ bắt màu thuốc nhuộm [6]

Hầu hết các chủng Bacillus đều có khả năng sử dụng các hợp chất hữu

cơ như đường, amino axit, các axit hữu cơ Bacillus có nhiệt độ sinh trưởng

tối ưu từ 30 - 45°C và thời gian sinh trưởng khá ngắn khoảng 24 giờ nuôi cấy

trong môi trường tối ưu cho sự phát triển [17]

Các chủng Bacillus sinh các enzyme như amylase, protease, phytase được đặc biệt quan tâm và nghiên cứu [1] Một số chủng Bacillus như B

subtilis, B amyloliquefaciens trong đất có khả năng phân hủy phytate tạo dinh

dưỡng vì vậy mà thúc đẩy quá trình phát triển của thực vật Phytase có nguồn gốc từ thực vật với một lượng nhỏ không đủ để phân giải lượng phytate khá lớn trong đất vì thế, sự có mặt của nhóm vi khuẩn này có ý nghĩa vô cùng qua trong đối với quá trình phân giải phytate [44]

1.3.2 Phytase từ Bacillus

PhyC [19] và TS-phy [21] là hai loại phytase được sinh tổng hợp từ Bacillus, chúng đều thuộc nhóm β-propeller phytase (BPP) [47] Hoạt độ xúc

tác và tính ổn định về nhiệt của phyC phụ thuộc vào khả năng liên kết với ion

Ca2+ và đây cũng chính là điểm khác so với các nhóm phytase khác Ở môi trường tĩnh điện thích hợp thì ion Ca2+ dễ dàng tạo được liên kết với cơ chất

BPP có hai vị trí gắn với phosphate, vị trí “bẻ gãy” và vị trí “ái lực” Sự thủy phân cơ chất xảy ra tại vị trí “bẻ gãy”, còn vị trí “ái lực” thì có thể làm tăng

ái lực liên kết với cơ chất [48]

Cấu trúc của β-propellerphytase gồm có 6 dải băng được xếp lại với

nhau như hình cánh quạt, trong đó mỗi dải băng thường bao gồm 4-5 nếp gấp β chạy song song nhưng ngược chiều nhau, riêng nếp gấp thứ tư của mỗi dải được nối với nếp gấp β đầu tiên của dải băng tiếp theo trên phía đầu của phân tử enzyme Dải băng thứ 6 được sắp xếp dọc theo trục trung tâm của cánh quạt, tạo thành một mạch trung tâm, liên kết với nhiều phân tử nước [14] Dải băng này bao gồm 1 nếp gấp β từ đầu N và 3 nếp gấp β khác

từ đầu C của phân tử protein enzyme Để duy trì sự ổn định cấu trúc của enzyme thì dải băng thứ 6 này tham gia vào 2 đầu C và N của phân tử enzyme; một nếp gấp β phụ được thêm vào cuối đầu N của enzyme, kết nối

dải băng thứ 6 và thứ 5 [14] ( Hình 1.3.)

Hình 1.3 Cấu trúc của BPP phytase (Ha và cs [14])

Tính đặc hiệu của phytase ở Bacillus rất cao, tuy nhiên chúng thường

nhạy cảm với một số enzyme tiêu hóa như pepsin Hoạt độ riêng thấp và sự nhạy cảm cao với pepsin đã làm cản trở việc sản xuất và sử dụng phytase của

Bacillus ở quy mô công nghiệp [23, 24]

Phytase từ Bacillus là enzyme đơn phân tử, kích thước phân tử khoảng 36,5 - 44 kDa trên bản gel SDS-PAGE Kích thước phân tử của phytase từ B

subtilis là 44 kDa [22]

Canxi là yếu tố quan trọng, có ảnh hưởng trực tiếp đến độ bền phân tử

và hoạt tính của các phytase từ Bacillus Trong môi trường có CaCl2 sau 10

phút ủ ở 70°C, hoạt độ của phytase từ Bacillus sp DS11 không thay đổi (giữ

nguyên 100% hoạt tính) Hoạt tính của enzyme này giảm ở 50°C nếu trong môi trường thiếu CaCl2 Sau khi ủ ở 90°C trong 10 phút, hoạt độ còn lại đạt khoảng 50% hoạt độ lúc ban đầu khi có mặt canxi Điều đó cho thấy ion Ca2+

ảnh hưởng mạnh mẽ đến duy trì sự ổn định của enzyme trước tác động biến tính của nhiệt độ [20]

Đa số phytase của Bacillus có pH tối ưu khoảng 6,5 - 7,0; phytase của

B subtilis có pH tối ưu 6,0 - 6,5; B subtilis VTC68013 có pH ở 7,0 nhiệt độ

tối ưu là 55°C [23]

1.4 Ứng dụng của phytase

Ở động vật nhai lại, phytate được phân hủy thông qua hoạt động của các phytase có nguồn gốc từ các vi sinh vật trong dạ cỏ (vi khuẩn, nấm) Tuy nhiên, cơ chế này thường không có ở các động vật dạ dày đơn như heo, gia cầm và cá Do vậy, chúng không có khả năng hấp thụ axit phytic;

và thức ăn của chúng thường được bổ sung các loại phốt phát vô cơ Theo nghiên cứu của Scheldeler SE, khi bổ sung vào khẩu phần ăn của gà mái nuôi lấy thịt một lượng phốt phát hợp lí sẽ nâng cao tăng trọng trong khoảng 7 tuần tuổi, cải thiện năng suất xương chân, không gây thiệt hại

năng suất thịt; đối với gà trống giúp tăng trọng nhanh, nâng cao khả năng chuyển hóa thức ăn và sức sống [5]

Việc bổ sung một hàm lượng phytase thích hợp vào thức ăn của động vật nuôi sẽ làm tăng hàm lượng phốt phát dễ hấp thu trong thức ăn và làm giảm bớt lượng phốt phát dư thừa thải ra phân, qua đó, góp phần giảm thiểu ô nhiễm cho môi trường Ở Mỹ, nếu tất cả các động vật đều được sử dụng thức ăn có bổ sung lượng phytase phù hợp thì lượng phốt phát mà chúng thủy phân có giá trị khoảng 168 triệu USD, tương ứng với 8,23x 104

tấn phốt phát thải ra môi trường mỗi năm [41] Hiện nay, phytase là phụ gia chăn nuôi được áp dụng ở 22 nước trên thế giới, đặc biệt tổ chức FDA (The Food and Drus Administration) đã chấp thuận phytase là enzyme đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học [50]

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ảnh hưởng của phytase đến sự sinh trưởng đã được thí nghiệm trên gà và lợn Năm 2008, Mai Thị Hằng và cs đã

thử nghiệm bổ sung phytase tái tổ hợp từ Aspergillus niger XP phối hợp với

xylanase và amylase trong thức ăn cho gà Lương Phượng kết quả là gà tăng trọng thêm 5,6 - 25,7% và giảm 4,6 - 12,7% lượng thức ăn tiêu tốn so với lô đối chứng dương (gà ăn khẩu phần có bổ sung Pvc nhưng không bổ sung phytase tái tổ hợp) [26] Năm 2005, Trần Quốc Việt và Ninh Thị Len nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm phytase thương mại (Natuphos-BASF) đến tăng trưởng của lợn con cai sữa và lợn nuôi thịt đã công bố sự tăng trọng 16,4% và giảm 8% chi phí thức ăn so với lô đối chứng (lợn có khẩu phần ăn không bổ sung phytase) [3] Thử nghiệm này cho thấy việc bổ sung 1000 IU phytase tái tổ hợp/kg thức ăn đã thay thế được hoàn toàn lượng Pvc mà động vật nuôi cần, đặc biệt làm giảm 21,9 - 41,9% lượng phốt phát thải ra phân [26]

Ngoài ra, phytase còn được nghiên cứu sử dụng dể loại bỏ phytate

trong thực phẩm, sản xuất các dẫn xuất myo-inositol phốt phát cho công

nghiệp dược, loại bỏ phytate trong công nghiệp sản xuất giấy [17]

1.5 Một số thành tựu nghiên cứu gây đột biến điểm trên phytase

Các sản phẩm phytase thương mại trên thị trường hiện nay đều là các

phytase axit (HAP – Histidine acid phosphatase), chúng có nguồn gốc từ E

coli hoặc nấm mốc Các enzyme này hoạt động rất tốt trong môi trường axit

song lại kém bền ở nhiệt độ cao do đó gây cản trở trong việc chế biến thức ăn công nghiệp [28, 36, 43] Để nâng cao tính bền nhiệt của phytase axit, hàng loạt các nghiên cứu đã được tiến hành, trong đó có nghiên cứu đột biến điểm

trên phytase có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus fumigatus của Lehmann và

cs [22, 23] Nghiên cứu này đã thành công trong việc làm tăng tính chịu nhiệt của enzyme lên 15 – 26oC so với phytase trước đột biến mà vẫn bảo toàn

được hoạt tính của phytase Đột biến điểm thay thế Gly - 277 và Tyr - 282 trên phytase từ A fumigatus bằng các gốc tương ứng Lys và His của phytase

A niger đã làm thay đổi pH hoạt động của enzyme này [42, 43] Năm 2000,

để nâng cao được hiệu quả xúc tác và tính chịu nhiệt của axit phosphatase

(appA) có nguồn gốc từ Escherichia coli, Rodriguez và cs đã tiến hành gây đột biến điểm ở 3 vị trí và các cấu trúc này được biểu hiện trong Pichia

pastori Kết quả bước đầu cho thấy enzyme này đã hoạt động được ở pH 3,5 -

5,5; phytase của các cấu trúc đột biến sau khi hoạt động ở 80°C trong 10 phút

giữ lại hơn 20% (P < 0.05), và tăng 7°C so với phytase chưa đột biến [36]

Kỹ thuật gây đột biến điểm có định hướng cũng được Mullaney và cs sử dụng

để làm thay đổi dải pH của phytase có nguồn gốc từ Aspergillus niger NRRL

3135 (phyA) hoạt động tốt ở pH 3,0 – 5.0 K300E là vị trí axit amin duy nhất

được gây đột biến, chính sự thay thế này đã làm tăng hiệu quả phân giải axit phytic là 56% và 19% ở pH 4,0 và 5,0 ở 37oC [28]

Phytase kiềm là các enzyme có cấu trúc beta-propeler (BPP), được

tách chiết từ Bacillus và một số loại phấn hoa Khác với phytase axit,

enzyme này có khả năng chịu nhiệt và không bị biến tính ở nhiệt độ cao [43] hoạt động tốt ở pH trung tính và hơi kiềm của ruột non, ít nhạy cảm với pancreatin; tuy bền với dải pH rộng (từ pH 3 đến 9) nhưng lại nhạy cảm với pepsin Khả năng chịu nhiệt và hoạt động trên phạm vi pH rộng giúp enzyme chịu được nhiệt độ cao trong quá trình ép viên thức ăn Nghiên cứu của Salvadó JMV và cs (2010) cho thấy các phytase kiềm sau đột biến hoạt động ở dải pH rộng, từ pH 2,5 - 9; khi ủ enzyme ở 80°C và pH 5,5 hoặc 7,5 thì enzyme vẫn giữ được hoạt tính khá cao [37] Tran TT và cs (2011) tiến

hành gây đột biến điểm trên phytase kiềm chịu nhiệt từ vi khuẩn Bacillus sp

MD2 với mục tiêu tăng cường hoạt động và tính ổn định của enzyme trong môi trường axit Các đột biến này được thực hiện trên bề mặt xúc tác của enzyme (P257R, E180N, E229V và S283R) và một số điểm ở gần trung tâm hoạt động (K77R, K179R và E227S) Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng với các điểm đột biến E229V và S283R làm tăng hoạt động của enzyme lên 19% và 13% ở pH 2,6 - 3 Đột biến E227S đã thay đổi pH hoạt động tối

ưu của enzyme đến pH 5,5 và tăng độ bền của enzyme trong môi trường axit (Ở pH 2,6, sau 3 giờ ủ thì hoạt tính của phytase đột biến E227S vẫn giữ được trên 80% trong khi đó enzyme không đột biến thì chỉ giữ được khoảng 40% hoạt tính ban đầu) [45] Đó là những nghiên cứu bước đầu về đột biến điểm nhằm thay đổi đặc tính và hoạt động của enzyme phytase kiềm; chưa

có một nghiên cứu nào nhằm nâng cao khả năng kháng pepsin của phytase, giúp enzyme này bền hơn trong pha dạ dày và thể hiện được đầy đủ hoạt tính của nó trong pha ruột non của động vật dạ dày đơn

Pepsin chủ yếu có trong dịch vị, thường được tiết ra dưới dạng zymogen (tiền enzyme) là pepsinogen chưa có hoạt tính Khi tiếp xúc với môi trường axit của dạ dày pepsinogen chuyển thành pepsin dạng hoạt động Pepsin này lại

tiếp tục hoạt hóa pepsinogen thành pepsin (giai đoạn tự xúc tác)

Pepsin hoạt động tốt trong môi trường axit của dạ dày, nồng độ axit HCl thích hợp là 0,1 % - 0,8%

Pepsin bền vững ở pH thấp, nhưng dễ mất hoạt tính ở pH > 6,5 - 7 Nguyên nhân làm bất hoạt pepsin là do có sự biến tính của protein, dẫn đến cấu trúc của enzyme bị biến đổi Khả năng tái hoạt hóa của enzyme tùy thuộc

pH, nồng độ enzyme hoặc thời gian làm biến tính [32, 8] Trong môi trường axit mạnh, nhiệt độ cao (pH 1,8 và 50°C) thì pepsin mất dần hoạt tính Tốc độ

sự mất hoạt tính tỷ lệ trực tiếp với nồng độ [Η +] [8]

Ở pH = l,5 - 2, pepsin thủy phân các protein có khối lượng phân tử lớn

do có khả năng cắt vào khoảng 30% các liên kết peptit, sản phẩm chính của quá trình thủy phân là protease, pepton và một ít axit amin Các protein tan trong nước (caseine, albumin, hemoglobin) thì pepsin dễ dàng phân cắt, còn đối với các nucleoprotein và các protein không tan như keratin (ở tóc, da), collagen, sợi fibroin… thì hầu như ít bị pepsin phân cắt [32]

Pepsin là enzyme thuộc nhóm protease, có khả năng phân cắt không

đặc hiệu, có thể cắt tại nhiều điểm trên phân tử protein (Hình1.4) [32]

Hình 1.4 Sơ đồ minh họa cơ chế tác dụng của các protease với cơ chất [32]

Vị trí thủy phân

Cơ chất Đầu N

Trung tâm hoạt động

Đầu C

Nghiên cứu của Palashoff (2008) đã thống kê các dữ liệu phân cắt của pepsin trên 40 protein ở pH 2,5 – 2,7; phát hiện 1344 vị trí axit amin trên phân tử protein bị phân cắt Ngoài ra, Palashoff cũng tiến hành thực nghiệm thủy phân 9 loại protein khác nhau bằng pepsin ở các pH 1,0; 2,5 và 4,0 và tìm ra 591 vị trí cắt của pepsin trên các protein này Quy luật cắt và tính đặc hiệu của pepsin cũng được Palashoff công bố: pepsin ưu tiên cắt ở vị trí các axit amin kị nước như leucine và phenylalanine, tryptophan và tyrosine; nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các axit amin như proline, histidine là những vị trí có tần suất pepsin cắt thấp nhất [30] Các nghiên cứu trên cho thấy pepsin

là enzyme có khả năng thủy phân rất đặc hiệu đối với các cấu trúc dạng vòng xoắn trên bề mặt phân tử protein có chứa các axit amin kị nước Đặc biệt, hiệu quả thủy phân của pepsin càng cao nếu các vòng xoắn này được kết nối trực tiếp với các axit amin chứa cacbon hydro mạch vòng như tyrosine, tryptophan [30]

Nghiên cứu của Vương Thị Thanh Hằng và cs (2015), đã phát hiện được 80 vị trí cắt trên tổng số 354 axit amin của phân tử phytaza kiềm ACZ57955.1 bằng công cụ PeptideCutter [4] Tuy nhiên, công cụ này chỉ cho phép xác định các vị trí cắt/thủy phân của pepsin trên cấu trúc phân tử ACZ57955.1 bậc 1 mà chưa cho phép xác định mức độ ưu tiên đối với từng vị trí cắt Dựa vào nghiên cứu của Palashoff về tần suất thủy phân đối với từng

vị trí cắt P1-P1’ của pepsin, tác giả Vương Thị Thanh Hằng và cs đã xác định được tần suất thủy phân của pepsin đối với từng vị trí axit amin trên phân tử ACZ57955.1 So với công cụ PeptideCutter, bảng xác suất cắt của Palashoff cho phép các tác giả xác định được 276 vị trí cắt trên toàn phân tử ACZ57955.1 Mặc dù tổng số các vị trí cắt gấp 3,5 lần so với dự đoán của công cụ PeptideCutter, hầu hết các vị trí cắt với xác suất cắt cao (≥40%) trên phân tử ACZ57955.1 đều trùng với các vị trí cắt được dự đoán bằng công cụ

PeptideCutter Thông số về xác xuất thủy phân của pepsin đối với từng vị trí (cặp P1-P1’) được Palashoff tính toán chủ yếu dựa trên cấu trúc bậc 1 của protein Do vậy, xác suất cắt cao chưa hẳn đã là những vị trí được pepsin tấn công trước bởi protein có cấu trúc bậc 2, 3 và cả bậc 4, tạo thành cấu trúc không gian 3 chiều của mỗi protein Theo nhóm tác giả thì các vị trí aa nằm trên bề mặt của phân tử protein sẽ có thể bị thủy phân trước bởi pepsin, mặc dù xác suất cắt của các vị trí này có thể thấp hơn Nhóm tác giả đã sử dụng phần mềm Pymol được để mô tả vị trí của các điểm có xác suất bị cắt bởi pepsin

≥20%, kết quả cho thấy: có 6 vị trí có xác suất bị thủy phân bởi pepsin từ 50 - 71%, trong đó không có vị trí nào nằm trên bề mặt phân tử ACZ57955.1; trong số 18 vị trí có xác suất cắt ≥40% thì có 10 vị trí nằm trên bề mặt phân tử ACZ57955.1 Các vị trí cắt có tần suất thấp hơn (từ 20-30%) đa phần lại nằm trên bề mặt phân tử protein [4] Trong số các điểm cắt với xác suất  20%, không có vị trí nào nằm trong trung tâm hoạt động của phytaza kiềm ACZ57955.1; có hai điểm cắt (I230 và V129 với xác suất cắt lần lượt là 30%

và 29%) nằm gần trung tâm hoạt động của enzyme này [4]

Những nghiên cứu trên là tiền đề cho các nghiên cứu đột biến điểm thay thế các vị trí axit amin nhạy cảm với pepsin bằng các axit amin có tần suất bị cắt bởi pepsin thấp như proline, histidine; từ đó nâng cao được khả năng kháng pepsin của protein (phytase), giúp chúng qua được pha ruột non

và thể hiện tốt hoạt tính trong đường ruột động vật nuôi [30]

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và hóa chất

2.1.1 Hóa chất

Môi trường Luria Betani - LB (Difco), Tris-base (Sigma); axit axêtic,

axit clohidric, natri hidroxit, ethanol, iso-propanol, glyxeron, canxi clorua,

natri clorua, cloroform, iso amyl alcohol, phenol, SDS, EDTA, glucose, ammonium molypdate tricloroaxetic acid (Merk); natri-phytate (Sigma, P3168); ethidium bromide (Promega); agarose (Bio basic); dung dịch chuẩn 1000 ppm

Fe3+, Mg2+, Zn2+ và Ca2+ (Scharlau, Tây Ban Nha) Các hóa chất phân tích thông dụng khác được mua của Trung Quốc và Việt Nam: CH3COOH, FeSO4.7H2O,

CH3COONa, NaOH, HCl, Na2CO3, C2H5OH, NH4OH … đều đa ̣t đô ̣ tinh sa ̣ch ở mức phân tích

Các bộ kit tinh sạch ADN plasmid, tinh sạch ADN từ gel; các loại enzyme cắt giới hạn, enzyme polymerase… và các hóa chất sinh học phân tử khác đều mua từ hãng Fermentas (Đức) đạt độ tinh khiết ở mức phân tích

2.1.2 Thiết bị

Các thiết bị, máy móc dùng trong nghiên cứu thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học- Vi sinh, Khoa Sinh, Đại học Sư phạm Hà Nội, bao gồm: tủ ấm, tủ sấy (Binder, Đức); nồi hấp thanh trùng (Tommy, Nhật); máy li tâm (Sorval, Mỹ); quang phổ kế (UV- VIS, Shimazdu, Nhật); máy lắc ổn nhiệt (BR300LF

25 và Memmert, Đức); máy đo pH (MP200R, Thụy Sĩ); cân điện (Shimadzu, Nhật); cân phân tích (Precisa XT 320M, Thụy Sĩ); máy lọc nước siêu sạch (Millipore, Mỹ); máy làm đá (Brema, Đức); tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu -

70C (Sanyo, Nhật); máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ); tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật); máy vortex (Kika, Đức); bộ điện di ADN (Bio Rad,

Mỹ); bàn UV soi ADN (ETX-20C, Mỹ) Các loại pipet từ 2 µl - 5 ml (Gilson, Pháp) và các dụng cụ hóa sinh, vi sinh thông dụng khác

2.1.3 Chủng giống vi sinh vật

Một số chủng vi sinh vật được dung trong đề tài:

Vi khuẩn E coli NovaBlue, E coli BL21(DE3) mua từ hãng Novagen

được dùng làm tế bào chủ tách dòng và biểu hiện gen

2.1.4 Plasmid

Plasmid được sử dụng trong nghiên cứu là: vector pET22b+ tái tổ hợp

với gen phyC mã hóa phytase kiềm từ Bacillus subtilis [55]

2.1.5 Môi trường nuôi cấy và dung dịch đệm

2.1.5.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường LB: 0,5% yeast extract; 1% tryptone; 1% NaCl, pH 7 Môi trường LBA: môi trường LB có bổ sung ampicillin 100 mg/l

Các môi trường trên đều được chuẩn bị trong nước cất 1 lần, bổ sung thạch 20g/l (nếu cần), hòa tan đều bằng khuấy từ có gia nhiệt và đem khử trùng trong chai thủy tinh trung tính ở 121C, 1at trong 15 phút Ampicillin (nếu cần bổ sung) sẽ được bổ sung vào môi trường lỏng hoặc đặc (có thạch) khi môi trường đã được để nguội đến 55 - 60C

Dung dịch đệm thử hoạt tính phytase kiềm (0,1M Tris-HCl, 5mM CaCl2, pH 7)

Dung dịch đệm cho pepsin: 0,2 M KCl – HCl, pH 2

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tin sinh học

2.2.1.1 Thiết kế các cặp mồi mang đột biến điểm trên bề mặt phytase

b Thiết kế điểm đột biến bằng phần mềm Pymol http://www.pymol.org/

Sử dụng các công cụ hiển thị của phần mềm Pymol để hiển thị các axit amin kị nước (leucine, phenyalanine…) trên bề mặt phân tử 1POO Đây là các điểm cắt đặc hiệu của pepsin, đặc biệt khi các điểm kị nước này nằm gần

vị trí của các axit amin có mạch cacbon hydro vòng như tyrosine, tryptophan Các điểm này được định hướng để thiết kế các điểm đột biến; so sánh, đối chiếu để xác định các vị trí có thể gây đột biến trên phân tử ACZ57955.1

Sau khi tìm ra các điểm có khả năng bị thủy phân bởi pepsin chúng tôi

tiến hành dùng thao tác Mutagenesis gây đột biến in silico để thay thế các axit

amin đó bằng các axit amin khác như Proline, Histidine… [33] đây là các điểm không đặc hiệu đối với pepsin Sau đó, chúng tôi tiến hành so sánh, đánh giá 1 số chỉ tiêu trên mô hình cấu trúc bậc 3 của phytase kiềm trước và sau khi đột biến để đánh giá sự thay đổi cấu trúc của enzyme

2.2.1.2 Thiết kế và kiểm tra lại mồi

Để có được các cấu trúc đột biến chúng tôi tiến hành thiết kế các cặp

mồi mang một vị trí đột biến thay thế axit amin Leucin hoặc Phenylalanin bằng proline hoặc các axit amin khác ít nhạy cảm với pepsin Các cặp mồi này cần phải thỏa mãn đủ các điều kiện của sau:

+ Mồi gây đột biến phải có các điểm thay thế nucleotide tạo nên điểm đột biến mong muốn nằm ở chính giữa mồi, cách hai đầu khoảng 10-15 bp; trình tự nucleotide còn lại (không có điểm đột biến) phải bắt cặp chính xác với sợi đối diện của plasmid khuôn

+ Có độ dài khoảng 25-45 bp; mồi có thể dài >45 bp nhưng có thể ảnh hưởng tới hiệu quả của phản ứng sinh tổng hợp đột biến

+ Tm ≥ 78oC; được tính toán theo công thức: Tm=81,5+41(%GC) – (675/N) - % sai số hoặc sử dụng phần mềm tính toán Tm cho Phusion high fidelity DNA polymerase của hãng Agilent: www.genomics.agilent.com [54]

+ Mồi tối ưu cần phải có tỷ lệ GC tối thiểu là 40% và đầu 3’ nên kết thúc bằng nhiều G và C

Để tránh nhầm lẫn và sai sót, chúng tôi sử dụng phần mềm BioEdit để kiểm tra lại trình tự của các cặp mồi đột biến và các thông số Tm, %GC

2.2.2 Phương pháp vi sinh

2.2.2.1 Nuôi cấy giống vi sinh vật

E coli NovaBlue được nuôi trên môi trường LB đặc bổ sung 2% agar

qua đêm (từ 14 -16 giờ) ở 37oC cho đến khi khuẩn lạc mọc rõ

E coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp (pET22b+ - phyC) được

nuôi trên môi trường LBA đặc (có bổ sung 2% agar và ampicillin để đạt 100 mg/l) qua đêm (từ 14 -16 giờ) ở 37oC cho đến khi khuẩn lạc mọc rõ

2.2.2.2 Giữ giống vi sinh vật

Giống vi sinh vật được bảo quản ở 4°C, cấy chuyển 1 lần mỗi tháng trên cùng loại môi trường đặc Để giữ giống trên 1 năm, sinh khối VSV được hòa đều trong dung dịch 10% glycerol và bảo quản trong tủ lạnh sâu -800C

2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử

2.2.3.1 Tách chiết và tinh sạch plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa phytase kiềm

* Tách plasmid tái tổ hợp bằng kit Miniprep (Fermentas #K0503)

Một khuẩn lạc E coli được cấy vào 3 ml môi trường LBA dịch thể,

nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm (14-16 giờ) Thu 3ml dịch nuôi cấy đem li tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút Hòa thật đều cặn tế bào trong 250

µl dung dịch rửa tế bào (Resuspension Solution) đã bổ sung 1/100 V RNase

và vontex đều Thêm vào dịch huyền phù tế bào 250 µl dung dịch phá tế bào (Lysic solution) và trộn nhẹ bằng cách đảo đầu ống eppendorf (4-6 lần) cho

đến khi thấy dung dịch nhớt (Chú ý: đảo đầu eppendorf để trộn mẫu không

được quá 5 phút) Tiếp tục cho thêm 350 µl dung dịch trung hòa và kết tủa protein (Neutralization Solution), trộn nhẹ bằng cách đảo đều eppendorf 4-6 lần cho đến khi mở nắp thấy dung dịch hết nhớt Thu dịch nổi sau 5 phút li

tâm ở 13000 vòng/phút và chuyển dịch nổi sang cột GenJET bằng pipet (Chú ý: không hút phần kết tủa trắng ở phía dưới) Li tâm cột GenJET 1 phút, loại

bỏ dịch chảy qua cột (dịch li tâm) và thêm 500 µl dung dịch rửa cột (Wash Solution) vào cột, tiếp tục li tâm 1 phút, loại bỏ dịch li tâm

Lặp lại bước rửa với 500 µl dung dịch rửa (Wash Solution) Tiếp tục li tâm thêm 1 phút cho hết hoàn toàn ethanol còn sót lại trong cột Sau đó, chuyển cột GenJET sang ống eppendorf 1,5ml sạch; thêm 30 µl dung dịch rửa giải ADN (Elution Bufer) vào giữa màng của cột GenJET để chiết ADN

plasmid (Chú ý: cẩn thận không chạm đầu pipet vào màng silica phía dưới)

Ủ cột GenJET trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và li tâm 5 phút ở 13.000 vòng/phút để thu dịch chiết qua cột

Tiếp tục chiết lần 2 bằng 20 µl dung dịch rửa giải ADN (Elution Bufer) tương tự như chiết lần 1

Thu dịch chiết ADN plasmid vào eppendorf sạch và bảo quản ở -20oC cho đến khi dùng

Nồng độ ADN và độ tinh sạch của mẫu được xác định thông qua độ hấp phụ quang (A - Absorbance) ở bước sóng 260 và 280 nm Nếu tỷ số A260/A280 đạt giá trị 1,8 – 2,0, mẫu ADN được coi là tinh sạch Cứ 1 giá trị A260 tương đương với 50µg/ml ADN trong dung dịch

2.2.3.2 Tạo plasmid tái tổ hợp mang một điểm đột biến thay thế một axit amin bằng phản ứng PCR

Phản ứng PCR gây đột biến điểm có thành phần và các tỉ lệ như sau: 5µl dung dịch đệm HF; 1,25 µl mỗi loại mồi đột biến (Y143P hoặc E189P hoặc E297P); 0,5 µl dNTPs 10 Mm; 0,75 µl DMSO; 0,1 µl ADN khuôn; bổ sung thêm nước để tổng thể tích đạt 25 µl

* Chu trình nhiệt

98C: 3 phút;

20 chu kỳ (98C: 30 giây; 55oC: 1 phút 30 giây; 68C: 10 phút);

72C: 10 phút; 4C:

5 µl sản phẩm của phản ứng PCR trên sẽ được cắt giới hạn bằng

enzyme XhoI, sau đó kiểm tra trên gel agarose 0,8%; 1 µl dung dịch enzyme

DpnI được bổ sung vào thể tích còn lại của sản phẩm PCR để loại bỏ các

ADN plasmid khuôn (đã được methyl hóa bởi E coli NovaBlue) Các phản

ứng trên được tiến hành ở 37C trong 20 phút

Bảng 2.1.Xử lý sản phẩm PCR đột biến

1 Sản phẩm PCR đột biến: 5 µl 1 Sản phẩm PCR đột biến: 20 µl

2 Buffer Tango*Y TM : 1 µl 2 DpnI: 0,3 µl

Ủ 20 phút ở 37 o C  điện di Ủ 20 phút ở 37 o C  Biến nạp

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di gel agarose 0,8%, nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide 0,5 mg/l và quan sát dưới ánh sáng đèn cực tím

Song song với thí nghiệm kiểm tra trên bản gel điện di, 1 µl dịch phản

ứng DpnI được trực tiếp biến nạp vào 50 µl tế bào khả biến E coli

BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42C trong 90 giây

2.2.3.3 Tạo tế bào khả biến E coli BL21(DE3) [theo 38]

Tế bào khả biến E coli BL21(DE3) được chuẩn bị theo phương pháp

hóa học của Morrison, 1977, và được giữ ở -80C cho các thí nghiệm biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt

Một khuẩn lạc E coli được cấy vào 5 ml môi trường LB, nuôi lắc 200

vòng/phút ở 37°C qua đêm Sau đó, 3 ml dịch huyền phù tế bào được cấy chuyển vào 150 ml môi trường LB (OD600 ~ 0,1), tiếp tục nuôi lắc ở 37°C, 200 vòng/phút cho tới khi OD600 đạt 0,4 – 0,6 Đặt dịch nuôi vào trong

đá để dừng nuôi cấy Từ bước này tất cả các thao tác phải thực hiện ở 4°C

Li tâm toàn bộ dịch huyền phù tế bào ở 5000 vòng/phút trong 10 phút và hòa tan cặn tế bào thu được trong 37,5 ml (1/4V) dung dịch 100 mM MgCl2 Ủ mẫu dịch huyền phù 5 phút trong đá, sau đó li tâm thu tế bào ở 4000 vòng/phút,

4oC trong 10 phút Tiếp tục hòa cặn tế bào trong 7,5 ml (1/20V) dung dịch 100

mM CaCl2 (hòa với 3 ml trước cho tan rồi cho tiếp 4,5 ml), ủ mẫu 10 phút trong đá Li tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C để thu cặn tế bào và tiếp tục hòa cặn tế bào trong 1,5 ml (1/100V) dung dịch 100 mM CaCl2 đã bổ sung 15% glycerol Dịch tế bào khả biến này được chia đều vào các ống eppendorf, mỗi ống 50 µl và bảo quản ngay ở - 80°C

Tần số biến nạp của mỗi mẻ tế bào khả biến (được chuẩn bị như trên) sẽ được kiểm tra bằng cách biến nạp 10 ρM pUC19 vào 50 µl tế bào khả biến

bằng phương pháp sốc nhiệt (42oC trong 90 giây) Bổ sung 1 ml môi trường LB dịch thể vào ống tế bào khả biến và nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở 37⁰C; sau đó, 300µl dịch nuôi được trang đều trên đĩa Petri đựng môi trường LBA đặc Ủ các đĩa Petri này trong tủ ấm ở 37⁰C qua đêm cho đến khi các khuẩn lạc mọc rõ trên bề mặt môi trường đặc Tần số biến nạp (P) được tính toán dựa trên số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa Petri theo công thức P = số CFU * (1000/300) *

105 (CFU là số khuẩn lạc mọc trên LBA) Nếu P đạt trên 5x106 khuẩn lạc/µM plasmid là tế bào khả biến đạt tiêu chuẩn

2.2.3.4 Biến nạp ADN vào E coli BL21(DE3) bằng sốc nhiệt [theo 38]

Tế bào khả biến E coli BL21(DE3) được lấy từ tủ lạnh sâu (-80oC) và đặt ngay vào đá, để tự tan trong đá khoảng15-30 phút Hỗn hợp ADN từ phản ứng PCR sinh tổng hợp đột biến cũng được để trong đá Bổ sung 5µl hỗn hợp phản ứng này vào 50µl tế bào khả biến (dùng pipet bơm từ từ vào

và khuấy nhẹ nhàng bằng đầu pipet, không được hút lên, hút xuống, không được lắc) Ủ mẫu trong đá 30 phút rồi chuyển mẫu sang bể ổn nhiệt có nhiệt

độ 42oC và ủ trong 120 giây Bổ sung 1 ml môi trường LB và ủ trong tủ ấm

37oC trong 60 phút, thỉnh thoảng lắc /đảo đầu eppendorf Dùng que trang vô trùng để trang đều 300µl dịch huyền phù trên đĩa thạch môi trường LBA (LB có 100 µg/ml kháng sinh ampicillin, đĩa thạch LBA phải được ủ trước trong tủ ấm 37oC) Các đĩa Petri này được nuôi ở tủ ấm 37oC qua đêm để thu các khuẩn lạc

2.2.3.5 Kiểm tra dòng ADN tái tổ hợp bằng kích thước plasmid và phản ứng PCR tuyển chọn

Các khuẩn lạc thu được ở trên (phương pháp 2.2.3.4) sẽ được nuôi tách biệt trong 5 ml môi trường LBA lỏng ở 37°C, lắc 200 vòng/phút trong

14-16giờ Dịch huyền phù tế bào E coli này được li tâm ở 8.000 vòng/

phút trong 5 phút để thu sinh khối và tách chiết plasmid (phương pháp