Ứng dụngkháng nguyên tái tổ hợp p24, GP41, GP120 trong chẩn đoán HIV bằng kỹ thuật ngưng kết hạt latex

Bạch Thị Như Quỳnh và cộng sự tại việnCông nghệ Sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam công bố đã biểu hiện thành công 3 kháng nguyên quan trọng của virus HIV p24,gp41 và

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

HIV Human immunodeficiency

virus

virus suy giảm miễn dịch ở người

Gag Group-associated anti- gen Kháng nguyên liên kết nhóm

RT Reverse transcriptase Enzym phiên mã ngược

WB Western blot Kỹ thuật miễn dịch trên màng

polyvinyliden difluoritIFA Immunofluoresscence Kỹ thuật miến dịch huỳnh quangElisa Enzyme linked immune

sorbent assay

Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym

DNA Deoxyribonucleic acid acid deoxyribonucleic

Trx A gen encodes thioredoxin A

of E Coli, wich is available in

plasmide pET32a(+)

Gen mã hóa thioredoxin A của

E.coli được thiết kế sẵn trong

plasmide pET32a(+)Trx- 120 A recombinant fusion is

encoded by a fusion gên of trx

and gp120, produced in E coli

Protein tái tổ hợp dạng lai được

mã hóa từ gen trx dung hợp với gen gp120, được tổng hợp trong

E.coli

Trx- gp41 A recombinant fusion is

encoded by a fusion gen of trx

and gp 41, produced in E coli

Protein tái tổ hợp dạng lai được

mã hóa từ gen trx dung hợp với gen gp41, được tổng hợp trong

E.coli

Trx-p24 A recombinant fusion is

encoded by a fusion gen of trx

and p24, produced in E coli

Protein tái tổ hợp dạng lai được

mã hóa từ gen trx dung hợp với gen p24, được tổng hợp trong

E.coli

PBS Phosphate buffered saline Đệm phosphat saline

SDS Sodium dodecyl sulfat Natri dodexin sulfat

TBS Tris buffered saline Đệm saline

TEMED N,N,N’,N’- tetramethyl

ethylenediamine

N,N,N’,N’- tetramethyl ethylenediamine

UNAID Joint United Nations

Programme on HIV/AIDS

Chương trình phối hợp của liên hợp quốc về HIV/ AIDS

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thê giới

UNICEF United Nations Children's

Emergency Fund

Quỹ Nhi đồng Liên Hiệp Quốc

AIDS acquired immunodeficiency

syndrome

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải

CD4 cluster of differentiation 4 Tế bào CD4

BSA Bovine serum albumin Huyết thanh bò

mARN Messenger ribonucleic acid ARN thông tin

ĐẶT VẤN ĐỀ

HIV là virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch ở người Từ một cănbệnh không được ai biết đến nay đã trở thành nỗi sợ hãi, ám ảnh của hàngtriệu người trên toàn cầu Kể từ trường hợp nhiễm đầu tiên được ghi nhận vàonăm 1981, đến nay HIV đã lan rộng ra hầu hết các nước trên thế giới Theothống kê của Tổ chức y tế thế giới và Chương trình phối hợp của Liên HợpQuốc về phòng chống HIV/AIDS, tính đến tháng 12/2007 toàn thế giới có33,2 triệu người nhiễm HIV/AIDS còn sống, 95% số người nhiễm ở các nướcnghèo và đang phát triển Việt Nam là một trong những quốc gia chịu ảnhhưởng nặng nề của đại dịch này

Do tính chất nguy hiểm của bệnh, để đảm bảo an toàn trong truyền máu

và tầm soát bệnh, tránh lây lan, bùng phát dịch trong cộng đồng, việc pháttriển các kit chẩn đoán HIV là vô cùng cần thiết Tuy nhiên, tại Việt Nam, tất

cả các kit đang sử dụng trong chẩn đoán đều nhập ngoại với giá thành cao, độđặc hiệu chưa thể đánh giá được do các hãng sản xuất giữ bí mật phân typeHIV sử dụng trong sản xuất chế phẩm Vì vậy việc nghiên cứu phát triển cácchế phẩm chẩn đoán HIV có độ nhạy, độ đặc hiệu cao cho các chủng HIV lưuhành trong nước có ý nghĩa rất lớn cả về mặt thực tiễn và lâm sàng Từ kếtquả nghiên cứu gần đây của TS Bạch Thị Như Quỳnh và cộng sự tại việnCông nghệ Sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam công

bố đã biểu hiện thành công 3 kháng nguyên quan trọng của virus HIV (p24,gp41 và gp120) dựa trên phân type HIV lai CRF01-AE lưu hành chủ yếu tại

Việt Nam là tiền đề hết sức thuận lợi để chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Ứng

dụng kháng nguyên tái tổ hợp P24, GP41, GP120 trong chẩn đoán HIV bằng kỹ thuật ngưng kết hạt latex” Đề tài nhằm thực hiện 2 mục tiêu:

1. Ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp p24, gp41, gp120 tạo sinh phẩm thửnghiệm chẩn đoán HIV dựa trên kỹ thuật ngưng hạt latex

2. Đánh giá độ tương đồng trong khả năng phát hiện HIV giữa sinh phẩm ngưngkết hạt latex và kit nhập ngoại trên huyết thanh bệnh nhân.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nhiễm HIV ở Việt Nam và trên thế giới

1.1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới

Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới WHO, chương trình Phối hợpcủa Liên Hợp Quốc về HIV/AIDS (UNAIDS) và Quỹ Nhi đồng Liên HiệpQuốc (Unicef) năm 2010, có khoảng 34 triệu người sống chung với HIV trêntoàn thế giới, trong đó có 3,4 triệu trẻ em dưới 15 tuổi Chỉ tính riêng năm

2010 đã có thêm 2,7 triệu ca nhiễm mới HIV, 390 000 ca trong số đó là trẻ

em dưới 15 tuổi [10] Sự phân bố tỷ lệ nhiễm mới HIV trên toàn thế giớikhông đồng đều giữa các quốc gia và khu vực Cụ thể, Sub-Saharan Châu Phi

là khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề nhất với 70% tổng số ca nhiễm mới trêntoàn thế giới, tiếp theo là khu vực Đông Nam Á (17%) và một số quốc giađang phát triển khác [10]

Mặc dù số trường hợp nhiễm HIV vẫn đang gia tăng nhưng tỷ lệ nhiễmđang có xu hướng giảm trong những năm qua Theo số liệu thống kê tại 39quốc gia từ năm 2001 đến 2011cho thấy, tỷ lệ nhiễm HIV trong nhóm ngườitrưởng thành đã giảm hơn 25% Riêng khu vực châu Phi cận Sahara, số lượngngười nhiễm HIV trong năm 2011 là 1,8 triệu người, thấp hơn đáng kể so với2,4 triệu người vào năm 2001 [11]

1.1.2 Tình hình nhiễm HIV ở Việt Nam

Tại Việt Nam, kể từ ca nhiễm HIV đầu tiên được phát hiện năm 1990,tính đến ngày 31/12/2014 toàn quốc có 226,964 trường hợp nhiễm HIV, trong

đó 71,433 người đã chuyển sang giai đoạn AIDS và có tới 71,368 người đã tửvong do căn bệnh này Trong những năm gần đây, số người nhiễm HIV đượcphát hiện với khoảng 12,000 – 14,000 ca mắc mới mỗi năm Tính đến 2014,100% số tỉnh thành, 98.9% quận huyện và 80.3% xã phường đã có ngườinhiễm HIV Dịch HIV ở Việt Nam tập trung chủ yếu ở 3 nhóm quần thể cóhành vi nguy cơ lây nhiễm HIV cao là người tiêm chích ma túy, nam quan hệ

tình dục đồng giới và phụ nữ bán dâm [20].

1.2 Đặc điểm chung của HIV

1.2.1 Hình thái và cấu trúc HIV

Hình 1.1 Hình thái ngoài và cấu trúc của virus HIV

Virus HIV (gồm HIV-1 và HIV-2) thuộc vào họ Retroviridae, giống Lentivirus [1] HIV có dạng hình cầu, đường kính hạt virus 80-100 nm

[2] Hạt virus HIV hoàn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm 3 lớp

- Lớp vỏ ngoài (envelop) cấu trúc bởi một màng lipid kép [7] Trên màng

có các gai nhú glycoprotein liên kết đặc hiệu với các thụ thể trên màng sinhchất tế bào chủ có trọng lượng phân tử 160 kDa (gp160), gồm 2 phần:

+ Glycoprotein màng ngoài có trọng lượng phân tử 120 kDa (gp120)+ Glycoprotein xuyên màng có trọng lượng phân tử 41 kDa (gp41) [8]

- Vỏ capsid gồm 2 lớp protein:

+ Lớp ngoài hình cầu có trọng lượng phân tử 18 kDa (p18)

+ Lớp trong hình trụ có trọng lượng phân tử 24 kDa (p24)

gp120, gp41 và p24 là những kháng nguyên rất quan trọng để chẩn đoánHIV

- Lõi nằm bên trong của vỏ capsid là vật chất di truyền của HIV gồm haiphân tử ARN mạch đơn, chuỗi dương Hệ gen HIV chứa 3 nhóm gen cấu trúc:

+ Gen gag (group specific antigen) là các gen mã hoá cho các kháng

nguyên đặc hiệu trên vỏ capsid của virus

+ Gen pol (polymerase) mã hoá cho các enzyme phiên mã ngược (RT

-Reverse transcriptase), protease và endonuclease (còn gọi là integrase)

+ Gen env (envelop) mã hoá cho glycoprotein vỏ ngoài của HIV [2].

1.2.2 Chu trình sống HIV

Chu trình sống của virus HIV được tóm tắt trong sơ đồ hình 2

Hình 1.2: Chu trình sống của HIV

(1) Sự hấp phụ lên bề mặt tế bào: Do sự phù hợp cấu trúc giữagp120 với thụ thể biểu hiện trên màng tế bào, HIV có thể hấp phụ lên bề mặt

tế bào chủ Trong đa số các trường hợp, thụ thể này là CD4 biểu hiện trên bềmặt tế bào lympho T hỗ trợ (T-help) hoặc một số tế bào khác như bạch cầuđơn nhân lớn, đại thực bào và 1 số tế bào dòng lympho B [2]

(2) Sự xâm nhập vào tế bào: Sau khi bám vào thụ thể trên tế bào vậtchủ, gp41 của HIV cắm sâu vào màng tế bào, nhờ đó bộ gen của HIV chuivào bên trong tế bào Một số tế bào không có thụ thể CD4 như tế bào thần

kinh đệm và tế bào sợi, gp41 đóng vai trò thay thế cho gp120 liên kết với tếbào chủ, đồng thời giúp HIV tránh được tác dụng của kháng thể[9]

(3) Sự phiên mã ngược: Dưới tác dụng của enzym phiên mã ngược(Reverse transcriptase), cADN bổ sung đã được tạo thành từ khuôn ARNmạch đơn của HIV tạo nên sản phẩm lai ARN-ADN Sau đó dưới tác dụngcủa enzym, ARN tách khỏi ADN và sợi ADN bổ sung mới được tổng hợp, tạo

thành phân tử ADN chuỗi kép.[12]

(4) Sự tích hợp: Ở giai đoạn này phân tử ADN mạch kép sẽ chuyểnsang dạng vòng khép kín, chui vào trong nhân rồi tích hợp với ADN của tếbào chủ nhờ enzyme integrase để tránh sự bảo vệ cơ thể, tác dụng của thuốc

và làm chậm quá trình diễn tiến của bệnh Sau khi tích hợp, ADN của HIVtồn tại ở một trong 2 trạng thái: không hoạt động và nằm im như tiền virus,trạng thái tiềm tàng này có thể hoạt động như những virus độc lực dưới cáctác động của môi trường; hai là dạng hoạt động, ADN bổ sung của HIV đượcsao chép thành các hạt virion mới

(5) Giai đoạn sinh tổng hợp: Giai đoạn này ADN bổ sung của HIVđược phiên mã thành ARN genome và ARN thông tin (mARN) để dịch mãthành các protein (enzyme, protein vỏ, ) của thế hệ virus HIV mới [13]

(6) Giai đoạn lắp ráp: Từ các thành phần đã được tổng hợp, các hạtvirus mới được lắp ráp ở bào tương tế bào chủ [14]

(7) Giai đoạn phóng thích: Từ vị trí lắp ráp các hạt HIV gần màngnguyên sinh chất, HIV nảy chồi thoát khỏi tế bào chủ Sau đó các hạt virusnày tiếp tục gây nhiễm cho tế bào mới trong khi các tế bào chủ đã giúp chúngnhân lên bị tiêu diệt [15]

1.2.3 Phân loại HIV

HIV có hai type gây bệnh trên người là HIV-1 và HIV-2 Cả hai týp đềulây truyền qua quan hệ tình dục, qua máu và từ mẹ sang con, và dường nhưbệnh cảnh lâm sàng AIDS của chúng giống nhau Tuy nhiên, HIV-2 khó lâytruyền hơn và thời kỳ giữa sơ nhiễm HIV-2 đến biểu hiện bệnh dài hơn Trênthế giới, chủ yếu là nhiễm HIV-1, type HIV-2 tương đối ít gặp, tập trung ởTây Phi và hiếm gặp ở các châu lục khác Riêng HIV-1 có thể được xếp lớpvào 4 nhóm: M, O và 2 nhóm mới N và P Bốn nhóm này có thể đại diện cho

4 sự thâm nhập riêng rẽ của virus suy giảm miễn dịch của loài linh trưởng vàocon người Trong đó nhóm O xuất hiện giới hạn ở khu vực Tây – Trung Phi;nhóm N –được phát hiện năm 1998 ở Cameroon – là nhóm cực kỳ hiếm;nhóm P – phát hiện lần đầu tiên ở một phụ nữ người Cameroon năm 2009[16] Nhóm này có liên quan gần gũi với virus suy giảm miễn dịch ở loài khỉđột (gorilla); nhóm M – chiếm tới hơn 90% người nhiễm HIV-1 Trong nhóm

M, người ta biết có ít nhất 9 subtype có đặc điểm di truyền khác biệt nhau chủyếu ở vùng V3 của gen chi phối gpl20, kí hiệu từ A đến K [17]

Đôi khi, 2 virus thuộc các subtype khác nhau có thể gặp nhau trong tếbào của một người nhiễm và pha trộn với nhau về vật liệu di truyền để tạo nênmột virus lai tạo mới (một tiến trình tương tự với sự sinh sản giới tính) Nhiềuchủng trong số các loại virus mới này không thể sống sót lâu dài, nhưng một

số dạng virus lai khả ổn định Chính vì khả năng tái tổ hợp phức tạp của HIVđang xuất hiện ngày càng nhiều và liên tục biến đổi đã làm cho việc nghiêncứu về HIV ngày càng phức tạp và khó khăn Trong nghiên cứu của TS BạchThị Như Quỳnh và cộng sự, CRF01-AE (là subtype lai giữa phó type A vớiphó type E của thế hệ cha mẹ khác) đã được chứng minh là subtype lưu hànhphổ biến nhất ở Việt Nam [3]

1.2.4 Triệu chứng

Thời gian trung bình từ khi nhiễm HIV đến khi tiến triển thành AIDSkhoảng 10 - 12 năm Mỗi giai đoạn bệnh liên quan chặt chẽ đến số lượng tếbào CD4 [2]

(1) Giai cấp tính: kéo dài từ 3 – 6 tháng sau hành vi nguy cơ Ở giaiđoạn này nồng độ HIV có thể lên đến vài triệu hạt virus/ml máu Số lượng tếbào T-CD4+ bị giảm đáng kể nhưng có đến 80% người bị nhiễm virus hoàntoàn không có biểu hiện gì của bệnh, 20% còn lại có một số những biểu hiệnnhiễm trùng cấp như: sốt, đau cơ khớp, nôn, tiêu chay, phát ban, hạch to…Các triệu chứng này hiện diện trong vòng 5-10 ngày rồi tự khỏi hoàn toàn.Trong giai đoạn này rất khó phát hiện được kháng thể kháng HIV

(2) Giai đoạn mạn tính: nhờ sự bảo vệ mạnh mẽ của hệ miễn dịch sẽlàm giảm số lượng của các hạt virus trong máu, cơ thể chuyển sang giai đoạnnhiễm HIV mạn tính Giai đoạn này có thể kéo dài từ 2 tuần-20 năm tùy theotừng người mà không có bất kể triệu chứng gì

(3) Giai đoạn AIDS: số lượng các tế bào CD4+ giảm xuống dưới 200

tế bào/1ml máu, sự miễn dịch qua trung gian tế bào bị vô hiệu và xuất hiệnnhiễm trùng do một loạt các vi sinh vật cơ hội gây ra Các triệu chứng đầutiên thường bao gồm giảm cân vừa phải và không giải thích được, nhiễmtrùng đường hô hấp tái phát (như viêm xoang, viêm phế quản, viêm taigiữa, viêm họng), viêm tuyến tiền liệt, phát ban da, và loét miệng

1.3 Kỹ thuật phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV

Phương pháp chẩn đoán gián tiếp sự có mặt của HIV là phương phápdùng kháng nguyên đã biết của HIV phát hiện kháng thể kháng HIV có trongcác dịch cơ thể (máu, dịch tiết, ) Để kiểm tra kháng thể đối với HIV cần ít

nhất hai kỹ thuật: kỹ thuật sàng lọc và ít nhất một kỹ thuật khẳng định Các kỹthuật phát hiện sàng lọc cần độ nhạy rất cao để giảm thiểu nguy cơ cho kếtquả âm tính giả Điều này có nghĩa rằng các xét nghiệm này phải có thể pháthiện sự sự có mặt của kháng thể kháng HIV ở nồng độ rất thấp, ví dụ tronggiai đoạn đầu của quá trình nhiễm trùng nguyên phát Nếu kết quả của mộtxét nghiệm sàng lọc là dương tính, kết quả này phải được khẳng định bởi (ítnhất) một xét nghiệm khẳng định khác có độ đặc hiệu cao Không bao giờđược chẩn đoán sự nhiễm HIV dựa trên kết quả dương tính của duy nhất một

kỹ thuật sàng lọc Mặt khác, để loại trừ việc vô ý làm lẫn mẫu xét nghiệm,người ta thường xét nghiệm thêm một mẫu máu thứ hai của cùng một bệnhnhân Chỉ khi đó, kết quả chẩn đoán HIV mới có thể cho thông báo cho bệnhnhân Hầu hết các kỹ thuật kiểm tra sàng lọc đều dựa trên nguyên lý của phảnứng Elisa (enzyme linked immune sorbent assay) hoặc các xét nghiệm tương

tự (UNAIDS, 1997b)

1.3.1 Kỹ thuật ngưng kết (agglutination)

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý ngưng kết thụ động, những hạt nhưgelatin (SERODIA test), latex hoặc hồng cầu người làm giá đỡ cho cácprotein virus Khi cho tiếp xúc với kháng thể kháng HIV, các hạt này tạothành một mạng lưới ngưng kết có thể nhận định bằng mắt thường Đây là kỹthuật đơn giản, nhanh, không đòi hỏi trang bị đặc biệt, sinh phẩm dễ bảoquản, đồng thời có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở với các xét nghiệm viên cóthể được đào tạo nhanh Nhờ các ưu điểm ấy, kỹ thuật này có thể tiến hànhhàng loạt nên có ý nghĩa điều tra dịch tễ, sàng lọc máu tại các ngân hàng máunhỏ [21] Tuy nhiên hạn chế của kỹ thuật là có thể xảy ra phản ứng dươngtính giả Hiện nay kit test nhanh dựa trên nguyên lý kỹ thuật ngưng kết sửdụng thường quy tại các cơ sở y tế hiện nay là Serodia HIV 1/2 kit

(Fujirebio Inc., Tokyo, Nhật Bản) Kháng nguyên được gắn trên hạt gelatinbao gồm protein tái tổ hợp gp41, p24 của HIV-1 và gp36 của HIV-2.

1.3.2 Kỹ thuật miễn dịch enzyme pha rắn ELISA

ELISA là phương pháp cho phép phát hiện hầu hết các mẫu xét nghiệm

có kháng thể kháng HIV Tuy nhiên, đây là phương pháp có độ nhạy cao, do

đó có thể cho những kết quả dương tính giả ELISA được ứng dụng để pháthiện các kháng thể IgG anti-HIV, IgA anti-HIV hoặc IgM anti-HIV bằng 3 kỹthuật sau:

Kỹ thuật ELISA gián tiếp

Kháng thể kháng HIV trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu vớikháng nguyên HIV đã được cố định sẵn trên giá đỡ (ở các giếng phản ứngtrên hạt nhựa) Phức hợp kháng nguyên - kháng thể được nhận biết bởi mộtcộng hợp là kháng thể kháng Ig người có gắn enzyme và sẽ cho phản ứnghiện màu với một cơ chất thích hợp Giá trị mật độ quang của phản ứng màu

tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử Đây làxét nghiệm có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu không cao do thường bị dươngtính giả.[6]

Kỹ thuật ELISA Sandwich

Kháng thể kháng HIV được cố định trong giếng để tóm bắt các khángnguyên virus trong mẫu thử và được phát hiện bởi kháng thể 2 gắn enzyme.Giá trị mật độ quang của phản ứng màu tỷ lệ thuận với kháng nguyên hiệndiện trong mẫu thử ELISA sandwich thường được sử dụng để phát hiệnkháng nguyên p24 của HIV trong chẩn đoán sớm HIV [18]

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IFA)

Nguyên lý của IFA cũng tương tự ELISA nhưng chất gắn đánh dấu làchất màu huỳnh quang và kết quả được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang.Phản ứng dương tính được thể hiện bằng những tế bào bị nhiễm HIV phátquang ở ngoại vi.

1.3.3 Kỹ thuật Western Blot (WB)

Do hạn chế của ELISA là dương tính giả nên để hạn chế nguy cơ này,cần phải có phương pháp kết hợp để khẳng định chẩn đoán của ELISA.Western Blot (WB) là phương pháp hỗ trợ phổ biến nhất để khẳng định kếtquả dương tính của ELISA, IFA cũng được dùng như một phương pháp thaythế cho WB Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên nguyên lý ELISA gián tiếp thựchiện trên băng giấy, cho phép xác định kháng thể kháng các thành phần khácnhau của protein virus Có WB riêng cho HIV-1 và HIV-2

HIV được ly giải và điện di trên gel polyacrilamide để phân tách cácthành phần kháng nguyên virus theo trọng lượng phân tử, sau đó được chuyểnlên màng nitrocellulose hoặc PVDF (Polyvinylidene Difluoride) và được cắtthành từng dải băng để sử dụng Mỗi dải băng dùng cho một mẫu thử nghiệm

Ủ huyết thanh của mẫu thử với băng giấy Nếu trong mẫu thử có Kháng thểkháng HIV thì chúng sẽ gắn đặc hiệu lên các protein là kháng nguyên tươngứng và được phát hiện bằng cộng hợp là kháng thể kháng Ig người đã đượcđánh dấu bằng enzyme cho màu phản ứng với cơ chất Vị trí các băng màutương ứng với thành phần protein virus gắn với kháng nguyên đặc hiệu Giátrị: Xét nghiệm khẳng định WB có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được thựchiện trong trường hợp các kết quả xét nghiệm phát hiện sàng lọc không phùhợp và khó biện luận.[19][20]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là kháng thể kháng HIV trong các mẫu huyếtthanh bệnh nhân được thu thập từ trung tâm phòng chống AIDS-Bộ QuốcPhòng

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2016

Địa điểm nghiên cứu tại Labo sinh học phân tử Viện Hàn lâm và Côngnghệ Việt Nam và Labo Sinh học phân tử Trường Đại học Y Dược HảiPhòng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm kết hợp mô tả cắt ngang và hồi cứu

2.2.2 Sinh phẩm, hóa chất và vật liệu, trang thiết bị

2.2.2.3 Trang thiết bị

- Máy ly tâm thường - Tủ âm sâu -20, -80

- Máy soi chụp ảnh gel (Bio- Rad) - Cân phân tích 10-4g

- Bộ nguồn điện di (Bio-Rad) - Tủ cấy vô trùng

- Pipetman (Gilson) - Tủ hút khí độc

Kiểm tra chất lượng protein tái tổ hợp Thực hiện quy trình gắn từng loại kháng nguyên tái tổ hợp lên hạt latex

Phối trộn 3 loại hạt latex gắn kháng nguyên theo tỷ lệ 1:1:1

Kiểm tra phản ứng ngưng kết với kháng thể bệnh nhân nhiễm HIV

Tối ưu hóa điều kiện phản ứng ngưng kết

Đánh giá độ tương đồng của chế phẩm với các kit đang lưu hành

- Máy ly tâm lạnh (Sorvall Biofuge Presco)

2.3 Sơ đồ nghiên cứu

2.4 Tiến trình triển khai nghiên cứu

2.4.1 Điện di kiểm tra chất lượng protein tái tổ hợp

2.4.1.1 Biến tính protein tái tổ hợp

- Trộn từng loại protein tái tổ hợp p24, gp120 và gp41 với C1- buffer

theo tỷ lệ 40µl protein với 10µl C1- buffer (tỷ lệ 4:1)

- Đun sôi biến tính protein ở 100ºC trong 10 phút

2.4.1.2 Chuẩn bị gel polyacrylamide %

Điện di gel polyacrylamide được tiến hành theo phương phápcủa

Laemmli U.K (1970), thường được sử dụng để tách riêng các băngprotein có trọng lượng phân tử khác nhau Chúng tôi sử dụng kỹ thuậtnày để kiểm tra các protein tái tổ hợp sau khi biểu hiện

Quy trình:

Đổ gel theo công thức :

(1) Công thức đổ gel cô

- Tris-HCl 0,5M pH=8,8 1,25 ml

- Gắn bản gel vào buồng điện di

- Đổ dung dịch SDS-page 1X với nồng độ 10% đầy bể điện di

- Tra 15 µl và 10 µl marker lần lượt từng loại protein tái tổ hợp vào mỗi giếngđiện di

- Điện di 40mA trong 45 phút

- Sau khi điện di, gel được nhuộm với dung dịch Coomasie brilliant blue (0,1% Coomassie Brilliant Blue R- 250 (w/v)

+ 40% methanol (v/v), 10% acid acetic (v/v)) trong 2 giờ trên máy lắc, sau đó đổ dịch nhuộm, thay bằng dịch tẩy, lắc trong 30 phút thì đổ dịch tẩy đi cho nước vào

- Có thể quan sát trực tiếp hoặc soi kiểm tra mẫu trên nguồn sáng trắng và ghi lại kết quả

2.4.2 Quy trình gắn kháng nguyên tái tổ hợp lên hạt latex

- Trước khi thực hiện quy trình, làm ấm hạt latex, Polylink Coupling Buffer vàPolylink Wash/Storeage Buffer ở nhiệt độ phòng

- Hút 130ml hạt latex (tương đương 12,5mg) vào 3 ống eppendorf 1.5ml,ghi nhãn gp120, gp41 và p24

- Ly tâm các ống ở tốc độ 3000vòng/phút trong vòng 5 phút, loại bỏ dịch nổi

- Tái huyền phù các hạt trong 400µl Coupling Buffer

- Trộn đều rồi ly tâm 3000vòng/phút trong vòng 5 phút

- Chuẩn bị 200mg/ml dung dịch EDAC (carbodiimide) bao gồm 10mgPolyLink EDAC và 50μl Polylink Coupling Buffer trong thời gian đợi ly tâm

- Hỗn hợp sau ly tâm được loại bỏ dịch nổi

- Tái huyền phù các hạt trong 170µl Coupling Buffer

- Thêm 20 μl dung dịch EDAC rồi đảo đều

- Bổ sung từng loại protein gp120, gp41 và p24 vào các ống ghi nhãn tươngứng với nồng độ 500µg rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ Chú ý đảo đềutrong lúc ủ

- Ly tâm 3000vòng/phút trong vòng 10 phút Hút bỏ dịch nổi

- Tái huyền phù các hạt trong 400µl BSA 5%, ủ trong 5 giờ ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 3000vòng/phút trong vòng 10 phút, loại dịch

- Hòa tủa trong 400µl Wash Buffer, ly tâm 3000vòng/phút trong 10 phút, loại

- Chuẩn bị 3 lam kính, ghi nhãn (-),

- Nhỏ 1 giọt huyết thanh bệnh nhân bằng pipetman (tương đương 10 µl)lên mỗi lam kính

- Nhỏ 1 giọt (tương đương 10 µl) dung dịch hạt latex không gắn khángnguyên vào lam thứ nhất

- Nhỏ 1 giọt dung dịch latex gắn kháng nguyên HIV tái tổ hợp vào lamthứ 2

- Nhỏ 1 giọt hạt latex gắn kháng nguyên thioredoxin tái tổ hợp vào lamthứ ba

- Dùng pipet trộn đều các dung dịch trên lam kính

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 10-15 phút

- Đọc kết quả bằng mắt thường và soi dưới kính hiển vi quang học

- Ghi lại kết quả

2.4.4 Pha loãng dung dịch hạt latex gắn kháng nguyên tái tổ hợp của HIV

- Tiến hành pha loãng chế phẩm gắn kháng nguyên HIV tái tổ hợp theocấp số 2 để thu được các dung dịch có độ pha loãng từ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 đến1/32 bằng cách:

+ Hút 120μl dung dịch hạt latex trộn đều trong 120 μl dung dịchPBS 5% để thu được dung dịch pha loãng 1/2

+ Hút 120μl dung dịch hạt latex trộn đều với 120 dung dịch PBS5% để thu được dung dịch pha loãng 1/4

+ Với phương pháp tương tự để thu được các dung dịch pha loãng 1/8-1/32

2.4.5 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của chế phẩm

Độ nhạy là tỷ lệ những trường hợp thực sự có bệnh và có kết quả xétnghiệm dương tính trong toàn bộ các trường hợp có bệnh Như vậy độ nhạycho cả kết quả dương tính giả

Độ đặc hiệu là tỷ lệ những trường hợp thực sự không có bệnh và có kếtquả xét nghiệm âm tính trong toàn bộ các trường hợp bị bệnh, độ đặc hiệucàng cao kết quả càng chính xác

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của protein tái tổ hợp gp120, gp41 và p24

Protein gp120, gp41 và p24 tái tổ hợp do nhóm nghiên cứu của TS BạchThị Như Quỳnh cung cấp được kiểm tra độ tinh sạch bằng kỹ thuật điện di vàđịnh lượng bằng phương pháp Bradford

3.1.1 Kiểm tra nồng độ protein tái tổ hợp

Nồng độ của các protein tái tổ hợp Gp120, Gp41 và p24 được xác địnhbằng phương pháp đo mật độ quang học dung dịch bằng máy Nanodrops(Thermo) ở bước sóng 280nm Kết quả thu được trong bảng sau:

Bảng 3.1 Nồng độ Protein tái tổ hợp được đo bằng máy Nanodrops

3.1.2 Kiểm tra độ tinh sạch của Protein tái tổ hợp

Để có thể ứng dụng các protein tái tổ hợp cho nghiên cứu vào ứng dụngtạo Kit chẩn đoán HIV bằng kỹ thuật ngưng kết hạt latex, trước tiên phải kiểmtra độ tinh sạch của protein tái tổ hợp

Việc kiểm tra độ tinh sạch được tiến hành bằng phương pháp điện diprotein trên gel polyaryamide

Kết quả điện di của protein tái tổ hợp Gp120