Nghiên cứu đặc tính hoá sinh, khả năng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất của một số hợp chất tự nhiên từ dịch chiết quả phật thủ = (Citrus medica L. var. sarcodactylis (Noot.

Xuất phát từ thực tế trên, cùng với mong muốn góp phần vào việc nghiên cứu, phát hiện thêm các thuốc có nguồn gốc thảo dược để dự phòng và chữa bệnh béo phì, chúng tôi chọn đề tài: “Nghi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

––––––––––––––––––––––––––––––

NGUYỄN XUÂN HẠNH

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH HÓA SINH, KHẢ NĂNG CHỐNG BÉO PHÌ VÀ RỐI LOẠN TRAO ĐỔI CHẤT CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN TỪ DỊCH CHIẾT

QUẢ PHẬT THỦ

(Citrus medica L var sarcodactylis (Noot.) Swingle.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2010

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Bệnh béo phì (Obesity) được tổ chức Y tế Thế giới (WHO) định nghĩa

là tình trạng tích luỹ mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khoẻ Tổ chức Quốc tế theo dõi bệnh béo phì (Internation Obesity Tast Force – IOTF) cho biết tình trạng béo phì đang tăng lên với tốc độ báo động, không những ở các quốc gia phát triển

mà ở cả các quốc gia đang phát triển Hiện nay trên Thế giới có khoảng 1,7 tỷ người thừa cân và mắc bệnh béo phì [3][65] Ở Việt Nam, theo điều tra mới nhất của Viện Dinh dưỡng cho thấy tình trạng thừa cân (2007), béo phì cũng đang tăng nhanh, trong đó tỷ lệ béo phì ở người trưởng thành, từ 25 – 64 tuổi, lên tới 16,8% [13]

Người bị béo phì ngoài thân hình nặng nề, khó coi… còn có nguy cơ mắc nhiều bệnh như rối loạn lipid máu, rối loạn về tim mạch, đột qụy, tăng huyết áp, sỏi mật, xương khớp, ung thư và Đái tháo đường (ĐTĐ)… trong đó biến chứng của bệnh tim mạch và đột qụy là yếu tố gây tử vong hàng đầu [3][31]

Do tốc độ phát triển nhanh của bệnh nên nhu cầu về thuốc điều trị cũng tăng nhanh Ngày nay, hàng loạt thuốc điều trị bệnh béo phì đã ra đời và đang được sử dụng nhằm hạn chế sự phát triển của bệnh như: Sibutramine, Orlistat, Metformin…, tuy nhiên đây đều là những loại thuốc không rẻ và thường kéo theo nhiều phản ứng phụ của cơ thể [3]

Uỷ ban chuyên gia của WHO đã khuyến nghị nên phát triển và sản xuất các thuốc có nguồn gốc thảo dược vì đây là nguồn dược liệu sẵn có, giá thành

rẻ và ít độc [19][31][56]

Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của các loài cây thuốc có giá trị của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lí, hiệu quả có tầm quan trọng đặc biệt

trong Y - Dược học Phật thủ - Citrus medica L var sarcodactylis (Noot.) Swingle thuộc họ Cam – Rutaceae là một cây thuốc quý Trong dân gian, bộ

phận thường dùng là quả, ngoài ra hoa, lá và rễ cũng được dùng, quả Phật thủ

có công dụng: Dùng trị các bệnh như: trướng đầy bụng, đau dạ dày; chán ăn, nôn mửa; ho dai dẳng có nhiều đờm [5][18] Tuy nhiên, về tác dụng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất, đặc biệt khả năng hỗ trợ hạ đường huyết các bệnh ĐTĐ thì hầu như chưa được các nhà khoa học ở Việt Nam đề cập nghiên cứu

Xuất phát từ thực tế trên, cùng với mong muốn góp phần vào việc nghiên cứu, phát hiện thêm các thuốc có nguồn gốc thảo dược để dự phòng và chữa bệnh béo phì, chúng tôi chọn đề tài:

“Nghiên cứu đặc tính hoá sinh, khả năng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất của một số hợp chất tự nhiên từ dịch chiết quả Phật thủ

(Citrus medica L var sarcodactylis (Noot.) Swingle.)”

2 Mục đích nghiên cứu

2.1 Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học cơ bản của quả Phật thủ (Citrus

medica L var sarcodactylis (Noot.) Swingle.)

2.2 Bước đầu nghiên cứu tác động của các phân đoạn dịch chiết từ qủa Phật thủ lên trọng lượng cơ thể và một số chỉ số hoá sinh (glucose, cholesterol, triglycerid, HDL-c, LDL-c, lipase) trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm 2.3 Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ lên chỉ số glucose máu của chuột béo phì được tiêm STZ liều thấp (110 120mg STZ/kg) để tạo mô hình thực nghiệm ĐTĐ type 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Dựa trên mục tiêu nghiên cứu chúng tôi xác định các nhiệm vụ cụ thể của luận văn như sau:

3.1 Đưa ra quy trình tách chiết một số hợp chất từ quả Phật thủ

3.2 Khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong quả Phật thủ ở các phân đoạn dịch chiết

3.3 Nghiên cứu tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ lên

sự giảm trọng lượng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm

3.4 Nghiên cứu khả năng điều hoà đường huyết của các phân đoạn dịch chiết

từ quả Phật thủ trên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng theo type 2

4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tƣợng

4.1.1 Mẫu thực vật

Quả Phật thủ (Citrus medica L var sarcodactylis (Noot.) Swingle)

Thời gian thu hái: Được thu mua vào tháng 11 năm 2009 tại Thành phố

nghiệm, chuột béo phì gây ĐTĐ mô phỏng theo type 2, dựa theo các tài liệu [66] và đã được cải biến trong các nghiên cứu ở Việt Nam [6][11]

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Phương pháp chiết xuất

5.2 Phương pháp khảo sát thành phần hoá học

5.2.1 Phương pháp định tính thành phần hoá học của quả Phật thủ

5.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất bằng kĩ thuật sắc kí lớp mỏng [17] 5.2.3 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau (Singleton và cộng sự 1999)

5.3 Phương pháp tạo mô hình động vật thực nghiệm: Chuột béo phì thực nghiệm, chuột ĐTĐ type 2

5.4 Phương pháp định lượng một số chỉ số hoá sinh máu [11][17]

5.5 Phương pháp xử lý thống kê toán học [20]

6 Những đóng góp mới của đề tài

 Đưa ra quy trình tách chiết phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ quả Phật

thủ

 Đánh giá được tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ đến khả năng giảm trọng lượng và một số chỉ số hoá sinh của chuột béo

phì thực nghiệm

 Đánh giá được khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết

lên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 thông qua chỉ số glucose huyết

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các hợp chất thực vật thứ sinh (Plant secondary metabolites)

1.1.1 Một số khái niệm cơ bản về hợp chất thực vật thứ sinh

Hợp chất thực vật thứ sinh là các sản phẩm của các quá trình trao đổi chất được sinh ra ở thực vật Chúng là các chất hoá học thứ cấp (Secondary products) được tổng hợp và chuyển hoá từ các chất trao đổi bậc nhất (primary compotunds) như axit amin, axit nucleic, carbonhydrate, lipid, peptid, hoặc từ các sản phẩm trung gian của chu trình đường phân, chu trình pentose – phosphate, chu trình axit citric… Khác với các chất trao đổi bậc nhất, giữ vai trò trung tâm và tham gia trực tiếp vào các quá trình trao đổi chất của cơ thể, các hợp chất thực vật thứ sinh không phải là các yếu tố đặc biệt cần thiết cho các quá trình sinh trưởng, phát triển, quang hợp và sinh sản [70] Chúng được tạo ra trong các tế bào chuyên biệt với vai trò điều hoà mối quan hệ qua lại giữa các tế bào trong cơ thể và là các hợp chất phòng thủ giúp thực vật chống chịu lại với các bệnh xâm nhiễm thực vật đối với môi trường sống xung quanh [61]

Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học và các thuộc tính lý học của chúng mà các hợp chất thực vật thứ sinh được phân loại thành 3 nhóm chính là: Nhóm terpen, nhóm các hợp chất phenolic và nhóm alkaloid

1.1.1.1 Terpen thực vật

Terpen là nhóm hydrocacbon thực vật lớn và đa dạng nhất, được hình thành từ quá trình polymer hoá các tiểu đơn vị isopren (C5H8), có công thức cấu tạo chung là (C5H8)n Trong thực vật, terpen được tổng hợp thông qua con đường trao đổi chất acetate/mevanolate hoặc con đường glyceraldehydes – 3 - phosphate/pyruvate Hầu hết các terpen đều thuộc nhóm hydrocarbon, tuy nhiên chúng có thể bị khử hoặc bị oxy hoá để hình thành các hợp chất

terpenoid khác nhau như alcohol, ketone, acid và aldehyde Vì vậy, một số tác giả sử dụng thuật ngữ “terpen” để chỉ chung một nhóm lớn các hợp chất bao gồm cả terpen và terpenoid [63]

Hình 1.1 Cấu trúc một số triterpen

1.1.1.2 Các hợp chất phenolic từ thực vật

Hợp chất phenolic là nhóm các chất khác nhau rất phổ biến trong thực vật Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có vòng thơm (benzen) mang một, hai hay ba nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp vào vòng benzen Dựa vào thành phần và cấu trúc người ta chia hợp chất phenolic thành 3 nhóm nhỏ [34]:

 Nhóm hợp chất phenolic đơn giản: Trong phân tử chỉ có một vòng

benzen và một vài nhóm hydroxyl Tuỳ thuộc vào số lượng nhóm -OH mà chúng được gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquinone…), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquynol…)

 Nhóm hợp chất phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử

của chúng ngoài vòng thơm benzen (C6) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh Đại diện nhóm này có acid cyamic, acid ceramic

 Nhóm hợp chất phenolic đa vòng: Là nhóm đa dạng nhất trong các hợp

chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn

phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng Nhóm này có flavonoid, tannin và coumarin

Hợp chất phenolic được hình thành một cách dễ dàng trong tất cả các cơ quan thực vật từ những sản phẩm đường phân và chu trình pentose phosphate qua acid sikimic hay theo con đường acetate manolate qua acetyl-SCoA Trong

số các chất polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng nhất vì chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và mang nhiều đặc tính sinh dược học có giá trị

1.1.1.2.1 Flavonoid

Flavonoid là những sắc tố, phần lớn có màu vàng (flavus – nghĩa là màu vàng) Tuy nhiên một số sắc tố khác như xanh, đỏ, tím,… hoặc không màu cũng xếp vào nhóm flavonoid vì chúng có chung đặc điểm cấu tạo

* Cấu tạo hoá học và phân loại

Về cấu tạo hoá học, khung cacbon của flavonoid là C6-C3-C6, gồm 15 nguyên tử cacbon, hai vòng benzen A và B nối với nhau qua dị vòng C, trong

đó A kết hợp với C tạo khung chroman [39][43]

9

10 8

4

1'

5' 6'

4'

3' 2'

B

Hình 1.2 Flavan (2 – phenyl chroman)

Tuỳ theo mức độ oxy hoá vòng pyran, sự có mặt hay không có mặt của nối đôi giữa C2 với C3 và nhóm cacbonyl ở C4 mà có thể phân biệt flavonoid thành các nhóm phụ sau: Flavon và flavonol, flavanol (đihidro flavon), chalcol, aurol, leucoantoxianidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid và neoflavonoid [72]

Cyanidin Epicatechin Quercetin

OH O

O H

* Hoạt tính sinh học của flavonoid

Tác dụng chống oxy hoá (antioxidant)

Flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hoá dây truyền gây

ra bởi các gốc tự do hoạt động Tuy nhiên hoạt tính này mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào đặc điểm của từng flavonoid cụ thể

Gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý bình thường của cơ thể hay do tác động bên ngoài là nguyên nhân gây phá huỷ ADN, protein, lipid làm phát sinh nhiều bệnh tật nguy hiểm và sự lão hoá cho cơ thể Flavonoid có bản chất polyphenol nên dễ dàng biến đổi dưới tác động của các enzyme có trong tế bào động thực vật Đặc biệt flavonoid có nhóm hydroxyl ở vị trí ortho dễ dàng bị oxy hoá bởi xúc tác của enzym polyphenoloxydase tạo semiquynol hoặc quynol [17] Đây là các gốc tự do bền vững chúng có thể nhận điện tử và trở thành dạng hidroquynol Bởi vậy các chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động và loại chúng ra khỏi cơ thể Quá trình được tóm tắt qua sơ đồ sau:

O2 + Flavonoid (dạng khử) oxydase

peroxydase

polyphenol

Flavonoid (dạng oxy hoá)

(Hidroquynol) (Semiquynol hoặc quynol)

Ngoài ra flavonoid còn có tác dụng bảo vệ các hệ thống sinh học nhờ khả năng tạo phức với các kim loại chuyển tiếp như Fe2+, Cu2+… hoạt hoá enzym chống oxy hoá và ức chế sự oxy hoá

Tác dụng thay đổi hoạt độ các enzyme

Hợp chất phenol nói chung và flavonoid nói riêng có khả năng tương tác với protein, nhờ tính chất này mà các flavonoid có thể làm thay đổi hoạt tính enzyme Năm 1929, A.I Oparin và A.L Kursanop đã phát hiện ra các flavonoid có khả năng ức chế nhiều loại enzyme nhưng tính chất này không hoàn toàn đặc hiệu Đây chính là cơ sở hoá sinh để định hướng cho việc sử dụng flavonoid thiên nhiên vào lĩnh vực sinh – y học phục vụ sức khoẻ vào đời sống con người [17]

Tác dụng kháng khuẩn

Nhiều công trình nghiên cứu trong nước và thế giới đã chứng tỏ tác dụng chống viêm nhiễm (anti-inflamatory), chống vi khuẩn (anti-bacterial) và virut (antiviral) [2][8]

Tác dụng làm bền thành mạch máu

Các dẫn xuất đường của flavonoid có hoạt tính của vitamin P như rutin, hesperidin… có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch, giảm sức thẩm thấu của hồng cầu qua thành mao mạch Hoạt tính này được ứng dụng trong chữa trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch, trĩ, rối loạn tuần hoàn tĩnh mạch [19]

Tác dụng giảm béo phì và lipid máu

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật cho thấy khi chuột béo phì được điều trị bằng dịch chiết giàu flavonoid từ lá Bằng lăng

(Lagerstroemia specciosa L.) thì có trọng lượng giảm đáng kể (~ 10%) [68] Thí nghiệm tương tự với flavonoid từ lá Kim ngân (Lonicera japonica

Thunb.) đối với chuột cống trắng uống cholesterol cũng cho thấy có tác dụng làm giảm các chỉ số cholesterol, triglyceride, LDL-c đồng thời tăng HDL-c [29] Naringin (C17H32O4) và Hesperidin (C28H34O15) là những flavonoid có

hàm lượng cao trên họ Cam chanh (Rutaceae) đã được nhiều nhà nghiên cứu

chiết xuất và thử tác dụng trên mô hình chuột béo phì cho kết quả tốt trong việc làm hạ các chỉ số lipid máu [28][34]

moschatus) [11]… Đã có một số nghiên cứu tác dụng của Naringin của các

loài Citrus (họ Cam) có vai trò hạ glucose và lipid máu của bệnh béo phì và

màu, có hoạt tính quang học, vị chát, dễ bị oxy hoá khi đun nóng hay khi để ngoài ánh sáng

Tác dụng sinh học của tannin là chất bảo vệ cây trồng trước sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh và côn trùng ăn lá [44][51] Trong y học, tannin được

sử dụng làm thuốc cầm máu, chữa đi ngoài, ngộ độc kim loại nặng, chữa trĩ, viêm miệng, viêm xoang, điều trị cao huyết áp và đột qụy [1]

O

OH OH

OH OH

O H

O

OH OH

OH OH

O H

O

OH OH

OH OH

O H

ngày, coumarin được sử dụng làm nước hoa, hương liệu, bán tổng hợp các chất hoá học khác nhau, đặc biệt là các chất chống đông máu và chất diệt loài gặm nhấm Trong y học, tác dụng đáng chú ý của dẫn chất coumarin là tác dụng chống co thắt, làm giãn nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch Nhiều chất coumarin có tính kháng khuẩn, một số khác có tác dụng kháng viêm, kháng nấm, kháng khối u, trừ giun sán, giảm đau và hạ nhiệt

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của coumarin

1.1.1.3 Alkaloid thực vật

Alkaloid là những hợp chất chứa nitơ, không những chỉ có trong thực vật mà còn có cả trong động vật Nguyên tử nitơ có thể là một phần, hoặc không phải là một phần của hệ thống dị vòng Chúng có cấu trúc phân tử phức tạp, có hoạt tính Sinh - dược rõ rệt và phân bố hạn chế trong giới thực vật

69 Hiện nay đã có hơn 12000 loại alkaloid khác nhau được phân lập Trong cây, alkaloid tồn tại dưới 3 dạng: dạng tự do, dạng muối của các axit phổ biến như citric, lactic, oxalic, axetic, malic…và dạng oxit nitơ Alkaloid không phổ biến rộng ở tất cả các loài thực vật mà chỉ tập trung ở một số ít loài, chủ yếu được tìm thấy trong các loài thực vật có hoa, nhưng chỉ có khoảng 20% số loài thực vật có hoa là có thể sản sinh ra alkaloid Đa số alkaloid không có mùi, vị đắng, một số ít có vị cay, ở dạng chất rắn có màu trắng, trừ một vài chất có màu vàng (berberin, palmatin) Về vai trò sinh học, các alkaloid được coi là một trong những “hàng rào phòng thủ hoá học hữu hiệu” bảo vệ cây trước sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh và các loại côn trùng, sâu bệnh ăn

lá 72 Về y học, alkaloid được sử dụng rất đa dạng: làm thuốc gây ức chế,

hoặc kích thích hệ thần kinh trung ương, dùng làm thuốc điều hoà huyết áp, chữa loạn nhịp tim, thuốc diệt ký sinh trùng, kháng khuẩn, thuốc chống ung thư và nhiều tác dụng quan trọng khác Dưới đây là 3 dạng alkaloid điển hình:

Caffeine morphine Nicotin

Hình 1.6 Các dạng alkaloid điển hình 1.1.2 Vai trò của các hợp chất thực vật thứ sinh

Các hợp chất thứ sinh có rất nhiều vai trò quan trọng, mang chức năng sinh thái đặc biệt, giúp cho thực vật sống sót, phát triển và tồn tại:

- Giúp cơ thể chống lại bệnh tật, ký sinh trùng và các vi sinh vật gây nhiễm bệnh

- Giúp cơ thể chống lại các yếu tố bất lợi trong quá trình sinh tồn

- Tạo lợi thế cạnh tranh giữa các loài khác nhau

- Tạo thuận lợi cho các quá trình sinh sản: Nhiều sắc tố flavonoid đóng vai trò là chất dẫn dụ động vật và côn trùng tham gia vào việc thụ phấn và phát tán hạt [17][26][56]

1.1.3 Ứng dụng của các hợp chất thực vật thứ sinh

- Công nghệ Y- Dược: Rất nhiều hợp chất thứ sinh được sử dụng để sản

xuất nhiều loại thuốc điều trị các bệnh khác nhau như: Quinin dùng làm thuốc trị sốt rét, quinidin dùng làm thuốc trợ tim, daizein dùng làm thuốc chống ung thư…[17][18]

- Công nghệ hoá thực phẩm: Dùng làm gia vị, phẩm màu, hương liệu…

- Công nghệ hoá mỹ phẩm: Dùng làm nước hoa, xà phòng, mỹ phẩm…

- Sản xuất hàng tiêu dùng: Dùng làm dung môi, keo dán, hàng dệt

may…

- Dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc bảo vệ thực vật

1.2 Bệnh béo phì (Obesity)

1.2.1 Khái niệm và phân loại bệnh béo phì

Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) định nghĩa béo phì (obesity) là tình trạng tích luỹ mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng hay toàn bộ cơ thể gây ảnh hưởng tới sức khoẻ

Để nhận định tình trạng béo gầy WHO thường dùng chỉ số khối cơ thể (BMI – Body Mass Index) Chỉ số khối cơ thể được tính theo công thức như sau:

2

W (H)

BMI Trong đó: W: Khối lượng (kg)

1.2.2 Thực trạng béo phì trên Thế giới và Việt Nam

Theo tổ chức Y tế Thế giới, hiện nay số người béo phì trên thế giới đã lên đến hơn 1,7 tỉ người Trên thế giới cứ 4 người trưởng thành thì có một người béo phì, tức là số người béo phì ở độ tuổi trưởng thành trên thế giới chiếm 25% [3] Tình trạng béo phì đang tăng lên với tốc độ báo động, không những ở các quốc gia phát triển mà ở cả các quốc gia đang phát triển Tỉ lệ người béo phì ở Mỹ chiếm tới hơn 30%, Trung Quốc có hơn 20% số người thừa cân và béo phì Số người béo phì cũng đang báo động ở châu Âu, đứng đầu bảng là nước Anh với hơn 23% số người béo phì, và châu Âu hiện có tới hơn 14 triệu trẻ em thừa cân và béo phì Còn ở châu Mỹ thì Braxin cũng là nước có tỉ lệ người dân bị béo phì cao (chiếm 16%) [3]

Theo tiêu chuẩn châu Á, Việt Nam hiện có 16,8% số người ở độ tuổi từ

25 – 64 đã thừa cân, béo phì Theo đó thì cứ 100 người trong độ tuổi trưởng thành thì có 17 người béo phì, và tỉ lệ người béo phì ở thành phố gấp 3 lần ở nông thôn Tình trạng thừa cân béo phì tăng nhanh ở tuổi ngoài 45 (chiếm 2/3

số người béo phì) và nữ giới có tỉ lệ béo phì cao hơn nam giới Còn đối với trẻ

em thì tình trạng béo phì cũng ở mức đáng ngại Theo kết quả điều tra của Viện dinh dưỡng: Ở Hà Nội có tới 4,9% số trẻ ở độ tuổi từ 4 – 6 bị thừa cân béo phì Ở Thành phố Hồ Chí Minh tỉ lệ này còn cao hơn nhiều, có tới 6% số trẻ dưới 5 tuổi và 22,7% số trẻ đang học ở cấp I bị thừa cân béo phì Đây thật

sự là mối đe dọa tiềm ẩn trong tương lai, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của mỗi người và sự phát triển của kinh tế và xã hội [3]

1.2.3 Nguyên nhân gây ra bệnh béo phì

Mọi người đều biết cơ thể giữ được cân nặng ổn định là nhờ trạng thái cân bằng giữa năng lượng do thức ăn cung cấp và năng lượng tiêu hao cho lao động và các hoạt động khác của cơ thể Cân nặng của cơ thể tăng lên có thể

do chế độ ăn dư thừa vượt quá nhu cầu hoặc do nếp sống làm việc tĩnh tại ít tiêu hao năng lượng

Khẩu phần ăn và thói quen ăn uống: Năng lượng (calorie) được đưa

vào cơ thể qua thức ăn, thức uống được hấp thụ và được oxy hoá để tạo thành

nhiệt lượng Năng lượng ăn quá nhu cầu sẽ được dự trữ dưới dạng mỡ

Chế độ ăn giàu chất béo (lipid) có liên quan chặt chẽ với gia tăng tỉ lệ

béo phì Các thức ăn giàu chất béo thường ngon nên người ta ăn quá thừa mà không biết Vì vậy, khẩu phần ăn có nhiều mỡ, dù số lượng nhỏ cũng có thể gây thừa calorie và tăng cân Không chỉ ăn nhiều mỡ, thịt mà ăn nhiều chất bột, đường, đồ ngọt đều có thể gây béo

Việc thích ăn nhiều đường, ăn nhiều món xào, rán, những thức ăn nhanh nấu sẵn và miễn cưỡng ăn rau quả là một đặc trưng của trẻ béo phì Thói quen ăn nhiều vào bữa tối cũng là một điểm khác nhau giữa người béo

và người không béo

Vận động thể lực kém: Cùng với yếu tố ăn uống, sự gia tăng tỉ lệ béo

phì song song với sự giảm hoạt động vận động thể lực trong một lối sống tĩnh tại hơn, thời gian dành cho xem tivi, đọc báo, làm việc bằng máy tính, nói chuyện qua điện thoại nhiều hơn

Kiểu sống tĩnh tại cũng giữ vai trò quan trọng gây nên béo phì Những người ít hoạt động thể lực, thường ăn những thức ăn giàu năng lượng, khi họ thay đổi lối sống và hoạt động nhưng vẫn giữ thói quen ăn nhiều cho nên họ

bị béo phì Điều này giải thích béo phì biểu hiện ở tuổi trung niên, hiện tượng béo phì ở các vận động viên sau khi giải nghệ và công nhân lao động chân tay

có xu hướng béo phì khi về hưu.[3][27][31]

Yếu tố di truyền: Đáp ứng phát sinh nhiệt kém có thể do yếu tố gen di

truyền Yếu tố di truyền có vai trò nhất định đối với những trẻ béo phì thường

có cha mẹ béo và đã được nghiên cứu trên chuột với các gen ob ob Tuy vậy nhìn trên đa số cộng đồng thì yếu tố này không lớn

Yếu tố kinh tế xã hội: Ở các nước đang phát triển, tỉ lệ người béo phì ở

tầng lớp nghèo thường thấp (thiếu ăn, lao động chân tay nặng, phương tiện đi lại khó khăn) và béo phì thường được coi là một đặc điểm của người giàu có

Ở các nước đã phát triển, khi thiếu ăn không còn phổ biến nữa thì tỉ lệ béo phì lại thường cao ở tầng lớp nghèo, do thói quen ăn uống thiếu khoa học của họ

1.2.4 Tác hại và những nguy cơ của bệnh béo phì

Mất thoải mái trong cuộc sống: Người béo phì thường có cảm giác khó

chịu về mùa hè do lớp mỡ dày như một hệ thống cách nhiệt Người béo phì cũng thường xuyên cảm thấy mệt mỏi chung toàn thân, hay nhức đầu, tê buốt

ở hai chân làm cho cuộc sống thiếu thoải mái

Giảm hiệu suất lao động: Người béo phì làm việc chóng mệt, nhất là ở

môi trường nóng Mặt khác do khối lượng cơ thể quá nặng nề nên để hoàn thành một động tác, một công việc trong lao động, người béo phì mất nhiều thì giờ hơn và mất nhiều công sức hơn Hậu quả là hiệu suất lao động của

người béo phì giảm rõ rệt hơn so với người bình thường

Kém lanh lợi: Người béo phì thường phản ứng chậm chạp hơn so người

bình thường trong sinh hoạt cũng như trong lao động Hậu quả là rất dễ bị tai nạn xe cộ cũng như tai nạn lao động.[27]

Hai nguy cơ rõ rệt ở người béo phì:

Tỉ lệ bệnh tật cao, béo phì là một trong các yếu tố nguy cơ chính của các bệnh mãn tính không lây như rối loạn lipid máu, bệnh mạch vành, đái tháo đường không phụ thuộc insulin (thường gọi là ĐTĐ type 2), sỏi mật Ở phụ nữ mãn kinh, các nguy cơ ung thư túi mật, ung thư vú và ung thư tử cung

tăng lên, còn ở nam thì bệnh ung thư thận và ung thư tuyến tiền liệt hay gặp hơn.[31]

Tỉ lệ tử vong cũng cao hơn, nhất là trong những bệnh kể trên.[53][55]

1.2.5 Giải pháp phòng và điều trị bệnh béo phì

Nguyên tắc cần thiết để phòng và điều trị bệnh béo phì là: Thực hiện một chế độ ăn uống hợp lý và hoạt động thể lực đúng mức để duy trì sự ổn định cân nặng của cơ thể Các biện pháp cụ thể là:

- Chế độ ăn: Đảm bảo đủ năng lượng, ít đường, ít chất béo, đủ đạm, vitamin, nhiều rau quả

- Luyện tập thể dục thường xuyên ở môi trường thoáng đãng

- Xây dựng nếp sống năng động, tăng cường các hoạt động thể lực Đối với những bệnh nhân béo phì, ngoài các biện pháp kể trên còn kết hợp với sử dụng thuốc hoặc phẫu thuật

- Sử dụng thuốc: Thuốc giảm cân không được sử dụng vì mục đích thẩm mỹ, mà chỉ được sử dụng cho những bệnh nhân có BMI lớn hơn 27 và

có các vấn đề về sức khoẻ mà phải giảm cân thì mới cải thiện được Các loại thuốc thường được sử dụng hiện nay là:

+ Metformin: Có tác dụng giảm mỡ máu dẫn đến giảm trọng lượng, tuy nhiên nó cũng hay gây tác dụng phụ là buồn nôn, tiêu chảy, gây toan máu

+ Orlistat (Xenical): Làm ức chế lipase và sự hấp thu mỡ ở ruột, tác dụng phụ của orlistat là làm suy giảm khả năng hấp thụ vitamin tan trong mỡ

+ Các thuốc ức chế sự thèm ăn như: Ephedrine, caffeine [3][31]

Tuy nhiên sử dụng thuốc cũng thường gây ra những tác dụng phụ không mong muốn, nên cần hết sức thận trọng khi sử dụng thuốc

- Phẫu thuật để giảm cân: áp dụng đối với những bệnh nhân có BMI trên 35, kèm theo các bệnh lý và rối loạn liên quan Phẫu thuật mang lại thành công rất lớn, nhiều người giảm được đến 50% cân nặng trong vòng 1 – 2 năm

đầu sau phẫu thuật, tuy nhiên nó cũng gây ra nhiều tác dụng phụ như suy nhược, khô da, rụng tóc tạm thời…[3][65]

1.2.6 Rối loạn trao đổi lipid máu

Huyết thanh người bình thường có 5 – 7 g/l lipid toàn phần bao gồm acid béo tự do, triglyceride, cholesterol toàn phần với hai dạng cholesterol tự

do và cholesterol este, các photpholipid Vì không tan trong nước nên lipid được vận chuyển trong máu dưới dạng kết hợp với các protein đặc hiệu Các acid béo tự do được vận chuyển chủ yếu bởi albumin, các lipid khác được lưu hành trong máu dưới dạng phức hợp lipoprotein như: các hạt chymomicron, VLDL, HDL, IDL, LDL Các lipoprotein này có kích thước, thành phần, tỉ trọng và chức năng khác nhau trong quá trình chuyển hoá lipid [9][24][53][73]

Để đánh giá lượng mỡ trong máu người ta làm xét nghiệm với các chỉ số:

 Cholesterol toàn phần (2,9 – 5,2 mmol/l)

Fredrickson căn cứ vào kĩ thuật điện di và siêu ly tâm với các thành phần huyết thanh đã phân loại chứng tăng lipid máu thành 5 type dựa trên những thay đổi thành phần lipoprotein Cách phân loại này đã được WHO chính thức

sử dụng vào năm 1970 [23] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh người mắc bệnh béo phì có nguy cơ cao mắc các bệnh rối loạn lipid máu dẫn đến xơ vữa động mạch (liên quan chủ yếu đến các lipoprotein) hoặc hiện tượng “nhiễm độc mỡ tế bào” [19][23]

1.2.7 Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường

Béo phì và ĐTĐ là hai bệnh không truyền nhiễm nguy hiểm nhất của thế kỷ 21 Hai căn bệnh này có mối quan hệ chặt chẽ với nhau thể hiện ở chỗ

tỉ lệ người béo phì luôn tăng tương đương với số bệnh nhân bị ĐTĐ Một cuộc khảo sát của Mỹ gần đây đã chỉ ra rằng có tới 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do béo phì Béo phì liên quan tới ĐTĐ type 2 thông qua sự đề kháng insulin Nồng độ acid béo tự do cứ tăng 100µM thì mức đề kháng insulin tăng khoảng 5 – 10% [3] Thiếu insulin dẫn đến sự tăng trọng lượng cơ thể, tăng đường máu, cuối cùng dẫn đến bệnh ĐTĐ type 2

Có nhiều nhân tố ảnh hưởng tới mối quan hệ giữa béo phì và bệnh ĐTĐ type 2 bao gồm: Chỉ số khối cơ thể, thời gian béo phì, chế độ dinh dưỡng, sự vận động thân thể… Một thống kê đã chỉ ra rằng những người có chỉ số khối cơ thể lớn hơn 30 kg/m2 trong 10 năm có nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ type 2 cao gấp 2 lần người bị béo phì dưới 5 năm và nếu trọng lượng tăng 1

kg thì rủi ro về bệnh ĐTĐ type 2 tăng 4,5% [31] Đây chính là cơ sở để Reed

và cộng sự đưa ra phương pháp gây mô hình ĐTĐ thực nghiệm ở động vật bằng cách tiêm STZ liều đơn cho chuột đã được vỗ béo nhiều ngày [60][67] Tại Việt Nam, Trần Thị Chi Mai đã áp dụng phương pháp này và đạt hiệu quả 90% chuột xuất hiện ĐTĐ với nồng độ glucose máu ≥ 10 mmol/l [19]

Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy acid béo tự do có vai trò trong bệnh sinh ĐTĐ type 2 Phần lớn người béo phì có nồng độ acid béo trong huyết tương tăng cao Sự tăng này ức chế quá trình hấp thu glucose ngoại vi dưới tác dụng của insulin, ức chế sử dụng glucose của toàn cơ thể, ức chế oxy hoá glucose ở cơ [32]

ĐTĐ đặc trưng bởi sự rối loạn chuyển hoá glucid, sự rối loạn này ảnh hưởng đến môi trường nội môi do đó kéo theo hoặc làm cho quá trình rối loạn chuyển hoá lipid ở mỗi loại ĐTĐ mang những đặc trưng riêng Đặc trưng chung của rối loạn chuyển hoá lipid trong ĐTĐ là sự tăng triglyceride, giảm HDL-c và LDL-c vẫn nằm trong giới hạn bình thường Tuy nhiên ở ĐTĐ type

1 rối loạn tăng triglyceride sẽ mất đi khi kiểm soát được glucose máu khác với type 2, rối loạn này có thể vẫn kéo dài mặc dù có sự điều trị giảm glucose máu thích hợp LDL-c của type 2 cũng có thể tăng nhẹ và xuất hiện nhiều LDL-c với kích thước nhỏ và nặng hơn khi việc kiểm soát glucose kém Đây chính là yếu tố làm tăng nguy cơ bệnh xơ vữa động mạch [19]

1.3 Bệnh đái tháo đường

1.3.1 Khái niệm và phân loại

Danh từ đái tháo đường (diabetes mellitus) có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (diabetes: nước chảy trong ống syphon) và tiếng Latinh (mellitus: ngọt) [73] Khoảng 1550 năm trước công nguyên các thầy thuốc Hy Lạp đã mô tả bệnh này với các triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, nước tiểu có đường và sút cân nhanh [3] PGS.TS Tạ Văn Bình thì định nghĩa ĐTĐ là một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng đường máu, do hậu quả của việc mất hoàn toàn insulin hoặc là do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin Bệnh ĐTĐ được xác định dựa vào những tiêu chí trong bảng 1.2 [3]

Bảng 1.2 Các tiêu chí để chuẩn đoán ĐTĐ theo WHO [3]

Kết Luận

Đường huyết lúc đói (mmol/l)

Đường huyết 2 giờ sau khi làm nghiệm pháp tăng đường huyết (mmol/l)

Đường huyết tại thời điểm bất kì (mmol/l)

triệu chứng uống nhiều, đái nhiều và gầy sút

Rối loạn dung

Dựa vào những hiểu biết về nguyên nhân phát sinh bệnh, uỷ ban chuyên gia về chẩn đoán và phân loại ĐTĐ của WHO chia ĐTĐ thành các loại như sau:

 ĐTĐ type 1: Thường xảy ra ở trẻ em và thanh thiếu niên, khởi phát

ở các cá thể có tính mẫn cảm về di truyền với bệnh Nguyên nhân chính của bệnh là tế bào β đảo tụy Langerhans bị phân huỷ dẫn đến mất khả năng sản xuất insulin - một hormone điều hoà lượng đường trong máu Quá trình huỷ hoại tế bào β do cơ chế tự miễn [3][25] Người ta đã biết đến 18 vùng gen liên quan đến type này được ký hiệu từ IDDM1 đến IDDM18 Các gen này chủ yếu liên quan đến những yếu tố kháng nguyên bạch cầu người HLA hoặc gen

mã hoá insulin [11]

 ĐTĐ type 2: Chiếm 80% - 90% bệnh nhân, có tính quy tụ gia đình

và hay gặp ở những người trên 30 tuổi Hai yếu tố chính đóng vai trò quan trọng trong cơ thể sinh ĐTĐ type 2 là khiếm khuyết chức năng tế bào β tuyến tụy và tình trạng kháng insulin [3][31] Hai yếu tố này luôn có tác động qua lại với nhau và không thể kết luận yếu tố nào xuất hiện trước Kháng insulin

có thể do bất thường ở hậu thụ thể insulin, bất thường về số lượng receptor

insulin hoặc ái lực gắn hormone của insulin và cũng có thể do acid béo tự do tăng cao gián tiếp làm ảnh hưởng quá trình truyền tin nội bào của insulin ở tế bào đích Bởi vậy, bệnh béo bệu là một trong những nguyên nhân môi trường được đề cập đến nhiều nhất vì chính béo bệu làm gia tăng tình trạng kháng insulin [11]

Sinh bệnh học ĐTĐ type 2 diễn biến qua ba giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Mặc dù nồng độ glucose trong máu vẫn bình thường, nhưng có hiện tượng kháng insulin vì insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu

- Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần do có hiện tượng tăng glucose huyết sau ăn

- Giai đoạn 3: Kháng insulin không đổi nhưng bài tiết insulin suy giảm gây tăng glucose huyết lúc đói, bệnh ĐTĐ biểu hiện ra bên ngoài

 Ngoài ra còn có ĐTĐ thai nghén và một số type ĐTĐ đặc biệt khác như thiếu hụt chức năng tế bào β, thiếu hụt di truyền về tác động của insulin, bệnh tụy ngoại tiết,…

1.3.2 Thực trạng đái tháo đường Thế giới và Việt Nam

Cùng với các bệnh không lây nhiễm khác, bệnh ĐTĐ đang phát triển với tốc độ nhanh chóng cùng sự phát triển của nền kinh tế xã hội Năm 1994, toàn Thế giới có 110 triệu người mắc ĐTĐ Năm 1995 đã tăng lên 135 triệu người chiếm 4% dân số thế giới Dự đoán đến năm 2010 có khoảng 221 triệu

và năm 2025 có khoảng 300 triệu bệnh nhân chiếm 5,4% dân số thế giới Đặc biệt ngày nay tỉ lệ người mắc bệnh ở châu Á đã vượt xa châu Âu – nơi vẫn được xem là ổ bệnh [1] Tại Tây Thái Bình Dương có 12 quốc gia có tỉ lệ ĐTĐ type 2 trên 8%, cá biệt có quốc đảo có tỉ lệ bệnh vượt 40% [13]

Việt Nam hiện nay ĐTĐ đang gia tăng rất nhanh Năm 1990, Hà Nội

có tỉ lệ mắc bệnh là 1,2%, Huế 0,96%, Thành phố Hồ Chí Minh là 2,52%

Theo điều tra quốc gia năm 2002 cho thấy tỉ lệ người mắc bệnh ĐTĐ lứa tuổi

từ 30 – 64 trong toàn quốc là 2,7% (khu vực đô thị và khu công nghiệp tỉ lệ tới 4,4%) Đặc biệt bệnh này trong nhóm người có yếu tố nguy cơ là rất cao (10,3%) Hiện nay, có khoảng 2 triệu người mắc bệnh ĐTĐ nhưng có tới 65%

số đó không biết mình đã mắc bệnh Theo PGS TS Tạ Văn Bình: ĐTĐ type 2

ở lứa tuổi thanh thiếu niên ngày một tăng nhanh, đây là một vấn đề rất đáng lưu tâm

1.3.3 Tác hại và biến chứng

ĐTĐ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và khả năng làm việc của người lao động, nhưng hơn cả là nguy cơ biến chứng của bệnh nhân thường rất cao [3]:

- Biến chứng mắt như: Bệnh lý võng mạc (27,8%), đục thuỷ tinh thể (6,1%) tăng sinh gây mù loà (1,1%)… Bệnh về võng mạc tăng dần theo thời gian phát hiện bệnh

- Biến chứng thận như: Microalbumin niệu (11,6%), macroalbumin (3%), suy thận từ độ 1 đến độ 4 (3,5%)…

- Biến chứng thần kinh ngoại vi: Giảm hoặc mất phản xạ gân xương hoặc cảm giác rung…

- Tổn thương bàn chân: Tuỳ từng mức độ như phỏng rộp, biến dạng, loét, hoại thư, cắt cụt,…

- Biến chứng mạch máu lớn: Mạch vành có tới (38%), đột qụy (1,2%), tăng huyết áp (27,6%)…

1.3.4 Phòng và điều trị bệnh ĐTĐ

Trừ những nguyên nhân di truyền thì ăn uống sinh hoạt hợp lý điều độ

và khám sức khoẻ định kỳ là phương thức chung để phòng bệnh nói chung và bệnh ĐTĐ nói riêng Tuỳ theo loại ĐTĐ mà việc điều trị bằng thuốc là khác nhau:

- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin như Sulfonflurea, Nateglinid (Starlix)…

- Thuốc làm tăng tính nhạy cảm của thụ thể với insulin như: Biguanid, nhóm thiazolidinedion…

- Các thuốc chống tăng glucose huyết sau bữa ăn: Thuốc ức chế enzyme α – glucosidase…

1.3.5 Đái tháo đường với y học cổ truyền

Theo quan niệm đông y ĐTĐ thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba triệu chứng chính là ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều do ăn quá nhiều các chất cay, béo, ngọt làm mất cân bằng âm dương trong cơ thể tạo thành hoả nhiệt, uất nhiệt làm phần âm của phủ tạng như âm, vị, thận bị hao tổn Hoả nhiệt làm phế hư gây chứng tiêu khát, vị âm gây chứng gầy đói, thận hư gây tiểu nhiều và tiểu ra đường Xuất phát từ quan niệm đó nên phương pháp điều trị chủ yếu là dưỡng âm, thanh nhiệt sinh tân dịch làm cơ thể lập lại cân bằng âm dương trong cơ thể Thảo dược hay dùng là sinh địa, cỏ ngọt, mướp đắng, hoàng kỳ, huyền sâm…[5][18]

1.3.6 Chuyển hoá glucose và sự điều hoà glucose huyết

Glucose trong cơ thể có nguồn gốc chủ yếu từ thức ăn thông qua quá trình tiêu hoá Vào các thời điểm xa bữa ăn hoặc khi glucid thức ăn không đủ,

cơ thể sẽ huy động nguồn glucose thứ hai nhờ sự thoái hoá glycogen ở gan,

cơ Ngoài ra glucose còn có được nhờ quá trình tân tạo glucose nhờ hệ thống enzyme đặc hiệu riêng biệt (xảy ra ở gan, thận, ruột) từ pyruvat, lactat hay các sản phẩm trung gian của chu trình Krebs

Glucose sau khi được hấp thu hoặc tạo thành trong cơ thể sẽ tan trong máu và được vận chuyển vào trong tế bào nhờ các protein vận chuyển Cuối cùng glucose sẽ thoái hoá để tạo năng lượng hay các sản phẩm trung gian thông qua quá trình đường phân, chu trình pentose phosphate hay con đường

tạo uronic và ascorbic Glucose dư thừa khi nhu cầu năng lượng của cơ thể thấp lại được chuyển thành dạng glucid dự trữ là glycogen ở gan [24]

Để duy trì nồng độ glucose ổn định trong máu cơ thể phải huy động nhiều cơ chế, có sự xúc tác của nhiều loại enzym khác nhau nhằm cân bằng giữa lượng glucose đi vào máu và lượng glucose được thu nạp bởi các tổ chức Trong đó quan trọng nhất là việc điều hoà quá trình tân tạo glucose và quá trình thoái hoá glucose có sự tham gia của nhiều protein vận chuyển glucose qua màng tế bào (các GLUT)

Glucose trong cơ thể được điều hoà ổn định bởi các hormone mà chủ yếu là các hormone tuyến tụy nội tiết Insulin là hormon tiết bởi các tế bào β của đảo tụy Langerhans có tác dụng làm giảm glucose máu do làm tăng dự trữ glycogen ở gan, cơ, ức chế quá trình tân tạo đường mới Glucagon là hormon tiết bởi tế bào α đảo tụy, có tác dụng ngược với insulin, nghĩa là làm tăng sự phân giải glycogen và tăng tân tạo đường mới do đó tăng glucose huyết

1.4 Cây Phật thủ [5]

Phật thủ: Citrus medica L var sarcodactylis (Noot.) Swingle thuộc họ Cam - Rutaceae

1.4.1 Mô tả: Cây bụi hay cây gỗ nhỏ, cao 3- 4m, có gai Lá hình trứng, chóp

hơi tròn, có khi lõm, gốc thuôn, cuống ngắn Hoa trắng Quả dài, vỏ mầu vàng sẫm, có nhiều múi chạy dọc theo quả, phía ngọn tách ra trông như những ngón tay chụm lại; cùi dày đặc, giòn và có mùi thơm phức

Cây ra hoa đầu mùa hạ, quả chín vào mùa đông

1.4.2 Bộ phận dùng: Quả - Fructus Citri Sarcodactylis, thường gọi là Phật

thủ (tay phật) Hoa, lá và rễ cũng được dùng

1.4.3 Nơi sống và thu hái: Là cây trồng lấy quả dùng trang trí mâm quả ngày

Tết Thu hái quả vào mùa thu đông khi quả chuyển sang mầu vàng Thái dọc

thành từng miếng mỏng rồi phơi hay sấy khô Thu hái rễ vào mùa thu Lá thu hái quanh năm

1.4.4 Thành phần hoá học: Trong phật thủ có tinh dầu và mầu flavonoid, gọi

là hesperidin Vỏ quả chứa tinh dầu Vỏ quả trong chứa limettin; ngoài ra còn diosmin và hesperidin [54]

1.4.5 Tính vị, tác dụng: Quả có vị cay, chua và đắng, tính ấm, có tác dụng

hành khí chỉ thống, kiện vị, hoá đàm

1.4.6 Công dụng: Dùng trị: 1 Trướng đầy bụng, đau dạ dày; 2 Chán ăn, nôn

mửa; 3 Ho dai dẳng có nhiều đờm

1.4.7 Cách dùng: Cũng sử dụng như Thanh yên

Liều dùng 3 – 10g cùi quả khô, dạng thuốc sắc hoặc dùng với quả ngâm rượu uống

1.4.8 Đơn thuốc:

1 Viêm dạ dày mạn tính, đau dây thần kinh bụng: Dùng quả tươi 10 – 15

g (hoặc 6g khô), ngâm trong nước sôi và uống thay trà

2 Ho có đờm, viêm khí quản mạn tính: Nhai cùi cả vỏ nuốt nước; hoặc phối hợp với Bán hạ (đã xử lý với gừng), mỗi vị 6g, sắc uống, pha them đường kính uống [5][18]

Cũng như Thanh yên, ta có thể dùng hoa, lá và rễ thay thế khi không có quả

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Quả Phật thủ (Citrus medica L var sarcodactylis (Noot.) Swingle)

Thời gian thu hái: Được thu mua vào tháng 11 năm 2009 tại Thành phố

Hà Nội và Thành phố Hải Phòng

A B

Hình 2.1 Quả và cây Phật thủ (A); Quả Phật thủ chín (B)

Xử lí mẫu: Quả tươi được rửa sạch, loại bỏ chất bảo quản bằng máy tạo ozone khử độc Nonan, để ráo nước, thái mỏng, sấy khô ở 50o

C, sau đó tán thành bột mịn và bảo quản trong dung dịch ethanol 80% Tên khoa học được xác định theo Tiến sĩ phân loại thực vật Võ Văn Chi

2.1.2 Mẫu động vật

Chuột nhắt trắng chủng Swiss (14 – 16g) 4 tuần tuổi được mua tại Viện

Vệ sinh Dịch tễ TW

Thức ăn tiêu chuẩn được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW

Thức ăn giàu lipid được trộn từ nhiều thành phần khác nhau như: Ngô, sữa bột nguyên kem, lạc, lòng đỏ trứng, mỡ lợn, phối trộn theo tài liệu

[60][71] và dựa theo bảng trích dẫn, phân tích của Viện Dinh Dưỡng Quốc gia [13]

2.1.3.2 Các dụng cụ thí nghiệm

Máy cô thu hồi dung môi, máy đo quang phổ UV-vis 1000 (Mỹ), máy

ly tâm (Sigma, Mỹ), máy đo đường huyết (Onetouch Ultra, Mỹ)… và các dụng cụ thí nghiệm cần thiết khác

Hình 2.2 Máy đo đường huyết tự động Onetouch Ultra 2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu

Quả Phật thủ thái mỏng, sấy khô ở 50oC, sau đó tán thành bột mịn, rồi tiến hành ngâm lạnh trong EtOH 80% Chiết rút dịch chiết 3 lần với EtOH 80% (lần 1 ngâm trong 3 tuần, 2 lần sau mỗi lần ngâm 1 tuần) thu được dịch chiết Dịch chiết thu được đem lọc 3 lần bằng giấy lọc để loại bỏ cặn, sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao EtOH Cao EtOH hoà

tan trong nước nóng rồi tiếp tục chiết qua các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, CHCl3, EtOAc, các dịch chiết cũng được loại dung môi thành các cao tương ứng

2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hoá học của quả Phật thủ

2.2.2.1 Định tính

Cao các phân đoạn được hoà tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau:

Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự

có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng

Diazo hoá Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính Acid

sulfuric H2SO4 10%

Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron Vanilin/HCl Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của

khác

Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu vàng FeCl3/HCl Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu lục,

xanh, đen

Glycoside Keller-Killian Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng đỏ

nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng

2.2.2.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Ciocalteau

Nguyên tắc dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam Soi màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765nm, dùng chất chuẩn là acid gallic [66]

Các bước tiến hành như sau:

 Chuẩn bị mẫu định lượng và hoá chất

- Dung dịch acid gallic: 0,5g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh Như vậy dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5mg/ml

- Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml

- Dung dịch mẫu cần định lượng

 Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic

Chuẩn bị cóng định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0, 1, 2,

3, 5 và 10ml sau đó dẫn nước cất tới 100ml ta thu được các nồng độ 0, 50,

100, 150, 250 và 500 mg/l acid gallic

Cho vào mỗi cuvert 20μl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng

độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + 1,58ml H2O + 100μl thuốc thử Ciocalteau sau từ 3 đến 5 phút cho thêm 300μl Na2CO3 Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 200C rồi xác định ở bước sóng 765nm Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn

Folin- Dựng đường chuẩn acid gallic

Hình 2.3 Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic

 Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20μl (0,02ml)

để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn acid gallic

Nguyên tắc: Kĩ thuật này dựa vào mức độ tương tác của các chất khác

nhau với pha tĩnh (bản mỏng) và pha động (hệ dung môi chạy sắc kí) Pha tĩnh có thể là silicagel, bột Al2O3 hoặc polyamide… Pha động là một hỗn hợp

từ 2 dung môi trở lên với các độ phân cực khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu phân tích

Phương pháp: Các mẫu (đã pha trong dung môi thích hợp) được tiến

hành chạy sắc kí trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) kích thước phù hợp trên các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn ra

hệ dung môi phù hợp nhất Một số hệ dung môi được sử dụng:

- TEAF: 5:3:1:1 (Toluen – ethylacetate – acetone – acid formic)

- Toluen: Ethylacetate: Acid formic = 5:4:1

- Ethylacetate: Acid formic: Nước = 8:1:1

Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% Xác định hệ số lưu (Rf) theo công thức: Rf = a/b Trong đó a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu, b là khoảng di chuyển của dung môi

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn quả Phật thủ lên trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh máu của chuột béo phì thực nghiệm

2.2.3.1 Thử độc tính cấp, xác định LD 50 [50]

Xác định LD50 của dịch chiết quả Phật thủ theo đường uống là xác định liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm Chuột được nhịn đói trước 16h thí nghiệm và được cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng (liều tối đa cho phép), theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết quả Phật thủ

2.2.3.2 Nghiên cứu tác dụng chống béo phì của các phân đoạn dịch chiết

2.2.3.2.1 Mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss (khối lượng ban đầu là 14 – 16g) được chia làm nhiều lô, mỗi lô gồm 6 con

- Lô nuôi thường: Cho ăn chế độ bình thường (thức ăn chuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW)

- Các lô còn lại: Cho ăn thức ăn giàu lipid với thành phần được trộn

từ nhiều loại thức ăn khác nhau như: ngô, sữa bột, đậu tương, lòng đỏ trứng, lạc, mỡ nước…

- Thời gian nuôi chuột theo hai chế độ ăn là 6 tuần

Bảng 2.2 Thành phần thức ăn giàu lipid

Vitamin & axit amin 2

Thành phần thức ăn được tính toán dựa trên thành phần dưỡng chất của từng loại hỗn hợp thức ăn phối trộn, theo tài liệu chuẩn của Viện dinh dưỡng Quốc gia Việt Nam và theo tài liệu [67][71]

Sau 6 tuần nuôi, tiến hành cân đo trọng lượng và xét nghiệm một số chỉ

số hoá sinh như: Glucose máu, cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c, lipase (EC 3.1.1.34) để xác định mức độ khác nhau của các lô theo 2 chế độ ăn

2.2.3.2.2 Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột sau khi nuôi bằng mô hình gây béo phì thực nghiệm, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm tiếp Chuột béo phì được chia làm 5 lô, mỗi lô gồm

6 con, cao của các phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ được hoà vào nước cất rồi cho chuột uống hàng ngày vào buổi sáng:

- Lô 1: Chuột béo phì không điều trị, chỉ cho uống nước muối sinh lý (0,9% NaCl), (lô đối chứng)

- Lô 2: Chuột béo phì cho uống cao phân đoạn EtOH (1000mg/kg)

- Lô 3: Chuột béo phì cho uống cao phân đoạn n-hexan (1000mg/kg)

- Lô 4: Chuột béo phì cho uống cao phân đoạn EtOAc (1000mg/kg)

- Lô 5: Chuột béo phì cho uống Metformin - một loại thuốc chữa béo phì, tiểu đường type 2 hiện đang bán trên thị trường với liều 500mg/kg thể trọng [3]

Thời gian điều trị chuột là 21 ngày

Sau 21 ngày cho uống các phân đoạn dịch chiết, chúng tôi tiến hành xác định trọng lượng và lấy máu chuột để phân tích một số chỉ số hoá sinh: Glucose, cholesterol, triglycerid, HDL-c, LDL-c, lipase

2.2.4 Phương pháp gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm bằng STZ liều thấp

Để tìm hiểu tác dụng của dịch chiết quả Phật thủ lên đường huyết, trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột đái tháo đường mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giầu chất béo kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan [67] Sau đó chuột được phân lô và điều trị 21 ngày, theo dõi đường huyết và phân tích một số chỉ số hoá sinh như: Cholesterol, HDL-c, LDL-c, triglycerid, lipase

2.2.4.1 Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2

Để có mô hình ĐTĐ mô phỏng type 2, chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo và cholesterol sau 6 tuần nuôi, được tiêm màng bụng liều đơn STZ (110mg/kg pha trong đệm citrate 0,01M, pH = 4,3)

Đo đường huyết tại các thời điểm 0 giờ (trước khi tiêm STZ), 24 giờ,

48 giờ (sau khi tiêm STZ) và 72 giờ Chuột nào có đường huyết cao (≥18mmol/l) và ổn định được lựa chọn để cho uống cao các phân đoạn dịch chiết trong vòng 21 ngày Đường huyết trong các trường hợp trên đều được

đo sau khi cho chuột nhịn qua đêm (12h), chỉ cho uống nước

2.2.4.2 Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết

Các lô chuột ĐTĐ type 2 (6 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hàng ngày bằng cách cho uống cao các phân đoạn Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ

ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 7, ngày thứ 14, ngày thứ 21 khi điều trị

- Lô 1: Lô STZ nhóm đối chứng cho uống nước cất

- Lô 2: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn EtOH (1000mg/kg)

- Lô 3: Lô STZ điều trị bằng Metformin (500mg/kg)

2.2.5 Phương pháp định lượng một số chỉ số hoá sinh

Các chỉ số hóa sinh máu như nồng độ glucose, LDL-c, triglicerid, HDL-c, cholesterol, lipase đều được xác định bằng máy phân tích tự động Hóa sinh của Nhật Bản ( Olympus AU400 Japan)

2.2.5.1 Phương pháp định lượng glucose máu [49]

Máu sử dụng để định lượng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi chuột Định lượng glucose huyết bằng máy đo đường huyết tự động và bộ kít thử tương ứng (Onetouch Ultra, Johnson & Johnson, USA) Nguyên tắc của phương pháp dựa trên phản ứng đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kit thử với glucose trong máu tạo thành axit gluconic và H2O2 (phản ứng 1)

H2O2 tạo thành được peroxydase phân hủy giải phóng oxy, oxy hoá Dianisidin tạo phức chất màu vàng nâu (phản ứng 2)

O-Glucose + H2O2 + O2 axit gluconic + H2O2 (1)

O-Dianisidin + H2O2 phức hợp nâu vàng + H2O2 (2)

Cường độ mầu được xác định theo phương pháp đo quang tương ứng với lượng glucose trong máu cần định lượng

2.2.5.2 Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh

Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c) và lipase được xác định trên máy xét nghiệm sinh hoá tự động (Phòng hoá sinh - Bệnh viện Hữu nghị Việt – Xô) Nguyên tắc xác định của mỗi chỉ

số như sau:

2.2.5.2.1 Định lượng triglycerid huyết thanh [4][14]

Nguyên lý: Thuỷ phân triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng

glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4-aminoantipyryl và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:

Triglycerid lipoprotei nlipase Glycerol + acid béo

Glycerol + ATP glycerolki nase Glycerol–3–phosphate + ADP

Glycerol–3–phosphate + O2

oxidase phosphate glycerol 3

Dihydroxyacetone phosphate + H2O2

H2O2 + aminoantipyrine + 4–chlorophenol peroxidase quinonimin + 4HCl + 4H2O

Tính kết quả: Đo mật độ quang học quinonimin ở bước sóng 546 nm rồi

so với chuẩn

2.2.5.2.2 Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh [21][22]

Nguyờn lý: Thuỷ phõn cholesterol este bằng enzyme cholesterol

esterase (CHE) và oxy hoỏ bằng cholesterol oxydase (CHO) Đo mật độ quang của quinonimin tạo nờn từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-

aminophenazone và phenol nhờ xỳc tỏc của peroxidase Cỏc phản ứng:

Cholesterol este + H2O CHE Cholesterol + acid bộo

Cholesterol + O2 CHO Cholesterol–3– one + H2O2

2H2O2 + 4 – aminophenazone + phenol Peroxidase Quinonimin + H2O

Tớnh kết quả : So mật độ quang của Quinonimin với ống chuẩn

2.2.5.2.3 Định lượng HDL-c

Nguyờn tắc: Xột nghiệm gồm hai bước đặc hiệu Bước thứ nhất

cholesterol trong chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phỏ huỷ bằng cỏc phản ứng enzyme đặc hiệu Bước thứ 2 cholesterol trong HDL được định lượng bằng phản ứng enzyme với sự cú mặt của chất surfactant đặc hiệu cho HDL

Bước 1: Chylomicron, LDL, VLDL Điều kiện đặc biệtCHE + CHO Cholestenon + H2O

Cỏc số liệu thu được được biểu diễn dưới dạng giỏ trị trung bỡnh ± sai

số (SE), cỏc số liệu được xử lý thống kờ trờn phần mềm MS.Excel với cỏc phộp thử t-test cho cỏc mẫu độc lập và phõn tớch Anova một, hai nhõn tố với mức ý nghĩa p < 0,05 [20]

Lớp nước còn lại

Lớp nước

(bay hơi chân không)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Quy trình tách chiết các phân đoạn từ quả Phật thủ

Phương pháp chiết có một ảnh hưởng quan trọng đến việc phân lập các hợp chất Để tìm hiểu các thành phần hợp chất tự nhiên có trong quả Phật thủ chúng tôi tiến hành chiết các hợp chất trong các dung môi có độ phân cực tăng dần, n – hexan, CHCl3, EtOAc Quy trình được trình bày trên hình 3.1

Hình 3.1 Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ quả Phật

thủ (Citrus medica L var sarcodactylis (Noot.) Swingle)

Quy trình trên được thực hiện như sau: Ngâm kiệt 2000g bột quả Phật thủ khô trong 30 lít ethanol 80%, sau đó lọc dịch chiết qua giấy lọc 3 lần rồi

2000g bột quả Phật thủ

395g Cao EtOH Trích lại 195g

Bổ sung nước + n-hexan, tỉ lệ (1:1)

19,5g Cao phân đoạn n-hexan

19,4g Cao phân đoạn CHCl3