Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh giai đoạn nảy mầm ở hạt đậu tương(Glycine max

Mục đích nghiên cứu Xác định một số chỉ tiêu trong điều kiện áp suất thẩm thấu ASTT khác nhau: khả năng nảy mầm, sinh trưởng thân mầm, rễ mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô, hàm lượng

NGUYỄN THỊ LAN PHƯỢNG

ẢNH HƯỞNG CỦA ÁP SUẤT THẨM THẤU ĐẾN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ, HOÁ SINH GIAI ĐOẠN NẢY MẦM Ở HẠT ĐẬU TƯƠNG

(Glycine mahx)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN VĂN MÃ Học viên thực hiện: NGUYỄN THỊ LAN PHƯỢNG

HÀ NỘI, 2010

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây Đậu tương (Glycine max (L) Merrill) hay còn gọi là đậu nành, là

cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị về mặt kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao Trong hạt đậu chứa: 40% protein, 12-25% lipid, 10-15% glucid, các chất khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, các vitamin A, B1, B2, D, E, F và các enzym, sáp, nhựa, cellulose 1 , 4

Trong cây đậu tương có nhiều loại axit amin cơ bản isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin Ngoài ra, đậu tương được coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các amino axit không thay thế cần thiết cho cơ thể người và động vật Một đặc tính khác nữa ở cây đậu tương là có vi khuẩn nốt sần ở rễ, tạo khả năng cố định nitơ không khí, vì vậy trồng đậu tương có tác dụng cải tạo đất và bảo vệ môi trường 4

Ở Việt Nam, đậu tương là cây trồng quan trọng và có mặt tương đối sớm, sản phẩm từ đậu tương được sử dụng phổ biến trong các bữa ăn hàng ngày như: đậu phụ, sữa đậu nành, dầu ăn, nước tương, bột đậu Ngoài ra đậu tương được dùng như một số bài thuốc cổ truyền ngừa ung thư, giảm sỏi thận 8] Không những đậu tương được sử dụng cho người mà còn được sử dụng làm thức ăn cung cấp protein thực vật cho động vật như: khô dầu đậu tương, bột đậu tương

Đậu tương là loại cây trồng quan trọng ở một số nước trên thế giới như

Mỹ, Braxin, Achentina, Trung Quốc, Ấn Độ, Paragoay, Canađa, Inđônêsia và các nước khác Sản lượng đậu tương cũng tăng theo từng năm Theo dự báo của Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng xuất khẩu đậu tương trên thế giới năm 2010 dự báo đạt 88,24 triệu tấn, tăng so với 86,35 triệu tấn của năm 2009 Vì vậy tổng sản lượng dầu đậu tương thế giới dự báo đạt 39,97 triệu tấn trong năm 2010, tăng so với 37,98 triệu tấn của năm 2009 Tổng xuất khẩu dầu đậu tương thế giới dự báo đạt 9,06 triệu tấn so với 9,01 triệu tấn của năm 2009

Việc nâng cao năng suất cây đậu tương mang lại nhiều lợi ích Tuy nhiên vấn đề cơ bản hạn chế năng suất đậu tương ở Việt Nam là điều kiện khí hậu, đặc biệt là hạn hán Nước ta có địa hình đa dạng, diễn biến khí hậu phức tạp, lượng mưa phân bố không đều giữa các vùng và các thời kỳ trong năm nên hạn hán có thể xảy ra ở bất kỳ vùng nào, mùa nào, khi gặp điều kiện thiếu nước năng suất sẽ giảm đáng kể 6 , 10 , 14

Các nghiên cứu tìm hiểu bản chất khả năng chịu hạn của cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng ngày càng được mở rộng Với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật hiện đại, các nhà khoa học có điều kiện đi sâu tìm hiểu cơ chế sinh

lý liên quan đến tính chịu hạn của thực vật như: ảnh hưởng của thiếu nước đến

sự phát triển của hạt [44], [50], đến quá trình hô hấp [45] và quang hợp [46], [48] Một số cơ chế hóa sinh và sinh học phân tử cũng đã được nghiên cứu nhằm: xác định vị trí của gen liên quan đến điều chỉnh áp suất thẩm thấu [17], gen tổng hợp một số chất hình thành và tích lũy nhiều khi hạn hán: prolin [3], [12], nhóm amin bậc 4, một số đường [27], [33], [37], [51] Trên thế giới đã có một số nhà khoa học nghiên cứu như: James A.Bunce [42], Miquel Ribas - Carbo [46], Sheila A.Blackman [52], tìm hiểu ảnh hưởng của sự thiếu nước đến quang hợp, hô hấp, sinh trưởng đã đạt được kết quả nhất định

Ở Việt Nam, một số tác giả đã nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn khi xử lý phân vi lượng, khả năng quang hợp, chất lượng hạt khi gây hạn, nâng cao khả năng chịu hạn của đậu tương: Ngô Đức Dương [6], Điêu Thị Mai Hoa [11], Nguyễn Huy Hoàng [13], [16], Trần Thị Phương Liên [17], Nguyễn Văn

vật nói chung, đậu tương nói riêng là một việc quan trọng, xuất phát từ vấn đề

này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh giai đoạn nảy mầm ở hạt đậu tương (Glycine max)”

2 Mục đích nghiên cứu

Xác định một số chỉ tiêu trong điều kiện áp suất thẩm thấu (ASTT) khác nhau: khả năng nảy mầm, sinh trưởng thân mầm, rễ mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô, hàm lượng prolin, hoạt độ một số enzym trong mầm đậu tương

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Xác định một số chỉ tiêu sinh lý như: tỷ lệ nảy mầm, sinh trưởng thân mầm, rễ mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô của mầm đậu tương trong các điều kiện ASTT khác nhau

- Xác định hàm lượng prolin của mầm đậu tương trong các điều kiện ASTT khác nhau

- Xác định hoạt độ các enzym proteaza, lipaza và -amylaza của mầm đậu tương ở các điều kiện ASTT khác nhau

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng: Giống đậu tương DT96, AK02

Phạm vi nghiên cứu: một số chỉ tiêu sinh lý (tỉ lệ nảy mầm, chiều dài thân mầm, rễ mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô của mầm), hàm lượng prolin, hoạt độ các enzym proteaza, lipaza và -amylaza của mầm đậu tương

5 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn

Bổ sung nguồn tài liệu cho việc nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh của mầm đậu tương trong điều kiện ASTT khác nhau và mối quan hệ của chúng với khả năng chịu hạn của cây

Xác định được giống chịu được điều kiện ASTT cao phục vụ cho việc gieo trồng ở vùng ngập mặn hoặc vùng hạn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương

1.1.1 Nguồn gốc cây đậu tương

Cây đậu tương thuộc họ Đậu (Fabaceae), bộ Fabales là một trong

những cây trồng cổ nhất của nhân loại Năm 1948, Ricker và Morse đã khẳng

định tên thực vật đúng của đậu tương là Glycine max (L.) Merrill Chi phụ Soja có hai loài Glycine max (L.) Merrill và Glycine soja Sieb et Zucc Glycine max (L.) Merrill là cây trồng hàng năm, không phát hiện thấy loài

hoang dại Nó có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung Quốc) Xuất phát từ một loài đậu nành dại thân mảnh, dạng dây leo, ít phân nhánh, dạng bụi, xẻ lá chét lông chim, phiến lá hình ô van, chùm hoa có cuống ngắn, hoa tím hoặc trắng, quả thẳng hoặc cong, thường có nhiều lông Mỗi quả thường có ba hạt hình tròn hoặc cầu Vỏ hạt có màu sắc biến đổi từ vàng sáng đến nâu, đen, xanh Khối lượng của hạt dao động từ 10g đến 20g [1], [4], [10]

Từ Trung Quốc, cây đậu nành đã được nhân rộng ra khắp thế giới Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản vào khoảng 200 năm trước công nguyên, đậu nành được đưa vào Triều Tiên và sau đó phát triển sang Nhật Giữa thế kỷ 17, đậu nành mới được nhà thực vật học người Đức Engelbert Caempfer đưa về Châu Âu và đến năm

1954, đậu nành được du nhập vào Hoa Kỳ [28] Những nghiên cứu về nguồn gốc cây đậu tương chứng tỏ nó bắt nguồn từ Trung Quốc, các kết quả nghiên cứu về tế bào học, hình thái học, protein trong hạt và ADN của ty thể đã chứng tỏ rằng G

soj2a là tổ tiên hoang dại của cây đậu tương trồng [4]

1.1.2 Tình hình gieo trồng cây đậu tương

Cây đậu tương là cây có ý nghĩa về mặt kinh tế và môi trường Nó có tác dụng cải tạo đất Trên thế giới, diện tích đậu tương ngày càng được mở rộng, năng

suất ngày càng tăng Đậu tương có mặt ở khắp các châu lục, tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ, tiếp đến là châu Á và một số nơi khác trên thế giới

Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng tương đối sớm nhưng do tập quán canh tác nên đậu tương chưa phát triển về diện tích và năng suất So với bình quân chung của thế giới, năng suất đậu tương của Việt Nam chỉ đạt 57%

Cả nước hình thành 6 vùng sản xuất đậu tương: vùng Đông Nam Bộ có diện tích lớn nhất chiếm 26,2% diện tích đậu tương cả nước, miền núi Bắc Bộ 24,7%; Đồng bằng sông Hồng 17,5%; Đồng bằng sông Cửu Long 12,4%; còn lại là vùng đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên chiếm 33,4% Về sản lượng: 3 vùng Đồng bằng sông Hồng, Đông Nam Bộ, Đồng bằng sông Cửu Long chiếm 63% sản lượng đậu tương cả nước Đặc biệt vùng Đồng bằng sông Cửu Long với 12,4% diện tích nhưng lại chiếm 20,9% sản lượng đậu tương cả nước, năng suất bình quân đạt 16 tạ/ha [4]

1.2 Các giai đoạn sinh trưởng phát triển của đậu tương

1.2.1 Giai đoạn nảy mầm

Sau khi trồng, hạt đậu tương ngấm nước rất nhanh, trừ 1 vài giống đặc biệt là loại hoang dại, khả năng ngấm nước chậm hơn Trong điều kiện thuận lợi rễ xuất hiện sau khi trồng từ 1 đến 2 ngày Rễ này gọi là rễ chính nó phát triển nhanh xuống phía dưới đến ngày thứ 4, ngày thứ 5 rễ phụ bắt đầu xuất hiện Sau 3-4 ngày lá mầm xuất hiện và đẩy lên khỏi mặt đất do sự sinh trưởng mạnh của phần trên trụ mầm dưới Lúc đầu lá mầm có màu vàng nhạt, sau có màu xanh, sau cùng chuyển sang vàng và rụng xuống [1], 4 , [15]

Thực chất quá trình nảy mầm là một chuỗi biến đổi sinh lý, sinh hoá mạnh mẽ diễn ra trong hạt, chuẩn bị cho sự hình thành cây non Đậu tương thuộc cây hai lá mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các pha như sự nảy mầm của cây hai lá mầm, đó là:

+ Pha trương hạt: Tính từ khi bắt đầu nảy mầm, hạt hút nước rất mạnh làm trương hạt

+ Pha hình thành và hoạt hoá enzym: Hạt có một lượng enzym nhất định nhưng chủ yếu ở dạng liên kết, khi hạt hút nước thì enzym mới được giải phóng ở dạng tự do và bắt đầu hoạt động mạnh

+ Pha tích luỹ chất dinh dưỡng: Ngay trong những phút đầu tiên ngâm trong

nước, độ hấp thụ oxi của hạt tăng lên, đặc biệt chu trình hexozomonophotphat tăng

lên nhiều lần, do vậy lượng ATP tích luỹ nhiều

+ Pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc trưng cho cơ thể trong giai đoạn nảy mầm: các chất dinh dưỡng trong hạt chủ yếu thuộc 3 nhóm chất hữu cơ là: gluxit, protein, lipit Trong quá trình nảy mầm enzym -amilaza tác động vào liên kết 1,4- glucozit phân giải tinh bột thành các đextrin tham gia vào quá trình hô hấp ở các dạng saccarôzơ tích luỹ ở các

tế bào trụ phôi Protein được phân giải bởi enzym proteaza thành các axit amin

và các amít Phần lớn các axit amin tạo thành được vận chuyển vào trụ phôi để tổng hợp các phân tử protein đặc trưng cho cơ thể Enzym lipaza phân giải lipit thành axit béo và glixerol Ngoài ra lipit còn được tái chuyển hoá thành gluxit cung cấp năng lượng cho hạt nảy mầm

Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự hấp thụ nước, nhờ cơ chế hút trương của hạt làm hạt trương lên Sau khi kết thúc sự ngủ nghỉ, trong hạt bắt đầu tăng tính thuỷ hoá của keo nguyên sinh chất, giảm tính ưa mỡ và độ nhớt của keo, dẫn đến những biến đổi sâu sắc và đột ngột trong quá trình trao đổi chất trong hạt liên quan đến sự nảy mầm Đặc trưng nhất là tăng mạnh mẽ hoạt tính enzym thuỷ phân, polisaccarit, protein và các chất phức tạp khác thành các chất đơn giản dẫn đến thay đổi hoạt động thẩm thấu Các sản phẩm thuỷ phân này dùng làm nguyên liệu cho quá trình hô hấp tăng lên mạnh mẽ của phôi hạt, vừa làm tăng ASTT trong hạt, giúp cho quá trình hút nước vào hạt nhanh chóng

1.2.2 Giai đoạn cây con

Sau khi gieo 5-7 ngày, thân rễ vươn dài và đưa hai lá mầm lên khỏi mặt đất, hai lá mầm mở ra, thân mầm phát triển thành thân chính Lúc này, cây con sống chủ yếu nhờ vào thức ăn dự trữ trong lá mầm Khi bộ rễ phát triển hút chất dinh dưỡng từ đất nuôi cây là lúc lá mầm chuyển thành màu vàng, rụng xuống đất (sau khi gieo 15-20 ngày) [15]

Nhu cầu về nước của giai đoạn này khá lớn Để đảm bảo hạt nảy mầm, hàm lượng nước trong hạt phải đạt 50% so với khối lượng hạt [4], [15] Thiếu nước ở thời kỳ cây con sẽ làm giảm quá trình tăng trưởng, nhưng ít ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất nếu hạn không cản trở sự khép tán hoàn toàn [10]

1.2.3 Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng

Thân lá phát triển nhanh từ khi mọc đến khi ra hoa Có hai loại đặc tính chính ở cây đậu tương là sinh trưởng của thân và ra hoa chính Đối với đặc tính sinh trưởng vô hạn, cây tiếp tục sinh trưởng sinh dưỡng hầu như trong suốt vụ trồng Đặc tính sinh trưởng hữu hạn, cây ngừng sinh trưởng khi ra hoa Ở giai đoạn này, bộ rễ phát triển nhanh cả về chiều rộng và chiều sâu Nốt sần hình thành nhiều và bắt đầu hoạt động cố định đạm, cung cấp dinh dưỡng cho cây [4 , [28]

Sự sinh trưởng, phát triển của cây là kết quả của các quá trình trao đổi chất như quang hợp, hô hấp, vận chuyển các chất đồng hoá… Tất cả các quá trình này đều bị kìm hãm bởi sự thiếu nước Vì vậy, ở giai đoạn này nhu cầu

về nước cho cây sinh trưởng, phát triển tăng hơn so với giai đoạn cây con

1.2.4 Giai đoạn sinh trưởng sinh thực

* Giai đoạn ra hoa

Thời gian ra hoa đầu tiên đến ra hoa cuối cùng kéo dài từ 3 đến 4 tuần, tùy thuộc vào giống chín sớm hay chín muộn Ở những giống sinh trưởng hữu hạn, có

chùm hoa ở cả ngọn và nách lá, quả hình thành phân bố đều dọc theo thân, phía ngọn có phần nhiều hơn Cây đậu tương ra nhiều hoa nhưng tỷ

lệ hoa không đậu quả chiếm khoảng 20 - 80% [6], [10], [15] Hoa rụng do nhiều nguyên nhân nhưng chủ yếu là sự ảnh hưởng bất lợi từ môi trường, đặc biệt là hạn hán Các nghiên cứu về nhu cầu nước của cây đậu tương cho thấy cây cần rất nhiều nước ở giai đoạn này Thiếu nước dẫn đến giảm số chùm hoa, rụng hoa và giảm số quả [37]

* Giai đoạn hình thành quả và hạt

Quả đầu tiên hình thành trong phạm vi 7 - 8 ngày sau khi hoa đầu tiên nở Trong điều kiện bình thường, quả sẽ phát triển đầy đủ sau khoảng

20 ngày, các chất dinh dưỡng trong cây được vận chuyển vào hạt, quả mẩy dần [15] Nhu cầu về nước ở giai đoạn này của cây tăng cao, thiếu nước làm rụng quả, giảm kích thước hạt, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất của hạt [37]

* Giai đoạn quả chín

Hạt phình to, kín khoang hạt, quả mẩy đều, cây ngừng sinh trưởng, độ

ẩm trong hạt giảm dần cho đến khi chỉ còn 13 - 15% Lá đậu chuyển sang mầu vàng và rụng xuống đất [13] Nhu cầu về nước của cây đậu tương ở giai đoạn này giảm hơn so với các giai đoạn trước Khi quả chín, để duy trì chất dinh dưỡng, tránh bị nhiễm bệnh và nẩy mầm sớm cần phải điều chỉnh độ ẩm của đất giảm dần

Tính mẫn cảm của cây đậu tương đối với sự thiếu hụt nước ở các giai đoạn sinh trưởng là khác nhau Giá trị của tính mẫn cảm ở mỗi giai đoạn được cho là phần năng suất bị giảm do thiếu nước nghiêm trọng ở giai đoạn đó Kết quả cho thấy giá trị mẫn cảm của đậu tương ở giai đoạn sinh dưỡng là 0,12; ở thời kì ra hoa là 0,24; cuối ra hoa hình thành quả là

0,35 và giai đoạn quả chín là 0,13 [4] Sử dụng giá trị này để có kế hoạch tưới tiêu hợp lý cho từng giai đoạn sinh trưởng của cây đậu tương Theo

đó cần tưới nước khi sự suy kiệt nước trong đất đạt tới 80% ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, 45% ở giai đoạn ra hoa, 30% ở giai đoạn cuối ra hoa, làm quả và 80% ở giai đoạn quả chín Như vậy, không nên để cây thiếu nước ở giai đoạn cây ra hoa, tạo quả mà tưới nước là rất cần thiết ở giai đoạn này

1.3 Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khả năng nảy mầm của hạt

ASTT là lực gây ra sự chuyển dịch của dung môi vào tế bào qua màng sinh chất Nó không phụ thuộc vào bản chất của chất tan, mà phụ thuộc vào nồng độ phân tử chất tan, nhiệt độ, sự phân li của dung dịch ASTT bao gồm ASTT bên trong (ASTT thấu nội bào) và bên ngoài (ASTT môi trường)

ASTT bên trong: Dịch tế bào có chứa hàm lượng lớn các chất hữu cơ là sản phẩm của quá trình trao đổi chất Các chất này trong dịch tế bào đã tạo nên ASTT cao, giúp cho quá trình xâm nhập của nước vào trong tế bào bằng con đường thẩm thấu

ASTT bên ngoài chủ yếu do tính mặn của môi trường gây nên Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lượng muối cao, đặc biệt là NaCl Điều đó đã hạn chế khả năng hút nước, dẫn đến khó khăn trong việc hút chất dinh dưỡng [11] Nếu cây sinh trưởng trong môi trường không có muối, thì nước sẽ dễ dàng thấm qua màng bán thấm để đi vào tế bào chất nhờ hiện tượng thẩm thấu Đất

bị nhiễm mặn sẽ gây nên 2 tác hại đối với thực vật:

Tác hại thứ nhất, gây ra hiện tượng hạn sinh lí Hàm lượng muối cao trong đất làm cho ASTT môi trường lớn Nếu ASTT nội bào không thắng nổi

áp suất của môi trường, cây sẽ bị khô héo do nước từ trong tế bào đi ra ngoài Thiếu nước nhẹ thì làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng quá trình già hoá tế bào Khi bị

khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tổn thương và chết

Tác hại thứ hai, liên quan đến tính gây độc của các ion đối với thực vật Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lượng cao các ion, đặc biệt Na+

và Cl-, ngoài ra còn có các ion khác: SO4

Nước là điều kiện quan trọng cho sự nảy mầm Nước tham gia vào quá

trình trao đổi chất, các phản ứng sinh hoá trong tế bào, là nguồn nguyên liệu của nhiều phản ứng Nước đảm bảo cho cây tồn tại và phát triển

Hạt khô có hàm lượng nước từ 10 - 14% thì không nảy mầm Nhờ lực hút trương nước của keo nguyên sinh mà hạt hút được nước và khi hàm lượng nước bằng 50 - 70% khối lượng hạt thì các hoạt động sống tăng lên mạnh mẽ

và phôi phát động sinh trưởng hay nảy mầm

Sự thiếu nước ở thực vật chủ yếu do hạn hán và ASTT môi trường gây nên Khi thiếu nước thường làm cho tế bào mất sức căng, đỉnh sinh trưởng bị héo và các quá trình sinh lý diễn ra không bình thường Hoạt động của enzym thuỷ phân thường diễn ra nhanh hơn là enzym tổng hợp dẫn đến tế bào mất chất dinh dưỡng Đồng thời cũng gây ảnh hưởng trầm trọng đến quá trình hô hấp Khi thiếu nước cường độ hô hấp tăng nhưng hiệu quả năng lượng bị giảm sút Thiếu nước gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và phát triển của cây, cuối cùng ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất của chúng

Thực vật nói chung và đậu tương nói riêng sống trong điều kiện thiếu

nước có khả năng chống lại hoặc hạn chế sự mất nước bằng những biến đổi hình thái hoặc những phản ứng hoá sinh phù hợp

Biến đổi hình thái được chú ý nhiều là ở bộ rễ Bên cạnh đó là sự giảm diện tích lá của đậu tương khi gặp hạn, nhằm giảm sự thoát hơi nước của lá

Các thay đổi hoá sinh thường liên quan đến cơ chế chống mất nước do sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước Điều chỉnh ASTT nội bào thông qua tích luỹ các chất tan, các protein và axit amin nhờ enzym thuỷ phân là cơ chế giúp tế bào duy trì lượng nước tối thiểu Trong điều kiện thiếu nước, các phản ứng hoá sinh diễn ra nhằm khử độc các sản phẩm được tạo nên trong quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử hoặc xúc tiến phục hồi các cấu trúc bị tổn thương

Về khả năng chịu mặn của thực vật, trước hết phải nói đến cơ chế tích luỹ và duy trì nồng độ cao các chất hoà tan trong tế bào nhằm đảm bảo cạnh tranh nước với môi trường nhiễm muối và chống lại hiện tượng hạn sinh lí Hàm lượng NaCl cao trong đất nhiễm mặn làm các loài thực vật sống thường xuyên trên đất này phải có khả năng thu nhận và tích trữ Na+

, Cl- cao hơn nhiều thực vật vốn có khả năng chịu mặn

Ngoài ra còn có những thay đổi về các phản ứng sinh lí như: hô hấp, quang hợp, thoát hơi nước của lá cho phù hợp với điều kiện thiếu nước của cây

Đã có một số công trình nghiên cứu sự ảnh hưởng của ASTT trên các đối tượng động vật (lưỡng cư, bò sát… ) Trên thực vật, các nhà khoa học cũng đã đánh giá được ảnh hưởng của ASTT đối với khả năng hút nước, sinh trưởng của rễ, thân và lá

Trong nuôi cấy mô, ảnh hưởng của manitol đến tích lũy prolin và glucose liên quan đến khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy callus

cà chua [7] Đã có một số công trình nghiên cứu ảnh hưởng của ASTT trên đối tượng đậu tương, nhưng nghiên cứu mới chỉ dừng lại việc đánh giá sự ảnh hưởng của một ASTT nhất định (7 hoặc 9 atm) Hiện nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào được công bố việc đánh giá tổng thể ảnh hưởng của các mức ASTT khác nhau từ thấp đến cao

1.4 Prolin và vai trò của prolin đối với khả năng chịu hạn của cây

1.4.1 Cấu tạo prolin

Công thức cấu tạo Cấu trúc không gian

Prolin hay - pirolidin cacboxylic là một - iminoaxit ưa nước có công thức phân tử C5H9NO2, có mạch bên là hidrocacbua khác với các axit amin khác ở chỗ, nhóm amin bậc 1 ở Cα liên kết với cacbon của mạch bên tạo thành vòng pirolidin

1.4.2 Vai trò của prolin

Prolin được tổng hợp từ L-glutamat bởi enzym chìa khoá

-pyrrolin-cacboxilat-synthetaza (P5CS), enzym này được điều hoà bởi prolin thông qua

cơ chế ức chế ngược Ở thực vật chịu stress nước, sự điều hoà ngược này đã biến mất và đây có thể là nguyên nhân làm tăng sự tích luỹ prolin dưới các điều kiện stress

Prolin thuộc nhóm các chất điều hòa thẩm thấu Chúng có khối lượng phân tử nhỏ, các hợp chất này có chung tính chất không tích điện ở pH trung tính (như các ion vô cơ) và có khả năng hòa tan tốt trong nước, không độc khi tập trung với nồng độ cao và làm ổn định cấu trúc của các phân tử protein, giúp thành tế bào chống lại ảnh hưởng làm biến tính của sự tập trung muối cao và các chất tan khác có hại cho tế bào [49] Prolin tự do trong khi stress

có hiệu ứng sinh học đa năng, không chỉ trong chức năng điều chỉnh ASTT

mà còn có tác động bảo vệ hàng loạt enzym trong điều kiện biến tính (nhiệt

độ cao, nồng độ muối cao…) [3] Bên cạnh đó prolin còn thể hiện khả năng bảo vệ gián tiếp protein và màng khỏi tổn thương Prolin còn được xem như một dạng dự trữ nitơ Khi gặp stress, nó dễ được sử dụng ở giai đoạn khử như thành phần của hệ thống giữ gìn pH của tế bào và điều chỉnh thế khử của tế bào Prolin còn là nguồn cung cấp năng lượng và đương lượng khử [30]

Phân tử prolin có cấu trúc vòng (pirolidin) Cấu trúc này tạo cho prolin một hình dáng vững chắc hơn so với các axit amin khác Như vậy, vai trò của prolin trong chống chịu stress nước ở thực vật thể hiện: prolin tham gia điều chỉnh ASTT của nội bào, tham gia vào cấu trúc bảo vệ màng và protein, dự trữ nitơ và năng lượng

Sự tích lũy prolin là một phản ứng chuyển hóa thông thường ở thực vật trong điều kiện thiếu hụt nước và stress muối Đây là chủ đề được các nhà khoa học nghiên cứu hơn 20 năm qua (Stewart and Larher, Thompson, Stewart, Hanson and Hizt, Rhodes, Delauney and Verma, Samaras, Taylor, Rhodes) [50]

Đã có nhiều công trình trên thế giới nghiên cứu trên nhiều đối tượng thực vật và cây trồng khác nhau, nhằm tìm hiểu về cơ chế tổng hợp, chuyển hoá prolin,… liên quan đến vai trò của prolin đối với tính chịu hạn của thực vật Trong dòng tế bào thuốc lá được nuôi cấy thích nghi với nồng độ 428

mM NaCl, prolin chiếm trên 80% axit amin tự do (Rhodes and Handa, 1989) [50] Người ta thừa nhận rằng, có sự phân bố đồng đều prolin trong toàn bộ thể tích nước của nội bào, kết quả xác định axit amin tại thời điểm này vượt quá 129 mM Tuy nhiên, nếu chỉ hạn chế trong nội bào thì sự tích lũy prolin

có thể vượt quá nồng độ 200 mM trong các tế bào này vì thế nó góp phần căn bản vào việc điều chỉnh thẩm thấu nội bào (Binzel et al, 1987) [33] Tương tự

như vậy, sự tích lũy prolin nội bào ở các tế bào Distichlis spicata trong điều

kiện stress muối (xử lí ở nồng độ 200 mM NaCl) ước tính trên 230 mM (Ketchum et al, 1991) [43] Kishor P.B.K và cộng sự (1995) [44] nghiên cứu

cây thuốc lá được chuyển gen (gen liên quan đến sinh tổng hợp prolin – P5CS) trong điều kiện hạn nước, hạn muối Kết quả cho thấy hàm lượng prolin tăng khoảng từ 10 - 18 lần so với đối chứng Thực vật được chuyển gen (gen P5CS) cũng được nghiên cứu trên đối tượng là cây đậu tương (J.A.de Ronde; R.N Laurie; T.Caetano; M.M Greyling; I.Kerepesi 2004) [41] Kết quả so sánh tính chịu hạn giữa dòng đậu tương chuyển gen P5CS và dòng đối chứng (không chuyển gen) cho thấy dòng chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn Ngoài ra, còn có nghiên cứu trên nhiều đối tượng: dưa hấu, cà chua, lúa mỳ,

củ cải đường, khoai tây, [34], [36], [38], [39], [40], cũng cho kết quả tương tự

Theo Delauney AJ, Verma DPS (1993) [35] con đường tổng hợp prolin trong thực vật như sau:

P5CS: -pyrrolin-5-cacboxilat synthetaza

P5CR: -pyrrolin-5-cacboxilat reductaza

Ở Việt Nam, một số tác giả đã nghiên cứu vai trò của prolin đối với khả năng chịu hạn của nhiều loại cây trồng Theo Nguyễn Hữu Cường (2003) [3]: bằng việc xử lí lạnh, mặn, hạn trên các giống lúa đã cho thấy

có mối tương quan thuận giữa tính chống chịu của cây với hàm lượng

prolin gia tăng của các giống lúa nghiên cứu Tác giả Đinh Thị Phòng (2001) [27] cho biết: khi xử lí hạn, hàm lượng prolin đều tăng lên, mức độ tăng lên khác nhau ở mỗi giống Những giống chịu hạn tốt hàm lượng prolin tăng 9 lần sau khi xử lí hạn 8 ngày

Như vậy, prolin có ảnh hưởng lớn tới tính chịu hạn ở thực vật và cây trồng nói riêng Sự tổng hợp axit amin prolin ở thực vật hay cây trồng diễn ra khi chúng sống trong điều kiện thiếu nước, stress muối Những nghiên cứu về prolin trên đối tượng lúa, đậu xanh, cà chua, cây thuốc lá… cho thấy sự tương quan thuận giữa gia tăng hàm lượng prolin với tính chống chịu sự thiếu nước, stress muối của chúng [3], [11], [34], [39] Do

đó, có thể xem axit amin này như một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật hay sự tích lũy prolin là biểu hiện của phản ứng thích nghi của thực vật với điều kiện cung cấp nước khó khăn

1.5 Một số enzym trong hạt nảy mầm

Trong hạt nảy mầm xuất hiện một số enzym để thuỷ phân các chất có trong hạt, xúc tác cho sự nảy mầm của hạt Một số enzym có vai trò quan trọng đối với sự nảy mầm của hạt đậu tương là enzym proteaza, lipaza, -amylaza Enzym có bản chất là protein Đến nay đã biết và phân loại được hơn

3500 enzym Nhiều enzym được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau như: nghiên cứu cấu trúc phân tử, định lượng các chất trong công nghiệp, nông nghiệp, y học

Ở đậu tương đang nảy mầm, diễn ra quá trình phân giải các chất hữu cơ cung cấp năng lượng cho cây sinh trưởng và phát triển Enzym hoạt động chủ

yếu trong giai đoạn này là enzym thuỷ phân thuộc nhóm hiđrolaza (các

enzym xúc tác cho phản ứng thuỷ phân) như: proteaza, lipaza, -amilaza,

Proteaza: xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptit, tạo thành peptit phân tử thấp và các axit amin Proteaza đóng vai trò quan trọng trong cơ thể sống, nhất là thời kỳ nảy mầm của hạt Thời kỳ này protein bắt đầu được phân giải thành axit amin dưới tác dụng của enzym proteaza Proteaza không chỉ tham gia vào phân giải protein dự trữ trong hạt mà chúng còn tham gia vào quá trình vi xử lý phân tử protein, phân giải các protein lạ hoặc bị biến tính khi gặp điều kiện cực đoan (lạnh, mặn, hạn, tác động cơ học ) [17] Trần Thị Phương Liên (1999) khi nghiên cứu so sánh phổ điện di hoạt tính proteaza của các giống đậu tương chịu nóng, chịu hạn khác nhau đã nhận xét rằng: proteaza trong quá trình nảy mầm của hạt ở tất cả các giống đậu tương nghiên cứu rất đa dạng, có hoạt tính cao, có khả năng phân giải hoàn toàn chất dự trữ tạo nguyên liệu để tổng hợp protein cho cơ thể mới [17] Có nhiều loại proteaza trong hạt đậu tương, chúng có kích thước phân tử, nhiệt độ tối ưu và pH tối ưu là 5 (gần với pH của tế bào) Các axit amin là nguồn nguyên liệu cho quá trình tổng hợp mới các chất đồng thời góp phần tăng ASTT của tế bào thực vật Proteaza còn tham gia trong nhiều lĩnh vực quan trọng của đời sống như công nghiệp chất tẩy rửa, công nghiệp hoá chất, y học và nhiều ngành công nghiệp khác

Lipaza: xúc tác phản ứng thuỷ phân triaxilglixerol tạo thành các axit béo tự do và glixerol Lipaza xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lượt từng este trong phân tử chứ không cắt đứt cả 3 liên kết este cùng lúc Axit béo và glixerol là nguyên liệu cho hô hấp giải phóng năng lượng và kiến tạo các thành phần của tế bào Chuẩn độ lượng axit béo sinh ra bằng kiềm từ đó xác định hoạt độ lipaza

-amilaza: phân giải liên kết 1,4-glucozit ở giữa chuỗi mạch polisacarit tạo các đextrin phân tử thấp Dưới tác dụng của enzym này dung dịch tinh bột nhanh chóng mất khả năng tạo màu với dung dịch iot và bị giảm nhanh độ nhớt Do đó, để xác định hoạt độ của enzym -amilaza người ta thường dựa

vào sự biến đổi màu của iot khi cho tác dụng với enzym này

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên 2 giống đậu tương AK02 và giống DT96

- AK02: giống được tạo ra bằng phương pháp chọn lọc cá thể từ giống đậu tương vàng Mường Khương và được công nhận giống chính thức năm

1987 [9] Giống được trồng 3 vụ trong năm Vùng đất gieo trồng thích hợp: đồng bằng, trung du và miền núi phía Bắc Một số đặc tính chủ yếu như chiều cao cây từ 30-40 cm, ít phân cành, thuộc nhóm ngắn ngày Thời gian sinh trưởng (TGST) từ 75-85 ngày Hạt có dạng bầu dục hơi tròn, màu hạt vàng nhạt Khối lượng 1000 hạt đạt khoảng 100-120g Năng suất trung bình đạt khoảng 10-12 tạ/ha Khả năng chống chịu sâu bệnh và rét trung

bình [9]

- DT96 do Viện Di truyền nông nghiệp (DTNN) cung cấp Sau 7 năm khảo nghiệm liên tục (1998-2004) tại nhiều vùng sinh thái khác nhau, Viện DTNN đã sản xuất thành công giống đậu tương chịu hạn DT96 Giống mới được Bộ NN&PTNT công nhận chính thức là giống Quốc gia vào tháng 7-

2004 Giống được tạo bằng phương pháp lai hữu tính giữa 2 giống phổ biến trong sản xuất là DT90 và DT84 DT96 kết hợp được nhiều đặc tính tốt của

2 giống, chịu nóng tốt như DT84 và chịu lạnh như DT90 Ngoài ra còn một

số đặc điểm ưu việt hơn DT84 và DT90 như chất lượng hạt thương phẩm, tính kháng sâu bệnh [29] DT96 có TGST ngắn (90 - 98 ngày), phù hợp trồng thuần Cây cao 45 - 58cm, thân có 12 - 15 đốt, sinh trưởng hữu hạn, phân cành vừa phải, lá hình tim nhọn, màu xanh sáng, lông nâu Hạt màu vàng sáng, rốn hạt màu trắng, hạt to, khối lượng 1000 hạt đạt 190 - 220g, tỉ

lệ protein 42,86%, lypit 18,34% [5]

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xác định áp suất thẩm thấu

Áp suất thẩm thấu (P) được xác định theo phương pháp của Schardakov

& Grodzinsk (1981), tính giá trị bằng phương trình Van– Hoff:

P = i×C×R×T Trong đó: P: Áp suất thẩm thấu (atm)

C: Nồng độ mol/l của dung dịch (M) R: Hằng số khí (R=0,0821)

T: Nhiệt độ tuyệt đối (K) i: Hệ số điều chỉnh sự phân ly (Đối với dung dịch saccarôzơ i= 1)

2.2.2 Lập đường chuẩn prolin

* Xây dựng đường chuẩn prolin

Cân 10 mg prolin tinh khiết hoà tan trong 100ml nước, ta được dung dịch gốc (gọi là dung dịch B) nồng độ 0,1 mg/ml (hoặc 100 g/ml) Lấy 5 ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 1 đến 5, cho các chất tham gia phản ứng như sau Pha 10ml dung dịch A có nồng độ lần lượt là 20, 40, 60, 80, 100 ( g/ml) như sau:

STT 10 ml dung

dịch A ( g/ml)

V nước (ml)

Sau đó đo OD các dãy dung dịch prolin chuẩn ở bước sóng 520nm trên máy UV- Visible Spectrophotometer, UV- 2450 do h·ng SHIMADZU- Mü s¶n xuÊt Thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê, sau đó lập đường chuẩn bằng phần mềm Excel, thu được đường chuẩn sau:

Đường chuẩn prolin

y = 0.0179x + 0.095

R2 = 0,99

0 0.5

1 1.5

Thí nghiệm được tiến hành tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học

và Chuyển giao công nghệ - Trường ĐHSP Hà Nội 2

Để xác định các chỉ tiêu nghiên cứu, hạt được gieo trong dung dịch

đường theo phương pháp xác định khả năng chịu hạn của Volcova:

Chọn hạt giống đều, khoẻ, có phôi sáng, không nấm mốc Khử trùng khay, bình, tay, bằng cồn 960 Giấy lọc được sấy 130oC trong vòng 1 giờ, hạt được khử trùng bằng dung dịch KMnO4 1% trong 5 phút

Gieo trên khay có giấy thấm, bổ sung kháng sinh nistatin 1/2 viên trong 1/2 lít thành 2 phần vào các mẫu thí nghiệm:

+ Phần 1: lô đối chứng (ĐC) cho hạt nảy mầm trong nước cất

+ Phần 2: lô thí nghiệm (TN), cho hạt nảy mầm trong dung dịch đường saccarôzơ với ASTT từ 1 atm đến 12 atm tương ứng từ M1 đến M12)

Hạt nảy mầm trong dung dịch đường Hàng ngày bổ sung lượng nước hoặc dung dịch đường ở các lô như nhau

2.2.4 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu

Các chỉ tiêu sinh lý: được xác định theo phương pháp của Volcova

a: số hạt nảy mầm b: tổng số hạt đem gieo

2.2.4.2 Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng của mầm

- Chiều dài thân, rễ mầm (mm): sử dụng thước chia đơn vị đến mm để

đo chiều dài của thân mầm, rễ mầm vào các ngày 3, 5, 7 sau khi hạt nảy mầm

- Khối lượng tươi của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước cất, sau đó cân khối lượng của mầm vào ngày thứ 3 và ngày thứ 7 sau khi hạt nảy mầm

- Khối lượng khô của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước cất, đem sấy khô ở 1050C đến khi khối lượng không đổi (3h) Cân khối lượng khô, thời gian cân vào ngày thứ 3 và ngày thứ 7 sau khi gieo hạt

2.2.4.3 Phân tích hàm lượng prolin

Hàm lượng prolin của mầm được xác định theo phương pháp của Bates

và cộng sự (1973) [31], đã được Đinh Thị Phòng cải tiến (2001) [27]

Cân 0,5 g mầm/1 mẫu, nghiền kĩ, thêm 10 ml dung dịch axit sulfosalicylic 3%,

li tâm 4000 vòng trong 30 phút, lọc lấy dịch trong Lấy 2 ml dịch chiết cho vào bình (hoặc ống nghiệm) thêm 2 ml axit axetic và 2 ml dung dịch ninhydrin (dung dịch này gồm 30 ml dung dịch axit axetic + 1,25 g ninhydrin), đậy kín Ủ nước nóng 1000C trong 1h Sau đó ủ đá 5 phút Tiếp theo, bổ sung vào bình phản ứng 4 ml toluen, lắc đều Lấy phần dịch mầu hồng ở bên trên, đo mật độ quang học ở bước sóng 520 nm trên máy quang phổ UV- Visible Spectrophotometer, UV- 2450 do h·ng SHIMADZU- Mü s¶n xuÊt

Tất cả các α - axit amin của protein đều phản ứng màu với ninhydrin tạo hợp chất màu xanh tím Riêng imino axit như prolin tạo thành màu vàng với cơ chế phản ứng phức tạp Tính chất này có cực đại hấp thụ ở bước sóng λ= 520 nm

Hàm lượng axit amin prolin được tính theo công thức sau: (công thức suy ra từ việc lập đường chuẩn prolin)

Y= 0,0179X + 0,095 (R2= 0,99) Trong đó: Y: hàm lượng prolin ( g/ml)

X: giá trị mật độ quang học đo được ở bước sóng 520nm

R2: hệ số tương quan Sau đó hàm lượng prolin được đổi ra đơn vị g/g theo công thức:

V Y A

Trong đó: A: hàm lượng prolin ( g/g)

P: khối lượng mẫu (g) V: thể tích dịch prolin chiết được

2.2.4.4 Xác định các chỉ tiêu hoá sinh của hạt nảy mầm

* Hoạt độ của enzym proteaza

- Xác định hoạt độ enzym proteaza theo Phạm Thị Trân Châu [2]

Cách tiến hành: Lấy hai bình nón (V= 100ml), cho vào mỗi bình 2g cơ chất đã nghiền nát và 10ml KH2PO4 0,1N, lắc nhẹ để tạo môi trường pH thích hợp với hoạt động của proteinaz có trong cơ Thêm vào bình 1 (đối chứng) 10ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzym Cho vào mỗi bình 2ml dung dịch protein 5% Đặt 2 bình trong tủ ấm 370c, thời gian 1 giờ Sau đó thêm vào bình 2: 10ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzym kết thúc quá trình thủy phân protein Dùng ống đong đo dung dịch mẫu (V) Lọc dung dịch trong từng bình, đo lại dung tích dịch lọc, chuyển sang bình tương ứng với bình thí nghiệm (2) và bình kiểm tra (1) Thêm vào mỗi bình chứa dịch lọc 10ml foocmaldehit và 5 giọt timolphtalein để làm chất chỉ thị màu Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N đến khi xuất hiện màu xanh mực cửu long

Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu được tính theo công thức:

V1: số ml dung dịch NaOH 0,2N chuẩn độ bình đối chứng

V2: số ml dung dịch NaOH 0,2N chuẩn độ bình thí nghiệm

V3: số ml dịch lọc đem chuẩn độ g: số gam mẫu phân tích

f: hệ số điều chỉnh NaOH 0,2N

* Hoạt độ của enzym lipaza

Xác định hoạt độ của enzym lipaza theo Nguyễn Văn Mùi [25]

+ Bình kiểm tra phải đun sôi dịch enzym 3 đến 5 phút để làm mất hoạt động của enzym trước khi cho tiếp xúc với cơ chất

+ Sau khi ngừng phản ứng, cho vào mỗi bình 25ml cồn 96% và 15 đến 25ml ete Lắc đều, để lắng

+ Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N với 0,5ml chỉ thị màu phenolphtalein

- Tính kết quả: Hoạt độ của lipaza được biểu thị bằng số mililit (ml) NaOH

0,1N dùng để chuẩn độ axit béo từ sự phân hủy dầu thực vật trong 10g hạt

theo công thức:

X=(a b) f 10

Trong đó: X: là hoạt độ enzym lipaza

a: số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm

b: số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình đối chứng f: hệ số chỉnh lí NaOH 0,1N

w: khối lượng hạt

* Hoạt độ của enzym - amilaza

Xác định hoạt độ enzym -amilaza theo Nguyễn Văn Mùi [25]

lƣợng tinh bột còn lại khi -amilaza thủy phân Sự khác nhau giữa mật độ quang

của bình đối chứng và bình thí nghiệm là lƣợng tinh bột bị enzym thủy phân

OD : mật độ quang ở dung dịch thí nghiệm

Hoạt độ của enzym -amilaza tính theo công thức:

Trong đó: X: là hoạt độ -amilaza

c: lƣợng tinh bột bị thuỷ phân (g) w: lƣợng chế phẩm enzym phân tích (mg)

1000: là hệ số chuyển mg thành gam 6,889; 0,029388: là các hệ số phương trình tính hoạt độ thu được bằng phương pháp xử lí số liệu thực nghiệm

1

N

i i

X X

Các tính toán được thực hiện trên cơ sở sử dụng phần mềm Microsoft Excel Trong mỗi bảng, số liệu so sánh giữa ĐC và các mẫu thí nghiệm kèm theo chữ (a) thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy α = 0,05 giữa các mẫu TN liền kề, dấu (*) thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy α = 0,05 giữa các ngày TN liền kề

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Sự nảy mầm của hạt đậu tương trong các điều kiện ASTT khác nhau

3.1.1 Thí nghiệm thăm dò khả năng nảy mầm của hạt trong các điều kiện ASTT khác nhau

Dung dịch đường saccarôzơ được pha để có các ASTT khác nhau tương ứng: nước cất (NC), 1atm (M1), 5atm (M5), 10atm (M10), 15atm (M15) Mỗi công thức TN được lặp lại 3 lần Tưới dung dịch đường tương ứng ở các ASTT này mỗi ngày 1 lần cho từng lô hạt, tới khi hạt nảy mầm tối đa (5 ngày) Mỗi ngày tính số hạt nảy mầm ở các mẫu thăm dò Tỷ lệ nảy mầm (TLNM) qua các ngày ở cả 2 giống DT96 và AK02 được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương trong các điều kiện

DT96

Ngày 1 59,66 0,40 32,66 0,40 0 0 0 Ngày 2 94,66 0,40 96,33 0,80 54,66 0,70 0,33 0,40 0 Ngày 3 97,33 0,40 98,33 0,40 96,33 0,40 40,66 1,00 0 Ngày 4 98,66 0,81 98,66 0,40 97,66 0,40 42,00 0,70 0 Ngày 5 98,66 0,81 98,66 0,40 97,66 0,40 42,00 0,70 0

Thử nghiệm này giúp xác định được khoảng nảy mầm của hạt khi sử dụng các nồng độ đường khác nhau Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu các chỉ tiêu sinh lý, hàm lượng prolin và hoạt độ một số enzym của mầm đậu tương trong dung dịch đường với 12 ASTT khác nhau từ 1 đến 12 atm tương ứng từ M1 đến M12

3.1.2 Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương

Nảy mầm là quá trình sinh lí quan trọng trong chu kì sinh trưởng và phát triển của thực vật nói chung, đậu tương nói riêng đảm bảo duy trì sự sống, tạo

cơ sở ban đầu cho sự phát triển của một cơ thể mới Trong giai đoạn này, thực vật rất mẫn cảm với sự thiếu nước Xác định quá trình nảy mầm được bắt đầu bằng sự hút nước, trương nước của hạt [10] Khi hạt được gieo trong môi trường có ASTT cao, nghĩa là áp lực giữ nước của môi trường lớn hơn khả năng hút nước của tế bào, hạt khó hút được lượng nước cần thiết Thậm chí, khi khi ASTT quá cao còn có thể làm cho nước từ trong tế bào đi ra ngoài, làm tế bào bị mất nước, kìm hãm sự nảy mầm của hạt Theo nghiên cứu của Fernando

và cộng sự trên cây Chenopodium quinoa willd cho thấy: TLNM chỉ đạt

khoảng 14% sau gieo hạt, khi cho chúng nảy mầm trong dung dịch NaCl [38] Theo nghiên cứu của Nguyễn Huy Hoàng (1992) [13], trong môi trường đường giống chịu hạn giỏi có TLNM lớn hơn 81%, chịu hạn khá TLNM từ 61– 80%, chiụ hạn trung bình TLNM từ 41 – 60%, chịu hạn yếu TLNM từ 21 – 40%, kém dưới 20%

TLNM của hạt đậu tương trong dung dịch đường tương ứng với mỗi ASTT khác nhau được trình bày ở bảng 3.2, hình 3.1, hình 3.2

Bảng 3.2: Tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tương Đơn vị: %

Hình 3.1 Tỷ lệ nảy mầm của giống đậu tương AK02

Hình 3.2 Tỷ lệ nảy mầm của giống đậu tương DT96

Kết quả cho thấy TLNM của hạt đậu tương tăng từ ngày thứ 1 đến ngày thứ

3, từ ngày thứ 4 mầm phát triển không đáng kể và tỷ lệ nảy mầm vẫn giữ ở mức như ngày 3 ở tất cả các mẫu TN Trong ngày thứ 1, đậu tương chỉ nảy mầm ở ASTT thấp 1- 4 atm, từ 5 atm trở đi hạt không có dấu hiệu nảy mầm ở

cả 2 giống Ngày thứ 2, hạt nảy mầm từ 1-9 atm ở giống AK02, từ 1-10 atm

ở giống DT96 Ngày 3 nảy mầm của hạt từ 1-12 atm nhưng ở mức ASTT cao (12 atm) TLNM thấp, chỉ đạt 1,66% (AK02), 6,66% (DT96) Ngày 4 hầu như không có hạt nảy mầm thêm, hạt có hiện tượng bị hỏng ở M12

mầm tốt từ 1-6 atm, nảy mầm khá từ 7-9 atm ở cả 2 giống ASTT càng cao hạt nảy mầm càng kém TLNM cao hay thấp thể hiện khả năng thích ứng với điều kiện thiếu nước (điều kiện ASTT cao) của hạt đậu tương TLNM của hạt cũng tăng dần từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 4 Ở M3 ngày 1, TLNM 16% ngày thứ 4 TLNM 97,66% (AK02) Trong khi đó, giống DT96, TLNM ngày 1 là 19%, ngày thứ 4 TLNM là 98%, khi ASTT cao hạt nảy mầm rất yếu, ở 12 atm hạt có hiện tượng bị thối Nguyên nhân là do khi gieo hạt ở trong điều kiện ASTT cao, sự hút nước của hạt sẽ bị cản trở dẫn đến thiếu nước trong hạt, các chất sẽ không được hoạt hoá, do vậy hạt khó nảy mầm Điều này chứng tỏ, ASTT cao sẽ ức chế hoạt động sinh lý, hoá sinh nhất là sự ức chế hoạt động của các enzym phân huỷ có trong hạt, ASTT càng cao hạt càng bị ức chế mạnh

Giống DT96 có khả năng nảy mầm cao hơn và sớm hơn so với giống AK02 ở các ASTT cao, thể hiện qua ngày 3 M8 có TLNM là 50,33% (AK02),

ở giống DT96 là 65,33% Cũng ở ngày này, M11 có TLNM là 3,33% (AK02), còn ở giống DT96 đạt 12,33% và M12 giống AK02 hầu như không nảy mầm, nhưng giống DT96 nảy mầm được 6,66% Chứng tỏ giống DT96 có khả năng hút nước tốt hơn so với giống AK02 ở điều kiện ASTT cao

Như vậy, hạt của 2 giống AK02 và DT96 đều có thể nảy mầm tương đối tốt ở khoảng ASTT từ 1-6 atm, đạt yêu cầu ở khoảng ASTT từ 7-9 atm,

từ 10-11 atm TLNM thấp, đến 12 atm TLNM rất thấp ASTT càng cao càng ức chế hoạt động nảy mầm của hạt Giống DT96 có TLNM cao hơn

so với giống AK02 ở mức ASTT cao, chứng tỏ giống DT96 chịu được ASTT cao hơn so với giống AK02

3.2 Sự sinh trưởng của mầm đậu tương trong điều kiện ASTT khác nhau

3.2.1 Sinh trưởng thân mầm của hạt đậu tương

Sự sinh trưởng của thân mầm được xác định bằng cách, đo chiều dài thân mầm vào ngày thứ 3, 5, 7 sau khi gieo hạt, kết quả được trình bày ở bảng 3.3, hình 3.3 và hình 3.4

Bảng 3.3 Sinh trưởng thân mầm của hạt đậu tương

Đơn vị: mm/mầm

CTNC

CTTN

X mx

% so Đ/C X mx

% so Đ/C X mx

% so Đ/C X mx

% so Đ/C X mx

% so Đ/C X mx

% so Đ/C Đ/C 53,00 1,22 100,00 100,66 2,25* 100,00 168,00 2,32* 100,00 53,66 0,81 100,00 103,66 3,26* 100,00 183,66 3,08* 100,00

Hình 3.3 Chiều dài thân mầm của giống đậu tương AK02

Sự sinh trưởng thân mầm của 2 giống đậu tương tăng dần qua các ngày

TN ở cả mẫu ĐC, và các mẫu TN Mẫu ĐC ngày 3, chiều dài thân mầm là 53,00 mm, ngày 5 đạt 100,66 mm, ngày 7 đạt 168 mm đối với giống AK02 Giống DT96 đạt các giá trị tương ứng là: 53,66 mm ngày 3, 103,66 mm ngày

5, 183,66 ngày 7

Ở các mẫu TN, M7 chiều dài thân mầm tăng tương ứng ở các ngày đo đạt 14,33 ngày 3, đạt 27,33 mm ngày 5, đạt 37,66 ngày 7 ở giống AK02 và giống DT96 đạt 17,33 mm ngày 3, đạt 32,66 mm ngày 5, và 40,00 mm ngày 7

Trong cùng một ngày đo, ASTT càng thấp sự sinh trưởng của thân mầm càng mạnh ở cả 2 giống Giống AK02 vào ngày thứ 3 từ M1 đến M3 (1-3 atm), sinh trưởng thân mầm phát triển mạnh, M3 đạt 41,66mm Từ M4 đến M7 sinh trưởng của mầm giảm rõ rệt, M4 đạt 32,33 mm đến M7 giảm còn 14,33 mm Ít

có sự thay đổi về sinh trưởng thân mầm từ M8 (10,66 mm) đến M10 (9,00 mm) Tăng rất chậm ở M11 (3,33 mm) đến M12 (1,66 mm) Trong ngày thứ 5

sự sinh trưởng của thân mầm mạnh ở các ASTT thấp và giảm dần ở ASTT cao

Sở dĩ có sự thay đổi này là do, tại thời điểm hạt nảy mầm, bên cạnh sự sinh trưởng tương đối ổn định của rễ thì vòng trụ dưới đẩy 2 lá mầm lên, thân mầm

và lá mầm có khả năng tổng hợp chất hữu cơ cung cấp cho quá trình phát triển của thân mầm Còn từ ngày thứ 7 sau khi nảy mầm, thân mầm bắt đầu bước vào quá trình phân hoá tạo cành để chuyển sang giai đoạn cây non nên chiều

chiều dài thân mầm hầu như không tăng là do hạt hút được rất ít nước vì vậy, không đủ cho quá trình hoạt hoá enzym nên hạt nảy mầm rất chậm

Hình 3.4 Chiều dài thân mầm của giống đậu tương DT96

Sự sinh tưởng của 2 giống AK02 và DT96 tương đương nhau ở ASTT thấp từ 1-4 atm, nhưng khi ASTT cao hơn từ 5-11 atm thì sự sinh trưởng của DT96 mạnh hơn AK02, ở 12 atm sinh trưởng mầm hầu như không xẩy ra Điều này cho thấy: trong môi trường có ASTT cao, sự sinh trưởng của mầm gặp nhiều khó khăn do hạt không hút đủ nước để kích hoạt các enzym hoạt động, phục vụ cho sự nảy mầm nên sự gia tăng chiều dài của thân mầm bị kìm hãm và sự kìm hãm này theo chiều giảm sinh trưởng thân mầm khi ASTT tăng

Mỗi giống đậu tương có khả năng chống chịu ASTT khác nhau thì sự sinh trưởng của thân mầm cũng khác nhau Tuy nhiên, ở khoảng ASTT thấp,

ít ảnh hưởng đến sinh trưởng của mầm, vì vậy sự sinh trưởng này của 2 giống tương đương nhau Khi ASTT môi trường tăng cao thì giống nào có khả năng chống chịu tốt hơn sẽ sinh trưởng mạnh hơn Vì vậy theo kết quả trên, giống DT96 có khả năng chịu được ASTT cao hơn so với giống AK02

3.2.2 Sinh trưởng rễ mầm của hạt đậu tương

Tiến hành đo chiều dài rễ mầm vào các ngày 3, 5 và 7 sau khi hạt nảy mầm, kết quả được trình bày trong bảng 3.4, hình 3.5, hình 3.6

Bảng 3.4: Sinh trưởng rễ mầm của hạt đậu tương

Đơn vị: mm/ mầm

CTNC

CTTN

% so Đ/C X mx

% so

% so Đ/C Đ/C 54,66 1,08 100,00 128,00 1,41* 100,00 211,00 2,08* 100,00 65,00 1,12 100,00 178,00 2,07* 100,0 220,66 1,63* 100,0