Nghiên cứu trích ly các hoạt chất chống oxy hóa từ nấm Linh chi bằng sóng siêu âm ứng dụng cho thực phẩm chức năng.

Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến khả năng trích ly các triterpenoid trong nấm Linh Chi .... Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến khả năng trích ly các triterpenoid trong

3333333333333333333

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-

NGUYỄN VĂN DUNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT VIÊN NANG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG TỪ NẤM LINH CHI ỨNG DỤNG SÓNG SIÊU ÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành/Ngành : CNSH-CNTP

Lớp: 43CNTP Khoa : CNTP

Khóa học : 2011-2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong Khóa luận này là trung thực

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Khóa luận này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin đƣợc trích dẫn trong chuyên đề này đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc

LỜI CẢM ƠN

Có được kết quả nghiên cứu này, tôi xin trình bày lòng biết ơn sâu sắc đến:

ThS Nguyễn Đức Tiến - Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Phụ phẩm và Môi

trường nông nghiệp thuộc Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ, động viên, khuyến khích tôi rất tận tình và chu đáo trong những lúc khó khăn, truyền cho tôi kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

ThS Trần Thị Lý và các thầy cô giáo khác trong Bộ môn Công nghệ thực

phẩm - Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ, hỗ trợ về phương tiện nghiên cứu, kiến thức và có những góp ý sâu sắc trong thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình và những người thân đã luôn ở bên động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin cảm ơn bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi, chia sẻ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu trên

Thái nguyên,ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Văn Dung

MỤC LỤC

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về nấm Linh chi 4

2.1.1 Nguồn gốc của nấm Linh chi 4

2.1.2 Phân loại nấm Linh chi 4

2.1.3 Đặc điểm thực vật của nấm Linh chi 5

2.2 Thành phần hóa học và các nhóm hoạt chất sinh học của nấm Linh chi……… 6

2.2.1 Thành phần hóa học của nấm Linh chi 6

2.2.2 Các nhóm hoạt chất có trong nấm Linh chi 6

2.3 Giới thiệu về Beta- Glucal và Triterpenoid 9

2.3.1 Beta-glucal 10

2.3.2 Triterpenoid 11

2.3.3 Ứng dụng điều trị các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi 13

2.4 Ứng dụng sóng siêu âm trong trích ly các hoạt chất sinh học 15

2.4.1 Cơ sở khoa học trích ly các hoạt chất trong nấm Linh Chi 15

2.4.2 Phương pháp trích ly Beta - Glucal và Triterpenoid trong nấm Linh chi… 17

2.4.3 Ứng dụng sóng siêu âm trích ly các hoạt chất sinh học từ nấm Linh chi… 18

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Đối tượng nghiên cứu 20

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

3.3 Thiết bị và vật tư hóa chất nghiên cứu 20

3.3.1 Thiết bị và dụng cụ 20

3.3.2 Hóa chất nghiên cứu 20

3.4 Nội dung nghiên cứu 20

3.5 Phương pháp nghiên cứu 21

3.5.1 Phương pháp phân tích 21

3.5.2 Bố trí thí nghiệm 26

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng trích lyTriterpenoid từ nấm Linh 32 4.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng trích lyTriterpenoid từ nấm Linh chi 32

4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly Triterpenoid từ nấm Linh chi33 4.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi 35

4.1.4 Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến khả năng trích ly tritecpenid từ nấm Linh chi 36

4.1.5 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến khả năng trích ly Triterpenoid từ nấm Linhc chi 37

4.1.6 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi 39

4.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng trích ly Beta-glucal từ nấm Linh chi 41

4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly Beta-glucal từ nấm Linh chi 41 4.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng trích ly Beta-glucal từ nấm Linh chi 43

4.2.3 Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến khả năng trích ly Beta-glucal từ nấm Linh chi 45

4.2.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến khả năng trích ly Beta-glucal từ nấm Linh chi 46

4.2.5 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly Beta-glucal từ nấm Linh chi 47

4.3 Ứng dụng chế phẩm trích ly sản xuất viên nang 49

4.3.1 Tỉ lệ phối chế 49

Thang điểm đƣợc xây dựng cho từng chỉ tiêu cảm quan bằng thực nghiệm 50

4.3.2 Xác định các thông số thích hợp trong quá trình sấy tạo sản phẩm 51

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

5.1 kết luận 53

5.2 kiến nghị 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi và công dụng 9 Bảng 3.1 Công thức phối chế của viên nang Linh Chi 31 Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi(ethanol) tới khả năng trích ly

triterpenoid trong nấm Linh Chi 32 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi 34 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng trích ly các triterpenoid trong nấm Linh Chi 35 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến khả năng trích ly các

triterpenoid trong nấm Linh Chi 36 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến khả năng trích ly các triterpenoid trong nấm Linh Chi 38 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly các triterpenoid trong nấm Linh Chi 39 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng trích ly Beta-glucal trong nấm Linh Chi 42 Bảng 4.7 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của dịch trích ly Triterpenoid từ nấm Linh chi 41 Bảng 4.7 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch trích ly Triterpenoid từ nấm Linh chi 41 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng trích ly Beta-glucal trong nấm Linh Chi 44

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng trích ly Beta-glucal trong nấm Linh Chi 43 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm tới khả năng trích ly Beta-glucal trong nấm Linh Chi 47

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến khả năng trích ly glucal từ nấm Linh chi 46

Beta-Bảng 4.12 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly Beta-glucal từ

nấm Linh chi 47

Bảng 4.13 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch trích ly Beta-glucal từ nấm Linh chi 48

Bảng 4.14 Tỉ lệ phối chế tạo ra sản phẩm viên nang 50

Bảng 4.15 Kết quả điểm đánh giá cảm quan cho các chỉ tiêu 50

Bảng 4.16 Ảnh hưởng thời gian sấy tới độ ẩm của viên nang Linh chi 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Các loại nấm Linh chi 5 Hình 2.1 Công thức cấu tạo Beta-glucal 10 Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của lanosterol và ba trong số nhiều hợp chất phân lập từ Ganoderma lucidum 12 Hình 3.1 Công thức DPPH 25 Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến khả năng trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi 32 Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi 34 Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi 35 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến khả năng

trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi Error! Bookmark not defined

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến khả năng trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi 38 Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi 40 Hình 4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng trích ly Beta-glucal trong nấm Linh Chi 42 Hình 4.8 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi tới khả năng trích ly Beta-glucal trong nấm Linh Chi 44 Hình 4.9 Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm tới khả năng trích ly Beta-glucal trong nấm Linh Chi 45 Hình 4.10 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến khả năng trích ly Beta-glucal từ nấm Linh chi 46 Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của dịch trích ly Triterpenoid

từ nấm Linh chi 49 Hình 4.12 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly Beta-glucal từ nấm Linh chi 48

mm : Minimet

pa : Áp suất TCVN : Tiêu chuẩn Việt nam

W : Woat

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Nấm Linh chi được xếp hàng đầu trong danh mục nấm dược liệu và từ lâu đã được xem là dược liệu quý trong đông y Biết được những tác dụng quý của các hoạt chất trong nấm Linh chi, ngày càng nhiều nơi trên thế giới quan tâm nghiên cứu và bào chế các sản phẩm có thành phần hoạt chất từ nấm Linh chi, trong đó có Việt Nam Ngày nay, qua nhiều công trình nghiên cứu khoa học hiện đại đã xác định được trên 100 hợp chất, dẫn xuất của nấm Linh chi và đã được chứng minh có tác dụng chữa bệnh, hỗ trợ cho hệ thống miễn dịch, thần kinh, phòng chống bệnh, bồi bổ sức khỏe và kéo dài tuổi thọ [27]

Trong nấm Linh chi có rất nhiều hoạt chất sinh học khác nhau Các hoạt chất sinh học có tác dụng dược lý mạnh của nấm Linh chi đều có bản chất Triterpennoid

và polysacharide kể cả Beta-glucal Các polysacharide có thể ở dạng tự do hoặc liên kết với protein có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn Do có các tính chất quý báu như vậy mà nhu cầu sử dụng nấm Linh chi và các sản phẩm thương mại có bổ sung hoạt chất từ nấm Linh chi trong lĩnh vực chế biến thực phẩm, y tế và mỹ phẩm ngày càng tăng[11]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học từ nấm Linh chi Việc trích ly các hoạt chất sinh học bằng công nghệ sử dụng dung môi có hỗ trợ xử lý bằng sóng siêu âm, enzyme và các điều kiện nhiệt độ, áp suất… đã phát triển ở quy mô công nghiệp ở một số nước như Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, Mỹ,… Trong thời gian gần đây, ở trong nước đã có một số nghiên cứu được tiến hành nhằm phát triển công nghệ và sản phẩm mới từ nấm Linh chi Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ mới, đặc biệt là công nghệ trích ly

có hỗ trợ bằng siêu âm để trích ly các hoạt chất sinh học từ nấm Linh chi vẫn còn rất hạn chế Việc nghiên cứu ứng dụng sóng siêu âm để trích ly các hoạt chất sinh học từ nấm Linh chi nhằm tạo ra các sản phẩm thương mại có ý nghĩa khoa học và

có tính thiết thực vì có thể mang lại lợi ích về kinh tế xã hội ở Việt Nam

Việt Nam có tiềm năng lớn về sản xuất nấm Linh chi, do có điều kiện thời tiết thuận lợi, nguồn nguyên liệu trồng nấm phong phú, nguồn lao động dồi dào nên có

thể trồng nấm quanh năm Tuy nhiên, lĩnh vực chế biến nấm Linh chi cũng như các loại nấm thuốc hay nấm thực phẩm khác của Việt Nam chưa được phát triển phù hợp với tiềm năng về nguyên liệu Sản phẩm nấm Linh chi của Việt Nam trên thị trường vẫn chủ yếu là nấm quả thể khô nguyên thể, có rất ít sản phẩm chế biến tinh sâu Các sản phẩm cao cấp ở dạng cao, bột, trà, …đều được nhập khẩu từ Hàn Quốc

và Trung Quốc với giá thành cao

Vì những lý do nêu trên và để góp phần thúc đẩy phát triển công nghệ trích ly

nấm Linh chi trong nước, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu trích ly các hoạt chất chống oxy hóa từ nấm Linh chi bằng sóng siêu âm ứng dụng cho thực phẩm chức năng ”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu trích ly các hoạt chất chống oxy hóa từ nấm Linh chi bằng sóng siêu

âm ứng dụng cho thực phẩm chức năng

1.2.2 Yêu cầu

Nội dung 1: Xác định ảnh hưởng của một số điều kiện đến khả năng trích ly

Triterpenoid từ nấm Linh chi

- Xác định ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng trích ly

- Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng trích ly

- Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly

- Xác định ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến khả năng trích ly

- Xác định ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến khả năng trích ly

- Xác định ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch trích ly

Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng của một số điều kiện đến khả năng trích ly

Beta-glucal từ nấm Linh chi

- Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng trích ly

- Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly

- Xác định ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến khả năng trích ly

- Xác định ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến khả năng trích ly

- Xác định ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch trích ly

Nội dung 3: Ứng dụng chế phẩm trích ly bổ sung vào viên nang thực phẩm

chức năng

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về nấm Linh chi

2.1.1 Nguồn gốc của nấm Linh chi

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới Nó

thường mọc trên những thân cây mục hay còn gọi là Linh chi thảo, do vậy nhiều tác giả đã cho rằng đây là một loại cây cỏ thực ra Linh chi là một loại nấm Trong tự nhiên, nấm Linh chi chỉ mọc ở rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm cao, thường thấy xuất hiện trên những thân cây mục [5]

Trung Quốc được coi là cái nôi phát hiện nấm Linh chi, từ đầu thế kỷ 17 nấm Linh chi đã được biết đến, nuôi trồng và sử dụng như nguồn dược liệu quý Tại Nhật Bản, đến năm 1971, hai giáo sư của trường đại học Kyoto là Yukio Naoi và Zenzabuno Kasai đã nghiên cứu thành công công nghệ gây giống và từ đó nấm Linh chi mới sản xuất được ở quy mô lớn [7]

2.1.2 Phân loại nấm Linh chi

Tên gọi: Nấm Linh chi, Nấm lim, Nấm trường thọ…

Tên khoa học: Ganoderma lucidum

Nấm Linh chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay [4]:

Giới (regnum): Nấm (Fungi)

Ngành (phylum): Nấm đảm (Basidiomycota)

Lớp (class): Agaricomycetes

Bộ (ordo): Polyporales

Họ (familia): Nấm gỗ (Ganodermataceae)

Chi (genus): Ganoderma

Loài (pecies): Ganoderma Lucidum

Linh chi được chia thành hai nhóm là Cổ Linh chi và Linh chi

- Cổ Linh chi: Tên khoa học là Ganoderma applanatum (Pers) Past, còn gọi là

Linh chi đa niên nhiều tầng và có hàng chục loài khác nhau Đây là các loài nấm gỗ không cuống hoặc cuống rất ngắn, có nhiều tầng, mỗi năm thụ tầng lại phát triển thêm một lớp mới chồng lên Mũ nấm hình quạt, màu từ nâu xám đến đen sẫm, bề mặt trên sù sì thô ráp Nấm rất cứng, cứng như gỗ lim nên còn gọi là nấm lim

- Linh chi: Tên khoa học là Ganoderma lucidum (Leyss ex fr) kart, có nhiều

loài khác nhau Kết quả thống kê cho thấy, chủng loại Linh chi rất phong phú, ước tính thống kê trên thế giới có trên 200 loài nấm Linh chi, có loài hình nấm nhưng

mũ không tròn mà nhăn nheo, có loài hình giống như trái thận, có loài giống như sừng hươu

Hình 2.1 Các loại nấm Linh chi 2.1.3 Đặc điểm thực vật của nấm Linh chi

Nấm Linh Chi là một trong những loại nấm phá gỗ, nó thường ký sinh trên các cây gỗ lâu năm Ngoài ra còn gặp chúng trên các cây Lim, Phượng Vĩ, So Đũa và một số loài cây chết, mục hoặc trên cây sống như Xoài, Mít, Mãng Cầu…Nấm thường có ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trong tự nhiên, nấm thường chỉ có ở nơi rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm cao [6]

Linh Chi có cấu tạo 2 phần: Phần cuống và mũ nấm Cuống nấm biến dị rất lớn từ rất ngắn 0,5cm; cho đến dài cỡ hàng 5 - 10 cm hoặc rất dài 20 - 25cm Cuống

có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm do quá trình lên tán mà thành

Mũ nấm dạng thận gần tròn, đôi khi xoè hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàng nâu, vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím hoặc nâu đen, nhẵn bóng như láng vecni Kích thước tán biến động từ 2 - 30cm; dày 0,8 - 2,5cm

Thịt nấm dày từ 0,4 - 1,8cm; màu vàng kem, nâu nhạt hoặc trắng Nấm mềm, dai khi tươi và trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùng của sợi phình hình chuỳ, màng rất dày đan khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh cuống [8]

2.2 Thành phần hóa học và các nhóm hoạt chất sinh học của nấm Linh chi

2.2.1 Thành phần hóa học của nấm Linh chi

Cho đến nay đã xác định được trên 90 nguyên tố hóa học trong nấm Linh chi, trong đó hai nhóm được quan tâm nhất là polysacharide và triterpenoide Trong các hợp chất trên thì polysacharide chứa hàm lượng cao nhất, chiếm từ 50-60%, là hợp chất quyết định chất lượng của nấm Linh chi Nấm Linh chi có hàm lượng polysacharide càng cao thì được đánh giá là chất lượng càng tốt Trong số các nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm Linh chi đầu tiên được tiến hành vào đầu thế kỷ 20, khi các nhà khoa học quan tâm đến lớp vỏ láng của nấm và đã phát hiện các chất như esgosterol, các enzyme Nấm Linh chi nuôi trồng thì hàm lượng polysacharide và polysacharide liên kết protein được nghiên cứu nhiều nhất, chúng

có tác dụng tăng cường miễn dịch, tiêu diệt tế bào khối u thông qua kích hoạt các tế bào miễn dịch Hàm lượng một số thành phần hợp chất chính trong nấm Linh chi gồm: nước 12-13%; cellulose 54-56%; lignin 13-14%; hợp chất có ni tơ 1,6-2,1%; hợp chất phenol 4-5%; chất béo 1,9-2%; kali 1,9-2%; natri 0,08-0,12%; canxi 1-1,2%

2.2.2 Các nhóm hoạt chất có trong nấm Linh chi

- Nhóm có bản chất protein

Nhóm này do các nhà khoa học Nhật Bản tìm ra, được chứng minh là có tác dụng chống dị ứng và điều hoà miễn dịch rất hữu hiệu, đồng thời duy trì tạo kháng thể hỗ trợ chống các kháng nguyên viêm gan B [30]

- Nhóm nucleoside

Nhóm này có đặc trưng bởi dẫn xuất của adenosine với tác dụng hỗ trợ thư giãn

cơ, giảm đau và ức chế sự kết dính tiểu cầu

- Nhóm alcaloide

Nhóm này có tác dụng trợ tim

- Nhóm steroide

Ergosterol (tiền vitamin D2) có khoảng 0,3-0,4% trong nấm Linh chi Steroid có tác dụng chủ đạo là ức chế sinh tổng hợp cholesterol bởi các lacton A, B và các sterol [21]

- Các hợp chất lanostanoide có cấu trúc kiểu triterpen

Các hợp chất lanostanoide có cấu trúc kiểu triterpen đƣợc phát hiện ngày một nhiều, một số cấu trúc nhƣ:

Ganodermenonol: : 26 - hydroxy - 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien -one

Ganodermadiol: 5 alpha-lanosta-7,9 (11).24-trien-3 beta.26-diol

Ganodermatriol: 5 alpha-lanosta-7,9 (11).24-trien-3 beta.26,27-triol

- Nhóm các este với acid béo không no linoleic

Nhóm các este với acid béo không no linoleic đƣợc ghi nhận vào năm 1991, có hoạt tính chống ƣng thƣ, đó là 2 ergosterol mới [16]:

Steryl este 1: Ergosta-7.22-dien-3beta-yl-linoleate

Steryl este2: 5alpha 8alpha- epidioxyergosta- 22-dien-3 beta-yl-lino leate đồng thời các tác giả còn tìm ra một lanostanoid và một steroid mới cũng có tác dụng ức chế các tế bào ƣng thƣ

- Nhóm polysacharide

Nhóm polysacharide cũng rất phong phú ở nấm Linh chi và có hoạt lực mạnh Hee và cộng sự đã khảo cứu nhóm polysacharide và phát hiện có hoạt tính tăng miễn dịch Polysacharide có nguồn gốc từ nấm Linh chi dùng điều trị ung thƣ đã đƣợc công nhận sáng chế ở Nhật Bản năm 1976 Công ty Kureha Chemical Industry sản xuất chế phẩm trích ly từ nấm Linh chi có tác dụng kháng các tác nhân gây ung thƣ Công ty Teikoko Chemical Industry sản xuất sản phẩm từ nấmLinh chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế tế bào ung thƣ β-D-glucan của nấm Linh chi là polysacharide liên kết với các acid amin, kích thích hay điều hòa hệ thống miễn dịch bằng cách hoạt hóa các tế bào, đại thực bào, tăng hàm lƣợng glolubin giúp tăng miễn dịch đối với các tế bào lạ nhƣ vi khuẩn, vi rút hay tế bào khối u [22]

- Các phức hợp polysacharide-proteine

Đặc biệt các phức hợp polysacharide-proteine có hoạt tính hỗ trợ chống khối u

và tăng miễn dịch đã được chỉ ra từ lâu

- Nhóm triterpennoid

Đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh là nhóm saponinetriterpennoids Giai đoạn

từ năm 1984-1987, lần đầu tiên chứng minh các acid ganoderic C mới được tìm thấy trong tự nhiên Sau đó đến năm 1986, Morigiwa tìm ra thêm acid Ganoderic B Ngày nay nhóm acid ganoderic đã được phát hiện có tới hàng chục dẫn xuất khác nhau Đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải phóng histamin, tăng cường hấp thụ oxy và cải thiện chức năng gan Hiện nay đã tìm thấy trên 80 dẫn xuất từ acid Trong đó ganodosteron được xác định là chất kích thích hoạt động của gan và bảo vệ gan Phân tích thành phần nguyên tố của nấm Linh chi còn phát hiện thấy có khoảng 40 nguyên tố, trong đó có germanium Germanium có liên quan chặt chẽ với khả năng lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô, đặc biệt là giảm bớt đau đớn cho người bị ung thư giai đoạn cuối

Bảng 2.1 Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi và công dụng

Cyclooctasulfur Ức chế giải phóng histamine

Nucleotid Adenosine và dẫn xuất Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giãn cơ,

giảm đau Protein Lingzhi-8 Chống dị ứng phổ rộng, điều hoà miễn dịch

Steroid

Lanosporeric A Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Lonosterol Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Compounds I, II, III, IV, V Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Polysacharide

Ganoderans A, B, C Hạ đường huyết Beta-D- glucan Chống ung thư, tăng tính miễn dịch BN-3B:1, 2, 3, 4 Tăng tính miễn dịch

Triterpenoid

Ganoderic R, S Ức chế giải phóng histamine Ganoderic B, D, F, H, K, Y Giảm huyết áp

Ganoderic s Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Ganodermic Mf Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Ganodermic T.O Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Ganosporelacton A Chống khối u Ganosporelacton B Chống khối u

2.3 Giới thiệu về Beta- Glucal và Triterpenoid

Trong nấm Linh chi có rất nhiều hoạt chất sinh học khác nhau, nhưng chiếm nhiều nhất và có hoạt tính mạnh nhất là Beta-Glucal và Triterpenoid

Hình 2.1 Công thức cấu tạo β-glucan

Beta-Glucal thường có trong tế bào thực vật, hạt ngũ cốc, nấm men, nấm và

vi khuẩn Nấm mộc nhĩ trắng có hàm lượng Beta-Glucal cao nhất là 2,5% trọng lượng khô Nấm mỡ trung bình có hàm lượng Beta-Glucal khoảng 42mg/100g nấm khô, nấm hương có hàm lượng Beta-glucal là 22mg/100g nấm khô Đậu nành có chứa 0,8% Beta-1,3-glucal so với trọng lượng khô, trong cần tây, củ cải, cà rốt cũng chứa gần 20% Beta-1,3-glucal trong thành phần cacbonhydrat tổng số [16] Ngoài

ra, theo các nghiên cứu của viện thực phẩm Nhật Bản thì trong 100g nấm Linh chi khô có khoảng 52,8 mg Beta-glucal

2.3.1.2 Cơ chế tác động của Beta-glucal

Beta-Glucal kết hợp với các thụ thể bên ngoài màng của đại thực bào và những

tế bào bạch cầu khác (bao gồm cả những tế bào thực bào tự nhiên và những tế bào tạo độc tố của cơ thể) Với sự kết hợp đặc hiệu giữa các thụ thể trên bề mặt đại thực bào với tác nhân lạ, Beta-glucal có tác dụng phát hiện sự xâm nhập hoặc bám vào

cơ thể của các nhân tố bất lợi và cảnh báo cho cơ thể biết [21] Beta-Glucal kết hợp

rất đặc hiệu với các bạch cầu và gây ra phản ứng chuỗi dẫn đến việc gia tăng hoạt tính miễn dịch:

- Sản xuất ra những tế bào bạch cầu từ tủy xương bao gồm: Đại thực bào, bạch cầu trung tính và hồng cầu

- Huy động các tế bào bạch cầu máu có khả năng nhận diện “kẻ thù” và di chuyển đến nơi có tác nhân lạ

- Hoạt tính thực bào của bạch cầu tiêu diệt các tế bào bên ngoài xâm nhập vào

- Sản xuất ra các tác nhân kháng vi sinh vật tăng cường sự đặc hiệu của hệ thống miễn dịch

2.3.2.1 Định nghĩa

Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren Các triterpenoid có bộ khung chính từ 27 - 30 nguyên tử carbon rất thường gặp trong thực vật Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; ; eter -O-; C=O; nối đôi C=C Đặc tính chung là tan tốt trong eter dầu hỏa, ethanol, methanol, hexan, chloroform, ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid [12]

2.3.2.2 Cấu trúc của triterpenoid

Cấu trúc hóa học của triterpenoid dựa trên cấu trúc của lanostane, nó là một chất chuyển hóa của lanosterol, sinh tổng hợp dựa trên sự tạo vòng của các squalene

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của lanosterol và ba trong số nhiều hợp chất phân

lập từ Ganoderma lucidum

Cấu trúc của triterpenoid được phát hiện ngày một nhiều, năm 1986, Arisawa

và cộng sự đã xác định cấu trúc của một số triterpenoid:

+ Ganodermenonol: 26 - hydroxy - 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien -one

+ Ganodermadiol: 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 beta.26 - diol

+Ganodermatriol: 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 beta.26,27 – triol

Trong các nhóm Ganodermic acid, Wang và cộng sự đã chứng minh được hiệu lực ức chế kết tụ cầu ở người và xác định cấu trúc phân tử của Ganoderic acid S: Lanosta

- 7,9 (11).24 - trien - 3 beta, 15 alpha - diacetoxy - 26 - oic acid

2.3.2.3 Đặc điểm

Dựa vào cấu trúc của triterpenoid ta thấy hầu hết các triterpenoid là những hợp chất không phân cực và phân cực trung bình vì vậy chúng có đặc tính chung là tan tốt trong eter dầu hỏa, ethanol, methanol, hexan, chloroform, ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp đường để tạo thành glycoside Triterpenoid là hợp chất tao nên vị đắng trong nấm Linh Chi

2.3.3 Ứng dụng điều trị các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

2.3.1.1 Ứng dụng điều trị ung thư các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Ung thư là một căn bệnh rất nguy hiểm và mặc dù có những tiến bộ toàn diện trong chẩn đoán và điều trị nhưng nó vẫn là một thách thức lớn Nấm Linh chi có

tác dụng ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư Trong nấm Linh chi, một số lượng

lớn các hoạt chất sinh học có thể được trích ly từ quả thể nấm, sợi nấm, hoặc bào

tử Một số mô hình thí nghiệm trên động vật đã phát hiện ra tác dụng ức chế sự hình thành mạch vào và di căn Tuy nhiên, bằng chứng từ các thử nghiệm trên con người vẫn còn hạn chế

- Thử nghiệm trên động vật

Trong một nghiên cứu được tiến hành bởi Kim và cộng sự (1980) một số hoạt chất của polysacharide và protein từ nấm đã được tìm thấy chứng tỏ hoạt động kháng u đáng kể Một phần ba động vật trong thí nghiệm đã giảm tăng trưởng khối

u Trong một nghiên cứu khác được tiến hành bởi Hyun, Choi, và Kim (1990) , sử dụng nấm Linh chi được trích ly polysacharide bằng nước nóng với thử nghiệm 2mg/1 cá thể chuẩn trong 5 tuần, tỷ lệ ức chế khối u đạt 52-81% so với cá thể chuột không sử dụng dịch trích ly

- Thử nghiệm trên người

Trong một nghiên cứu của Gao, Sai và cộng sự (2003) Đã có 134 bệnh nhân ung thư tự nguyện tiến hành bổ sung viên nang Nấm Linh chi với liều 1800 mg / ngày trong 12 tuần Khả năng miễn dịch tế bào ở 80% số bệnh nhân này đã được tăng

cường đáng kể về huyết tương Ngoài ra, chất lượng cuộc sống được cải thiện

khoảng 65% ở số bệnh nhân này Những kết quả này cho thấy các hiệu ứng chống khối u của nấm Linh chi được tác động vào hệ thống miễn dịch[25]

2.3.1.2 Ứng dụng điều trị đối với hệ thống miễn dịch các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có tác dụng tăng cường các chức năng của hệ thống miễn dịch, tăng cường sức khỏe, cải thiện sức đề kháng Do đó, loại bỏ các tế bào ác tính hay tiền ác tính Nhiều sản phẩm nấm Lịnh chi trên thị trường công bố có tác dụng miễn dịch Những polysacharide cũng có tác dụng ức

chế sự phát triển tế bào khối u trong cơ thể đồng thời tăng cường phản ứng miễn dịch ở cả người và động vật

2.3.1.3 Ứng dụng chống oxy hóa của các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Theo Collins (2005) các chất chống oxy hóa có thể giúp ngăn ngừa ung thư và

các bệnh mãn tính khác Chất chống oxy hóa cũng bảo vệ các thành phần tế bào, trong đó có khả năng làm giảm nguy cơ đột biến và gây ung thư và bảo vệ các tế bào miễn dịch Trong một nghiên cứu của Lee và cộng sự (2011) chứng tỏ các thành phần trong nấm Linh chi có khả năng chống oxy hóa trong đó có polysacharide và Triterpenoid

2.3.1.4 Ứng dụng kháng vi rút của các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Mục tiêu của nghiên cứu trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do virus và vi khuẩn là việc phát hiện ra tác dụng cụ thể ức chế virus và vi khuẩn mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường Các tác dụng phụ không mong muốn của thuốc kháng sinh, thuốc chống virus và sự xuất hiện các chủng kháng thuốc đột biến đã khiến các nhà nghiên cứu điều tra về hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus của nấm Linh chi Hijikata và Yamada (1988 ) trong một nghiên cứu dịch trích ly bằng nước nóng của nấm Lihh chi (tương đương với 36 hoặc 72 g nấm khô mỗi ngày) được sử dụng như điều trị cho 4 bệnh nhân cao tuổi bị đau dây thần kinh Cách điều trị này

đã làm giảm đáng kể cơn đau và thúc đẩy việc chữa lành các tổn thương, mà không phát hiện bất cứ độc tính ngay cả ở liều rất cao

Để đánh giá các tác dụng kháng khuẩn của nấm Linh chi, một số nghiên cứu trên động vật sử dụng nấm Linh chi đã được thực hiện Theo Ohno và cộng sự (1998) Những con chuột được tiêm dịch trích ly của nấm Linh chi với liều lượng (2

mg /1 cá thể chuột) cho thấy mức độ cải thiện tỉ lệ sống rõ rệt (> 80% so với 33% ở nhóm đối chứng)

2.3.1.5 Ứng dụng điều trị đái tháo đường của các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Các thành phần của nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường

huyết ở động vật với (liều 100 mg/kg) Theo Seto và cộng sự (2002) khi uống dịch nước Linh chi trích ly bằng nước nóng (0,03 mg/1cá thể chuột) trong 4 tuần đã thấy

được mức độ giảm glucose trong máu ở những con chuột béo phì và đái tháo đường Trong một nghiên cứu khác những con chuột bị tiểu đường được điều trị bằng nấm Linh chi trong 30 ngày Sau khi điều trị, phát hiện nồng độ insulin huyết thanh tăng (so với nhóm bệnh tiểu đường nontreated) và mức độ glucose giảm một cách phụ thuộc vào liều lượng uống dịch trích ly nấm Linh chi Tuy nhiên, các nghiên cứu này được thực hiện chủ yếu ở động vật

2.3.1.6 Ứng dụng điều trị gan và tổn thương dạ dày của các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Dịch trích ly bằng nước và nước nóng của nấm Linh chi đã được tìm thấy có

tác dụng mạnh về tổn thương gan Trong một nghiên cứu của Shieh và cộng sự (2001) khi trích ly nấm Linh chi bằng nước đã được đưa vào đường miệng chuột thấy có tác dụng ức chế chống lại sự hình thành của malondialdehyde (MDA), trong gan và thận chuột

2.4 Ứng dụng sóng siêu âm trong trích ly các hoạt chất sinh học

2.4.1 Cơ sở khoa học trích ly các hoạt chất trong nấm Linh Chi

Theo các nghiên cứu thì Beta-Glucal trong nấm Linh Chi thuô ̣c nhóm polysacharidee - là nhóm chất hữu cơ phổ biến và có khối lượng lớn nhất trong nấm Linh Chi Polysacharide có thể không tan như cellulose nhưng có những loại có độ trương nở và hoà tan tốt trong nước nóng và nước lạnh như tinh bột, guaran gum, lenantin, ergothioneine Cenllulose chiếm một lượng khá lớn và có độ nhớt vừa phải nên các chất trong nấm Linh Chi dễ hòa tan khi được trích ly bằng nước, mà không bị mất hoạt tính của các chất sinh học Theo nghiên cứu để nâng cao hiệu suất trích ly polysacharide trong nấm Linh Chi thì có thể sử dụng sóng siêu âm có tần số 8 kHz trong nước ở 950C trong 3h với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi(nước) là 1/12 Trong điều kiện này hiệu suất trích ly polysacharide có thể tăng lên 42% đến

75% [25] Cũng trong một nghiên cứu khác của Huang Sheng Quan và cộng sự

(2010) đã tiến hành xử lý nguyên liệu với sóng siêu âm với công suất 50W trong 701s với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi(nước) là 1/11,6 cho hiệu suất trích ly tăng 115,56% so với trích ly thông thường

Hầu hết các Triterpenoid là những hợp chất không phân cực vì vậy chúng

có đặc tính chung là tan tốt trong eter dầu hỏa, ethanol, methanol, hexan, chloroform, ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp đường để tạo thành glycoside Các triterpenoid có độ nhớt vừa phải, bền với nhiệt độ, tạo vị đắng trong nấm Linh Chi Hàm lượng của triterpenoid trong nấm là từ 0,6 – 11% trên một gam

bột Linh Chi khô Năm 2011, Yang Gao và cộng sự tiến hành nghiên cứu chỉ ra

nhóm hợp chất triterpenoid có hoạt tính đáng kể, đặc biệt là khả năng chống ung thư Tác giả đã đưa ra các phương pháp trích ly triterpenoid, có thể sử dụng dung môi methanol, ethanol để tách trực tiếp triterpene hoặc dùng kiềm để trích ly hết lượng acid sau đó tiến hành tách triterpenoid [28] Năm 1994, Kim và cộng sự tiến hành nghiên cứu trích ly triterpenoid bằng methanol của quả thể nấm Linh Chi có tác dụng ức chế sự nhân lên của virus

Chính vì vậy, dịch chiết Linh Chi rất thuận lợi trong việc chế biến các sản

phẩm đồ uống dạng cao nấm Linh Chi, trà hòa tan, trà túi lọc, viên nang Linh Chi Tiến hành trích ly Triterpenoid từ nấm Linh chi sử dụng dung môi ethanol Thu được dịch trích ly có chứa Triterpenoid và bã Sau đó sử dụng bã đã trích ly Triterpenoid để tiến hành trích ly Beta-glucal sử dụng dung môi là nước thu được dịch trích ly có chứa Beta-glucal

2.4.2 Phương pháp trích ly Beta-Glucal và Triterpenoid trong nấm Linh Chi

Hiện nay có hai phương pháp trích ly chính là: Phương pháp trích ly lỏng - lỏng và phương pháp trích ly lỏng - rắn Trích ly rắn - lỏng là quá trình tách một hoặc một số chất tan trong chất rắn bằng một chất lỏng khác gọi là dung môi Vì mục đích của đề tài là trích ly hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi cụ thể là Beta-

Glucal và Triterpenoid (đã được xử lý bằng sóng siêu âm) nên chúng tôi sẽ trình

bày về phương pháp trích ly rắn - lỏng Đối với phương pháp này phải có các yêu cầu sau:

Yêu cầu đối với dung môi: Dung môi phải có tính hoà tan chọn lọc, không độc, không ăn mòn thiết bị, rẻ và dễ tìm

Cơ chế hoà tan: Dung môi thấm qua các mao quản vào các tế bào dược liệu, thời gian thấm phụ thuộc vào đường kính, chiều dài mao quản, bản chất dung môi Quá trình hoà tan phụ thuộc vào bản chất hoá học của các chất tan và dung môi

2.4.3 Ứng dụng sóng siêu âm trích ly các hoạt chất sinh học từ nấm Linh chi

2.4.3.1 Định nghĩa

Siêu âm (ultrasound) là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian có tàn số lớn hơn giới hạn ngưỡng nghe của con người

2.4.3.2 Nguyên lý tác động của sóng siêu âm

Nguyên tắc phá vỡ cấu trúc tế bào bằng sóng siêu âm dựa trên hiệu ứng lỗ hổng khí, chuyển năng lượng âm thanh thành năng lượng cơ học dưới dạng sóng xung có

áp lực khoảng vài nghìn Pa (300MPa) Năng lượng này làm tan rã tế bào khi động năng của nó lớn hơn độ bền của màng tế bào Ngoài ra, vận tốc lớn hơn làm gia tăng quá trình phá vỡ và cắt đứt tế bào Khả năngtrích ly các hợp chất hòa tan tăng

do sự tạo thành các bọt khí trong dung môi khi sóng siêu âm truyền qua Dưới tác dụng của sóng, các bọt khí bị kéo nén, sự tăng áp suất và nhiệt độ làm các bọt khí

nổ vỡ, tạo lên hiện tượng “sốc sóng” Khi sự nổ vỡ của các bọt khí ở gần bề mặt pha rắn, xảy ra mất đối xứng sinh ra các tia dung môi có tốc độ cao vào thành tế bào, làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha rắn và lỏng do đó làm tăng sự xâm nhập của dung môi vào tế bào Điều này làm tăng sự chuyển khối và phá vỡ cấu trúc tế bào, sự nổ

vỡ của các bọt khí làm tăng sự thoát của các chất nội bào vào dung dịch Những tác dụng chính của sóng siêu âm trong quá trình xử lý:

- Tăng mạnh tính thẩm thấu của dung môi chiết xuất

- Làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ

- Tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp (thay cho kỹ thuật phối trộn)

- Có tác dụng làm nóng cục bộ nên tăng tính hòa tan của dung môi

- Tăng tốc độ của các phản ứng hóa học

- Làm sạch và khử khí trong chất lỏng

- Khử hoạt động của các vi sinh vật và men

- Tăng tốc độ các quá trình chiết xuất Hiệu ứng nổ bọt khí trong lòng chất lỏng

do siêu âm có khả năng tạo ra các tác động lý hóa: Khử khí, đồng hóa, phân tán, kết

tụ từng phần, oxy hóa, nhũ tương hóa, trùng hợp/ khử trùng hợp các chất cao phân tử Đa số các tác động này đều hỗ trợ tốt cho quá trình chiết suất Nhiều nước như Đức, Anh, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn độ, Nga,… Đã ứng dụng hiệu ứng nổ bóng khí để chiết suất các hợp chất tự nhiên như trích ly lá, rễ cây sâm, cây dược liệu với quy mô công nghiệp, làm giảm thời gian trích ly từ 2-3 lần và chỉ cần sử dụng 50-70% lượng dung môi, hiệu suất chiết tách tăng lên 30-50% so với phương pháp chiết suất truyền thống [23]

2.4.3.3 Thiết bị tạo sóng siêu âm và ứng dụng

Công nghệ chế tạo các thiết bị siêu âm dựa trên nguyên lý biến đổi năng lượng điện thành năng lượng siêu âm đã được phổ cập ở nhiều nước trên thế giới, tạo điều kiện cho ngành khoa học siêu âm được ứng dụng để làm phương tiện nghiên cứu bản chất hoặc tính chất của các đối tượng khác nhau trên cơ sở phân tích sóng siêu

âm về tác dụng vật lý, hóa học và sinh học của chúng Hiện nay trên thế giới đã chế tạo được các thiết bị siêu âm công suất từ 40W- 75KW, với dải tần số làm việc từ 20KHz-10MHz các thiết bị siêu âm công suất lớn được dùng để trích ly các sản phẩm sinh học quy mô lớn [16]

- Từ năm 1999 hãng Hielscher Ultrasonics của Đức đã sản xuất các mô đun đầu máy phát sóng siêu âm công xuất 1KW, 2KW, 4KW và 16KW để sử dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học như chiết suất dầu Biodiesel với mô đun thiết bị để chiết suất có công suất từ 200-750lít/giờ sử dụng đầu phát siêu âm 1KW, sử dụng

06 đầu phát sóng siêu âm loại 16KW

- Hãng Branson của Mỹ đã chế tạo thiết bị sản xuất dầu sinh học có sử dụng sóng siêu âm quy mô công nghiệp và cung cấp dầu trực tiếp cho người tiêu dùng

- Tại Ấn độ đã ứng dụng công nghệ siêu âm để để chiết suất các hợp chất tự nhiên như Actemisin, chè xanh, nghệ vàng… và thực nghiệm để so sánh với phương pháp thông thường được hãng chế tạo thiết bị siêu âm Telsonic AG thực hiện Kết quả cho thấy, sử dụng phương pháp chiết suất bằng sóng siêu âm có nhiều

ưu điểm hơn so với các phương pháp chiết suất thông thường, thể hiện qua nhiệt độ chiết suất thấp, số lần chiết suất ít hơn nên tiết kiệm được dung môi, thời gian chiết suất giảm từ từ 6-20 lần, hiệu suất thu hồi cao hơn từ 5-20% [19]

2.4.4.4 Một số kết quả nghiên cứu trích ly các hoạt chất sinh học từ nấm Linh

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu trích ly các hoạt chất đã được công bố như:

Zhao Li-Yan (2009 ) đưa ra quy trình trích ly Polysacharide bằng sóng siêu âm

với công suất 680 W, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 28/1, thời gian trích ly chỉ còn 17 phút

Xiao Ping Chen và cộng sự (2010), nghiên cứu nâng cao hiệu suất trích ly

Polysacharide trong nấm Linh chi bằng việc sử dụng sóng siêu âm có tần số 8 kHz trong nước ở 950C trong 3h Trong điều kiện này hiệu suất trích ly Polysacharide có thể tăng lên 42% đến 75% [27]

Gần đây trong nước cũng rất quan tâm và có khá nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi

Nhóm nghiên cứu của T.S Trương Thị Hòa (2001), trong nghiên cứu

“Trích ly hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi ” đã đã xác định được phương pháp

trích ly các hoạt chất sinh học sử dụng cho công nghệ sản xuất rượu bổ Phương pháp trích ly bằng cồn và sử dụng enzyme Novozyme 342 (hỗn hợp của enzyme cellulase và hemicellulase) đạt hiệu suất cao nhất (10,2%) ở điều kiên nhiệt độ

600C, nồng độ enzyme 0,21% trong 120 phút Ưu điểm của phương pháp trích lý bằng enzyme là cho hiệu suất trích ly cao, nhiệt độ trích ly thấp [6]

Theo kết quả của Nguyễn Thị Minh Tú (2009), trong nghiên cứu “Quy trình tách chiết các hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi ” với dung môi là nước quá trình

chiết đạt tối ưu ở nhiệt độ 800C, thời gian chiết 7h, tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là 1/20 thì hàm lượng chất chiết thu hồi đạt 6,91%.[10]

Những nghiên cứu về nấm Linh Chi tại Việt Nam tập trung chủ yếu vào điều tra, sưu tập, nêu đặc điểm phân loại, điều kiện sinh thái, quy mô nuôi trồng và các hoạt chất chính có trong nấm Linh Chi Tuy đã có sản phẩm sản xuất ở quy mô công nghiệp song giá thành còn quá cao

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidium) khô được nghiền nhỏ, kích thước ≤ 0,8

mm và có độ ẩm 12% do Viện Di truyền Nông nghiệp chuyển giao công nghệ và trồng tại Hợp tác xã Cựu chiến binh xã Long Hưng, huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu:

Thiết bị nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm của Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

- Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 12/2014-5/2015

3.3 Thiết bị và vật tư hóa chất nghiên cứu

3.3.1 Thiết bị và dụng cụ

- Thiết bị siêu âm (Ultrasonic LC 30, đức)

- Máy đo quang phổ (Zuzi 4110 ED Spectrophotometer, đức)

- Thiết bị trích ly cô chân không (Việt Nam)

- Tủ sấy (Grot DZ 47-63, Trung Quốc)

- Cân phân tích (Precisa XT 320 M, Thụy Sỹ)

- Cân kỹ thuật (Cent-0-Gram Balance, OHAUS, Mỹ)

- Nhiệt kế, bếp điện, giấy lọc, dụng cụ thủy tinh, bình tam giác, ống đong, bình định mức, phễu thủy tinh, pipet, micropipet buret,

3.3.2 Hóa chất nghiên cứu

- Các loại hóa chất phục vụ nghiên cứu, phân tích: Phenol, D-glucose, H2SO496%, axit ursolic, ethyl acetate, axit axetic, vanilin 5%, DPPH, MeOH

- Cỏ ngọt, đường lactose dùng trong chế biến thực phẩm

3.4 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định ảnh hưởng của một số điều kiện đến khả năng trích ly

Triterpenoid từ nấm Linh chi

- Xác định ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng trích ly Triterpenoidd

- Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng trích ly Triterpenoid

- Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năngtrích ly Triterpenoid

- Xác định ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến khả năng trích ly Triterpenoid

- Xác định ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến khả năng trích ly Triterpenoid

- Xác định ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly Triterpenoid

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của Triterpenoid

Nội dung 2 :Xác định ảnh hưởng của một số điều kiện đến khả năng trích ly Beta-

glucal từ nấm Linh chi

- Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng trích ly Beta- glucal

- Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly Beta- glucal

- Xác định ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến khả năng trích ly Beta- glucal

- Xác định ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến khả năngtrích ly Beta- glucal

- Xác định ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly Beta- glucal

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của Beta- glucal

Nội dung 3: Ứng dụng chế phẩm trích ly trong sản xuất viên nang thực phẩm chức

năng

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp phân tích

3.5.1.1 xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy khô đến trọng lượng không đổi

- Nguyên tắc: Sấy mẫu trong thời gian dài để tách lượng nước tự do và nước liên kết bên trong sản phẩm Trong quá trình sấy cần theo dõi và cân khối lượng mẫu đến khi khối lượng lần trước và lần sau nó không thay đổi thì dừng sấy Lượng nước trong nguyên liệu đã bay hết, phần còn lại là chất khô

- Công thức tính: Độ ẩm (W%) được tính theo công thức sau:

W (%) = 100

0 1

G G

Trong đó:

G1: Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi sấy (g)

G2: Khối lượng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g)

G0: Khối lượng chén sứ (g)

3.5.1.2 Phương pháp đo mật độ quang dịch chiết ( Theo TCVN 5367-91)

Dịch chiết thu được đem lọc sạch qua giấy lọc

Tiến hành: Bật máy đo quang phổ rồi để máy ổn định trong 10 phút Tráng cuvet bằng nước cất Trước khi đo mẫu cần đo bằng dung môi sử dụng để trích ly Sau đó, lấy khoảng 3 ml dịch chiết của mẫu cho vào cuvet, đo trên máy ở bước sóng tùy thuộc vào dịch trích ly

3.5.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng Beta-Glucal [29]

Lượng Beta- Glucanl được xác định bằng phương pháp phenol-sulfuric

Phương pháp phenol-sulfuric xác định Beta-Glucaldựa trên việc hấp thụ tại bước sóng 490 nm của phức chất tạo bởi phenol và cacbohydrate Hàm lượng Beta-Glucal được xác định bằng cách so sánh với một đường chuẩn Sử dụng máy quang phổ hấp thụ, chọn bước sóng 490 nm, xây dựng đường chuẩn, đo các mẫu phân tích Tùy từng điều kiện phương pháp phenol - sulfuric có độ chính xác đến ± 2% [33]

* Xây dựng đường chuẩn

Quy trình lập đường chuẩn Beta-Glucal như sau:

- Pha phenol 5%: Cân 5g phenol, hòa tan trong bình định mức 100ml bằng nước cất, sau khi phenol tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức

- Cân 1g D-glucose tinh khiết (chất chuẩn), hòa tan trong bình định mức 1lít bằng nước cất sau khi glucose tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức Ta có dung dịch chuẩn với nồng độ 1mg/ml (1000ppm)

- Từ dung dịch chuẩn ta pha thành dãy chuẩn với các nồng độ: 0,2mg/ml; 0,1mg/ml; 0,05mg/ml; 0,02mg/ml; 0,01mg/ml; tương ứng với các nồng độ 200ppm; 100ppm; 50ppm; 20ppm; 10ppm

- Lấy 5ml mỗi nồng độ chất chuẩn đưa vào các lọ 10ml

- Thêm lần lượt vào tất cả các lọ chuẩn 0,5ml dung dịch phenol 5% sau đó thêm lần lượt vào tất cả các lọ 2,5ml dung dịch H2SO4 96%

Chuyển dãy chuẩn ra các cuvet và đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng là 490

nm

* Kết quả xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn Beta-Glucal được dựng nhờ chương trình Microsoft Excel được thể hiện ở phụ lục 1 Với trục tung là mật độ quang và trục hoành là nồng độ chất chuẩn Phương trình thể hiện mối tương quan giữa Beta-Glucal và OD490 nm là

y = 0,006x + 0,0369

Trong đó x là hàm lượng Beta-Glucal trong 1 ml dịch(mg/ml), y là giá trị OD

490 nm tương ứng Hệ số tương quan r2 = 0,9995 chứng tỏ mối liên quan giữa x và

y là chặt chẽ

Dựa vào đường chuẩn, phương trình đường chuẩn y =0,006x + 0,0369 và kết quả đo quang phổ hấp thụ tại bước sóng 490 nm của các mẫu phân tích, xác định được nồng độ của các mẫu phân tích Hàm lượng Beta-glucal được xác đinh thông qua công thức dưới đây

* Tính toán xác định hàm lượng Beta- glucan trong sinh khối nấm Linh Chi

- Từ đường chuẩn xác định được nồng độ mẫu phân tích

- Hàm lượng glucan được tính theo công thức sau:

m: là khối lượng mẫu ban đầu đem phân tích

3.5.1.4 Phương pháp xác định hàm lượng trietrpenoid[23]

Lượng trietrpenoid được xác định bằng phương pháp đo mật độ chiết quang Phương pháp đo mật độ chiết quang dựa trên việc hấp thụ tại bước sóng 548,1 nm Hàm lượng triterpenoid được xác định bằng cách so sánh với một đường chuẩn Sử

dụng máy quang phổ hấp thụ, chọn bước sóng 548,1 nm, xây dựng đường chuẩn, đo các mẫu phân tích

* Xây dựng đường chuẩn

Quy trình lập đường chuẩn triterpenoid như sau:

- Cân chính xác 1,15 mg axit ursolic, hòa tan trong 10 ml ethyl acetate để xây dựng đường chuẩn với các nồng độ axit ursolic là 0; 0,20; 0,40; 0,60; 0,80; 1 và 1,20 mg dung dịch được làm khô ở 100 0C

- Sau đó thêm 0,40 ml dung dịch axit axetic và vanillin 5% -1 ml axit pecloric,

ở 600C trong 15 phút sau đó di chuyển nó vào bồn nước đá, thêm 5 ml axit axetic, đặt nó ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

- Xác định độ hấp thụ của nó trong 548,1 nm

Vẽ đường chuẩn dựa trên kết quả xác định Trọng lượng tiêu chuẩn trong phạm vi 0,14 mg cho thấy một mối quan hệ tuyến tính tốt với giá trị hấp thụ

0-* Kết quả xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn triterpenoid được dựng nhờ chương trình Microsoft Excel được thể hiện ở phụ lục 1 Với trục tung là mật độ quang và trục hoành là nồng độ chất chuẩn Phương trình thể hiện mối tương quan giữa triterpenoid và OD 548,1nm là:

* Tính toán xác định hàm lượng triterpenoid trong sinh khối nấm Linh Chi

- Từ đường chuẩn xác định được nồng độ mẫu phân tích

- Hàm lượng Triterpenoid được tính theo công thức sau:

Hàm lượng Triterpenoid (%) =

Trong đó:

X: số gam xác định từ đường chuẩn

V: thể tích dịch trích ly

n: là hệ số pha loãng

m: là khối lượng mẫu ban đầu đem phân tích

3.5.1.5 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa

- Nguyên tắc

Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa sẽ làm giảm màu của 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Xác định khả năng này bằng cách đo quang ở bước sóng có hấp thu cực đại tại λ = 515 nm

Hình 3.1 Công thức DPPH

- Tiến hành

Pha dung dịch DPPH 0,6 mM trong methanol (MeOH)

Các mẫu thử trích ly bằng ethanol và nước được tiến hành nghiên cứu ở 7 nồng độ: 2000 μg/ml, 1500 μg/ml, 1000 μg/ml, 500 μg/ml, 100 μg/ml, 50 μg/ml, 10 μg/ml (các mẫu pha trong dd DMSO)

0,5 ml mẫu thử ở các nồng độ khảo sát được cho phản ứng với 0,5 ml dung dịch DPPH Thêm MeOH vừa đủ 4 ml Hỗn hợp sau khi pha được để ở nhiệt độ phòng 30 phút Đo quang ở bước sóng λ = 515 nm

Acid ascorbic (Merck, Germany) được sử dụng làm chất đối chiếu

Đường chuẩn DPPH được dựng nhờ chương trình Microsoft Excel được thể hiện ở phụ lục 1 Với trục tung là mật độ quang và trục hoành là HTCO

- Tính kết quả

Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO %) được tính theo công thức:

HTCO % = [(ODchứng – ODthử) / ODchứng] × 100

OD chứng: mật độ quang của dung môi (MeOH)

ODthử: mật độ quang của mẫu thử

Các kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo khác nhau

3.5.1.6 Phương pháp đánh giá cảm quan

Đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm theo TCVN 3215:1979 Sản phẩm thực phẩm – Phân tích cảm quan – Phương pháp cho điểm Tổng số cảm quan viên cho mỗi thí nghiệm là 10 cảm quan viên Tiến hành tính toán điểm trung bình của các mẫu và xác định sự khác biệt về mức độ ưa thích giữa các mẫu theo thang điểm Hedonic (1 - 9)

Chỉ tiêu đánh giá: Màu sắc, mùi, vị, trạng thái của sản phẩm

3.5.2 Bố trí thí nghiệm

Tất cả công thức sử dụng 50g nấm Linh chi, và được lặp lại 3 lần

Phương pháp trích ly Beta glucal và Triterpenoid được thực hiện theo sơ đồ sau:

Nguyên liệu (nấm Linh chi)

Nghiền (kích thước ≤ 0,8 mm)

Bã Trích ly Tritecpenid Lọc dịch trích lý (ethanol) (chứa Triterpenoid)

Trích ly Beta-glucal

(nước cất)

Lọc dịch trích ly(có chứa Beta-glucal)

Cô chân không Cô chân không

Sấy chân không Sấy chân không

Chế phẩm Beta-glucal Trộn Chế phẩm Triterpenoid

Chế phẩm Linh chi

Phối chế Viên nang TPCN Nang thuốc

3.5.2.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng trích lyTriterpenoid từ nấm Linh chi

a, Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng trích

lyTriterpenoid từ nấm Linh chi

Sơ đồ 3.1 Phương pháp trích ly tTriterpenoid và Beta-glucal

Sơ đồ 3.1 Phương pháp trích ly Beta glucal và Triterpenoid

Sơ đồ 3.1 Phương pháp trích ly Beta glucal và Triterpenoid

Bố trí 4 công thức với nồng độ cồn là 95%, 90%, 85%, 80% , tỉ lệ nguyên

liệu/dung môi là 1/5, sử dụng sóng siêu âm ở tần số 20 kHZ, cường độ sóng siêu âm 8W/cm2, nhiệt độ 700C, thời gian xử lý sóng siêu âm là 6 phút, trích ly trong 1 giờ Chỉ tiêu : Hàm lượng Triterpenoid

b, Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích lyTriterpenoid từ nấm Linh chi

Bố trí 4 công thức khác nhau với nhiệt độ lần lượt là: 40, 50, 60, 70oC Nồng độ ethanol ở thí nghiệm 1, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/5 Sử dụng sóng siêu âm ở tần

số 20kHZ, cường độ 8W/cm2, thời gian xử lý sóng siêu âm là 6 phút, trích ly trong

lý sóng siêu âm là 6 phút, thời gian trích ly là 1giờ

liệu/dung môi ở thí nghiệm 3, cường độ sóng siêu âm ở thí nghiệm 4, sử dụng sóng siêu âm ở tần số 20 kH, thời gian trích ly là 1giờ

Bố trí 4 công thức khác nhau về tỷ nguyên liệu/nước cất là: 1/3, 1/4, 1/5, 1/6

Sử dụng sóng siêu âm ở tần số 20 kHZ, cường độ sóng siêu âm 8W/cm2, thời gian xử lý sóng siêu âm là 6 phút, thời gian trích ly là 1 giờ

Chỉ tiêu là: Hàm lượng Beta- Glucal

c, Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến khả năng trích ly Beta -Glucal từ nấm Linh chi

Bố trí 3 công thức khác nhau với cường độ là 4, 6, 8 W/cm2 Nhiệt độ ở thí nghiệm 1, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi nước cất ở thí nghiệm 2, sử dụng sóng siêu

âm ở tần số 20 kHZ, cường độ sóng siêu âm 8W/cm2, thời gian xử lý sóng siêu âm

nghiệm 3, thời gian xử lý sóng siêu âm là 6 phút, trích ly trong vòng 1 giờ

Chỉ tiêu là : Hàm lượng Beta-Glucal, DPPH

f, Thí nghiệm 6: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch trích ly Beta-glucal

Bố trí thí nghiệm như phần 3.5.1.5

3.5.2.3 Ứng dụng chế phẩm trích ly sản xuất viên nang Linh chi

a, Nghiên cứu lựa chọn công thức phối chế tạo sản phẩm viên nang Linh chi

Chúng tôi dự kiến trong viên nang Linh chi có các thành phần sau

- Chế phẩm Linh chi sau trích ly(trong 312mg chế phẩm Linh chi có 4,8mg Beta-glucal và 6,5mg Trterpenoid)

- Cỏ ngọt trích ly

- Đường lactose