Nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng môi trường và điều kiện nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối tạo rễ củ cây Ba kích (Morinda officinalis How)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN ĐÌNH HÙNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DINH DƯỠNG MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN SINH KHỐI TẠO RỄ CỦ CÂ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN ĐÌNH HÙNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DINH DƯỠNG MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN SINH KHỐI TẠO RỄ

CỦ CÂY BA KÍCH (Morinda officinalis How)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN ĐÌNH HÙNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DINH DƯỠNG MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN SINH KHỐI TẠO RỄ

CỦ CÂY BA KÍCH (Morinda officinalis How)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý, giúp đỡ của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong thời gian thực tập tốt

nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng môi

trường và điều kiện nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối tạo rễ củ cây Ba kích ( Morinda officinalis How)”

Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Nguyễn Thị Tình, Khoa

Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn tới Ths Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên đã dạy

dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho em trong suốt thời gian qua

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè lớp 44CNSH luôn ủng

hộ, động viên em để em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Do thời gian có hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của e được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, 15 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Đình Hùng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Phân loại khoa học Ba kích (Morinda officinalis How) [1] 4 Bảng 2.2 Các nguyên tố đa lượng và dạng sử dụng chính 14 Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ

rễ củ cây Ba kích tím sau 4 tuần nuôi cấy 25 Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối

rễ xủ Ba kích tím trên môi trường đặc (sau 30 ngày) 27 Bảng 4.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng tăng sinh khối rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc (sau 30 ngày) 30 Bảng 4.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả năng sinh trưởng và phát triển rễ củ Ba kích trên môi trường đặc (sau 30 ngày) 32 Bảng 4.5: Kết quả nghiên cứa hàm lượng đường đến khả năng tăng rễ củ Ba kích 35 Bảng 4.6: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tăng sinh khối

rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc (sau 30 ngày) 37 Bảng 4.7: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng tăng sinh khối

rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc (sau 30 ngày) 38 Bảng 4.8: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khố rễ củ Ba kích trong môi trường lỏng ( 40 ngày) 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và phát triển hệ rễ củ Ba kích tím (sau 30 ngày) 26 Hình 4.2: Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ củ

Ba kích tím trên môi trưởng đặc (sau 30 ngày) 29 Hình 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng tăng sinh khối rễ củ

Ba kích tím trên môi trường đặc (sau 30 ngày) 31 Hình 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ peptone đến khả năng tăng sinh khối rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc (sau 30 ngày) 34 Hình 4.5: Ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khối rễ Ba kích sau

40 ngày nuôi cấy ( A với 2 ống sục, B với 1 ống sục) 40

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

CT : Công thức

CV : Coeficient of Variation LSD : Least Singnificant Difference Test Đ/c : Đối chứng

MS : Murashige & Skoog (1962) B5 : Gamborg’s

MT : Môi trường

TB : Trung bình KLRT : Khối lượng rễ tươi

MỤC LỤC

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu về cây Ba kích 4

2.1.1 Phân loại khoa học 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố 4

2.1.3 Gía trị của cây Ba kích tím 6

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 8

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 8

2.2.2 Tình hình Nghiên cứu trên thế giới 9

2.3 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.3.1 Nuôi cấy mô – tế bào thực vật 9

2.3.2 Các cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào 10

2.3.3 Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô -tế bào thực vật 11

2.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 13

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 18

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

3.1.2 Hóa chất sử dụng 18

3.1.3 Thiết bị nghiên cứu 18

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 18

3.2.1 Địa điểm 18

3.2.2 Thời gian tiến hành 19

3.3 Nội dung nghiên cứu 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu và chỉ tiêu theo dõi 20

3.4.1 Phương pháp nghiên cứu 20

3.4.2 Chỉ tiêu theo dõi và đánh giá 24

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ củ cây Ba kích 25

4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng tăng sinh khối của rễ củ cây Ba kích tím trên môi trường đặc 27

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc 27

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và phát triển rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc 29

4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ pepton đến khả năng tăng sinh khối rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc 32

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng rễ củ Ba kích 34

4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ và ánh sáng đến khả năng tăng sinh khối rễ củ Ba kích tím 36

4.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tăng sinh khối rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc 36

4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rể củ Ba kích tím trên môi trường đặc 38

4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khối rễ củ Ba kích trong môi trường lỏng 40

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Kiến nghị 42

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Từ bao đời nay, ông cha ta đã biết đến và sử dụng nguồn thảo dược trong tự nhiên để phòng và chữa nhiều bệnh

Ba kích (Morinda officinalis How), họ Cà phê – Rubiaceae còn có tên khác

là Dây ruột gà, ba kích thiên, liên châu ba kích, chẩu phóng xì, sáy cáy (Thái), thau tày cáy (Tày), chồi hoàng kim, chày kiafng đòi (Dao) Là cây dây leo bằng thân quấn, sống nhiều năm Cây thường mọc hoang ở vùng đồi, núi thấp các tỉnh trung

du, miền núi phía Bắc nước ta như: Lạng Sơn, Hà Giang, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hòa Bình và Quảng Ninh… [15] [22]

Ba kích được sử dụng và biết đến như là một loại thảo dược quý hiếm.Theo Đông y, ba kích vị cay, chát, ngọt, tính ôn, vào kinh thận và được sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu quý Trong rễ Ba kích chứa một số thành phần như phytosterol, anthraglycosid, đường nhựa, axit hữu cơ, saccharid có tác dụng bổ thận

âm, bộ thận dương, tăng cường gân cốt, khử phong thấp Bên cạnh đó dịch chiết cồn

từ củ cây Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ năng, bổ trí nảo,giúp ăn và ngủ ngon [22]

Ngày nay, con người đã biết đến và sử dụng loài cây này làm dược liệu, có giá trị kinh tế cao 250000 – 300000 nghìn/kg Vì vậy chúng đang bị khai thác bừa bãi có nguy cơ bị khai thác cạn kiệt và suy giảm về mặt chất lượng cũng như số lượng Mặt khác, hàng ngàn heta trồng ba kích bị mắc bệnh vàng lá thối rễ gây thất thoát lớn cho người dân và cho thị trường [26] Nguồn cung cấp cây giống Ba kích hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm cành nhưng hệ số nhân rất thấp (chỉ đạt 0,61/năm); chất lượng giống lại không cao và còn phụ thuộc và điều kiện ngoại cảnh, đặc biệt là khả năng thoái hóa giống cao ảnh hưởng đến giá trị dược liệu của cây [2] Cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật trong và ngoài nước nói chung và ngành công nghệ sinh học nói riêng thì sự xuất hiện phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đã và đang giải quyết vấn đề về chất lượng và số lượng giống cây nói

riêng, bên cạnh đó giải quyết những hạn chế của phương pháp truyền thống Đây là một phương pháp tối ưu để tạo ra một số lượng lớn, đồng đều và sạch bệnh trong thời gian ngắn với so với ngoài tự nhiên là 3 -5 năm Xuất phát từ thực tiễn này

chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng môi trường

và điều kiện nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối rễ của cây Ba Kích tím” (Morinda officinalis How)”

1.2 Mục đích

- Nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng môi trường và điều kiện nuôi cấy

đến khả năng tạo rễ củ và nhân sinh khối rễ củ cây Ba Kích tím(Morinda officinalis How) bằng phương pháp in vitro

1.3 Yêu cầu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng sinh trưởng và

phát triển hệ rễ củ Ba kích tím

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất hữu cơ đến khả năng tăng sinh

khối rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng sinh khối

rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng đến khả năng tăng sinh

khối rễ củ cây ba kích tím trên môi trường đặc

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân nhanh sinh

khối rễ củ Ba kích tím trên môi trường lỏng

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Từ quá trình nghiên cứu giúp cho sinh viên cũng cố lại kiến thức đã học vào thực tiễn

- Đồng thời năng cao kỹ năng để tiếp cận công tác nghiên cứu khoa học phục

vụ cho sau này

- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích

số liệu

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp xác định được môi trường cũng như điều kiện nuôi cấy nhân sinh khối rễ củ giống ba kích tím bằng phương pháp nuôi cấy mô thích hợp

- Góp phần sản xuất nhanh các sản phẩm có hoạt tính sinh học trong điều kiện phòng thí nghiệm thúc đẩy lĩnh vực sản xuất thực phẩm chức năng

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây Ba kích

2.1.1 Phân loại khoa học

Ba kích tím thuộc họ Cà phê – Rubiaceae còn có tên khác là Dây ruột gà, ba

kích thiên, liên châu ba kích, chẩu phóng xì, sáy cáy (Thái), thau tày cáy (Tày), chồi hoàng kim, chày kiafng đòi (Dao) Thuộc chi Morinda và Việt Nam có trên 90 chi, khoảng 430 loài [15]

Bảng 2.1: Phân loại khoa học Ba kích (Morinda officinalis How) [1]

Ba kích có các đặc điểm sau: là loại cây thảo, sống lâu năm, dạng dây cuốn vào giá thể Ngọn non có màu nhiều lông tơ nhỏ trên mặt lá Cành Ba kích non có cạnh, lá mọc đối nhau hình mác hoặc hình dục thuôn nhọn, lá cứng dài từ 6cm – 14cm và có chiều rộng từ 2,5cm – 6cm Khi non mầm Ba kích có màu xanh lúc, khi già có màu trắng giống như mốc Phiến lá hình elip thuôn dài Lá mỏng ôm sát vào thân [23]

Hoa Ba kích nhỏ lúc đầu màu trắng sau đó chuyển sang màu vàng nhạt, thường tập trung ở tán đầu cành dài từ 0,3cm – 1,5cm có hình chén hoặc hình ống Mùa hoa Ba kích từ tháng 5 đến tháng 6 [23]

Qủa Ba kích có hình cầu, quả non có màu xanh khi chín có màu cam đỏ Mùa quả Ba kích là từ tháng 7 đến tháng 10 [23]

Rễ có thịt đầy, hình trụ tròn, cong queo, thắt thành từng đoạn nhƣ ruột gà Thân hình trụ tròn, phân nhiều nhánh Cành non có long thô màu nâu khi già nhẵn không lông [23]

Hình 2.1: Cây Ba kích tím (Morinda officinalis How)

Ba kích thuộc chi Morinda có trên 90 loài, tùy vào đặc điểm sinh học nó phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới Đặc điểm của một số loài:

Ba kích tím: cây thảo, sống lâu năm, leo bằng than cuốn Rễ hình trụ, mập, vặn vẹo, có nhiều vân dọc, thịt bên trong màu tím hay hồng Lá mọc đối xứng , hình bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng Cành non có cạnh, than non màu tím có lông, hình tròn trơn, màu xám.[ 23]

Morinda persic ifolia Buchannan Hamilton: cây nhỏ, cành lá sum sê, gốc thuôn hoặc tròn, lá mọc đối nhau, phiến lá đôi khi sẻ thùy Cụm hoa mọc đối diện

Morinda citrifoliaL: cây nhỡ, cao 6-8m Thần cành nhẵn, cành non mập, có 4 cạnh rõ Lá mọc đối hình bầu dục hoặc hình trứng, gốc thuôn hoặc hình nêm Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đối diện với lá thành đầu tròn, hoa màu trắng sau vàng nhạt

b, Phân bố

Cây Ba kích mọc hoang ở hầu hết hết các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Hà Giang, Thái Nguyên, Bắc Kạn, Lào Cai, Yên Bái, Phú Thọ, Lai Châu, Thanh Hóa, Nghệ An Ngoài ra còn có ở Trung Quốc, Ấn Độ, Triều Tiên, Lào.[23]

c, Điều kiện sinh thái

Cây thích ứng rộng với điều kiện sinh thái Cây ưa sáng, chịu bóng Khi cây non là cây ưa bóng khi cây lớn là cây ưa sáng Cây sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ 22- 25 °C, chịu được nhiệt độ tối thấp -3°C và tối cao là 42°C Độ ẩm không khí từ 82 – 89% Ba kích ưa đất feralit đỏ vàng và đất feralit giàu mùn, đất thịt ẩm mát Cây sinh trưởng sau 5 – 7 năm mới thu được dược liệu [22]

2.1.3 Gía trị của cây Ba kích tím

của người dân

Ba kích là loại cây leo dễ trồng, ưa sáng, ưu ẩm và chịu bóng, trồng bằng rễ Cây phát triển tốt trên đất đồi, đất vườn, sườn núi, có thể xen canh với cây lầm

nghiệp khác rất phù hợp với điều kiện nước ta

Hiện nay Ba kích có giá trị kinh tế rất cao Bình quân cây sinh trưởng sau 3 đến 5 năm mới thu dược liệu, năng suất bình quân 3kg củ tươi/gốc, giá thì trường 250.000 – 300.00/1kg Như vậy ngoài việc cây Ba kích không những có giá trị kinh

tế cao mà nó còn có ý nghĩa là cây dược liệu cần được bảo tồn

2.1.3.2 Gía trị dược liệu

Cây Ba kích thuộc họ Ca phê (Rubiaceae), là cây thảo dược có chưá nhiều hoạt chất có giá trị dược liệu chữa bệnh Ba kích có tác dụng hạ huyết áp, bổ gân cốt, trị liệt dương, bổ thận tráng dương, cường gân cốt, trừ phong thấp… Chủ trị

chữa đau mỏi xương khớp, thận dương suy, liệt dương…[20]

Đối với người cao tuổi Ba kích tím có tác dụng với các bệnh nhân mệt mỏi,

kém ăn, ít ngủ, dịch chiết Ba kích có tác dụng tăng lực, tăng cân, tăng cơ lực

Theo kinh nghiệm y học cổ truyền: Ba kích có vị ngọt, hơi cay có vị chát Có tác dụng ổn thận dương, cường gân cốt, trừ phong thấp Ngoài ra còn có tác dụng tang khả năng hoạt động sinh dục nam giới, sức dẻo dai Có khả năng trị vô sinh ở nam giới Ba kích còn có tác dụng tăng lực cho bênh nhân tuổi già, suy nhược cơ

thể, kém ăn và mệt mỏi [22]

Theo các tài liệu khác Ba kích còn có tác dụng chữa dương ủy, đau mỏi lung gối, gân cốt yếu mềm Nó còn được dùng như vị thuốc bổ não, tinh khí, chữa liệt

dương, xuất tinh sớm, phụ nữ kinh nguyệt không đều

Nhiều thí nghiệm lâm sàng gây viêm bằng kaolin gở chuột cống trắng cho

thấy Ba kích có tác dụng chống viêm rõ

Theo các nghiên cứu đã công bố trong rễ Ba kích có chưa các thành phần hóa học có các chất như: anthraglycosid, iridoid glycosid, đường nhựa, axit hữu cơ, phytosterol, saccharid, tinh dầu các sterol, các chất vô cơ như K, Na, Mg, Fe, Cu,

Zn… Rễ tươi còn chứa Vitamin C [25]

Theo y học hiện đại Ba kích có các tác dụng như: [25]

Tác dụng tăng lực: bằng phương pháp chuột bơi thực hiện trên chuột nhắt

trắng, dịch chiết Ba kích có tác dụng kéo dài thời gian bơi của chuột

Tác dụng chống độc: dùng phương pháp gây độc bằng amino clorua NH4Cl trên chuột nhắt bằng đường uống trước khi tiêm NH4Cl Ba kích có khả năng tăng

sức đề kháng của cơ thể với các chất gây độc

Tác dụng chống viêm: khi tiêm nhũ dịch kaolin 10% vào chuột trắng gây

phù chân, dịch chiết Ba kích có tác dụng chống viêm rõ rệt

Tác dụng giảm stress và hạ đường huyết: các oligosaccharide của Ba kích có

tác dụng chống stress trên chuột

Tác dụng dự phòng thiếu máu cục bộ: được thí nghiệm trên chuột cống trắng

bị tổn thương, cơ chế liên quan tới tăng canxi và các gốc tự do cho thấy dịch chiết

Ba kích có tác dụng dự phòng thiếu máu cục bộ

Tác dụng trên xương: Ba kích có tác dụng liên quan đến việc điều chỉnh và

sự hình thành xương, tăng sinh tế bào in vitro, ngăn ngừa và điều trị bệnh tiêu xương nhờ các chất Anthraquinon và polysaccharide Ngoài ra còn có tác dụng

giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa…

Tác dụng trên hệ nội tiết: được thí nghiệm trên chuột cống trắng đực chứng

tỏ Ba kích có khả năng tăng cường hoạt động của androgen hoặc tăng cường quá trình tiết hormone androgen Ngoài ra còn có tác dụng tăng cường co bóp ruột, hạ

huyết áp

Tác dụng chống oxy hóa: dịch chiết Ba kích có tác dụng chống oxy hóa nhờ

có các gốc tự do là ion superoxide và gốc hydroxyl

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam cũng đã có nhiều nhà khoa học tiến hành nuôi cấy mô Ba kích nhằm nhân giống và tăng năng suất cũng như góp phần bảo tồn loài Ba kích tím

khỏi nguy cơ tuyệt chủng như:

Năm 2010, Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây Ba kích Tái sinh chồi trên môi trường cơ bản MS bổ sung 0,25mg/l kinetin Đoạn thân được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất kích thích sinh trưởng khác nhau cho cảm ứng rễ Số chồi phát triển tốt trên môi trường MS bổ sung 3,5mg/l BA + 0,2mg/l IBA Chồi được tạo rễ trên môi trường MS bổ sung

NAA và IBA, ở môi trường MS bổ sung 0,2-0,25 mg/l IBA cho kết quả cao nhất

Năm 2012, Hoàng Thị Thế đã nghiên cứu nhân giống cây Ba kích bằng

phương pháp nuôi cấy mô

Năm 2015, Mai Thị Phượng trường Đại Học Dược Hà Nội đã nghiên cứu

cây Ba kích tím ở Ba Chẽ và xây dựng tiêu chuẩn thương phẩm Ba kích

Năm 2005, Ts Phạm Văn Hiển và ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume.)

có chất lượng cao bắt nguồn từ in vitro đã xây dựng được quy trình nhân nhanh in vitro cây Ba kích từ lát cắt đốt thân và ngọn với hệ số nhân 20 4 năm, tỷ lệ ra rễ in

vitro đạt >90%, tỷ lệ ra rễ ex vitro đạt 100%, tỷ lệ sống sau khi ra bầu đạt 70-80% 2.2.2 Tình hình Nghiên cứu trên thế giới

- Trung Quốc, Nhật Bản,Hàn Quốc, Việt Nam, Singapore các nước này đang nghiên cứu tách chiết cây thuốc từ nguồn rừng tự nhiên và rừng trồng Đã có

nhiều công trình nghiên cứu về việc xác định thần phần hóa học của Ba kích

- Năm 1995 nhóm tác giả người Nhật Bản Yoshikawa M, Yamaguchi S, Nishi H, Yamahara J, Murakami N, đã nghiên cứu thành phần hóa học thuốc kháng

sinh tự nhiên của rễ khô cây Ba kích

- Nhóm tác giả Singapore, Y Y Soon, BSc, (PHarmacy) (Hons), B K H Tan, PHD, MBBS, năm 2002 đã nghiên cứu sự giảm gluco huyết và sự chống lại oxy hóa

của Streptozotocin-induced gây ra bệnh tiểu đường của chuột

- Nhóm tác giả người Trung Quốc Li YF, Gong DH, Yang M, Zhao YM, Luo

ZP, năm 2003 đã tiến hành nghiên cứu về ngăn chặn của Oligosaccharidesextracted từ

Ba kích nguồn thuốc thảo dược tự nhiên của Trung Quốc

- Huang NZ, Fu CM, Zhao ZG, Tang FL, Li F (2007) Tisue culture and rapid proliferation of Morinda offcinalis How Guihaia nghiên cứu chất điều hòa

sinh trưởng đến khả năng tăng sinh và kéo dài và khả năng tạo rễ

2.3 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.1 Nuôi cấy mô – tế bào thực vật

Nhân giống bằng nuôi cấy mô là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phận của cây mẹ ( các cơ quan, mô, tế bào ) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng tuyệt đối có môi trường thích hợp và được kiểm

soát [12]

Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ( nuôi cấy chóp đỉnh và chồi bên)

Nuôi cấy mô sẹo

Nuôi cấy hạt phấn

Nuôi cấy protoplast – chuyển gen

Nuôi cấy tế bào đơn thu nhận các chất có hoạt tính sinh học

Ưu điểm chính của nuôi cấy mô là cây được trẻ hóa cao và có rễ giống như cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt Có

hệ số nhân cao hơn nhân giống hom, ngoài ra còn là một biện pháp làm sạch bệnh

Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc

khó nhân giống bằng phương pháp khác [15]

2.3.2 Các cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào

 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể Trong điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh [15] Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ

 Sự phân hóa và phản phân hóa

Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào

tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một

số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào

2.3.3 Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô -tế bào thực vật

2.3.3.1 Giai đoạn chuẩn bị

Đây là bước ñầu tiên của quy trình nhân giống Giai đoạn này gồm các khâu như: chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu, chọn cơ quan để lấy mẫu Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Sau ñó chọn chế độ khử trùng thích hợp làm sao để mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, đồng thời khả năng sinh trưởng và phát triển vẫn tốt Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các tác nhân hóa học có tính chất sát trùng mạnh như cồn 70%, HgCl2, NaOCl…[11] để khử trùng mẫu Nồng độ chất khử trùng được chọn trên cơ sở thực tiễn thí nghiệm, theo nguyên tắc

mô non nồng độ thấp, mô già nồng độ cao, có nhiều trường hợp phải phối hợp hai

hay nhiều chất khử trùng với nhau Cũng có thể bổ sung các chất kháng nấm và vi khuẩn vào môi trường nhằm tăng hiệu quả khử trùng Thời gian khử trùng ñược xác ñịnh bằng thực nghiệm ñối với từng loài cây hoặc mô nuôi cấy Nhìn chung, mô non khử trùng trong thời gian ngắn, mô già trong thời gian dài hơn

2.3.3.2 Giai đoạn nuôi cấy khởi động

Sau khi khử trùng, ta đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mô cấy Môi trường này được xác lập cho từng loại cây, loại mô nuôi cấy Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ ở phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu sẽ xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính Đây sẽ là những vật liệu khởi đầu để cho quá trình nhân nhanh tiếp sau đó

2.3.3.3 Giai đoạn nhân nhanh

Một khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi, các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn nhân nhanh Người ta cần thu được tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường đã được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu này Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong khoảng 1-2 tháng tùy mỗi loại cây và nhìn chung cho cả giai đoạn nhân nhanh là vào khoảng 10-36 tháng

2.3.3.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải ñược cấy sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ, ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân đối về thân, lá,

rễ để đạt tiêu chuẩn của một cây giống

2.3.2.5 Giai đoạn vườn ươm

Đây là giai đoạn đánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống in vitro khi chuyển cây từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên Khi đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm, nhằm giảm đi hiện tượng “sốc” do thay đổi

về ñiều kiện môi trường cần có giai đoạn thích nghi Quá trình thích nghi với điều

kiện bên ngoài của cây yêu cầu sự chăm sóc đặc biệt, do đó ở giai đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và trong điều kiện cách ly bệnh để các cây con đạt tỷ

lệ sống cao

2.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.4.1 Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay

bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…) [11] [15]

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy [11]

2.3.6.2 Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng [11]

- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định

về ánh sáng và nhiệt độ [11]

2.3.6.3 Môi trường dinh dưỡng

Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng

và phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy Thành phần và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng tùy thuộc loại mẫu

và mục đích nuôi cấy nhưng đều gồm các thành phần chính sau:

- Nguồn Cacbon

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức

dị dưỡng mặc dù chúng có thể sống bán dị dưỡng trong điều kiện ánh sánh nhân tạo

và lục lạp vẫn có khả năng quang hợp Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi

cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Nguồn cacbon thông dụng nhất hiện nay là saccharose, ngoài ra có thể sử dụng glucose, maltose [10]

- Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố N, P, K, Mg, Ca, Na,

Phospho Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng

như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường Kali Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O

Canxi Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O

Magie Sử dụng chủ yếu là MgSO4

Lưu huỳnh Chủ yếu là SO4

- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni… các nguyên tố vi lượng tuy bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy

 Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp [11]

 Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hydratcacbon [11]

- Các chất hữu cơ tự nhiên

Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường,

các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin…[11]

Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid [11]

Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B [11]

Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh…[11]

- Các thành phần khác

Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm có một số chất hữu

cơ như acid hữu cơ, acid béo; cùng 1 số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn… Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường agar cũng cung cấp 1 số chất dinh dưỡng cho tế

bào, mô nuôi cấy [11]

Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế

sự sinh trưởng của mẫu nuôi cấy Ngoài ra, có thể sử dụng 1 số chất chống oxy hóa

khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic [11]

- pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng từ 5,5-6,0 Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ

- Các chất điều hòa sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hòa sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy [11]

Dựa vào hoạt tính sinh lý phân chất điều hòa sinh trưởng thành 2 nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trường và nhóm chất ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy

mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng [12]

Nhóm Auxin: Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách) Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì-nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ và biểu bì Ngoài ra, auxin còn có tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá [13]

Các auxin thường được sử dụng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (auxin tự nhiên) Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân hủy trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus [11]

Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim Zeatin có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi Cytokinin cảm ứng sự hình thành

chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin Ngoài ra, cytokinin còn làm chậm sự già hóa [13]

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin với tỷ lệ thích hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền với nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea…[11]

Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938 Gibberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây

Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [11]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Ðối týợng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

3.1.1 Ðối týợng nghiên cứu

- Đối tượng là rễ củ Ba kích tím thu thập tại vườn nuôi khoa CNSH – CNTP

- Pepton, cao nấm men

3.1.3 Thiết bị nghiên cứu

- Cân phân tích Olhous – Vietlabcu

- Máy đo pH Hanna HI2210

- Máy đo nhiệt độ

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí nghiệm nuôi cấy mô thế bào thực vật Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm

3.2.2 Thời gian tiến hành

Từ tháng 14/11/2015 đến 14/05/2016

3.3 Nội dung nghiên cứu

 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng

phát triển hệ rễ củ cây Ba kích tím

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, ½ MS, B5, ½ B5 đến khả năng phát triển hệ rễ củ cây Ba kích

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng tăng sinh

khối của rễ củ cây Ba kích tím

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc

- Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng cao nấm men đến khả năng tăng sinh khối rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc

- Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng pepton đến khả năng tăng sinh khối rễ

củ Ba kích tím trên môi trường đặc

 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng rễ củ Ba kích tím

 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, ánh sáng đến

khả năng tăng sinh khối rễ củ cây Ba kích tím

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tăng sinh khối rễ củ Ba kích tím

- Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng tăng sinh khối rễ củ Ba kích tím

 Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân

nhanh sinh khối rễ củ cây Ba kích tím trên môi trường lỏng

3.4 Phýõng pháp nghiên cứu và chỉ tiêu theo dõi

3.4.1 Phýõng pháp nghiên cứu

 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi

trường MS, ½ MS, B5, ½ B5 đến khả năng phát triển hệ rễ củ cây Ba kích tím (sau

30 ngày nuôi cấy)

- Sử dụng môi trường nền là MS, ½ MS, B5, ½ B5 + đường 30 g/l + agar 5 g/l, pH = 5,6-5,8

- Sau khi khử trùng box và dụng cụ, mẫu sạch được lấy trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa CSNH & CNTP đưa vào môi trường nuôi cấy bề mặt sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ phòng từ 22-

25oC, độ ẩm 60-65%, chu kỳ chiếu sáng 16h sáng/8h tối Tiến hành theo dõi, chất lượng rễ, sau 30- 40 ngày

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, ½ MS, B5, ½ B5

đến khả năng phát triển hệ rễ củ cây Ba kích tím

 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu

cơ đến khả năng tăng sinh khối rễ củ cây Ba kích tím trên môi trường đặc

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến khả năng

tăng sinh khối rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc

Gỉa sử chọn được môi trường tốt nhất đã được chọn ở thí nghiệm 1là A, kết hợp với các hàm lượng nước dừa khác nhau

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 1 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả năng

tăng sinh khốicủ Ba kích tím trên môi trường đặc

- Bố trí thí nghiệm

Gỉa sử chọn ra được môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 2 làm môi trường nền (

B ), kết hợp với các hàm lượng cao nấm men khác nhau

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 1 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng pepton đến khả năng tăng

sinh khối rễ củ Ba kích tím trên môi trường đặc

- Bố trí thí nghiệm

Gỉa sử dụng chọn ra được môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 3 là C làm môi

trường nền, kết hợp với các hàm lượng peptone khác nhau

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 1 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ

- Thời gian theo dõi: 30 ngày

- Chỉ tiêu đánh giá: chất lượng rễ, Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng

 Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ và ánh sáng đến khả năng ra rễ củ Ba kích tím

Gỉa sử môi trường thích hợp nhất được chọn làm thí nghiệm 5 là F.Chọn những mẫu sống, không nhiễm để tiến hành thí nghiệm

- Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 CT, mỗi CT nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 bình, mỗi bình 1 mẫu

- Thời gian theo dõi: 30 ngày

- Chỉ tiêu đánh giá: Khối lượng rễ TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến khả năng ra

rễ củ Ba kích tím

Thí nghiệm được thực hiện như sau:

Công thức Môi trường Nhiệt độ ( oC )

Thí nghiệm được thực hiện như sau: