Phát hiện nhanh bệnh greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

Em được thực tập tại phòng thí nghiệm của Khoa CNSH – CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài: „„Phát hiện nhanh bệnh greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt N

- -

LÊ THỊ SINH

Tên đề tài:

PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI

Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoá học : 2012 – 2016

THÁI NGUYÊN - 2016

- -

LÊ THỊ SINH

Tên đề tài:

PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI

Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoá học : 2012 – 2016 Giảng viên : ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH-CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái

Nguyên Em được thực tập tại phòng thí nghiệm của Khoa CNSH – CNTP, trường

Đại học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài: „„Phát hiện nhanh bệnh greening trên

cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam’’ để hoàn thành khóa luận này ngoài

sự nỗ lực của bản thân em còn nhận được nhiều sự giúp đỡ của Ban giám hiệu

trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, cùng

các thầy cô giáo đã tận tình giảng dạy cho em suốt 4 năm học

Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Ban giám hiệu

trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, cùng

các thầy cô giáo đã tận tình giảng dạy cho em suốt 4 năm học vừa qua để em có thể

hoàn thành khóa luận

Đặc biệt, em xin được bày tỏ lòng kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc tới ThS

Bùi Đình Lãm người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến KS Lã Văn Hiền đã dành

rất nhiều thời gian quý báu trực tiếp hướng dẫn em thực hiện nghiên cứu đề tài

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã quan

tâm, ủng hộ và động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu giúp em

hoàn thành tốt khóa luận này

Do điều kiện và thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những thiếu sót

Kính mong thầy cô giáo và các bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài

của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 5 năm 2016

Sinh Viên

Lê Thị Sinh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Các loài cam, quýt có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất 6

Bảng 2.2: Tình hình sản xuất cây có múi ở các châu lục trên thế giới giai đoạn 2011 - 2013 14

Bảng 2.3: Diện tích, năng suất và sản lượng cây có múi trên thế giới giai đoạn 2005 – 20013 16

Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cây có múi của nước ta giai đoạn 2005 – 2013 16

Bảng 2.5: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các vùng của nước ta năm 2009 17

Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi để phát hiện tác nhân gây bệnh greening (Hung và cs, 1999b), (Hung và cs, 2004) [34], [35] 28

Bảng 3.2: Các trang thiết bị máy móc dùng trong thí nghiệm 29

Bảng 3.3: Bảng thu thập mẫu tại các địa phương 30

Bảng 3.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 32

Bảng 4.1: Kết quả thu thập mẫu vật liệu 36

Bảng 4.2: Kết quả đánh giá mẫu cam sành tỉnh Hà Giang 38

Bảng 4.3: Kết quả đánh giá mẫu cam vinh Thái Nguyên 39

Bảng 4.4: Kết quả giám định bệnh vàng lá greening 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Rầy chổng cánh Diaphorina citri 19

Hình 2.2 Triệu trứng nhiễm bệnh vàng lá greening trên cây có múi 21

Hình 4.1 Mẫu lá cây có múi thu thập để giám định bệnh vàng lá greening 37

Hình 4.2 Kết quả tách chiết DNA tổng số 40

Hình 4.3 Điện di sản phẩm PCR mẫu lá giám định bệnh greening 41

Hình 4.4 Kết quả tinh sạch mẫu lá cam 44

Hình 4.5 Kết quả giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ lá cam Vinh (Xã Quyết Thắng – tp Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) 45

Hình 4.6 Kết quả giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA tách từ lá cam sành (Quang Bình – Hà Giang) 45

Hình 4.7 Kết quả giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA tách từ lá cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lương, tp Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) 45

Hình 4.8 Kết quả so sánh trình tự gen sản phẩm PCR trên BLAST với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ lá cam Vinh (Xã Quyết Thắng – tp Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) 46

Hình 4.9 Kết quả so sánh trình tự gen sản phẩm PCR trên BLAST với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ lá cam Sành (Quang Bình – Hà Giang) 47 Hình 4.10 Kết quả so sánh trình tự gen sản phẩm PCR trên BLAST với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ lá cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lương, tp Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) 47

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

Trang

Phần 1:MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu nghiên cứu 2

1.4 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.5 Ý nghĩa của đề tài 3

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.5.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 3

Phần 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về cây có múi 4

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4

2.1.1.1 Nguồn gốc 4

2.1.2 Đặc điểm sinh học của cây có múi 7

2.1.3 Giá trị của cây có múi 9

2.1.4 Yêu cầu sinh thái của cây có múi 10

2.1.5 Một số sâu bệnh hại trên cây có múi 12

2.1.6 Tình hình sản xuất cây có múi 14

2.2 Bệnh vàng lá Greening trên cây có múi 18

2.2.1 Lịch sử của bệnh 18

2.2.2 Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh 18

2.2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá greening 21

2.2.4 Một số biện pháp phòng tránh 23

2.3 Tình hình nghiên cứu về phát hiện bệnh greening trên cây có múi 23

2.3.1 Các nghiên cứu về phát hiện bệnh trên thế giới 23

2.3.2 Các nghiên cứu về phát hiện bệnh ở Việt Nam 26

Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.1 Vật liệu nghiên cứu 28

3.1.1 Vật liệu thực vật 28

3.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 28

3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 29

3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 29

3.2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 29

3.3 Nội dung nghiên cứu 30

3.4 Phương pháp nghiên cứu 30

3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu vật liệu 30

3.4.2 Phương pháp xác định sự biểu hiện của bệnh greening thông qua sự biểu hiện bên ngoài 31

3.4.3 Phương pháp phát hiện bệnh greening trên cây có múi bằng kỹ thuật PCR 31

3.4.4 Giải trình tự gene của sản phẩm PCR 33

3.4.5 Phương pháp sử lý số liệu 35

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Kết quả thu thập mẫu vật liệu 36

4.2 Kết quả xác định mức độ biểu hiện của bệnh 37

4.2.1 Kết quả xác định sự biểu hiện của bệnh thông qua các triệu chứng bên ngoài 37

4.3 Kết quả giám định bệnh vàng lá greening bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu 40

4.3.1 Tách chiết DNA tổng số mẫu lá 40

4.3.2 Kết quả nhân đoạn gen 16s rDNA 40

4.4 Kết quả giải trình tự gen của sản phẩm PCR từ mẫu lá bị bệnh greening 44

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

I Tiếng Việt 50

II Tiếng Anh 52

III Tài liệu Internet 55 PHỤ LỤC

Bệnh greening là nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng của cây (Lê Mai Nhất, 2014) [11] Bệnh lan truyền với tốc độ nhanh và gây hại nghiêm trọng cho nhiều vùng trồng cam quýt trên thế giới Sản lượng quả bị giảm từ 30% đến 100% (Bassanezi R.B và cs, 2005) [25] Ở Việt Nam, bệnh greening được ghi nhận gây hại trên cây ăn quả có múi từ những năm 1960 Bệnh greening gây hại lớn nhất vào các năm 1970 và 1990 ở các nông trường trồng cam Mức độ thiệt hại trên bưởi từ 17% – 25% và trên cam quýt từ 54% – 70% (Vien N.V và cs,2009) [50] Bệnh vàng lá greening là bệnh hại quan trọng nhất, khốc liệt nhất, nguy hiểm nhất, nghiêm trọng nhất, hủy diệt nhất và tàn phá nặng nề nhất đối với nghề trồng cây ăn quả có múi trên thế giới (Su và cs., 2012) [44] Đặc trưng của bệnh Greening là có thời gian ủ bệnh dài, nên rất khó phát hiện bệnh ở giai đoạn đầu và thường hay nhầm lẫn với bệnh khác như khi cây bị thiếu kẽm (Zn) (Lê Mai Nhất, 2014) [11] Đến khi bệnh biểu hiện rõ ràng thì bệnh đã tàn phá rất nặng và các biện pháp chữa trị gần như là vô nghĩa trong lúc này, rất nhiều biện pháp đã được thực hiện nhưng vẫn không mang lại hiệu quả Hơn nữa, vi

khuẩn gây bệnh vàng lá đến nay đã xuất hiện các chủng mới, có độc tính nặng hơn (Hung và cs, 199a) [33].Chính vì vậy, việc phát hiện nhanh bệnh greening trong giai đoạn đầu là vô cùng quan trọng đối với việc phòng và điều trị bệnh

Ngày nay việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử cho phép chẩn đoán các bệnh trên cây có múi mang lại hiệu quả cao với nhiều ưu điểm như: độ nhạy cao, chính xác và mất ít thời gian Có thể kể đến một số kỹ thuật: PCR, real-time PCR, các kỹ thuật lai phân tử, southern blot Kết quả thu được từ những nghiên cứu chẩn đoán bằng sinh học phân tử là cơ sở để sớm đưa ra những giải pháp phòng tránh Đến nay đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện bệnh greening trên cây có múi Xác định tác nhân gây bệnh vàng lá

greening bằng phương pháp sinh học phân tử Phân lập vi khuẩn Candidatus

Liberibacter asiaticus gây bệnh greening từ rầy chổng cánh bằng kỹ thuật PCR

(Hung và cs, 199a) [33]

Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: „„Phát

hiện nhanh bệnh greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam’’

1.2 Mục đích nghiên cứu

Phát hiện nhanh bệnh greening trên cây có múi bằng kỹ thuật PCR

1.3 Yêu cầu nghiên cứu

- Thu thập nguồn vật liệu trên một số đối tượng cây có múi như: Cam, chanh, bưởi, quýt tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

- Xác định sự biểu hiện của bệnh greening trên mẫu vật liệu đã thu thập được

- Giám định bệnh vàng lá greening trên cây có múi bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

- Giải trình tự gene của sản phẩm PCR từ mẫu lá bị bệnh greening (từ 2-3 mẫu)

1.4 Mục tiêu nghiên cứu

- Thu thập được các mẫu vật liệu trên một số đối tượng cây có múi như: Cam, chanh, quýt, bưởi, ở các địa phương khác nhau

- Xác định các dạng triệu chứng bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có

múi ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

- Khuyếch đại thành công đoạn DNA đích trong bộ gene của vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

- Giải trình tự gene của sản phẩm PCR (2-3 mẫu) từ mẫu lá bị bệnh greening

và tiến hành phân tích BLAST trên NCBI, so sánh mức độ tương đồng với ngân hàng dữ liệu và sơ bộ kết luận loài vi khuẩn gây bệnh greening

1.5 Ý nghĩa của đề tài

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

- Xác định được phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh vàng lá greening trên cây có múi bằng kỹ thuật PCR Từ đó góp phần đưa ra các biện pháp phòng trừ kịp thời và có hiệu quả bệnh vàng lá greening

- Kết quả nghiên cứu cung cấp tài liệu học tập và nghiên cứu cho các sinh viên, nhà khoa học trên đối tượng cây có múi, góp phần duy trì, bảo tồn và phát triển bền vững ngành trồng cây ăn quả có múi ở Việt Nam

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn

- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục cho cho công tác sau này

- Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đại học

1.5.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

Thông qua việc phát hiện nhanh bệnh greening trên cây có múi sẽ góp phần giúp cho những người sản xuất sớm đưa ra những biện pháp phòng tránh sớm, loại

bỏ những mầm bệnh cho vườn cây Qua đó sẽ giữ vững được năng suất và chất lượng cho sản phẩm, nâng cao giá trị kinh tế và ổn định kinh tế - xã hội

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây có múi

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

2.1.1.1 Nguồn gốc

Nhóm tác giả (Bùi Huy Đáp, 1960) [5], (Trần Thế Tục và cs, 1998) [15], cho thấy trong các loại cây ăn quả, cùng với cây nho, cây cam quýt có lịch sử trồng trọt lâu đời nhất Phần lớn kết quả nghiên cứu đều thống nhất cam quýt có nguồn gốc ở miền Nam châu Á, trải dài từ Ấn Độ qua Himalaya, Trung Quốc xuống vùng quần đảo Philippine, Malaysia, miền Nam Indonecia hoặc kéo đến lục địa châu Úc Một báo cáo gần đây (Huang C H, 1987) [36], nhận định tỉnh Vân Nam Trung Quốc có thể là nơi khởi nguyên của nhiều loài cam quýt quan trọng Tại đây còn tìm thấy rất

nhiều loài cam quýt hoang dại Loài chanh yên, phật thủ (Citrus medica) có nguồn

gốc tại miền Nam Trung Quốc, là loài cây ăn quả được mang đến trồng tại Địa Trung Hải và Bắc Phi rất sớm, trước thế kỷ I sau Công Nguyên Những tài liệu cổ xưa có ghi chép loài cây ăn quả này ở Bắc Phi đến mức làm nhiều người hiểu lầm chúng có nguồn gốc tại đây Các loài chanh vỏ mỏng (Lime, C auranlifolia Swingle) được xác định có nguồn gốc ở miền Nam Trung Quốc và miền Tây Ấn

Độ, sau đó được các thuỷ thủ đi biển mang về trồng ở châu Phi, Địa Trung Hải và châu Âu, v.v

Các loài chanh núm (Lemon, Citrus lemon) chưa xác định được nguồn gốc,

nhưng những kỹ thuật di truyền hiện đại gần đây cho thấy có thể chanh núm là con lai tự nhiên giữa Citrus medica và Citrus aurantifolia, chính vì vậy mà chanh núm

có dạng hình thái trung gian giữa hai loại vừa kể trên Chanh núm được xác định sử dụng như một loại quả sớm nhất vào năm 1150 ở Bắc Phi, vùng biển Địa Trung Hải

và châu Âu Cam ngọt (Citrus sinensis L.) được xác định có nguồn gốc ở miền Nam

Trung Quốc, Ấn Độ và miền Nam Indonecia, sau đó được mang về trồng ở châu

Âu, Địa Trung Hải, châu Phi từ thế kỷ 13 đến thế kỷ 17 (Walter Reuther và cs, 1989 [48]) Giống cam nổi tiếng thế giới "Washington Navel", ở Việt Nam vẫn thường gọi là cam Navel được báo cáo là dạng đột biến tự nhiên từ một giống cam ngọt,

giống này được phát hiện ở Bahia Brazil, lần đầu tiên được trồng ở Úc năm 1824, ở Florida (Mỹ) năm 1835 Giống Washinhton Navel được du nhập và trồngở khắp các

Reuther et al, 1989) [48] các giống bưởi (Citrus grandis) được báo cáo có nguồn

gốc ở Malaysia, Ấn Độ, một thuyền trưởng người Ấn Độ có tên là Shaddock đã mang giống bưởi này tới trồng ở vùng biển Caribe, sau đó bưởi được giới thiệu ở Palestin vào năm 900 sau Công Nguyên và tiếp theo mới đến các nước ở châu Âu

Bưởi chùm (Citrus paradisis) được xác định là dạng đột biến hay dạng con lai tự nhiên của bưởi (Citrus grandis), xuất hiện sớm nhất ở vùng Barbadas miền Tây Ấn

Độ, tiếp theo là trồng ở Bang Florida (Mỹ) vào năm 1809, sau đó lan rộng và trở thành một trong những sản phẩm quả chất lượng cao ở châu Mỹ Các giống quýt cũng được xác định có nguồn gốc ở miền Nam châu Á, gồm miền Nam Trung Quốc, bán đảo Đông Dương, sau đó được những người đi biển mang đến trồng ở

Ấn Độ Quýt (Citrus reticulata) được trồng ở vùng Địa Trung Hải, châu Âu và châu

Mỹ muộn hơn so với các loài quả có múi khác, vào khoảng năm 1805 Môt số tà i liê ̣u nghiên cứu cho thấy cam quýt có nguồn gốc ở miền Nam châu Á Nhiều tác giả

cho rằng nguồn gốc quýt kinh (Citrus nobilis Lour) là ở miền Nam Việt Nam Thực

tế ở Việt Nam vùng nào cũng có trồng cam sành với nhiều vật liệu giống với các tên địa phương khác nhau mà không nơi nào trên thế giới có như: Cam sành Bố Hạ, cam sành Hàm Yên, cam sen Yên Bái, cam sen Đình Cả - Bắc Sơn, cam bù Hà Tĩnh (Trần Thế Tục, 1998) [15]

Họ Rutaceae Chi Citrus

Họ Rutaceae, được phân chia thành 130 giống (genus) nằm trong 7 họ phụ khác nhau, trong đó họ phụ Aurantirideae có ý nghĩa nhất Sự phân loại chi tiết hơn dưới

họ phụ Aurantirideae có tộc Citreae (28 genus) và tộc phụ Citrinae (13 genus), 3 nhóm: “tiền cam quýt”, “gần cam quýt” và nhóm “cam quýt thực sự” (true citrus

group) được phân nhóm từ Citreace và tộc phụ Citrnae Sự phân loại cam quýt khá

phức tạp vì có các yếu tố, như có rất nhiều giống (cultivars) trong sản xuất và các dạng con lai của các giống này (hybrids), đột biến và hiện tượng đa bội thể cũng là những nhân tố gây khó khăn cho phân loại cam quýt 130 giống (genera) nằm trong

Hiện nay tồn tại hai hệ thống phân loại cam quýt được nhiều người áp dụng,

theo Tanaka (Nhật Bản) cam quýt gồm 160 – 162 loài (Specias) Tanaka đã quan sát,

ghi chép tỷ mỉ đặc điểm hình thái của các giống đã biến dị này và phân chúng thành một loài mới hoặc giống mới có tên khoa học được bắt đầu bằng tên giống hay tên loài

đã phát sinh ra chúng và kết thúc bằng chữ “Horticulturre‟‟ Swingle đã chia cam quýt

ra làm 16 loài (Đường Hồng Dật, 2003) [4] Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn phải sử dụng hệ thống phân loại của Tanaka để gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại

này chi tiết tới từng giống Theo Tanaka có 10 nhóm quan trọng nhất trong nhóm True

Citrus group, đây là những loài được trồng phổ biến và có ý nghĩa với con người, có

thể được mô tả trong bảng sau (Đường Hồng Dật, 2003) [4]

Bảng 2.1: Các loài cam, quýt có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất

(Đường Hồng Dật, 2003) [4]

2.1.2 Đặc điểm sinh học của cây có múi

- Rễ cam quýt nói chung thuộc loại rễ nấm (Micorhiza), nấm Micorhiza sống cộng sinh trên lớp biểu bì của rễ , có vai trò như những lông hút ở các cây trồng và thực vật khác, cung cấp nước, muối khoáng và một lượng nhỏ chất hữu cơ cho cây, cây cung cấp hydrat carbon cho nấm (Trần Thế Tục, 1998) [15] Do những đặc điểm trên mà cam quýt không ưa trồng sâu, vì rễ cam quýt chủ yếu là rễ bất định, phân bố rất nông (10-30cm), phân bố tương đối rộng và tập trung ở tầng đất mặt Tuy nhiên, mức độ phân bố sâu hay rộng phụ thuộc vào loại đất, đặc tính của giống, cách nhân giống, chế độ chăm bón, tầng canh tác và mực nước ngầm Đặc biệt là biện pháp kỹ thuật canh tác, như làm đất, bón phân, phương pháp nhân giống, giống gốc ghép và giống cây trồng

thuộc giống, tuổi cây, điều kiện sinh sống, hình thức nhân giống mà cây có chiều cao và hình thái khác nhau Tán cây cam quýt rất đa dạng: có loại tán thưa, tán rộng,

có loại phân cành hướng ngang, có loại phân cành hướng ngọn Có loại tán hình cầu, hình bán cầu, hình tháp, hoặc hình chổi xể Cành có thể có gai hoặc không gai,

có thể còn non thì có gai và gai bị rụng khi về già , v.v Cành cây ăn quả có múi có

ba loại: cành mẹ, cành dinh dưỡng và cành quả (Vũ Công Hậu, 1996) [8]

+ Cành mẹ: Sinh ra cành quả nó có thể là cành xuân, cành hè hoặc cành năm trước Qua theo dõi cho thấy tuỳ từng giống thường cành thu hoặc cành hè làm cành

mẹ thì số cành quả nhiều và tỷ lệ đậu quả cũng cao

+ Cành dinh dưỡng: Cành không ra hoa, quả, chỉ có lá xanh có nhiệm vụ chính là quang hợp, giữa cành mẹ và cành dinh dưỡng không có giới hạn rõ, năm nay là cành dinh duỡng, sang năm sau có thể là cành mẹ

+ Cành quả: Tuỳ giống cây ăn quả có múi mà cành quả có độ dài từ 3 –

25 cm, thông thường từ 3 - 9 cm Cành quả có lá thường đậu quả tốt hơn cành quả không có lá

- Lá cam quýt thuộc loại lá đơn, phần lớn mép lá có hình răng cưa, lá có eo

Độ lớn của eo lá, hình dạng, kích thước lá, màu sắc lá, mật độ khí khổng, mật độ túi tinh dầu, v.v tuỳ thuộc vào giống, vào mùa vụ Bình quân trên mặt lá có từ 400-

500 khí khổng/mm2 Cây cam quýt trưởng thành thường có từ 150.000 - 200.000 lá,

sinh thái, vị trí và tình trạng sinh trưởng của cây và cành mang lá, vị trí của cấp cành Những lá hết thời gian sinh trưởng thường rụng nhiều vào mùa Thu và mùa Đông (Lê Đình Sơn, 1993) [13] Ở Việt Nam tuổi thọ trung bình của lá là 15-24 tháng, ở vùng Á nhiệt đới có thể dài hơn Tuỳ theo giống và tuỳ theo mùa, lá có thể giống nhau về hình dạng, độ lớn, màu sắc, mật độ khí khổng, mật độ túi tinh dầu Lá có quan hệ chặt chẽ với sản lượng, nhất là với trọng lượng quả (Đỗ Năng Vịnh, 2008) [22]

- Đặc điểm hoa và tỷ lệ đậu quả: Xét về hình thái có 2 loại hoa: hoa phát triển đầy đủ và hoa dị hình Hoa đầy đủ có cánh dài màu trắng và có công thức cấu tạo: K5; C5; A(20-40; G(8-15), thường thì số nhị gấp 4 lần số cánh hoa và xếp thành 2 vòng, nhị hợp Hoa dị hình: là những hoa bị thiếu khuyết 1 trong các bộ phận của hoa Về hoa tự cũng có 2 loại: hoa đơn và hoa chùm Hoa đơn có 2 dạng: dạng cành đơn có nhiều lá và 1 hoa ở đầu cành, dạng này có khả năng đậu quả cao nhất, trong điều kiện được chăm sóc tốt thì cây sẽ có nhiều loại cành này; dạng cành không có lá, thường có nhiều cành quả/1 cành mẹ, cuống ngắn dễ lẫn với dạng hoa chùm Hoa chùm: có 3 dạng: dạng trên cành ở mỗi nách lá có 1 hoa và 1 hoa ởngọn cành, trên mỗi cành có từ 3-7 hoa và khả năng đậu từ 1-2 quả; dạng trên ngọn cành có 1 hoa và mỗi nách lá có 1 hoa và có 1 số lá không hoàn chỉnh,chỉ ở dạng vảy, dạng này tỷ lệ đậu quả không cao; dạng hoa chùm không có

lá có từ 4 - 5 hoa, loại này tỷ lệ đậu quả rất thấp hoặc không đậu (Đào Thanh Vân

- Đợt 1 (rụng cả cuống): sau khi ra hoa 1 tháng (tháng 3 và đầu tháng 4)

- Đợt 2: rụng khi quả đạt 3- 4 cm (cuối tháng 4 trở đi), để lại cuống

Sau 2 đợt rụng quả sinh lý quả lớn rất nhanh (tốc độ trung bình đường kính quả tăng 0,5 - 0,7mm/ngày), trước khi hình thành hạt tốc độ chậm lại ít ngày, sau đó lại tăng nhanh đến khi đạt kích thước tối đa

- Hạt: Tuỳ theo giống mà có sự khác nhau về kích thước, số lượng màu sắc

và phôi hạt Các loại quả thuộc cây có múi phần lớn là hạt đa phôi, riêng cây bưởi là hạt đơn phôi (Vũ Công Hậu, 1996) [8]

2.1.3 Giá trị của cây có múi

Sản phẩm của cây có múi là một trong những sản phẩm có giá trị được nhiều người ưa chuộng và được sản xuất ở nhiều nước trên thế giới

- Giá trị dinh dưỡng: Quả cây có múi có nhiều chất dinh dưỡng nên giá trị sử dụng rất cao Trong 100g thịt quả có chứa 6 - 12% đường, chủ yếu là đường sacaroza Hàm lượng vitamin C trong quả khoảng 40 - 90 mg/100 tươi, 0,4 - 1,2% các acid hữu cơ, trong đó có nhiều loại acid có hoạt tính sinh học cao Trong quả còn có chứa các chất khoáng và dầu thơm (Đường Hồng Dật, 2003) [4]

- Giá trị công nghiệp và dược liệu: Vỏ quả có chứa tinh dầu Tinh dầu được cất từ vỏ, quả, lá, hoa được dùng trong công nghiệp thực phẩm và công nghiệp mỹ

phẩm Ở nhiều nước trên thế giới, người ta đã dùng các loại quả thuộc chi Citrus

làm thuốc chữa bệnh Ở thế kỷ XVI, các thầy thuốc Trung Quốc, Ấn Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dưới da Ở Mỹ vào những năm 30 của thế kỷ XX, các thầy thuốc đã dùng các quả cam quýt kết hợp với insulin để chữa trị bệnh đái tháo đường Ở Nga bắt đầu từ thế kỷ XI, các loại quả cây có múi đã được sử dụng để phòng ngừa và chữa trị trong y học dân gian Ở nước ta, nhân dân đã dùng cây ăn quả có múi để phòng và chữa trị một số bệnh từ lâu (Đường Hồng Dật, 2003) [4]

- Giá trị kinh tế: Cây ăn quả có múi là một trong những loại cây lâu năm, nhanh cho thu hoạch Một số loài có thể cho thu hoạch quả ở năm thứ 2 sau khi trồng Ở nước

ta, năng xuất trung bình của cam quýt ở thời kỳ 8 tuổi có thể đại tới 16 tấn/ha Cây cam

quýt có thể sống và cho thu hoạch quả trong vòng 15 - 30 năm Trong trường hợp đất tốt, được chăm sóc đầy đủ và áp dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh cao, trong các điều kiện khí hậu thích hợp và không bị sâu bệnh gây hại nặng, tuổi thọ của cam quýt

có thể kéo dài trên 50 năm (Đường Hồng Dật, 2003) [4]

- Giá trị sinh thái, môi trường: Cây có múi là cây ăn quả lâu năm được trồng trong các vườn cây của gia đình hộ nông dân hoặc trồng trên đồi tại các trang trại Trong quá trình sinh sống, các loại cam, quýt, bưởi tiết ra oxy trong không khí làm không khí trở nên trong lành, dịu mát Trong những chừng mực nhất định các chất bay hơi từ cây cam quýt có tác dụng diệt một số loài vi khuẩn làm cho không khí trở nên sạch hơn, môi trường sống của con người tốt hơn Cam quýt trồng trên các đồi đất, bên cạnh việc cho quả còn có tác dụng phủ xanh đất, giữ nước ngăn cản dòng chảy mạnh trên mặt đất sau các trận mưa lớn, do đó có ý nghĩa lớn trong việc làm giảm quá trình xói mòn, rửa trôi đất Ở vùng trung du và miền núi, cam quýt được trồng trong các vườn rừng, vườn đồi trong các hệ thống VAC và VACR là phương thức canh tác được áp dụng rộng rãi tại các trang trại nông nghiệp và đã thể hiện nhiều ưu điểm trong việc thực hiện nền nông nghiệp bền vững (Đường Hồng Dật, 2003) [4]

2.1.4 Yêu cầu sinh thái của cây có múi

- Nhiệt độ: Phần lớn cây có múi sinh trưởng thích hợp nhất ở nhiệt độ 25 –

thường cam quýt vùng á nhiệt đới lạnh có chất lượng , mã quả tốt hơn so với cam quýt vùng nhiệt đới Nhiệt độ cao ở vùng xứ nóng thường làm vỏ cam quýt vẫn còn xanh khi quả đã chín Biên độ nhiệt độ ngày đêm cũng ảnh hưởng khá lớn đến phân

hoàn toàn Tuy nhiên, nhiệt độ cao lại thuận lợi cho việc ra lộc Cam ngọt Valencia

ở nhiệt độ trung bình 30 - 32oC chỉ cần 20 - 30 ngày là ra xong một đợt lộc mới,

C thì cần 40 - 50 ngày theo (Phí Văn Ba, 1976) [1]

- Ánh sáng: Cây có múi thích hợp với ánh sáng có cường độ 10.000 – 15.000 lux (tương ứng thời gian chiếu sáng 16 – 17h/ngày), cây có múi ưu ánh sáng tán xạ, không ưu ánh sáng trực xạ Các giống cây có múi khác nhau có yêu cầu khác nhau

về ánh sáng: Cam cần ánh sáng nhiều hơn quýt, quýt cần nhiều ánh sáng hơn chanh (Nguyễn Thị Minh Phương, 2007) [12]

- Nước: Ẩm độ không khí là một yếu tố khá quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng của cam quýt Ẩm độ không khí quá cao sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh hại phát triển, như bệnh thối gốc, bệnh ghẻ, bệnh rám quả do nấm ẩm

độ quá cao sẽ hấp thu nhiều tia tử ngoại làm màu sắc cam quýt ít tươi thắm hơn, nhiệt độ cùng với ẩm độ quá cao làm quả phồng xốp, chất lượng kém (Nguyễn Mạnh Chinh, 2005) [2] Ẩm độ không khí phù hợp nhất vào khoảng 70 – 75% (Phạm Thị Chữ, 1996) [3]

Nước rất cần cho cây có múi đặc biệt là vào các giai đoạn ra chồi, ra hoa và quả đang đậu vào cuối tháng 2 đầu tháng 3 và giai đoạn phình quả đến khi quả chuẩn bị chín Lượng mưa thích hợp cho trồng cam quýt là từ 1000 – 2400 mm/năm, thích hợp nhất là 1200 mm (Phạm Thị Chữ, 1996) [3]

- Đất: Các yếu tố đất đai quan trọng khi lựa chọn đất trồng cam quýt, đó là tầng sâu đất, đất dễ thoát nước, mực nước ngầm sâu hoặc mực nước ngầm ổn định Mực nước ngầm trong đất nếu hơi cao một chút nhưng ổn định, không lên xuống thất thường thì cũng ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cam quýt Mực nước ngầm đảm bảo an toàn cho cây phải tối thiểu sâu 1,5 m dưới mặt đất Độ pH thích hợp với sinh trưởng của cam quýt từ 5,5 - 6,5, đất quá chua sẽ có nhiều dinh dưỡng

bị rửa trôi, và cũng có thể gây ngộ độc do một số nguyên tố như đồng (Cu) Đất quá kiềm, cây khó hút một số nguyên tố và thường có biểu hiện thiếu kẽm (Zn), sắt (Fe) Nhìn chung đất phù hợp với cam quýt là đất phù sa, phù sa cổ, đất bồi tụ, đất đỏ bazan, đất mùn đá vôi, v.v (Lê Đình Định, 1990) [6]

- Dinh dưỡng: Để phát triển tốt cây có múi cần cung cấp đầy đủ và cân đối các nguyên tố dinh dưỡng đa lượng N, P, K cũng như các nguyên tố khoáng vi lượng Cu, Mg, B

2.1.5 Một số sâu bệnh hại trên cây có múi

2.1.5.1 Một số bệnh hại chính

Ở cây có múi, người ta đã thống kê được khoảng 20 bệnh hại do virus và các sinh vật tương tự virus và hàng chục bệnh khác do nấm, vi khuẩn gây ra (Preslay.D, 1993) [41]

Bệnh cây có múi chia làm hai loại: Bệnh truyền nhiễm do vi trùng gây ra và bệnh không truyền nhiễm do các yếu tố vô sinh gây nên Tác nhân gây bệnh truyền nhiễm bao gồm vi khuẩn, nấm, virus và các thể tương tự virus, tuyến trùng Bệnh không truyền nhiễm do các điều kiện môi trường tự nhiên như hạn hán, mặn, úng, nguồn dinh dưỡng hoặc chế độ canh tác, sử dụng hóa chất không đúng cách gây nên Trong đó, virus và các tác nhân gây bệnh tương tự virus, vi khuẩn, nấm là nguyên nhân chủ yêu gây hại cho cây có múi Chúng có khả năng gây bệnh nặng nề

và khó chữa trị

- Bệnh Tristeza: Bệnh do virus gây ra, làm thiệt hại nghiêm trọng tới việc sản

xuất cam quýt trên thế giới Tác nhân gây bệnh là do virus Closterovirus, chủ yếu

gây hại trên mạch dẫn phloem nhưng người ta còn quan sát được sự hiện diện của chúng ở lớp vỏ của chồi non Chỉ riêng bệnh Tristeza đã phá hủy hơn 50 triệu cây

và tiếp tục đe dọa hơn 200 triệu cây khác trên toàn thế giới Bệnh gây lụi dần, lõm thân và vàng cây con (Đường Hồng Dật, 2003) [4] Nhân giống vô tính bằng mắt ghép nhiễm bệnh là nguyên nhân chính lan truyền bệnh, ngoài ra bệnh còn lây lan qua một vài loài rệp (Vũ Công Hậu, 1996) [8]

- Bệnh vàng lá greening: là bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất đến sản xuất cây có múi ở khu vực châu Á và châu Phi, đặc biệt là ở Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan và bệnh đã được phát hiện trên tất cả các vùng và hầu hết các giống cam, quýt, bưởi ở nước ta Bệnh do một loài vi khuẩn kí sinh và sinh sản trong trong mạch dẫn gây ra hiện tượng vàng chồi với vector truyền bệnh là rầy chổng cánh

Châu Á Diaphorina citri Ngoài ra, nhân giống bằng mắt ghép nhiễm bệnh cũng là

con đường chủ yếu dẫn đến lan truyền bệnh vàng lá greening trên cây có múi (Nguyễn Thị Minh Phương, 2007) [12]

- Bệnh loét: Bệnh do một số chủng vi khuẩn gram âm Xanthomonas

campestris citri (Hasse) Dye gây ra Ở nước ta, bệnh loét rất phổ biến và gây hại ở

cam quýt, đặc biệt là bưởi Bệnh gay ra các vết loét trên lá, cành, quả lúc đầu vết loét hình tròn sau đó lan rộng Tác nhân truyền bệnh chính là do gió hoặc mưa, bệnh thường được truyền trong khoảng cách gần Phương thức truyền bệnh đi xa chủ yếu

do vận chuyển giống, mắt ghép, gốc ghép nhiễm bệnh từ vùng này sang vùng khác

- Bệnh nấm Phytophthora: Do các chủng nấm thuộc hai nhóm Phytophthora

parasitica Dast và Phytophthora citrophthora gây nên Bệnh gây hại nghiêm trọng

ở các vùng ẩm thấp, mưa nhiều, bệnh gây hại do gây thối gốc, thối rễ, chảy gôm (Đường Hồng Dật, 2003) [4]

- Bệnh đốm nâu: Bệnh do nấm Alternaria gây ra, là bệnh nghiêm trọng cả ở

cây và quả Lá bị bệnh chuyển dần sang màu đen, xoăn lại và rụng Chồi non bị đen

và tàn lụi, trên quả xuất hiện những đốm nâu Bệnh do nấm tồn tại trên cành già bị nhiễm bệnh do bào tử nấm phát tán nhờ vào gió và nước lây nhiễm vào lá non và quả (Đường Hồng Dật, 2003) [4]

- Bệnh mốc xanh: Bệnh gây hại trên quả, do nấm Penicillium italicim và nấm

P digitalium gây ra Bệnh là vấn đề nghiêm trọng sau thu hoạch, trong quá trình bảo

quản và vận chuyển Trên quả xuất hiện những vết bệnh mọng, mềm và những vết bệnh phát triển nhanh thậm trí gây thối tới toàn bộ quả Bào tử nấm thường lơ lửng trong không khí và xâm nhiễm qua vết thương ở vỏ quả (Vũ Công Hậu, 1996) [8]

- Ngoài ra, một số bệnh khác như: Bệnh sẹo, bệnh than, bệnh đốm đen, muội, thối cuống cũng là những bệnh hại nghiêm trọng trên ăn quả cây có múi (Hà Minh Trung, 2006) [17]

2.1.5.2 Một số côn trùng gây hại trên cây có múi

Ngoài các bệnh hại chính, cây ăn quả có múi còn bị ảnh hưởng và tàn phá bởi một số loài côn trùng dưới đây:

- Sâu vẽ bùa: Phát triển quanh năm và gây hại trên tất cả các loài cây có múi Sâu hại lá non, đọt non ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cây, làm mất khả năng quang hợp của lá

- Sâu nhớt: Sâu nhớt gây hại lá và quả non trong mùa xuân từ tháng 2 đến tháng 3

- Rầy chổng cánh: Rầy chổng cánh chích hút nhựa từ các cành lộc non, lá non của cây Là vector truyền bệnh vàng lá greening trên cây có múi

- Nhện đỏ, nhện trắng: Nhện gây hại chủ yếu trên lá và quả làm cho lá có màu xám bạc, mất khả năng quang hợp

- Bọ xít xanh: Thường gây hại trên quả, dùng vòi chích hút vào quả làm quả nổi u có điểm nâu, tép khô và quả rụng

- Ruồi vàng: Ruồi đẻ trứng vào vỏ quả, vào lớp cùi Sâu non nở ra chui vào tép hại quả Quả bị thối và rụng

- Nhóm sâu đục gốc, thân, cành: Gồm sâu đục gốc, sâu đục thân, sâu đục cành Trong đó, sâu đục cành gây hại nhiều nhất, đục vào cành tăm sau đó chui xuống cành cấp 2, 3 (Preslay.D, 1993) [41]

2.1.6 Tình hình sản xuất cây có múi

2.1.6.1 Tình hình sản xuất trên thế giới

Hiện nay, cây có múi là một trong những loại cây ăn quả chủ lực và được trồng tại nhiều nước và vùng lãnh thổ trên thế giới Theo thống kê của FAO năm

2009 thì năm 2005 tình hình xuất nhập khẩu cam, quýt trên thế giới như sau: Nhập khẩu 37,13 nghìn tấn có giá trị 31.272,38 nghìn USD, xuất khẩu 63,71 nghìn tấn có giá trị 38.112,3 nghìn USD Như vậy, có thể thấy sản phẩm cam quýt có giá trị thương mại rất lớn trong nền kinh tế thế giới

Bảng 2.2: Tình hình sản xuất cây có múi ở các châu lục trên thế giới

(Nguồn : FASTAT/FAO Statistics – năm 2015) [52]

Năm 2011 diện tích cây có múi của toàn thế giới là 9.143.946 ha, năng suất trung bình đạt 16.366.212 tạ/ha, sản lượng đạt 132.696.521 tấn Đến năm 2013 diện tích tăng lên 9.634.816 ha và sản lượng cao hơn đạt 135.169.941 tấn vì năng suất tăng lên đạt 16.216.494tạ/ha

Châu Á có diện tích trồng cây có múi lớn nhất thế giới, kế tiếp tới châu Mỹ, châu Phi và châu Âu Châu đại dương là châu lục có diện tích trồng cây có múi nhỏ nhất (32.898ha)

Bảng 2.3: Diện tích, năng suất và sản lượng cây có múi trên thế giới

giai đoạn 2005 – 20013 Năm Diện tích (ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (tấn)

(Nguồn : FASTAT/FAO Statistics – năm 2015) [52]

Từ năm 2005 – 2013 diện tích trồng cây có múi trên thế giới tăng thêm được 1.698.031 ha Sản lượng cây có múi trên thế giới từ năm 2005 – 2013 có tăng lên

nhưng còn khá chậm, từ 112.206.114 tấn (năm 2011) lên 135.169.941 tấn (năm 2013)

2.1.6.2 Tình hình sản xuất ở Việt Nam

Ở nước ta, cam quýt có lịch sử trồng trọt lâu đời, cho đến nay đã chọn ra được nhiều giống có năng suất và chất lượng cao đem trồng ở hầu hết các vũng trên

Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cây có múi của nước ta giai đoạn 2005 – 2013

Chỉ tiêu Diện tích

(ha)

Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (tấn)

Kết quả thống kê của Bộ NN & PTNT đến năm 2013 cả nước có 56.600 ha

tích hầu như không tăng thì năng suất đã tăng đáng kể, từ 100,123 tạ/ha năm 2005 lên 125,190 tạ/ha năm 2013

Bảng 2.5: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các vùng của nước ta năm 2009

(nghìn ha)

Năng suất trung bình (tạ/ha)

Tổng sản lượng (Nghìn tấn)

800 ha diện tích cây trồng cho thu hoạch Tổng sản lượng cam, quýt năm 2009 đạt 683.300 tấn, riêng vùng Đồng bằng Sông Cửu Long chiếm 433.900 tấn trong tổng sản lượng cam, quýt do diện tích cho thu hoạch lớn, chiếm sản lượng lớn nhất trong

8 vùng của cả nước Vùng Nam Trung Bộ có diện tích trồng cây cam, quýt cho thu

hoạch thấp nên có sản lượng thấp nhất cả nước chỉ đạt 2.200 tấn Năng suất cam, quýt trung bình của cả nước năm 2009 đạt 117,3 tạ/ha

2.2 Bệnh vàng lá Greening trên cây có múi

2.2.1 Lịch sử của bệnh

Bệnh vàng lá greening là dịch hại nguy hiểm nhất trên cây có múi, bệnh do

vi khuẩn Liberibacter asiaticus gây nên Bệnh làm giảm năng suất, chất lượng, tuổi

thọ của cây và rất khó phòng trừ Bệnh được mô tả lần đầu tiên ở Trung Quốc năm

1929 với tên là Huanglongbing (Trung tâm làm vườn và trồng trọt, 2003) [20] Năm

1937 triệu chứng bệnh được phát hiện ở Nam Phi.Từ đó bệnh được báo cáo ở nhiều nơi với các tên gọi khác nhau như Likubin ở Đài Loan, Leaf mottling ở Philippine, Vein Phloem deneretion ở Indonesia Tại Việt Nam bệnh vàng lá greening được ghi nhận từ những năm 1960, từ đó đến nay đã sảy ra hai đợt cao điểm của bệnh vàng lá greening (Hà Minh Trung, 2006) [17]

+ Đợt thứ nhất vào các năm 1970 tại hầu hết các nông trường cam phía Bắc + Đợt thứ hai từ đầu thập kỷ 1990 tại các vùng trồng cam quýt quan trọng trong cả nước: Hà Giang, Tuyên Quang, Nghệ An, Đồng Tháp, Vĩnh Long Người sản xuất đa phần chưa hiểu biết những kỹ thuật trồng và thâm canh cây có múi, do

đó tạo ra những vườn cây kém chất lượng

2.2.2 Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh

2.2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh

Vi khuẩn gây bệnh greening là Candidatus Liberibacter thuộc α- Proteobacteria, họ Eubacteria (Jagoueix và cs., 1996) [37] Căn cứ vào khả năng chịu

nhiệt độ nên vi khuẩn được chia làm dòng châu Á và châu Phi Vi khuẩn dòng châu

Á có tên “Candidatus Liberibacter asiaticus” chịu được nhiệt từ 27 – 32°C Dòng châu Phi có tên “Candidatus Liberibacter africanus” mẫn cảm với nhiệt độ cao, chịu

được nhiệt độ từ 22 – 24°C Vi khuẩn được lan truyền qua mắt ghép, cành chiết và

qua côn trùng môi giới là rầy chổng cánh Diaphorina citri ở châu Á và rầy Trioza

erytrea ở châu Phi Bệnh greening lan truyền theo hai cách:

+ Do chiết ghép và nhân giống từ các cây bị bệnh

+ Lây truyền qua môi giới là rầy chổng cách Diaphorina citri ở châu Á và rầy Trioza erytrea ở châu Phi Rầy chổng cánh Diaphorina citri Là loại rầy có kích

thước dài 3,2 – 3,5 mm, toàn thân màu xám tro, hơi phớt xanh Mắt kép nhỏ, râu đầu có 9 đốt hai đốt cuối màu đen Đỉnh đầu có hai mảnh nhọn nhô ra phía trước như lưỡi kéo Cánh màu trong đục, có nhiều đốm nâu nhỏ

Rầy non và rầy trưởng thành chích hút dịch trên cây, lá non, lá bánh tẻ Thời gian phát triển của trứng từ 4 – 12 ngày, rầy non từ 10 – 35 ngày, rầy trưởng thành

vũ hóa sau 6 – 7 ngày thì đẻ trứng Rầy trưởng thành sống được từ 50 – 60 ngày Ở điều kiện miền Bắc nước ta rầy chổng cánh phát sinh 9 – 10 lứa trong một năm (Đường Hồng Dật, 2003) [4]

Hình 2.1 Rầy chổng cánh Diaphorina citri

A – Rầy trưởng thành; B – Trứng và rầy non

(Nguồn: Brlansky.R.H và Rogers.M.E, 2007) [30]

2.2.2.2 Triệu chứng của bệnh vàng lá greening

Triệu chứng của bệnh vàng lá greening trên cây có múi được Hà Minh Trung và cộng sự mô tả và ghi nhận (1995) [18]

Trên đồng ruộng lá cây có múi bị bệnh vàng lá greening biểu hiện nhiều triệu chứng khác nhau như:

(1) Phiến lá bị biến màu vàng, chỉ còn gân lá và các mô xung quanh gân lá còn xanh, triệu chứng này rất giống với hiện tượng thiếu Mangan (Mn) trên cây và được gọi là triệu chứng vàng lá gân xanh

(2) Hầu hết phiến lá và gân biến màu vàng chỉ còn lại một vài điểm xanh xen

kẽ giữa nền vàng Lá mới ra vàng, nhỏ và uốn cong, triệu chứng này giống với thiếu kẽm (Zn)

(3) Lá già có màu xám nhạt, cong vẹo, gân lá bị sưng, triệu chứng này giống với thiếu bo (B) Lá của đợt lộc hè và thu biểu hiện rõ hơn lộc xuân Lá bệnh rụng sớm vào mùa Đông, cành bệnh trở nên trơ trụi, dần dần khô chết

Trên hoa, quả: hoa ra trái vụ, quả nhỏ, tâm quả bị vẹo, nhiều hạt bị lép

Bộ rễ: Rễ kém phát triển hơn là cây bình thường

Khi cây bị nhiễm bệnh vàng lá greening vi khuẩn không gây hại mạch gỗ nhưng gây các vết chết hoại trong mạch libe, sự vận chuyển đường đến các bộ phận của cây bị cản trở Lá nhỏ, tuổi thọ của lá bị rút ngắn, sự phân chia tế bào luôn xảy

ra khiến gân lá bị sưng Vi khuẩn cũng hiện diện nhiều ở cuống quả và làm quả bị lệch tâm, quả nhỏ, khối lượng quả giảm và hàm lượng đường trong quả thấp dẫn đến chất lượng của quả giảm (Aubert.B, 1987) [24] Rễ cây bị bệnh làm nghẽn mạch dẫn, rễ bị hoại tử nhiều, rễ tơ không hút được dinh dưỡng để nuôi cây Cây nhiễm bệnh bị rụng quả cùng với sự phát triển của bệnh, cây sẽ chết sau 2 – 5 năm tùy theo mức độ nhiễm (Aubert.B, 1988) [23]

Đỗ Đình Đức, (1991) [7] đã chia triệu chứng bệnh làm bốn dạng:

- Dạng thứ nhất xuất hiện trên một vài lá, một vài cành hay một phần của tán cây, những cành khác vẫn xanh tốt bình thường, gân chính và gân phụ của lá xanh đậm, thịt lá giữa các gân vàng hay xanh lốm đốm, kích thước lá phát triển bình thường

- Dạng thứ hai bệnh biểu hiện trên toàn cây, gân và thịt lá vàng, lá uốn cong hình thìa, nhỏ và dày, cây lùn xơ xác, thân cây nơi tiếp hợp phình to, phần gỗ có nhiều gai nhỏ hay lỗ nhỏ, hoa nở sớm, dị hình, kéo dài, rễ tơ bị thối

- Dạng thứ ba bệnh chỉ biểu hiện trên giống cam Sông Con ghép trên gốc bưởi và đặc biệt là gốc cam Voi Quảng Bình

- Dạng triệu chứng thứ tư bệnh biểu hiện trên lộc xuân của giống cam Sông Con và Washington Navel, dọc theo gân chính thịt lá màu xanh thẫm hơn, rìa vết bệnh màu vàng nhạt (Đỗ Đình Đức, 1991) [7]

A B

Hình 2.2 Triệu trứng nhiễm bệnh vàng lá greening trên cây có múi

(Nguồn: Brlansky.R.H và Rogers.M.E, 2007) [30]

2.2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá greening

Bệnh có thể được phát hiện và chẩn đoán dựa trên các dạng triệu chứng trên đồng ruộng, tuy nhiên các dạng triệu chứng này sẽ thay đổi theo từng đối tượng và giai đoạn khác nhau và có thể nhầm lẫn với một số bệnh thiếu dưỡng chất như thiếu Zn…Mặt khác sự biểu hiện của triệu chứng bệnh còn phụ thuộc vào số lượng vi khuẩn trong cây, khi số lượng vi khuẩn trong cây thấp thì cây vẫn không biểu hiện triệu chứng nên không thể phát hiện được (Lê Mai Nhất, 2014) [11]

Xác định tác nhân bằng kính hiển vi điện tử: Dưới kính hiển vi điện tử có thể quan sát được vi khuẩn có lông cứng, kích thước 350 – 550 × 600 – 1500 nm, vách

tế bào có hai lớp, độ dày từ 20 – 25 nm Hình dạng của vi khuẩn thường có hình gậy, thon dài và được thay đổi từ lúc tế bào non đến lúc thành thục (Huang.A.L, 1987) [36] Bằng phương pháp cắt lát siêu mỏng và soi dưới kính hiển vi điện tử, Jeong-Soon Kim và cs, (2008) đã nghiên cứu sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh greening và cho thấy phần mạch dẫn (phloem) tích tụ tinh bột dẫn đến thoái hóa mạch dẫn, lục lạp trong lá bị ảnh hưởng nghiêm trọng Dẫn đến lá bị bệnh thường không có khả năng quang hợp, hấp thu và vận chuyển dinh dưỡng theo mạch dẫn (Jeong-Soon Kim và cs, 2008) [40] Phương pháp này cũng được Lê Mai Nhất, (2014) sử dụng để giám định các tác nhân gây bệnh vàng lá greening tại một số địa phương phía Bắc Việt Nam và cho kết quả tương tự (Lê Mai Nhất, 2014) [11]

Cho đến năm 1992, kính hiển vi điện tử đã được sử dụng rộng rãi để xác định tác nhân gây bệnh Tuy nhiên, sử dụng kính hiển vi điện tử không thể phân biệt được các dòng vi khuẩn châu Á và châu Phi (Lê Mai Nhất, 2014) [11]

Xác định tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử là phương pháp đã và đang được đẩy mạnh nghiên cứu, trong đó PCR là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất trong công tác chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Hung và cs,

1999 [33] đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu để chẩn đoán bệnh vàng lá greening, sản phẩm thu được có kích thước 226 bp Phương pháp PCR cũng được sử dụng để phát

hiện Liberibacter asiaticum trong cơ thể rầy chổng cánh Diaphorina citri (Hung và

cs, 1999a) [33] Bằng kỹ thuật này năm 2004 người ta đã phát hiện được dòng vi

khuẩn châu Mỹ là Liberibacter americanum đã có mặt tại 46 điểm của bang Sao

Paulo - Brasil, và chỉ một năm sau đã lên tới 79 điểm Kết quả này cho thấy sự lan

truyền nhanh chóng của vi khuẩn gây bệnh thông qua rầy chổng cánh Diaphorina

Citri Kỹ thuật lai DNA là phương pháp cho độ chính xác cao với vi khuẩn Liberibacter asiticum đặc biệt là trong côn trùng môi giới (Hung và cs, 1999a) [33]

Việc chẩn đoán tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR cho kết quả với độ chính xác cao, tuy nhiên phương pháp đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và chi phí tốn kém Vì vậy

mà ngày nay các nhà khoa học đã phát triển bộ Kit Iodine để chẩn đoán nhanh tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc Iodine có thể phản ứng với tinh bột trong lá cây

bị nhiễm bệnh và tạo màu nhạt hoặc đen

Su.H.J (2008) đã sử dụng phương pháp cây chỉ thị kết hợp với Công nghệ Sinh học để xác định các chủng gây bệnh hại trên cây có múi ở Đài Loan (Su.H.J, 2008) [42] Từ các mẫu bệnh được thu thập, vi khuẩn được làm sạch và sử dụng để lây nhiễm vào các giống cây có múi khác nhau được dùng để làm cây chỉ thị như quýt Ponkan, cam Liucheng, bưởi Wentan và chanh Eureka Cho đến nay đã xác định được bốn chủng vi khuẩn gậy bệnh khác nhau:

Chủng I: gây bệnh trên cam ngọt và quýt

Chủng II: có độ độc cao nên đã gây bệnh ở cả bốn giống cam, chanh, quýt, bưởi

Chủng III: chỉ gây hại ở mức trung bình nên chỉ biểu hiện ở cam ngọt, quýt

và biểu hiện nhẹ trên bưởi

Chủng IV: gây bệnh trên cam ngọt và quýt nhưng triệu chứng ẩn và phải sử dụng đến phương pháp PCR để phát hiện bệnh, tuy nhiên chủng này ít gặp trên đồng ruộng (Su.H.J, 2008) [42]

2.2.4 Một số biện pháp phòng tránh

Tạo giống cây sạch bệnh bằng vi ghép đỉnh sinh trưởng hoặc tạo cây giống

sạch bệnh bẳng phương pháp nuối cấy tế bào in vitro Vi ghép là phương pháp tốt

nhất để phục tráng lại cây giống đã bị bệnh vàng lá greening và các bệnh vi rút khác

ở các loài cây cây ăn quả có múi

Phun thuốc trừ sâu diệt rầy chổng cách khi cây ra đọt non từ 1 – 2 cm hoặc bất kỳ thời điểm nào phát hiện thấy rầy chổng cánh Một số thuốc có khả năng phòng trừ rầy hiệu quả là Bassa 50EC, Applaud 10 WP hoặc dầu D.C Tron Plus

Chặt bỏ các cây bị nhiễm bệnh và hủy bỏ hoàn toàn các vườn cây bị nặng Trồng cây chắn gió để ngăn chặn sự di chuyển của rầy chổng cánh và chăm sóc vườn thường xuyên

Chỉ nhân giống bằng các mắt ghép của cây mẹ sạch bệnh, tạo các nhà lưới bảo quản vườn cây mẹ và vườn ươm hoặc tạo vườn ở các khu cách ly (Đinh Hải Lâm, 2001) [10]

2.3 Tình hình nghiên cứu về phát hiện bệnh greening trên cây có múi

Kể từ khi được mô tả lần đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 1929 (Trung tâm làm vườn và trông trọt, 2003) [20] cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện trên thế giới cũng như ở Việt Nam nhằm xác định các tác nhân gây bệnh greening và đưa ra các biện pháp quản lý dịch hại

2.3.1 Các nghiên cứu về phát hiện bệnh trên thế giới

Cho đến nay, bệnh greening đã lan rộng trên 50 quốc gia trên thế giới và đe dọa nghiêm trọng đến nguồn gen cây có múi ở các nước châu Á Lin (1956) đã chứng minh bệnh có thể truyền được qua mắt ghép và được Bové và cs, 1984 khẳng định lại một lần nữa khi phát hiện các tác nhân gây bệnh truyền qua dây tơ hồng đến cây dừa cạn và được khẳng định là một loại vi khuẩn nhuộm gram âm (Bové và cs, 1980) [26] Bové và cs, 1984 cho rằng vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening ở Nam Phi là tác nhân không chịu nhiệt trong khi vi khuẩn này ở Philippines và Ấn Độ chịu nhiệt tốt (Bové và cs, 1984) [28] Theo Bové và cs, 1980 đã xác định có hai

loài vi khuẩn gây bệnh greening đó là Liberobacter asiaticum (loài châu Á) và

Liberobacter africanum (loài châu Phi), đến năm 2005 đã xuất hiện thêm dòng châu

Mỹ Loài vi khuẩn châu Á có tính kháng nhiệt nên khó phòng trị hơn (Bové và cs, 1980) [26]

Năm 1984, Garnier và Bové đã đề xuất kỹ thuật quan sát trực tiếp vi khuẩn gây bệnh greening như sau: Cắt nhỏ gân lá từ lá bệnh thành các mảnh nhỏ khoảng 1

mm, cố định với 4% glutaldehyde trong chất đệm 0,1M caccodylate (phosphate), pH: 7,5 trong 6 giờ Với cùng loại chất đệm nên nhúng 3 lần, sau đó cố định với 1%

mẫu nhuộm với citrate và quan sát dưới kính hiển vi điện tử (Garnier và cs, 1984) [31]

Theo nghiên cứu của Huang (1987) khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử đã quan sát được vi khuẩn có lông cứng, kích thước 350 – 550 x 600 – 1500 nm, vách

tế bào có hai lớp, dày từ 20 – 25 nm Vi khuẩn có hình gậy, thon dài và được thay đổi từ tế bào non tới lúc thành thục (Huang.A.L, 1987) [36]

Trong những năm trở lại đây với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử hiện đại thì kỹ thuật PCR là phương pháp hữu hiệu nhất để chẩn đoán nhanh và chính xác nhất các tác nhân gây bênh greening Đầu tiên dựa trên sự khuếch đại của đoạn 16s rDNA với sản phẩm thu được ở 1160 bp Các nghiên cứu đã sử dụng đoạn 16s rDNA của dòng vi khuẩn châu Á gây bệnh trên cây dừa cạn để xác định vị trí