Nghiên cứu tần suất các alen của 15 locus gen hệ identifiler thuộc quần thể người dân tộc tày ứng dụng trong giám định DNA nhân tế bào

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐỖ HOÀI NAM NGH

Trang 1

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐỖ HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU TẦN SUẤT CÁC ALEN

CỦA 15 LOCUS GEN HỆ IDENTIFILER THUỘC QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC TÀY ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH GEN NHÂN TẾ BÀO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội-2014

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐỖ HOÀI NAM

Đề tài:

NGHIÊN CỨU TẦN SUẤT CÁC ALEN

CỦA 15 LOCUS GEN HỆ IDENTIFILER THUỘC QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC TÀY ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH GEN NHÂN TẾ BÀO

Học viên: Đỗ Hoài Nam Chuyên ngành: Hóa Sinh

Người hướng dẫn: Đại tá PGS TS Nguyễn Văn Hà

Hà Nội-2014

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Đại Tá.PGS.TS Nguyễn Văn Hà, PGĐ Trung tâm Giám định Sinh học pháp lý - Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an, người đã nhiệt tình trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ của Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam nói chung, Viện Tài nguyên sinh vật nói riêng đã tham gia tổ chức, quản lý, giảng dạy lớp cao học K16 hướng dẫn, trang bị kiến thức cho tôi, là

cơ sở, tạo tiền đề giúp tôi hoàn thành bản luận văn này

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đồng nghiệp đã giúp

đỡ động viên tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn cũng như hai năm học cao học để tôi có kết quả của ngày hôm nay

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

Đỗ Hoài Nam

Trang 4

DANH MỤC BẢNG VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Trang 5

DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG BIỂU TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1.1 Các bộ kit thương mại và marker STR phổ biến 19

Bảng 1.2 Vị tr các locus STR thuộc bộ k t mpFlSTR® Identifiler®trên NST và Dye lable tương ứng 22

Bảng 2.1 Thành phần của một phản ứng PCR 30

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt của một phản ứng PCR 30

Bảng 2.3 Đặc điểm của các chất nhuộm màu huỳnh quang 31

s dụng trong bộ k t Identifiler 31

Bảng 2.4 Thành phần trong một giếng điện di 32

Hình 2.1 Minh họa peak alen khi alen là đồng hoặc dị h p 33

Hình 3.1 Hình minh họa kiểu gen của một mẫu có giới t nh nam (male) và một mẫu có giới t nh nữ (female) khi phân t ch trên máy 3130XL 37

Bảng 3.1 Kiểu gen minh họa của 15 locus STR theo hình 3.1 Female 40

Bảng 3.2 Tần suất xuất hiện của các alen trên 15 locus gen hệ Identifiler của người dân tộc Tày 41

Bảng 3.3 Tần suất xuất hiện của các alen trên locus D8S1179 43

Bảng 3.6 Tần suất xuất hiện của các alen trên locus CSF1PO 47

Bảng 3.8 Tần suất xuất hiện của các alen trên locus TH01 49

Bảng 3.13 Tần suất xuất hiện của các alen trên locus vW 55

Trang 6

Bảng 3.14 Tần suất xuất hiện của các alen trên locus TPOX 56

Bảng 3.17 So sánh tần suất xuất hiện của các alen trên locus FG 59

Bảng 3.18 Bảng tổng h p so sánh khả năng phân biệt của 15 locus trong quần thể người dân tộc Tày với các quần thể dân tộc khác 61

Trang 7

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1 Các phương pháp truy nguyên cá thể dùng trong Khoa học hình sự 5

1.1 Các phương pháp truyền thống trong nhận dạng pháp y và khoa học hình sự 5

1.2 Phương pháp giám định DN để truy nguyên cá thể và xác định huyết thống 5

1.2.1 Khái niệm về giám định DN và lịch s phát triển 5

1.2.2 Cơ sở khoa học của giám định DN 7

1.2.2.1 Cấu trúc, chức năng của phân t DN 7

1.2.2.2 Cơ chế phân ly độc lập và tổ h p tự do trong sinh sản hữu t nh 8

1.2.2.3 Khái niệm về Locus, Gen và Alen 9

1.2.2.4 Khái niệm về đa hình trong cấu trúc DN 10

1.2.3 Các phương pháp phân t ch DN trong khoa học hình sự 11

1.2.3.1 Phương pháp lai DN – DNA 11

1.2.3.2 Phương pháp RFLP 12

1.2.3.3 Phương pháp phân t ch DN dựa trên kỹ thuật PCR - Phương pháp FLP 13

1.2.4 Các locus STR s dụng giám định DN hình sự 14

1.2.4.1 Khái niệm VNTR, STR và Mini STR 14

1.2.4.2 Danh pháp đối với marker DN 17

1.2.4.3 Một số locus STR đư c dùng trong giám định DN hình sự 17

1.2.4.4 Các bộ k t thương mại s dụng locus STR trong nhận dạng cá thể người 18

1.2.4.5 Bộ k t nhận dạng mpFlSTR®IdentiflerTM PCR Amplification Kit 21

CHƯƠNG VẬT LIỆU PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 24

1 Vật liệu nghiên cứu 24

2 Hóa chất 24

Trang 8

3 Thiết bị và dụng cụ 25

4 Phương pháp nghiên cứu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

1 Xác định kiểu gen của các locus STR 36

2 So sánh tần suất tương đối của các alen trong quần thể người dân tộc Tày với một số dân tộc khác 40

2.1 Tần suất xuất hiện của các alen trên 15 locus gen hệ Identifiler của người dân tộc Tày 41

2.2 So sánh tần suất xuất hiện của các alen trên mỗi locus với các dân tộc khác 43

2.2.1 Locus D8S1179 43

2.2.2 Locus D21S11 44

2.2.3 Locus D7S820 46

2.2.4 Locus CSF1PO 47

2.2.5 Locus D3S1358 48

2.5.6 Locus TH01 49

2.2.7 Locus D13S317 50

2.2.8 Locus D16S539 51

2.2.9 Locus D2S1338 52

2.2.10 Locus D19S433 53

2.2.11 Locus vWA 55

2.2.12 Locus TPOX 56

2.2.13 Locus D18S51 57

2.2.14 Locus D5S818 58

2.2.15 Locus FGA 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

1 Kết luận 64

2 Kiến nghị 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

Trang 9

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1

thống trong các trường h p cụ thể

Giám định DN sẽ truy nguyên đư c cá thể người, xác định đư c quan hệ huyết thống cha – con, mẹ - con hay quan hệ huyết thống theo dòng bố, dòng mẹ Giám định DN có độ tin cậy cao bởi trong DN tế bào của người có chứa rất nhiều gen, các gen lại có t nh đa alen, mỗi alen chỉ xuất hiện trong quần thể với tần

số rất thấp Xét về cấu trúc di truyền, mỗi cơ thể người có cấu trúc di truyền riêng (trừ các trường h p sinh ra từ cùng một trứng), mặt khác mỗi một quần thể người khác nhau có những đặc điểm di truyền đặc trưng thể hiện bằng sự phân bố tần suất alen (còn gọi là tần suất gen) trong mỗi quần thể Do vậy, trong giám định DN những gen có t nh đa alen cao đư c khảo sát tần suất phân bố các alen thể hiện trong quần thể, từ đó làm cơ sở để phân t ch, đánh giá và kết luận giám định Các gen đư c s dụng trong giám định phải có t nh bảo thủ cao, đa hình, mức độ dị h p

t cao đư c di truyền qua các thế hệ và mang t nh đặc trưng cá thể

Để đánh giá sự sai khác trong tần suất xuất hiện các alen ở mỗi quần thể người khác nhau cần có các nghiên cứu thống kê cụ thể về tần suất alen, tần suất dị

h p t của từng locus, s dụng phép phân t ch có t nh ch nh xác cũng như độ tin cậy cao Đặc biệt là trong những trường h p vụ việc cụ thể, DN thu đư c bị đứt gãy hoặc biến t nh dẫn đến không thể nhân bội tất cả 15 locus STR, khi đó độ ch nh xác của xét nghiệm và đưa ra kết luận đư c t nh dựa trên các locus xuất hiện Vì

Trang 10

vậy việc thống kê tần suất alen, tần suất dị h p t , khả năng phân biệt của từng locus STR có vai trò quan trọng giúp đánh giá đúng mức độ tin cậy của phép phân

t ch và đưa ra kết luận giám định

Trên bình diện quốc tế, nhiều quốc gia đã cơ bản hoàn thành việc khảo sát đánh giá và kết luận về tần suất xuất hiện các alen thuộc các locus STR thể hiện trong quần thể như Mỹ, nh…

Ở Việt Nam do khoa học và công nghệ chưa phát triển kịp thế giới, cộng đồng người đa dạng về nguồn gốc, 54 dân tộc trải rộng, địa bàn phức tạp, kinh ph còn hạn hẹp do vậy công việc khảo sát này mới đang ở giai đoạn khởi đầu Mới có một số công trình nghiên cứu chưa thực sự hoàn chỉnh về tần suất các alen thuộc các locus STR trên cộng đồng người dân tộc Kinh, người dân tộc Mông…Nhằm tiếp tục công tác nghiên cứu khảo sát để có những tổng kết, đánh giá về tần suất các alen, sự xuất hiện hay không của các alen hiếm, những đặc điểm riêng và khác biệt trên cả 54 dân tộc và trong mỗi dân tộc trên các địa bàn phân bố khác nhau phục vụ công tác giám định hình sự và truy nguyên cá thể là hết sức cần thiết

2 Đối tư ng nghiên cứu của ề tài

Trong cộng đồng 54 dân tộc sinh sống tại Việt Nam, người Tày có mặt từ rất sớm, có thể từ n a cuối thiên niên kỷ thứ nhất trước Công nguyên Đây là dân tộc

có số dân đông thứ hai trong 54 dân tộc cư trú ở Việt Nam sau người Kinh, với dân

số khoảng trên 2.000.000 người Dân tộc Tày cư trú tập trung ở trung du và miền núi ph a bắc Việt Nam - chủ yếu là các tỉnh Lạng Sơn, Cao Bằng, Tuyên Quang, Hà Giang, Yên Bái, Bắc Kạn, Thái Nguyên Một số đáng kể ở Gia Lai, Đăk Lắc do di

cư mới và rải rác cư trú ở cả 63 tỉnh thành trong cả nước Người dân tộc Tày có vai trò hết sức quan trọng trong mọi mặt của đời sống - kinh tế - xã hội Thời gian gần đây cùng với sự hội nhập về kinh tế, sự phát triển của khoa học công nghệ Đời sống - kinh tế - xã hội của toàn xã hội nói chung, của cộng đồng người dân tộc Tày nói riêng có sự chuyển biến rõ rệt Đời sống mọi mặt đư c cải thiện t ch cực Tuy

Trang 11

nhiên tình hình tội phạm mà đối tư ng, nạn nhân là người dân tộc Tày cũng diễn biến phức tạp thay đổi theo chiều hướng gia tăng về số lư ng vụ việc, t nh chất nghiêm trọng và thay đổi về phương thức thủ đoạn Các vụ trưng cầu giám định

DN đối với các đối tư ng là người dân tộc Tày ngày một nhiều Tuy nhiên, do địa bàn trải dài và phức tạp, đường xá đi lại còn khó khăn, trình độ cán bộ tại địa phương không đồng đều, thủ đoạn phạm tội ngày càng tinh vi và đều có xu hướng xóa, hủy dấu vết tại hiện trường Do vậy lư ng mẫu thu đư c thường t và có chất

lư ng kém gây khó khăn cho công tác giám định DN , trong đó có bước t nh toán tần suất các alen thuộc các locus STR của quần thể người dân tộc Tày để đưa ra kết luận một cách ch nh xác nhất Cho tới nay chưa có công trình nghiên cứu nào tiến hành khảo sát tần suất các alen thuộc các locus STR của quần thể người dân tộc

Tày Trong bối cảnh đó việc thực hiện đề tài Nghiên cứu tần suất các a en của

15 ocus gen hệ Identifi er thuộc quần thể người d n tộc Tày ứng dụng trong giám ịnh DNA nh n tế bào” là rất cần thiết

3 Phư ng pháp nghiên cứu

- Điều tra khảo sát thực tế: Đảm bảo mẫu thu đư c là ngẫu nhiên và đúng là người dân tộc Tày

- Phương pháp thực nghiệm khoa học: Phân t ch kiểu gen của 200 cá thể người dân tộc Tày theo quy trình giám định DN của Viện Khoa học hình

sự

- Phương pháp thống kê: Để t nh tần suất các alen trong hệ Identifiler, phát hiện ra các alen hiếm đồng thời tìm đư c chỉ số phân biệt của mỗi locus

4 Đ ng g p của ề tài

Kết quả đạt đư c sau khi hoàn thành đề tài:

- Đưa ra đư c tần suất chi tiết các alen thuộc 15 locus STR hệ Identifiler nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết về tần suất trong giám định DN và đóng góp tư liệu vào hệ thống DN hình sự Quốc tế

Trang 12

- Là cơ sở khoa học để xây dựng t nh pháp lý khi phân t ch, đánh giá và kết luận giám định đối với những vụ việc liên quan đến người dân tộc Tày

- Phát hiện các alen hiếm hay đặc trưng (nếu có) trong hệ Identifiler của quần thể người dân tộc Tày, tr giúp công tác định hướng điều tra

- Kết h p với các công trình nghiên cứu và đề tài khác góp phần hoàn thiện kết luận về tần suất của các alen trong 15 locus gen STR hệ Identifiler của người thuộc 54 dân tộc khác nhau tại Việt Nam Trên cơ sở kết quả nghiên cứu của đề tài có thể so sánh rút ra đư c những đặc điểm chung và riêng biệt của mỗi quần thể người khác nhau

Trang 13

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Các phư ng pháp truy nguyên cá thể dùng trong Khoa học hình sự

1.1 Các phư ng pháp truyền thống trong nhận dạng pháp y và khoa học hình sự

Cùng với sự phát triển chung của xã hội loài người thì khoa học nhận dạng

cá thể người, xác định huyết thống cũng có sự phát triển vư t bậc theo thời gian Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định cá thể người, xác định huyết thống

 Phương pháp phục chế khuôn mặt từ xương hộp sọ

 Phương pháp nhận dạng qua Răng

 Phương pháp nhận dạng bằng vân tay

 Phương pháp nhận dạng cá thể bằng các yếu tố di truyền có bản chất Protein Tuy nhiên các phương pháp trên vẫn có những hạn chế nhất định [10, 11]

1 Phư ng pháp giám ịnh DNA ể truy nguyên cá thể và xác ịnh huyết thống

1.2.1 Khái niệm về giám ịnh DNA và ịch sử phát triển

Giám định DN ra đời dựa trên nên tảng sự phát triển của sinh học phân t

và gắn liền với sự phát triển của nó Theo thời gian, cùng với sự phát triển của sinh học phân t , công nghệ thông tin và các ngành khoa học khác có liên quan… Giám định DN ngày càng đư c hoàn thiện và phát triển không ngừng

Truy nguyên cá thể, xác định huyết thống ngày nay trở thành việc làm không phải quá phức tạp Công việc sẽ dễ dàng khi mẫu thu để phân t ch đạt chất lư ng

Lịch s phát triển của giám định DN lần đầu tiên đư c tác giả Ray White mô tả năm 1980, đó là kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - phân t ch t nh đa hình độ dài DN cắt bởi Enzyme giới hạn)

Năm 1985, lec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester nước

nh khi nghiên cứu các đoạn DN mã hóa cho myoglobin trong máu người đã

Trang 14

phát hiện ra trình tự của các bazonito đư c lặp lại một số lần với chiều dài lặp t 10

- 15 bp (base pair) hoặc vài chục bp, các đoạn lặp này đư c gọi là tiểu vệ tinh (minisatellite) hay VNTR (Variable Number of tandem Repeats) Ông cũng phân lập đư c hai đoạn DN và nhân bội chúng, s dụng làm đầu dò (probe) để phát hiện những vùng mà Jeffrey gọi là vùng siêu biến (hypervariable regions) ở các vật liệu di truyền khác nhau Kỹ thuật để Jeffrey phân t ch các đoạn lặp VNTR là kỹ thuật RFLP Đây đư c gọi là bước ngoặt lớn trong lịch phát triển của khoa học hình

sự thế giới nói chung và sinh học pháp lý nói riêng Các tiểu vệ tinh đư c phát hiện thấy ở những vị tr khác nhau trong DN nhân tế bào người Điều đáng chú ý là số lần lặp lại của các đoạn lặp này ở phần lớn các cá thể khác nhau thì khác nhau lec Jeffreys coi đây là đặc điểm rất quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể Giám định DN cho mục đ ch tư pháp ra đời từ đây Ban đầu giám định DN

đư c gọi là giám định vân tay di truyền (DNA - fingerprinting), về sau để tránh sự hiểu lầm giữa giám định đường vân và giám định DNA , Ủy ban nghiên cứu quốc gia Mỹ (NRC) đề nghị đổi là truy nguyên DN (DN - profiling) Cũng vào thời điểm năm 1985, tác giả Karry Mullis đã công bố kết quả th nghiệm thành công phản ứng chuỗi nhân gen PCR (Polymerase Chain Reaction) Thành công này đã gây tiếng vang lớn đối với các nhà sinh học phân t Họ coi đây là một chìa khóa để

mở ra tất cả những hướng nghiên cứu trong sinh học phân t Ch nh vì vậy mà Karry Mullis đư c nhận giải Nobel sau đó t năm Phản ứng PCR có ưu điểm vư t trội so với các phương pháp s dụng kỹ thuật RFLP là chỉ cần một lư ng rất t

DN khuôn ban đầu sau hơn 20 - 30 chu kỳ phản ứng đã tạo ra đư c hàng triệu bản sao nên rất dễ cho việc phân t ch đoạn DN đã đư c nhân bội

Năm 1991, một phương pháp mới trong giám định DN đư c giới thiệu, đó

là phương pháp phân t ch s dụng các đoạn lặp ngắn (STR - Short Tandem Repeats) có gắn chất huỳnh quang vào một đầu của sản ph m PCR nên rất thuận tiện cho việc s dụng laser để phát hiện và phân t ch Phương pháp này còn gọi là

Trang 15

Microsatellite Các STR thường có đoạn lặp từ 2 - 6 bp, vì thế có những tác giả còn gọi chúng là những SSR (Simple Sequence Repeat)

Từ khi có phản ứng PCR, các locus có những đoạn lặp thuộc loại VNTR và STR đều s dụng phản ứng này để nghiên cứu Tuy nhiên các locus STR có ưu điểm hơn vì chúng có trình tự lặp lại ngắn nên có khả năng nhân tổ h p đư c nhiều locus trong cùng một phản ứng PCR và những mẫu đem phân t ch t nhiều có biến

t nh vẫn có thể cho ra kết quả PCR Trong giám định DN s dụng các loại locus thuộc loại VNTR hoặc STR đã đư c các nhà sản suất chế tạo thành những bộ k t thương ph m nên rất thuận l i cho quá trình giám định với độ ch nh xác cao

Ngoài việc giám định DN từ nhân tế bào, từ năm 1984 trong giám định kỹ thuật hình sự người ta còn giám định cả DN ti thể và giám định DN những locus STR nằm trên nhiễm sắc thể giới t nh Y (hệ Y - STR) đư c di truyền theo dòng bố

Hiện nay các quy trình giám định DN nhân, DN ti thể đã có bước tiến

vư t bậc về công nghệ Việc giải mã hệ gen người đã hoàn thành có ý nghĩa hết sức quan trọng trong nghiên cứu di truyền và giám định DN

1 C sở khoa học của giám ịnh DNA

1.2.2.1 Cấu trúc, chức năng của phân tử DNA

Năm 1953, J.Watson và F.Crick đã xây dựng mô hình chuỗi xoắn kép cấu trúc phân t DN Mô hình này gồm hai mạch polynucleotide bắt cặp bổ sung tạo chuỗi xoắn kép Mỗi s i DN là một chuỗi nucleotide gồm 4 loại base nitơ: denin ( ), Guanin (G), Crytosine (C), và Thymine (T) sắp xếp nối tiếp, liên kết với nhau bằng mối liên kết phosphoeste của đường deoxyribose ( C5H10O4) và gốc phosphate đầu 5’ của các base nitơ Hai mạch đơn nối với nhau nhờ các liên kết hydro giữa các base nitơ denin liên kết thymin bằng hai liên kết hydro ( = T): Guanin nối với Cytosine bằng 3 liên kết hydro (C ≡ G) Mỗi mạch đơn là một trình tự có định

hướng với đầu 5’ là gốc phosphate tự do và đầu 3’ là gốc hydroxyl tự do

Trang 16

Trên mạch DN các nucleotide cách nhau 3,4 O, các phân t đường deoxirybose và các nhóm phosphate quay ra ngoài hình thành các liên kết kị nước đảm bảo t nh ổn định cho đại phân t DN

Sau khi có cấu trúc DN đư c phát hiện, người ta tiếp tục nghiên cứu bản chất của quá trình sao chép và các thành phần tham gia vào quá trình này Đến nay các nhà khoa học đi vào tìm hiểu cấu trúc, trình tự cụ thể của DN của các loài cụ thể, trong đó DN của loài người đư c ưu tiên số một

Như đã giới thiệu ở trên, năm 1985 Karry Mullis và cộng sự đã phát minh chuỗi phản ứng nhân gen PCR, đó là kỹ thuật invitro có thể thực hiện giống như trong cơ thể sống, có khả năng tạo ra hàng triệu bản sao của một vùng hoặc chuỗi

DN , sản ph m thu đư c là nguyên liệu đảm bảo cho quá trình phân t ch Nhờ có

kỹ thuật PCR, việc phân t ch cấu trúc đoạn DN đư c thực hiện dễ dàng, thậm ch

cả các mẫu có số lư ng DN rất t

Trong nhân tế bào người có 46 nhiễm sắc thể, sắp xếp thành 23 cặp trong đó

có 22 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới t nh (XX: nữ; XY: nam)

Giám định DN nhân tế bào (nuclear DN ) chủ yếu dựa vào việc phân t ch các locus mà chủ yếu dựa vào đoạn lặp STR hay Mini- STR, VNTR trong vùng intron (vùng không mã hóa, cho đến nay còn chưa rõ t nh chất và chức năng của vùng này), đặc điểm vùng này là rất bảo thủ, t biến đổi Do đó s dụng để xác định

cá thể, huyết thống; các locus s dụng trong giám định phải trên các nhiễm sắc thể khác nhau, đảm bảo cho sự phân ly độc lập các đoạn DN để có t nh đa hình cao Ngoài ra còn dựa vào các locus STR nằm trên nhiễm sắc thể Y (Y-STR) để xác định quan hệ huyết thống theo dòng bố, trên nhiễm sắc thể X để xác định mối quan

hệ giữa những người nữ giới có cùng cha hoặc mẹ

1.2.2.2 Cơ chế phân ly độc lập và tổ hợp tự do trong sinh sản hữu tính

Cơ chế phân ly độc lập trong hình thành giao t và tổ h p tự do trong thụ tinh là nền móng, cơ sở khoa học cho giám định DN Các tế bào sinh dưỡng

Trang 17

(soma) là tế bào lưỡng bội và mang một bộ nhiễm sắc thể đơn bội của cha và một

bộ đơn bội nhiễm sắc thể của mẹ Cứ mỗi cặp nhiễm sắc thể tương đồng trong tế bào lưỡng bội thì có một nhiễm sắc thể có nguồn gốc từ cha, nhiễm sắc thể còn lại

có nguồn gốc từ mẹ Còn các giao t là các tế bào đơn bội do giảm phân sinh ra, chỉ mang một nhiễm sắc thể của mỗi cặp tương đồng Con cái thừa hưởng các đặc t nh

di truyền thông qua 23 nhiễm sắc thể từ tinh trùng của bố và 23 nhiễm sắc thể từ tế bào trứng từ mẹ, đó ch nh là cơ sở khoa học cho việc xác định quan hệ huyết thống

mẹ - con - cha Cặp nhiễm sắc thể này quy định các t nh trạng khác nhau của cơ thể người, đư c bảo tồn, duy trì trong thế hệ và đư c di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Đến nay, người ta đã t nh đư c số lư ng nucleotide ở 46 nhiễm sắc thể có trong nhân tế bào của người là khoảng 3,2 tỷ cặp

Sự khác nhau về số lư ng, thành phần và trật tự sắp xếp của các nucleotide hay các đoạn DN trên 23 cặp nhiễm sắc thể có trong mỗi tế bào của mỗi cá thể là

cơ sở khoa học cho giám định DNA truy nguyên cá thể Hệ gen (genome) của người chứa rất nhiều các trình tự lặp lại khác nhau Những đoạn lặp lại có thể chứa hàng trăm, thậm ch chứa cả ngàn nucleotide ở vùng lặp lại Những vùng này thông thường nằm gần vùng tâm động hoặc vùng đầu của nhiễm sắc thể Những vùng này DN có các đơn vị lặp lại từ 2 đến 6 cặp nucleotide đư c gọi chung là các tiểu

vệ tinh (microsatellite) hay các trình tự lặp lại nối tiếp ngắn STR Những trình tự STR trở thành các chỉ thị di truyền (genetic marker) DN có t nh đa hình cao trong quần thể, đư c ứng dụng rộng rãi trong khoa học để xác định cá thể và huyết thống

1.2.2.3 Khái niệm về Locus, Gen và Alen

Gen là một đoạn DN mang thông tin mã hóa (vùng exon) và không mang thông tin mã hóa (vùng intron)

Locus : là vị tr của gen trên nhiễm sắc thể

len là các trạng thái khác nhau của cùng một gen

Trang 18

Mỗi cá thể đều nhận đư c hai alen, một alen từ bố và một alen từ mẹ Nếu hai alen trên cùng locus của cặp NST hoàn toàn giống nhau thì đư c gọi là đồng

h p t , còn khác nhau đư c gọi là dị h p t

1.2.2.4 Khái niệm về đa hình trong cấu trúc DNA

T nh đa dạng đư c thể hiện ở hai dạng: Đa dạng về trình tự các nucleotide trong đoạn DN và đa dạng về chiều dài

Đa hình về trật tự sắp xếp các nucleotide trong đoạn DN đư c sắp xếp một cách ngẫu nhiên không theo trình tự nhất định nào

Ví dụ: tại locus A ta có trình tự:

Ở cá thể thứ nhất: - AAACTGCTAG -

Ở cá thể thứ hai: - AACCTGCGAG -

Tại vị trí số 3 và vị trí số 8 của hai cá thể có sự khác nhau

Đa hình về chiều dài do khác nhau về số lần lặp lại: Một số gốc nucleotide

đư c lặp đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn DN (Variable number tandem repeat - VNTR) V dụ:

Cá thể thứ nhất: - ATATATATATAT - → 3 đoạn lặp lại ATAT

Cá thể thứ hai: - ATATATATATATATAT - → 4 đoạn lặp lại ATAT Những trạng thái khác nhau của mỗi gen hoặc mỗi locus đư c gọi là alen Mỗi cá thể lưỡng bội đều nhận đư c hai alen, một alen từ bố và một alen từ mẹ Tuy nhiên trong quá trình hình thành và phát triển của loài và cá thể, sự biến đổi trình tự nucleotide trên s i kép DN đã xảy ra Do vậy đối với mỗi locus gen, người ta đã xác định đư c rất nhiều alen Công thức chung để t nh số lư ng kiểu gen trong quần thể như sau:

X: số kiểu gen có trong quần thể

n: số lư ng alen của locus

Trang 19

Đối với locus có 12 alen, số lư ng kiểu gen của các cá thể theo lý thuyết là: 12(12+1)/2 = 78 Trong đó:

 12 kiểu gen đồng h p t

 66 kiểu gen dị h p t Tổ h p của 2 locus gen có 8 alen

và 12 alen, số lư ng kiểu gen thu đư c là:

 Locus 8 alen, số lư ng kiểu gen: X1 = 8x9/2 = 36

 Locus 12 alen, số lư ng kiểu gen: X2= 12x13/2 = 78

 Tổ h p 2 Locus X1 x X2 = 36x78 = 2808 kiểu gen

Theo cách tính toán như trên Tổ h p của 15 locus, khả năng hàng tỷ cá thể mới có hai cá thể có kiểu gen giống nhau

Sự khác nhau trong trình tự và số lư ng nucleotide của các alen trong cùng locus của các phân t DN trên các NST, kết h p với sự phân ly độc lập trong quá trình hình thành giao t và tổ h p tự do của các nhiễm sắc thể trong thụ tinh hình thành h p t là cơ sở cho giám định gen để truy nguyên cá thể

và giám định huyết thống [4]

1 .3 Các phư ng pháp ph n tích DNA trong khoa học hình sự

1.2.3.1 Phương pháp lai DNA – DNA

Đây là phương pháp mà đoạn DN trong mẫu xét nghiệm có thể đư c nhận biết bằng đoạn DN nhân tạo gọi là đầu dò DN (DN probe) có trình tự bổ sung Thông thường đoạn đầu dò có chiều dài 30 – 100bp DN s i kép của mẫu cần xét nghiệm đư c biến t nh thành hai s i đơn bằng nhiệt hoặc kiềm Liên kết hydro bị đứt nhưng các liên kết phosphodiester của khung DN không bị ảnh hưởng Mẫu sau khi biến t nh đư c làm lạnh nhanh để phân t DN không hồi t nh mà vẫn giữ

ở trạng thái s i đơn DN này đư c gắn vào màng (màng nitrocelluloes hoặc nylon) ở nhiệt độ cao Sau đó mẫu đư c ủ với đầu dò DN đã biết trình tự và đư c đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang Nếu trình tự nucleotide của DN của mẫu cần xét nghiệm bổ sung với trình tự của đầu dò thì chúng sẽ liên kết với nhau Sản

Trang 20

ph m lai có thể phát hiện bằng máy chụp X - quang hoặc có thể nhìn thấy qua flim

[1, 2]

1.2.3.2 Phương pháp RFLP

Những nghiên cứu trong lĩnh vực di truyền cá thể chứng minh rằng, phân t

DN có các đoạn trình tự nucleotide mang t nh đặc trưng cá thể Khi s dụng enzyme giới hạn cắt DN của từng cá thể thành những đoạn có k ch thước phân t nhỏ hơn, sau đó so sánh chúng với nhau trên gel điện di người ta thấy rằng những

cá thể khác nhau thu đư c những băng dài ngắn khác nhau Sản ph m DN sau điện di đư c chuyển lên màng nylon và lai với các đầu dò khác nhau, kết quả lai

đư c hiện trên flim cho thấy những đặc trưng của mỗi cá thể khác nhau Phương pháp này đư c gọi là phân t ch đa hình độ dài đoạn DNA đư c cắt bằng enzyme giới hạn – RFLP

Năm 1975 Southem E.M là người đầu tiên đã chuyển DN từ gel lên màng lai nitrocellulose có thể nhận biết các đoạn DN khác nhau của bộ gen đư c cắt bởi các enzyme giới hạn Năm 1980 Wyman và White đã phát hiện ra các đoạn lặp và đến những năm 1990 của thế kỷ XX, người ta đã phát hiện ra trên 3000 đoạn DN

đa hình trong bộ gen của người Một số đoạn DN đa hình trong số đó đã đư c s dụng cho khoa học hình sự để xác định huyết thống và nhận dạng cá thể người Phương pháp RFLP lần đầu tiên đư c áp dụng thành công trong lĩnh vực hình sự vào năm 1983 ở nh để phân t ch mẫu DN tinh dịch của tội phạm trong một vụ án Tuy nhiên, phương pháp này có những hạn chế khi áp dụng trong lĩnh vực khoa học hình sự do:

 Phương pháp RFLP đòi hỏi mẫu DNA phải nguyên vẹn với một lư ng mẫu lớn (ít nhất là 50ng)

 Phóng xạ là một yếu tố độc hại mà không phải bất kỳ một phòng thí nghiệm nào cũng có đủ cơ sở vật chất để tiến hành

Trang 21

 Phân tích RFLP rất phức tạp và mất nhiều thời gian (4 - 8 tuần mới đọc

đư c kết quả của 4 locus gen VNTR khác nhau)

 Phương pháp RFLP không phân t ch đư c toàn bộ các alen của các locus gen VNTR [2, 15]

1.2.3.3 Phương pháp phân tích DNA dựa trên kỹ thuật PCR - Phương pháp AFLP

Phương pháp AFLP [2] là một kỹ thuật s dụng enzyme giới hạn cắt sản

ph m PCR thành các đoạn dài, ngắn khác nhau Sau đó điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide, sự khác biệt về k ch thước và các đoạn DN của hệ gen đư c phát hiện một cách dễ dàng hơn Phương pháp này khắc phục đư c như c điểm của phương pháp RFLP bởi vì chỉ cần một lư ng DN rất nhỏ ban đầu (nanogram) chúng ta có thể xác định đa hình bằng cách nhân bội đoạn đó lên bằng PCR sau đó cắt bằng enzyme giới hạn th ch h p S dụng phương pháp này, người

ta xác định một cách dễ dàng 6 kiểu gen trong hệ thống nhóm máu BO là : ,

AB, OO, AO, BO, BB [16]

Kỹ thuật giải trình tự gen: C hai phư ng pháp giải trình tự gen:

- Giải trình tự theo phương pháp hóa học: Năm 1977, Maxam và Gibert lần đầu tiên phát minh phương pháp giải trình tự DN theo phương pháp hóa học Nguyên lý của phương pháp dựa trên sự biến tính DNA thành các mạch đơn và s

lý bằng các hóa chất với một nucleotide đặc trưng, đọc kết quả điện di bằng máy đọc phóng xạ

- Giải trình tự theo phương pháp enzyme: Cũng vào năm 1977, Sanger đã công bố phương pháp giải trình tự DNA khác với phương pháp của Maxam và Gilbert đó là phương pháp s dụng enzyme hay phương pháp dideoxy nucleotide Đặc trưng của phương pháp này là s dụng dideoxy nucleotide để làm ngưng tổng

h p các mạch đơn DN một cách ngẫu nhiên Trong phản ứng s dụng các thành phần như PCR bình thường nhưng có bổ sung khoảng 1% một trong 4 loại dideoxy

Trang 22

nucleotide - ddNTP cho mỗi loại phản ứng Các dideoxy nucleotide mất nhóm OH

ở vị tr 3’, sẽ làm cho mạch DN đang tổng h p bị ngừng lại

Mỗi loại phản ứng đư c thực hiện trong một ống riêng rẽ Tỷ lệ giữa hàm

lư ng dNTP và ddNTP làm cho quá trình tổng h p DNA thỉnh thoảng mới có một ddNTP đư c s dụng ngẫu nhiên, làm phản ứng tổng h p đoạn DN đó

bị dừng lại

Kết quả đã tạo ra các đoạn oligo nucleotide hơn kém nhau 1 nucleotide và

đư c phát hiện trên gel polyacrylamide

1 .4 Các ocus STR sử dụng giám ịnh DNA hình sự

1.2.4.1 Khái niệm VNTR, STR và Mini STR

VNTR đư c lec Jeffeys phát hiện năm 1985 đư c gọi là Minisatellite, tất

cả các đoạn DN nào có đoạn lặp từ 7 bp trở lên thì đều thuộc hệ VNTR Khi đó

kỹ thuật xác định chủ yếu là dùng RFLP hoặc phương pháp lai có gắn radioactive Một số locus thuộc về VNTR hay đư c s dụng để xác định huyết thống là D1S180

và D17Z5 (YNZ22) sau này mới áp dụng kỹ thuật dùng phản ứng PCR Như c điểm của phương pháp này là đòi hỏi DN với lư ng lớn và chất lư ng cao, không phù h p với mẫu hình sự và không có khả năng tổ h p nhiều locus khác nhau để thực hiện PCR trong cùng một phản ứng (multiplex) vì vậy chỉ áp dụng cho các phản ứng đơn l Do đó chỉ áp dụng cho xác định huyết thống và các nghiên cứu y học khác Phương pháp này có nhiều bất l i trong thực tiễn của lĩnh vực khoa học hình sự vì những lý do sau:

 Phân t ch các đoạn VNTR và kỹ thuật RFLP đòi hỏi mẫu DNA phải nguyên vẹn với một lư ng đủ lớn (tối thiểu 50ng)

 Việc s dụng phóng xạ là một yếu tố bất l i cho sự chuyển giao kỹ thuật đến các phòng th nghiệm

Trang 23

 Phân tích gặp khó khăn và rất độc hại về mặt phóng xạ nếu sơ xuất trong quá trình thực hiện và mất nhiều thời gian đòi hỏi từ 4 - 8 tuần mới thu đư c kết quả với 4 locus VNTR khác nhau

 Kỹ thuật phân t ch RFLP không phân t ch đư c toàn bộ các alen của hầu hết các locus VNTR

STR là những locus DN trong đó các đoạn lặp lại ngắn hay có thể nói

locus STR là các trình tự DN lặp lại nối tiếp ngắn, các trình tự DN lặp lại thường từ 2 - 6 nucleotide Phương pháp phân t ch dựa trên các locus STR là giải pháp kỹ thuật tốt nhất với khả năng phân biệt cao và tốc độ phân t ch nhanh STR ngắn nên có thể đồng thời phân t ch đư c ba hoặc nhiều STR hơn trong cùng một thời điểm Khi phân t ch nhiều STR một lúc ta gọi là đa hệ - Multiplex việc phân

t ch đa hệ rất có giá trị vì chúng có kết quả phân biệt lớn và thành công ngay cả một

số trường h p mẫu lẫn hoặc đã bị phân hủy phần nào Các STR có thể dễ dàng nhân bội tăng số lư ng bằng phương pháp PCR đồng thời Số lư ng đoạn lặp trong STR rất đa dạng ở các cá thể nên tạo ra nhiều tổ h p khác nhau

Tuy nhiên một locus STR đư c s dụng cho mục đ ch xác định cá thể người phải thỏa mãn một số yêu cầu nhất định nên không phải đoạn lặp nào cũng có thể

s dụng đư c

 Locus STR phải có t nh đa dạng và mức độ dị h p t cao Điều này giúp các nhà phân t ch chỉ s dụng một số locus tối thiểu đã đạt đư c sự phân biệt cá thể một cách tốt nhất

 Các lous STR có độ dài trung bình từ 100 - 400 bp so với các đoạn đa hình ngẫu nhiên khác (VNTR) các đoạn DNA ngắn nên có độ bền cao, ít bị đứt gẫy dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh Do vậy phương pháp PCR thực hiện sẽ hiệu quả hơn Những đoạn DN tuy có t nh đa hình nhưng độ dài lớn, trong thực tế chỉ có thể thực hiện phương pháp PCR với những mẫu DN đư c tách chiết từ các mẫu ph m sinh học còn mới hoặc đư c bảo quản trong điều kiện tốt

Trang 24

 Các locus chứa đoạn STR đư c di truyền độc lập do chúng nằm trên các NST khác nhau Điều này đảm bảo cho t nh độc lập của những locus Các STR thông thường có rất nhiều alen, độ dài các alen thông thường khác nhau về số đoạn lặp Do vậy việc s dụng các STR có chiều dài dưới 400 base dễ dàng phân tích bằng phương pháp điện di trong gel polyacrylamide là yêu cầu cần thiết trong quá trình lựa chọn

Vì thế những trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp lại gồm 4 nucleotide, đư c ứng dụng nhiều hơn so với các đoạn lặp hình thành từ hai hoặc ba nucleotide, v dụ (CCA)n, (CA)n, những đoạn đa hình từ các đoạn lặp lại từ các đơn vị lặp gồm 5 nucleotide, v dụ (CC G)n hoặc 6 nucleotide như (CC C )n chưa đư c s dụng nhiều, mặc dù đã có một số th nghiệm bắt đầu nghiên cứu Các đoạn lặp ( G T) hoặc (G T ) là trình tự lặp đư c s dụng nhiều nhất trong khoa học hình sự

Nhiều đoạn đa hình có trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp từ 4 nucleotide đã

đư c nghiên cứu và đáp ứng đư c yêu cầu của quy trình phân t ch cá thể người Các đoạn này có đặc t nh như sau:

 Có t nh đa hình và mức độ dị h p t cao ( > 70 % )

 Nằm trên các NST khác nhau nên di truyền độc lập

 Dễ dàng phối h p thành bộ phức khi thực hiện PCR

 Sản ph m PCR ổn định

 Sự đột biến gen thấp

 Biết trước k ch thước alen nên tránh đư c đánh giá nhầm lẫn Kích thước càng nhỏ càng có giá trị trong trường h p mẫu bị biến tính Với những ưu điểm trên, các locus STR đư c s dụng rộng rãi trong giám định DN nhân tế bào để xác định huyết thống và truy nguyên cá thể

Mini STR về thực chất vẫn là những đoạn STR nhưng đư c thiết kế

mồi với mục đ ch sao chép đoạn STR ngắn hơn nhằm thu đư c những đoạn

Trang 25

STR từ mẫu đã đư c phân hủy, biến t nh phần nào hay nói cách khác là lư ng

mẫu t (hàm lư ng DN khuôn t nh bằng picogam) [13]

1.2.4.2 Danh pháp đối với marker DNA

Tên các locus marker DN đư c đặt theo tên của gen nếu locus này nằm một phần hoặc nằm toàn bộ trong gen [16] V dụ marker STR TH01 từ gen Tyroisine Hydroxylase của người nằm trên NST số 11 Chữ TH xuất phát từ chữ cái đầu Tyroisine Hydroxylase, phần 01 của ký hiệu TH01 xuất phát từ vùng intron

1 (vùng không mã hóa protein) của gen Tyroisine Hydroxylase, đôi khi tiếp đâu ngữ HUM đư c thêm vào đầu danh pháp của marker này để xác định đó là từ bộ gen người (Human) vì vậy locus STR này sẽ đư c gọi là HUM TH01 hay TH01

Các marker DN nằm ngoài vùng gen thì đư c xác định bởi vị tr của chúng trên NST

V dụ: STR locus D5S818 và DYS019 đó là những marker không nằm trong vùng gen Trong trường h p này chữ D có nghĩa là DN , còn số tiếp theo là số thứ

tự của NST chữ S thực chất là trình tự đơn l của DN marker con số cuối cùng là

vị tr marker nằm trên mỗi NST riêng biệt, con số này là duy nhất Đối với marker

DN nhận dạng cá thể

V dụ: marker DN D16S539 có nghĩa là D: DNA, 16 Chromomsome số

16, S: Single copy sequence, 539 vị tr thứ 539 xác định trên NST số 16

1.2.4.3 Một số locus STR được dùng trong giám định DNA hình sự

Trang 26

 Số alen của locus đã quan sát, đư c ký hiệu: 7,8,9,10,11,12,13,14

1.2.4.4 Các bộ kít thương mại sử dụng locus STR trong nhận dạng

 Loại thứ 1: Trình tự lặp lại đơn giản gồm một loại trình tự lặp, ví dụ:

TPOX, CFS1PO, D5S818, D13S317, D16S539

Trang 27

 Loại thứ 2: Trình tự lặp lại đơn giản nhưng số alen không thực sự đồng

nhất ví dụ: TH01, D18S51, D7S820

 Loại thứ 3: Trình tự lặp lại kết h p với các alen không đồng nhất, ví dụ:

vWA, FGA, D3S1358, D8S1179

 Loại thứ 4: Trình tự lặp lại phức tạp, ví dụ: D21S11, LPL năm 1993 hãng

Promega đưa ra bộ kit đầu tiên gồm 3 locus STR là CFS1PO, TPOX, TH01, phát hiện bằng nhuộm bạc Bộ CTT cho xác xuất trùng lặp1/500 song rất dễ s dụng nên

đư c dùng nhiều tại Mỹ và nhiều nước khác trên thế giới

Bộ STR phục vụ cho ngành pháp lý đư c đánh dấu huỳnh quang đầu tiên là:

TH01, FES/FPS, vWA và F13A01 Đây là bộ đánh dấu thế hệ thứ nhất, xác suất

hai cá thể trùng nhau khi s dụng 4 locus này khoảng 1/10000 Bộ kit thế hệ thứ 2

có 6 locus là: TH01, vWA, FGA, D8S1179, D18S51, D21S11 Với xác suất hai cá

thể trùng nhau là 1/5000000 Những locus này đều s dụng phương pháp huỳnh quang để phát hiện nên đòi hỏi kinh ph và trang bị tương đối lớn và đồng bộ

Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều công ty thương mại

đã phát triển nhiều bộ kit nhận dạng có thể phân tích hàng chục locus trong một phản ứng giúp cho việc nhận dạng cá thể có độ ch nh xác gần như tuyệt đối

Bảng 1.1 Các bộ kit thương mại và marker STR phổ biến

xuất

Năm sản xuất

Các oại ocus STR

TH01, TPOX, CFS1PO

Amelogenin, TH01, TPOX,

CFS1PO

D5S818

Trang 28

plusTM

Applied

CFS1PO, D13S317, D7S820, D5S818, TPOX, CFS1PO, TH01, vWA, CFS1PO

Applied

D16S539, D13S317, D7S820, D5S818, vWA, CFS1PO, D16S539, D13S317, D7S820

TPOX, CFS1PO,vWA, TH01, D13S317, D7S820, D8S1179, D16S539, D18S51, D21S11, D5S818, D3S158, FGA Penta D, Penta E, Amelogenin

D3S1358, vWA, FGA, D5S818, TPOX, CFS1PO, D16S539, TH01, D13S317, D7S820, D8S1179, D18S51, D21S11, Penta D, Penta E, Amelogenin

PowerPlexTM Identifler TM Applied

D3S1358, vWA, FGA, D5S818, TPOX, CFS1PO, TH01, D16S539, TH01, D18S51, D21S11, D2S1338 D19S433, D7S820, D8S1179 Amelogenin AmpFlSTR® profiler

FGA, TH01, vWA, D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11, SE33, Amelogenin

FGA,TH01, vWA, CFS1PO, D16S539, D8S1179, D18S51, D2S1338, D19S443, SE33, D21S11, Amelogenin

Trang 29

Hiện nay, các bộ kit thương mại ngày càng đư c cải tiến cho kết quả ch nh xác hơn gấp nhiều lần so với trước Đồng thời, quy trình phân t ch và thời gian thu nhận kết quả cũng đư c rút ngắn rất nhiều lần Hai bộ kit đư c s dụng phổ biến nhất trên thế giới là PowerPlexTM 16 của hãng Promega và PowerPlexTM

IdentiflerTMcủa hãng pplied Biosytems, hai bộ kit này đều nhân đồng thời 16 locus trong cùng một phản ứng vì vậy độ ch nh xác cao [13, 14]

1.2.4.5 Bộ kít nhận dạng AmpFlSTR ® Identifler TM PCR Amplification Kit

Hiện nay, đa số phòng th nghiệm trên thế giới đều s dụng bộ k t này Đây

là sản ph m của hãng Applied Biosytems - Mỹ cho mục đ ch xét nghiệm huyết thống và giám định DN hình sự Đây là bộ kit chuyên dụng cho nhận dạng cá thể

s dụng 15 locus STR và một marker xác định giới t nh gồm có: TPOX,

CFS1PO, D3S138, D5S818, D8S1179, D18S51, TH01, vWA, D16S539, D13S317, D7S820, D21S11, FGA (13 locus gen tiêu chu n hệ thống CODIS và 2

locus đư c bổ sung: D2S1338, D19S443) Bộ kit phân t ch s dụng huỳnh quang 5

màu, tương th ch hoàn toàn với phần mềm phân t ch STR chuyên dụng Gene Mapper ID, đồng thời có thể tự động hóa toàn bộ quá trình từ chu n bị cho đến kết quả phân t ch Vì vậy, cho kết quả phân t ch ch nh xác và nhanh hơn rất nhiều so với phương pháp khác Ở Việt Nam các trung tâm xét nghiệm hàng đầu như học viện Quân Y, Viện Khoa học hình sự… cũng đang s dụng bộ kit này để phục vụ cho công tác giám định gen, nhận dạng pháp y Viện khoa học hình sự cũng đã triển khai hệ thống robot tách chiết tự động (3 hệ thống robot của hãng Tecan - thụy sỹ) kết h p với s dụng bộ kit Identifler nhằm nâng cao hiệu quả giám định gen hình sự

Identifiler® PCR mplification Kit (200 phản ứng) bao gồm:

Trang 30

deoxynucletide triphosphates, và bovine serum albumin in bufer with 0.05% sodium azide, dung tích: 1.1 ml/tube

 mpFLSTR Identifiler™Primer Set: Bộ Primer chu n gồm 01 ống dung t ch 1.1 ml chứa các primer gắn huỳnh quang và primer không gắn huỳnh quang (fluorescently labeled primers and non-labeled primer)

 mpliTaq Gold DN polymerase: Enzyme s dụng nhân bội DN trong bộ kit là 02 lọ mpliTaq gold DN polymerase với nồng độ 5 U/ l, thể

t ch: 50 l/lọ

 mpFLSTR Control DN 9947 : ng chứa 0.1ng/ l human female cell lineDNA in 0.05% sodium azidde and bufer 0.3 ml

 mpFLSTR Identifiler™ llelic Ladder: Bộ thang DN chu n gồm

01 ống dung t ch 50 l chưa mpFLSTR Identifiler llelic Ladder của các amplified alleles

Bảng 1.2 Vị tr các locus STR thuộc bộ k t mpFlSTR®

Identifiler®trên NST

và Dye lable tương ứng

Trang 31

Trang 32

CHƯƠNG VẬT LIỆU PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN

HÀNH NGHIÊN CỨU

1 Vật iệu nghiên cứu

Mẫu DN khuôn: Là mẫu máu đư c thu trên giấy FT card chuyên dụng Mẫu thu từ các cá thể người dân tộc Tày (200 mẫu) đư c xác định rõ nguồn gốc, thuộc các độ tuổi khác nhau, vùng cư trú khác nhau và không có quan hệ huyết thống trong vòng ba đời đã đư c thu mẫu máu và bảo quản

theo đúng quy trình

2 Hóa chất

Nhóm hóa chất cho tách chiết DNA

 Chelex® 100 resin (Bio-tad/Mỹ)

 PrepFiler™ Forensic DNA Extraction kit (P/N 4392852)

 QIAamp DNA Investigator kit (50) QIAGEN-Mỹ)

 FTA card và FTA purification kit

 Dung dịch PBS (Photphate Buffer Salin)

Nhóm hóa chất dùng cho định lượng

 Quantiblot Human DNA Quantitation kit của Perkin Elmer (Mỹ)

Nhóm hóa chất dùng cho PCR

 S dụng bộ k t mpFlSTR Identifiler PCR mplification Kit (Trong đó có s n các thành phần tham gia PCR: Primer, dNTPs,

Taq-DNApolymerase, Buffer, nước cất đề ion)

Nhóm hóa chất dùng cho điện divà phân tích gen

 POP-4™ Polymer (P/N 4352755)

Trang 33

 Máy định lư ng acid nucleic: Nanodrop

 Máy điện di mao quản: 3131/XL Genetic Alalyzer

Dụng cụ

 Pipet các loại

 ng Eppendorf các loại

 Plate 96 giếng

 Đầu côn các loại và găng tay [6]

4 Phư ng pháp nghiên cứu

Quy trình tóm tắt quá trình thực hiện th nghiệm:

Thu mẫu máu → Tách chiết DN → Định lư ng DN (bằng phương pháp Quantiblot) → PCR (nhân gen bằng bộ kit Indentifiler)/Máy PCR 9700 (ABI-Mỹ) → Chạy điện di (trên máy ABI 3130XL) → Phân t ch kết quả và

x lý số liệu

Thu mẫu máu: Dùng bút bấm chuyên dụng ch ch đầu ngón tay của đối

tư ng cần thu mẫu Thu mẫu máu khoảng một giọt nhỏ từ vết ch ch lên giấy

FT , đưa vào phong bì bảo quản

Trang 34

- Quy trình tách chiết bằng Chelex 100 như sau:

1 Cắt khoảng 1,5x1,5mm mẫu trên giấy FT cho vào ống ly tâm 1,5 ml

2 Cho 1 ml dung dịch PPS hoặc nước tinh khiết đã kh ion vào ống

3 Trộn điều và ủ ở nhiệt đọ phòng khoảng 15-30 phút để r a mẫu

4 Chu n bị dung dịch 5% chelex 100 bằng cách pha chelex với nước kh ion

5 Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong khoảng 3 phút

6 Hút loại bỏ toàn bộ dịch nổi

7 Thêm 200 µl dung dịch chelex 5% vào ống đựng mẫu

8 Ủ hỗn h p ở 560C trong vòng 30 phút

9 Vortex trong 5 giây

10 Ủ hỗn h p ở 1000C trong khoảng 8 phút

11 Vortex trong 5 giây

12 Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong 3 phút

13 Thu dịch nổi cho sang ống mới Đây là dung dịch chứa DNA cần thu [6]

Trang 35

Định lượng DNA: Sản ph m DN thu đư c sau quá trình tách chiết

đư c định lư ng bằng bộ kit “Quantiblot Human DN Quantitation Kit” của

hãng Perkin Elmer (Mỹ)

- Nguyên tắc: Định lư ng DN bao gồm quá trình lai đầu dò có gắn biotin với DN cần định lư ng Mẫu DN cần định lư ng đư c cố định trên màng nilon S dụng đầu dò đặc hiệu đối với đoạn lặp của locus gen D17Z1

để lai Một enzim liên kết HPR - S gắn vào đầu kia của Biotin Enzim này xúc tác quá trình oxy hóa của Chromogen TMB, để tạo thành kết tủa màu xanh trên màng nilon Lư ng kết tủa màu xanh sẽ biểu thị tỷ lệ lư ng DN

- Cách tiến hành:

1 Chu n bị pha mẫu DN chu n để lai xác định nồng độ chu n

2 Chu n bịmẫu DN cần định lư ng

3 Gắn DN lên màng nilon

4 Sau đó lai giữa hai đầu dò và mẫu Giai đoạn này s dụng đầu dò D17Z1 và enzim HRP-SA

5 Giai đoạn hiện màu, s dụng Chromogen TMB và H2O2

6 Đánh giá kết quả căn cứ vào mức độ kết tủa màu và mẫu DN chu n

để đánh giá Độ đậm nhạt khác nhau tùy thuộc vào lư ng DN nhiều hay t [6]

Trang 36

- Kỹ thuật này đã thay thế kỹ thuật RFLP vì những lý do sau:

1 Độ nhạy và t nh đặc hiệu cao

2 Tiết kiệm thời gian và dễ dàng trong công tác giám định

3 Có thể xác định đư c đối với cả những mẫu có số lư ng ít, chất lư ng thấp

4 Có thể đồng thời xác định đư c nhiều locus khác nhau và tự động hóa

đư c quy trình phân tích

- Thành phần tham gia phản ứng PCR bao gồm:

1 Đoạn DN khuôn: Đó là các đoạn DN sau tách chiết từ các mẫu xét nghiệm DN mạch đơn hay mạch đôi đều có thể s dụng đư c trong phản ứng PCR Nguồn DN khuôn có thể lấy đư c từ các mô hoặc các tổ chức khác nhau của cơ thể Hàm lư ng DN nhân thu đư c sau tách cũng khác nhau tùy thuộc vào từng mô, tổ chức cụ thể [16]

Một phản ứng PCR thông thường s dụng lư ng DN khuôn trong khoảng

từ 10ng - 1µg

2 Mồi (primer): Mồi là những đoạn oligonucleotide mạch đơn giản dài

15 - 30bp có trình tự bổ sung với trình tự base của hai đoạn đầu (locus) DN để khởi đầu quá trình tổng h p DN Mồi đư c thiết kế để chỉ gắn vào vị tr duy nhất trên DN Mồi càng dài thì khả năng tổng h p ch nh xác đoạn DN đ ch càng lớn

3 Các nucleotide (dNTPs): dNTPs là nguyên liệu cho phản ứng tổng

h p DN Chúng gồm hỗn h p của bốn loại nu dATP, dTTP, dCTP, và dGTP Ngoài bốn loại nêu trên người ta có thể s dụng một số nucleotide đư c gắn thêm biotin hoặc dioxygenin tùy theo mục đ ch s dụng và nghiên cứu Nồng độ dNTPs thường dùng cho phản ứng PCR cơ bản từ 10 - 200 M cho mỗi loại nucleotide

4 Taq - DNA polymerase: Taq - DN polymerase là enzyme chịu nhiệt

đư c chiết xuất từ vi khu n suối nước nóng có tên khoa học là Thermus aquaticus

Trang 37

Đặc điểm nổi bật của loại enzyme này là không bị bất hoạt ở nhiệt độ cao và có khả năng xúc tác phản ứng tổng h p DNA Taq - DN polymerase có trọng lư ng phân

t 94kDalton, có hoạt t nh 5’ - 3’ exonuclease và hoạt động tốt nhất ở 70 – 800C tốc

độ tổng h p trung bình đạt 75 nucleotide trong 1s Nồng độ Taq - DN polymerase trong phản ứng PCR cơ bản là 1 - 1,5 UI

5 Dung dịch đệm (buffer): Thành phần dung dịch đệm thay đổi tùy theo loại enzyme đư c s dụng trong phản ứng PCR nhưng quan trọng nhất là ion

Mg2+ Ion Mg2+ rất cần thiết cho quá trình liên kết các dNTPs và hoạt tính enzyme Taq - DNA polymerase Nồng độ MgCl2 trong hỗn h p phản ứng PCR cơ bản thay đổi từ 0,5 - 5,0 mM

- Một quá trình PCR đặc trưng bao gồm một chu kỳ để nhân đôi một trình tự

DN đặc hiệu Trước chu kỳ đầu tiên thường có một bước khởi động nóng ở 940

C trong vòng 4 - 5 phút để làm biến t nh hoàn toàn DN khuôn Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn lặp lại sau:

1 Giai đoạn 1 (biến tính): DN s i khuôn đư c biến t nh ở nhiệt độ 94 -

950C trong khoảng 30 giây - 1 phút Khi đó các liên kết hydro trong phân t bị b gẫy và DN s i kép bị tách thành hai s i đơn

2 Giai đoạn 2 (gắn mồi): Mồi là các đoạn Oligonucleotide dài từ 15-30 nucluotide

có trình tự bổ sung với DN khuôn Nhiệt độ gắn mồi khoảng 40 o

C - 70oC (tùy thuộc

Tm của mồi) và kéo dài 1 phút

3 Giai đoạn 3 (kéo dài chuỗi): Nhiệt độ đư c tăng lên đến 72oC là nhiệt độ

th ch h p để cho DN polymerase kéo dài chuỗi Thời gian phản ứng tùy thuộc độ dài của đoạn DN cần nhân bản, thường kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút

Trong th nghiệm sau khi thu đư c các mẫu DN đạt tiêu chu n, tiến hành phản ứng PCR khuếch đại các mẫu bằng bộ kit Amp/STR® Identifiler

®

PCR Amplification Kit Đây là bộ k t đặc hiệu nhân cùng lúc 15 locus STR

và 1 marker giới tính, thành phần của một phản ứng gồm có:

Định dạng
Số trang	75
Dung lượng	0,97 MB