21 3.4.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học .... Nội d
Trang 1-
HÀ VĂN HƯỚNG
Tên đề tài:
ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI TRỒNG TỚI KHẢ NĂNG
TẠO QUẢ THỂ CỦA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO Cordyceps militaris
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành/ ngành: Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 - 2016
Thái Nguyên – năm 2016
Trang 2-
HÀ VĂN HƯỚNG
Tên đề tài:
ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI TRỒNG TỚI KHẢ NĂNG
TẠO QUẢ THỂ CỦA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO Cordyceps militaris
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành/ ngành : Công nghệ Sinh học Lớp : K44 – CNSH
Khoa : CNSH - CNTP
Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hướng dẫn: 1 TS Dương Văn Cường
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập em
đã tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nuôi
trồng tới khả năng tạo quả thể của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps
militaris”
Kết thúc thời gian thực tập tại Phòng Sinh học Phân tử - Viện Khoa học
Sự sống – Đại học Thái nguyên, đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp
Để đạt được kết quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực tập
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo Dương Văn Cường, thầy giáo Bùi Tuấn Hà, kĩ sư Ma Thị Trang và kĩ sư Vũ Hoài Nam đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài
Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập; cảm ơn bạn
bè đã giúp đỡ em trong thời gian vừa qua
Mặc dù bản thân đã cố gắng hết sức nhưng do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên bản khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Hà Văn Hướng
Trang 4DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Thành phần hóa học chủ yếu của hai loài Đông trùng hạ thảo quan
trọng 8 Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 19 Bảng 3.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến khả năng
sinh trưởng của sợi nấm 23 Bảng 3.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến sự hình
thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học 23 Bảng 3.4: Nghiên cứu ảnh hưởng của bột nhộng tằm đến khả năng sinh
trưởng của sợi nấm 24 Bảng 3.5: Nghiên cứu ảnh hưởng của bột nhộng tằm đến sự hình thành và
phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học 25 Bảng 3.6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển
của mầm quả thể, năng suất sinh học 26Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến
khả năng sinh trưởng của sợi nấm 28 Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến
sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh 30Bảng 4.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của bột nhộng tằm đến khả năng
sinh trưởng của sợi nấm 34 Bảng 4.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của bột nhộng tằm đến sự hình
thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học 36Bảng 4.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và
phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học 40
Trang 5DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 4 Hình 3.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo 21 Hình 4.1 Đặc điểm hình thái hệ sợi, mật độ hệ sợi giữa 3 công thức môi
trường A, môi trường B, môi trường C sau 10 ngày cấy giống 29 Hình 4.2.: Đặc điểm hình thái, chiều dài quả thể nấm ở 3 công thức môi
trường nền khác nhau 31 Hình 4.3: Nấm Cordyceps militaris được nuôi trồng ở 3 môi trường A, môi
trường B, Môi trường C 32 Hình 4.4: Đặc điểm hình thái hệ sợi, mật độ hệ sợi giữa 4 công thức với tỉ lệ
% nhộng tằm khác nhau sau 9 ngày cấy giống 35 Hình 4.5 Đặc điểm hình thái, chiều dài quả thể nấm ở 4 công thức tỉ lệ phần
trăm bột nhộng tằm khác nhau 37 Hình 4.6 Ảnh hưởng của tỉ lệ bột nhộng tằm đến sự hình thành và phát triển
của mầm quả thể, năng suất sinh họ 38 Hình 4.7 : Đặc điểm hình thái, chiều dài quả thể nấm ở 4 công thức nhiệt độ
khác nhau 41
Trang 6
ĐTHT : Đông trùng hạ thảo LSD : Least Singnificant Difference Test
MTN : Môi trường nền NAA : α-Naphthalene acetic acid
Trang 7MỤC LỤC
Trang
Phần 1: MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2
1.2.1 Mục tiêu 2
1.2.2 Yêu cầu của đề tài 3
1.3 Ý nghĩa của đề tài 3
1.3.1 Ý nghĩa lý thuyết 3
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Cơ sở khoa học 4
2.1.1 Tên gọi Đông trùng hạ thảo 4
2.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu và phân loại Đông trùng hạ thảo 5
2.1.3 So sánh giữa 2 loài ĐTHT Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris 7
2.1.4 Thị trường và giá 10
2.2 Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 11
2.2.1 Giá trị dược liệu theo y học cổ truyền Đông Á 11
2.2.2 Giá trị dược liệu theo y học hiện đại 12
2.2 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Cordyceps militaris trong và ngoài nước 14
2.2.1 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Cordyceps militaris trên thế giới 14
2.2.2 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Cordyceps militaris trong nước 16
Trang 8Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
19
3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 19
3.1.1 Đối tượng 19
3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 19
3.1.3 Vật liệu nghiên cứu 19
3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 20
3.2.1 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 20
3.2.2.Thời gian tiến hành nghiên cứu 20
3.3 Nội dung nghiên cứu 20
3.4 Phương pháp nghiên cứu 20
3.4.1 Phương pháp nghiên cứu 20
3.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 21
3.4.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học 22
3.4.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của bột nhộng tằm đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học 23
3.4.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học 25
3.4.3 Chỉ tiêu theo dõi 26
3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 27
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
4.1 Ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học. 28
Trang 94.1.1 Ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến khả năng sinh trưởng
của sợi nấm. 28
4.1.2 Ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học. 30
4.2 Ảnh hưởng của bột nhộng tằm đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học. 33
4.2.1 Ảnh hưởng của bột nhộng tằm đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm 33 4.2.2: Ảnh hưởng của bột nhộng tằm đến sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học 36
4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học 39
4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học 39
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43
5.1 Kết luận 43
5.2 Đề nghị 43
Trang 10Phần 1
MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề
Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) tên khoa học Cordyceps là các loài nấm ký
sinh trên một số loài côn trùng Vào mùa Đông nấm xâm nhiễm, ký sinh vào
cơ thể côn trùng Đến mùa Hè, hệ sợi nấm phát triển thành cây nấm nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu Chính vì vậy mà nấm có tên gọi Đông trùng hạ thảo, có nghĩa là mùa đông là côn trùng, mùa hạ là cây
cỏ
Từ y học cổ truyền Trung Hoa cho đến y học hiện đại của các nước
phát triển Mỹ, châu Âu đều công nhận giá trị dược lý của ĐTHT Loài nấm Cordyceps militaris là một trong những loài thuộc họ Cordyceps, trong quả thể nấm có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học như: Cordycepin
(3'-deoxyadenosine) là một chất tương tự nucleoside có các hoạt tính sinh học bao gồm kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u, hoạt động kháng virus [9],[ 38] Kim et al (2006) đã chứng minh rằng cordycepin có khả năng ức chế dependently collagen, chất gây ra hiện tượng kết tập tiểu cầu dẫn đến hiện tượng vỡ mảng xơ vữa trong động mạch vành [18] Adenosine được cho là có
tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch Mannitol của Cordyceps militaris cũng có chức năng hoạt tính sinh học, lợi tiểu, chống các chứng ho
ra máu [25] Superoxide dismutise để phòng ngừa và điều trị xuất huyết não, viêm loét, loại bỏ tình trạng viêm, loạn nhịp tim, phù nề, nhiễm độc, bệnh thấp khớp, thấp khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương bức xạ, nhiễm độc thuyên tắc Đông trùng hạ thảo còn có chứa nhiều loại vitamin (trong 100g đông trùng hạ thảo có 0,12 g vitamin B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K ) ngoài ra còn có khoảng 25 - 30 % protein
Trang 11Do có công công dụng rất tốt nên ĐTHT tự nhiên đang được săn đón rất nhiều với giá thành lên tới hàng tỉ đồng cho 1 kg Mặc dù vậy, sản lượng ĐTHT tự nhiên thu hoạch được rất ít Trước tình hình đó, các nhà khoa học trên thế giới như Mỹ, Thái Lan, Trung Quốc, đã tiến hành nghiên cứu nuôi ĐTHT trên môi trường nhân tạo có hầu hết các hoạt tính sinh học của ĐTHT
tự nhiên nhưng lại có giá thành rẻ hơn đáng kể
Tại Việt Nam, do điều kiện nuôi cấy rất nghiêm ngặt, chi phí lớn nên ĐTHT hiện mới chỉ được sản xuất bởi một số đơn vị như Công ty Thiên Phúc, Viện Bảo vệ thực vật với giá thành vẫn còn rất cao Để nuôi cấy ĐTHT trên môi trường nhân tạo phải trải qua hai giai đoạn chính là giai đoạn nhân giống cấp một và giai đoạn nuôi trên giá thể Hiện nay ở nước ta các nhà khoa học đã và đang tiến hành nghiên cứu phân lập các chủng nấm ĐTHT, xây dựng được quy trình nhân giống cấp một và đã có nhiều đơn vị đã sản xuất
thành công tạo quả thể nấm ĐTHT Cordyceps militaris Tuy nhiên việc tìm
kiếm thông tin về nuôi trồng loài nấm này trên các phương tiện thông tin, mạng internet còn gặp nhiều khó khăn Đặc biết có rất ít các nghiên cứu về giai đoạn nuôi trên giá thể được công bố, trong khi đó giai đoạn nuôi trên giá thể được coi là giai đoạn quan trọng nhất trong việc tạo ra quả thể và có được các hoạt chất quý hiếm
Xuất phát từ thực tiễn, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá ảnh
hưởng của điều kiện nuôi trồng tới khả năng tạo quả thể của nấm Đông
trùng hạ thảo Cordyceps militaris”
1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
Trang 121.2.2 Yêu cầu của đề tài
- Xác định được ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể,
năng suất sinh học
- Xác định được ảnh hưởng của bột nhộng tằm đến khả năng sinh
trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học
- Xác định được ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học
1.3 Ý nghĩa của đề tài
1.3.1 Ý nghĩa lý thuyết
Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố cơ bản tới sự sinh
trưởng và phát triển, hình thành thể quả nấm Cordyceps militaris sẽ là căn cứ
khoa học cho việc hoàn thiện và đưa ra quy trình sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo vào thực tiễn phục vụ đời sống con người
Trang 13Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học
2.1.1 Tên gọi Đông trùng hạ thảo
Đông trùng hạ thảo là tên gọi chung chỉ hiện tượng những loài nấm
thuộc lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes [13] Cordyceps là chi nấm thuộc họ Clavicipitaceae họ này thuộc lớp Ascomycetes Trong các loài thuộc chi Cordyceps, Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris là hai loài phổ biến và được nghiên cứu nhiều [21]
Tại Trung Quốc Cordyceps militaris có tên gọi là Đông trùng Hạ thảo
(Dong Chong Xia Cao) hoặc là Trùng thảo (Chong Cao) Bản chất là hiện tượng bào từ nấm kí sinh vào ấu trùng hoặc nhộng của bọ cánh phấn, côn trùng Bào tử nấm xâm nhiễm vào ấu trùng, đến khi điều kiện môi trường thuận lợi sợi nấm ăn kín ấu trùng, làm chết ấu trùng, các sợi nấm phát triển thành quả thể mọc ra từ thân ấu trùng Quả thể có hình thon dài, có màu vàng
cam, chiều dài quả thể từ 2-8cm, chiều ngang khoảng 0,5cm [10]
Hình 2.1 Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris [12]
Quả thể nấm
Vật chủ nhộng
Trang 142.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu và phân loại Đông trùng hạ thảo
Đông trùng hạ thảo được xem là rất quý, hiếm và những câu truyện mang tính thần thoại và truyền thuyết liên quan đến loài nấm này được lưu truyền trong nhiều thiên niên kỷ Ghi nhận đầu tiên về nấm Đông trùng hạ thảo được thực hiện tại Trung Quốc vào năm 620 sau Công nguyên vào Triều đại nhà Tạng (618-907 Sau Công nguyên) Sự ghi nhận này đã phơi bày bản chất sinh học từ những câu truyện huyền thoại và truyền thuyết về Đông trùng
hạ thảo Đông trùng hạ thảo là một sinh vật tồn tại hàng năm được chuyển một cách thần bí từ động vật chuyển sang thực vật vào mùa hè và sau đó lại từ thực vật chuyển sang động vật vào mùa đông Tiếp sau đó có nhiều công trình được xuất bản với nội dung về loài nấm Đông trùng hạ thảo này của các học giả xứ Tây Tạng từ thế kỷ 15 đến thế kỷ thứ 18, trong đó có công trình đầu tiên được cho là có cơ sở khoa học tin cậy nhất mô tả về nấm Đông trùng hạ thảo của Wu-Yiluo vào năm 1757, trong cuốn sách Dược điển, dưới Triều đại Qing Theo sau các học giả xứ Tây Tạng, việc phát hiện ra giá trị của Đông trùng hạ thảo thuộc về những người chăm bò trên núi Hymalaya ở Tây Tạng cũ và Nepal, họ thấy rằng những chú bò gặm cỏ ăn phải cây nấm Đông trùng hạ thảo vào mùa xuân đã trở nên cuồng nhiệt, bò đực luôn tìm
và theo sát bò cái [28]
Đông trùng hạ thảo là các loài nấm thuộc ngành phụ nấm túi (Ascomycotina), được xem như là một dược liệu nổi tiếng từ cổ xưa Khoa học phát triển, ngày nay loài người đã phát hiện hàng trăm loài nấm Đông trùng hạ thảo trên 6 lục địa ở các điều kiện sống rất khác nhau nhưng đều có những giá trị dược liệu tương tự Theo y học truyền thống của Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng chữa trị nhiều chứng bệnh: chữa bệnh về thận, bệnh về phổi, bệnh tim và suy giảm chức năng sinh lý của đàn ông và đàn bà, chống suy nhược, phục hồi sức khỏe, chữa trị ung thư, chứng nấc,
Trang 15giảm đau, bệnh trĩ và chống lão hóa [25]
Đối với các nước phương Tây, nấm Đông trùng hạ thảo cũng được biết đến từ rất sớm, đầu thế kỷ thứ 18 Xuất bản đầu tiên về loài nấm này do một Linh Mục người Pháp có tên là Perennin Jean Baptiste du Halde kể về những điều mà ông chứng kiến một vị thuốc thần bí chữa bệnh cho các Vua, Quan thuộc Vương triều của Trung Quốc Những bức minh họa của ông đã lôi cuốn
sự quan tâm về khoa học và đã lóe lên một quan niệm mới là sử dụng nấm Đông trùng hạ thảo trong phòng trừ sâu hại Cho đến năm 1843, Đức cha, Tiến sỹ M.J Berkeley đã xuất bản kết quả nghiên cứu của mình về nấm Đông
trùng hạ thảo tại tạp chí Y học New York và đặt tên nấm là Sphaeria sinensis Đến năm 1878, tên này mới được gọi là Cordyceps sinensis bởi Pier Andrea
Saccardo [28]
Chi nấm Cordyceps đã được thu mẫu và định loại trên 400 loài khác nhau
và theo hệ thống phân loại truyền thống các loài này được xếp vào họ
Clavicipitaceae Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm về cấu trúc
phân tử, các loài nấm trên được xếp trong 162 đơn vị phân loại, bao gồm các chi
chủ yếu là: Cordyceps, Elaphocordyceps, Metacordyceps và Ophiocordyceps thuộc 2 họ Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae [28] Tuy nhiên cho đến
nay người ta mới chỉ tập trung nghiên cứu 2 loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với con người
Mao X.L (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái, công dụng và ảnh minh
họa cho 13 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, đó là các loài: Cordyceps barnesii, Cordyceps capiata, Cordyceps crassispora, Cordyceps gunii, Cordyceps hawkesii, Cordyceps kyushuensis, Cordyceps martialis, Cordyceps militaris, Cordyceps nutans, Cordyceps ophioglossoides, Cordyceps sinensis, Cordyceps sobolifera, Cordyceps tubeculata
Trang 16Sung Jae Mo (2004) đã mô tả đặc điểm hình thái và hình ảnh của 25
loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Hàn Quốc, bao gồm các loài sau: Cordyceps adaesanensis, Cordyceps agriota, Cordyceps bifisispora, Cordyceps crassispora, Cordyceps discoideocapiata, Cordyceps formicarum, Cordyceps gemiculata, Cordyceps gracilis, Cordyceps heteropoda, Cordyceps ishikariensis, Cordyceps kyushuensis, Cordyceps martialis, Cordyceps militaris, Cordyceps nutans, Cordyceps ochraceostromata, Cordyceps ophioglossoides, Cordyceps oxycephala, Cordyceps pentatoni, Cordyceps pruinosa, Cordyceps rosea, Cordyceps scarabaeicola, Cordyceps sinensis, Cordyceps sphecocephala, Cordyceps tricentri, Cordyceps yongmoonensis [29]
Tại Nhật Bản Imazeki và cs (1988) đã mô tả và giới thiệu bằng hình
ảnh 33 loài nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps, đó là các loài: Cordyceps agriota, C longissima, C yakushimensis, C sobolifera, C heteropoda, C tricentri, C coccidiicola, C nutans, C pruinosa, C crinalis,
C militaris, C takaomontana, C neovolkiana, C nakazawai, C purpureostromata, C ferruginosa, C nigripoda, C roseostromata, C annullata, C clavata, C atrovirens, C gracilioides, C michiganensis., C subssesilis, C stylophora, C macularis, C discoideocapitata, C sphecocephala, C japonensis, C japonica, C ophioglossoides, C capita, C intermedia f michinoluensis [17]
Như vậy, loài nấm Cordyceps militaris có sự phân bố ở cả 3 nước
Trung Quốc, Nhật bản và Hàn Quốc Ở các khu hệ nấm này có nhiều nét khá tương đồng với Việt Nam
2.1.3 So sánh giữa 2 loài ĐTHT Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris
Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris là hai loài nấm được các nhà
khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều bởi nó có nhiều hoạt chất
Trang 17sinh học tốt cho sức khỏe con người như: Cordycepin, Adenosin, D-manitol, Polysaccaris, đây đều là những hợp chất có lợi cho hệ tuần hoàn, hệ miễn
dịch, tim mạch hô hấp của con người [21]
Loài nấm Cordyceps sinensis thường phân bố ở độ cao trên 2000m so
với mực nước biển ở khu vực Đông Á, tập trung chủ yếu ở vùng núi cao nguyên Tây Tạng – Trung Quốc Giá trị dược liệu của loài nấm này đã được biết đến hơn 2000 năm trước ở Trung Quốc [36] Tuy nhiên hiện nay sản
lượng thu hoạch nấm Cordyceps sinensis ngoài tự nhiên lại rất ít khoảng
80kg/năm không đủ để cung cấp cho nhu cầu thị trường, hơn nữa các sản phẩm này có thể không được đảm bảo chất lượng vì không có sự xác thực và kiểm tra Mặt khác hiện nay các nhà khoa học đang khó khăn trong việc tìm
ra môi trường phù hợp để có thể nuôi loài nấm này mọc được quả thể trên môi trường nhân tạo [24]
Không giống như loài nấm Cordyceps sinensis loài nấm Cordyceps militaris phân bố hầu khắp trên thế giới với khoảng độ cao rộng hơn Tuy
nhiên mật độ phân bố của loài nấm này không cao, hơn nữa quả thể ngoài tự nhiên khá nhỏ, khó tìm thấy trong tự nhiên [11],[ 15] Ban đầu các nhà khoa
học nghiên cứu sản xuất nấm Cordyceps militaris trên giá thể là các loài côn
trùng [22] Sau đó thử thành công trên các chất nền hữu cơ khác nhau và môi trường lỏng [35] Các nhà khoa học đã chứng minh rằng so với nuôi
Cordyceps sinensis, nuôi Cordyceps militaris dễ dàng hơn trong cả môi
trường rắn và môi trường lỏng truyền thống khi bổ sung hàm lượng nitơ và cacbon hợp lí
Thành phần hóa học, các hoạt chất sinh học của 2 loài nấm được thể hiện trong Bảng 1.1
Bảng 1.1: Thành phần hóa học chủ yếu của hai loài Đông trùng hạ thảo
quan trọng
Trang 19Việc nuôi Cordyceps militaris trên môi trường lỏng và môi trường rắn
khi bổ sung thêm nguồn nitơ và carbon phù hợp có thể thay thế việc sử dụng
loài nấm Cordyceps sinensis khi chúng cũng có những thành phần và hàm
lượng hoạt chất tương tự [12],[21]
2.1.4 Thị trường và giá
Theo DANIEL WINKLER vào cuối năm 2006 giá bán lẻ nấm
Cordyceps chất lượng tốt lên đến 240.000 CNY( Nhân dân tệ Trung Quốc)
tương đương khoảng 32.000 USD tại các thành phố lơn của Trung Quốc, cũng như các Hồng Kông hay San Fancisco của Mỹ [32] Công ty trách
Trang 20nhiệm hữu hạn Công nghệ Baoli – Laoning - Trung Quốc phân tích về thị
trường thực phẩm chức năng và nấm Cordyceps militaris cho rằng: Tình hình
kinh tế xã hội và mức sống của người dân trên toàn thế giới đã được cải thiện nên thị trường thực phẩm chữa bệnh có tiềm năng rất lớn Giá trị sản xuất các mặt hàng thực phẩm chữa bệnh đạt 70 tỷ nhân dân tệ ở Trung Quốc năm
2004 Nhật Bản đạt mỗi năm 3,6 tỷ đô la mỹ trong những năm 1990 Mỹ đạt mỗi năm 3,5 tỷ đô la mỹ trong những năm 1990 Các sản phẩm thực phẩm
chức năng và thuốc từ Cordyceps militaris chiếm thị phần lớn Một số ví dụ
về giá sản phẩm được sản xuất từ nguồn nguyên liệu Cordyceps militaris như
sau: sản phẩm viên nang Ultraceps được sản xuất từ Cordyceps của công ty Zeolite với giá 41,95 đô la mỹ/lọ, 90 viên/lọ, 650 mg/viên Cordygen5 với giá 19,95 đô la mỹ/lọ 90 viên [32]
2.2 Nghiên cứu về giá trị dƣợc liệu của nấm Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris
2.2.1 Giá trị dược liệu theo y học cổ truyền Đông Á
Đỗ Tất Lợi (1977) cho rằng Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bổ, dùng để chữa trị thần kinh suy nhược, chữa ho, ho lao, bổ tinh khí, chữa đau lưng, bổ thận Liều dùng 6-12 gam với hình thức ngâm rượu [2]
Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp và Nguyễn Thế Hải (2005) đã tổng quan các tại liệu nghiên cứu của Trung Quốc, Hàn Quốc và tài liệu ở các nước phương Tây về giá trị dược liệu của loài nấm Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris và Cordyceps sinensis Các loài nấm này có thể dùng
để chữa trị cho 25 loại bệnh khác nhau nên các tác giả đã gọi nấm Đông trùng hạ thảo là thần dược Theo y học cổ truyền của Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị thành công các chứng rối loạn lipit máu, viêm phế quản mạn, hen phế quản, viêm thận mạn tính, suy thận, rối loạn
Trang 21nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính, ung thư phổi
và thiểu năng sinh dục Tại Viện nghiên cứu nội tiết Thượng Hải (Trung Quốc), Đông trùng hạ thảo đã được dùng để chữa liệt dương có hiệu quả tốt [39]
Hoàng Khánh Toàn (2009) đưa ra một số bài thuốc có Đông trùng hạ thảo như sau:
Rượu đông trùng hạ thảo nhân sâm: Đông trùng hạ thảo và nhân sâm lượng bằng nhau, ngâm trong rượu tốt, mỗi ngày uống một chén nhỏ Công dụng: Bổ thận, tráng dương dùng cho người bị suy nhược, liệt dương
Canh đông trùng hùng áp: Đông trùng hạ thảo 10g, vịt đực 1 con, rượu trắng, gừng tươi, hạt tiêu, gia vị vừa đủ Vịt làm thịt rồi bỏ Đông trùng hạ thảo vào trong bụng, hầm nhừ, cho gia vị, ăn thịt, uống nước, mỗi tuần một lần Công dụng: Bổ hư, trợ dương dùng cho người bị liệt dương, người bị suy giảm ham muốn tình dục [3]
2.2.2 Giá trị dược liệu theo y học hiện đại
Những năm gần đây, rất nhiều tính chất dược lý của loài nấm này được nghiên cứu một cách khoa học và đã được công bố trên các tạp chí chuyên ngành, tiêu biểu một số công trình nghiên cứu như sau:
Tác dụng chống ung thư, đây được coi là giá trị dược liệu quan trọng được rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và công bố:
+ Dịch chiết từ thể quả Cordyceps militaris có tác dụng chống ung thư,
hiệu quả đối với hai loại tế bào màng trong tĩnh mạch rốn là HT1080 và F10 do có khả năng chống lại sự tạo thành các mạch máu mới bằng cách giảm
B16-sự biểu hiện của bFGF, một trong những nhân tố kích thích quá trình này Do
có vai trò kìm hãm quá trình tạo thành các mạch máu mà có thể ngăn chặn được quá trình di căn và sự phát triển của tế bào ung thư [34]
+ Dịch chiết Đông trùng hạ thảo có tác dụng kìm hãm sự phát triển của
Trang 22tế bào ung thư vú, ung thư phổi [9]
+ Dịch chiết bằng nước ấm nấm Cordyceps militaris có tác dụng kìm
hãm sự phát triển của dòng tế bào ung thư máu ở người bằng cách gây ra hiện tượng tự chết của các tế bào thông qua sự hoạt hoá enzym caspase-3 [23]
+ Thí nghiệm của Kim G.Y và đồng tác giả (2006) cũng cho kết quả tương tự với khả năng điều trị ung thư máu của dịch chiết từ quả thể nấm
Cordyceps militaris Các nhà khoa học cũng đã sử dụng dịch chiết từ loài nấm
này để thử nghiệm trên các dòng tế bào bình thường và các dòng tế bào ung thư Kết quả cho thấy hai dòng tế bào K562 (tế bào ung thư máu-leukemia) và Du145 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt-prostate carcinoma) bị ức chế mạnh bởi dịch chiết bằng dung môi butanol
+ Cordycepin gây ra hiện tượng tự chết của các dòng tế bào ung thư NB-4 và U937 Kết quả cho thấy sau khi điều trị bằng Cordycepin 2 dòng tế bào này có những chuyển biến đặc trưng của quá trình tự chết tế bào như co rút di động, ngưng tụ nhiễm sắc thể và blebbing tế bào chất Hiện tượng tự chết của các tế bào phụ thuộc vào sự hoạt hóa của enzyme caspase, các enzym caspase trong tế bào thì lại được kích hoạt bởi Cordycepin Để chứng minh thêm quá trình tự chết của tế bào gây ra bởi sự kích hoạt các caspase phụ thuộc vào Cordycepin, tác giả đã sử dụng chất ức chế Z-DEVDfmk để ngăn chặn sự hoạt hóa caspase – 3 kết quả cho thấy các dòng tế bào có sự phân chia [26]
Tác dụng hỗ trợ điều trị bênh tiểu đường Một nghiên cứu được thực hiện tại khoa tim mạch tại bệnh viện Nankai Thiên Tân – Trung Quốc từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 01 năm 2014 Nhóm nghiên cứu trên 120 bệnh nhân bị bệnh tiểu đường loại 2 – tức là khi đói lượng glucose trong huyết tương lớn hơn 7.0 mmol/l Số bệnh nhân này được chia ngẫu nhiên thành 3
Trang 23nhóm: nhóm 1 điều trị cơ bản, nhóm 2 được điều trị bằng việc sử dụng viên nang Đông trùng hạ thảo loại corbrin 2g sử dụng 3 lần/ngày và 3 ngày trước khi đi chụp động mạch, nhóm 3 sử dụng viên nang Đông trùng hạ thảo corbrin loại 3g sử dụng 3 lần/ngày và 3 ngày trước khi chụp động mạch Kết quả cho thấy bệnh nhân khi sử dụng viên nang có sự giảm và ổn định đường huyết hơn khi điều trị thông thường Tuy nhiên trong nghiên cứu này nhóm nghiên cứu chỉ xác định lượng đường huyết ở mức ngắn hạn trước và sau 3 ngày điều trị, cần có thêm các nghiên cứu với số lượng mẫu lớn hơn và thời gian dài hơn để có thể kết luận rõ hơn tác dụng của Đông trùng hạ thảo chữa bênh tiểu đường loại 2 [37].
Chống lão hoá, chống các chứng viêm tấy được thể hiện trong công trình nghiên cứu của Ahn Y J cs (2000) ông cho rằng nấm Đông trùng hạ thảo
có tác dụng chống viêm nhiễm kìm hãm sự phát triển của một số virut, vi
khuẩn và nấm[9] Ngoài ra nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris còn
có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipit, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp [20]
2.2 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Cordyceps militaris trong và
ngoài nước
2.2.1 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Cordyceps militaris trên thế giới
Nuôi trồng thể quả nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được
tiến hành ở nhiều nước trên thế giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và
Mỹ Tại Trung Quốc có các trang trại lớn chuyên nuôi trồng loài nấm này ở các tỉnh: Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tô Chỉ tính một trang trại nuôi trồng loài nấm này tại Kaiping, Quảng Châu, sản lượng một năm thu được 100.000 kg sản phẩm Sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo
Trang 24từ nuôi trồng nhân tạo đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới kể cả các nước phương Tây và mang lại lợi nhuận cao cho các doanh nghiệp và người nuôi trồng nấm Tại Thái Lan, Wongsa P và cs (2005) đã nghiên cứu phân lập và
sự sinh trưởng của hệ sợi và hình thành bào tử chồi của nấm Cordyceps ký
sinh kiến Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone Yeast Extract Glucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trường MEA (Malt Extract Agar) được dùng để phân lập và nuôi cấy hệ sợi [33]
Jae Sung Kim và đồng tác giả (2006), tại Hàn Quốc, đã sử dụng nhộng
tằm để nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps militaris Nhộng tằm được đựng
trong trong các lọ nuôi cấy, khử trùng ở 121oC trong thời gian 90 phút, để nguội, cấy giống nấm, 20 ngày sợi nấm ăn kín toàn bộ giá thể, trong điều kiện nhiệt độ 20-25oC, cường độ ánh sáng 500-700 lux đã hình thành mầm thể quả Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau: 40 g/lít đường glucose,
10 g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O [19]
Hai loài Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris được tập trung
nghiên cứu nuôi lấy sinh khối hệ sợi nhiều nhất [27] Duck-Hyun Cho và đồng tác giả (2003), tại Hàn Quốc, đã tiến hành nghiên cứu sự sinh trưởng của hệ sợi của 3 chủng ký hiệu là CHO-7208; CHO-7845; CHO-7846 của loài
Cordyceps militaris trên môi trường dinh dưỡng và quá trình hình thành thể quả nấm Cordyceps militaris với giá thể là sâu non loài Allomyrina dichotoma
Linnaeus Kết quả cho thấy sự sinh trưởng của hệ sợi của các chủng khác nhau là khác nhau trong nuôi cấy thuần khiết Chỉ có 2 chủng CHO-7208 và
CHO-7846 hình thành thể quả khi sử dụng sâu non Allomyrina dichotoma
Trang 25Linnaeus làm giá thể Chiều dài của thể quả đạt 51-56 mm sau 27 ngày nuôi cấy [40]
Tại thành phố Hayward, bang California, Mỹ, Công ty công nghệ sinh
học BIOKEN đã nuôi trồng quy mô công nghiệp loài nấm Cordyceps militaris Sản phẩm được tiêu thụ trong nước và thị trường quốc tế
2.2.2 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Cordyceps militaris trong nước
Ở nước ta nghiên cứu về nấm Cordyceps đang trong giai đoạn mới đạt
được một số kết quả Việc nghiên cứu mang tính chất điều tra, phát hiện, thu
thập và bước đầu phân lập chúng trong điều kiện Việt Nam
Nghiên cứu về thành phần loài:Trịnh Tam Kiệt (1996) đã nêu danh mục các loài nấm Đông trùng hạ thảo có ở Việt Nam thuộc họ Clavicipitaceae có 3
loài thuộc chi Cordyceps đó là Cordyceps martialis Speg., Cordyceps sinensis
và loài Cordyceps sobolifera Các tác giả đã ghi nhận nấm Đông trùng hạ
thảo có phân bố ở các tỉnh của Việt Nam như: Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm
Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Tây Ninh [1]
Năm 2009, Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam và trường Đại học
Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT ( Cordyceps nutans )
tại khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang Tác giả Phạm Quang Thu đã thông báo phát hiện được loài nấm ĐTHT và được giám định là loài
Cordyceps nutans Đây là loài nấm đầu tiên được mô tả và ghi nhận có phân
bố tại Việt Nam [4]
Tại vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Phạm Quang Thu đã phát
hiện nấm ĐTHT Cordyceps Gunnii [5]
Trang 26Tại vườn Quốc gia Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai đã phát hiện nấm ĐTHT
Cordyceps militaris ( Nấm nhộng trùng thảo) [6]
Nấm ĐTHT Cordyceps militaris lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở
Việt Nam Loài nấm này phân bố ở rừng tự nhiên có độ cao từ 1.900 m đến 2.100 m so với mực nước biển Ký chủ của loài này là nhộng thuộc bộ cánh
vẩy Lepidoptera, nấm dài 2 – 6,5 cm, hình chuỳ, phần thân và cuống nhỏ,
phần đầu( phần sinh sản) phình to có chiều rộng đến 0,6 cm Màu sắc của phần cuống nấm và phần sinh sản khác nhau, phần cuống nấm nhẵn có màu
da cam nhạt, phần sinh sản có màu da cam đậm và nhiều mụn nhỏ Thể quả dạng chai được cắm rất lỏng lẻo hoặc cắm sâu một phần vào mô của nấm ở phần sinh sản Túi bào tử có kích thước 300 – 510 µ x 3,5 – 5µ, phần mũ gắn trên túi thể quả có kích thước 3,5 – 5 µ [6]
Một số khu vực khác cũng đang được triển khai tìm kiếm và nghiên
cứu nấm Cordyceps, thường thì Cordyceps ở Việt Nam phân bố ở những khu
rừng nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 800 m đến 2000 m
Trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung
Quốc cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militarris PGS.TS Phạm Thị Thuỳ, Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát
triển nấm Đông trùng hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người Kết quả đã nghiên cứu và xác định được 3 loài nấm Đông trùng hạ thảo đó là:
- Cordyceps nutans ở Cúc Phương, Ninh Bình và Tam Đảo, Vĩnh Phúc
- Cordyceps militaris ở Vũ Quang, Hà Tĩnh
- Cordycep sp1 ở Sơn Động, Bắc Giang
Tác giả cũng đã xác định được một số giá trị dược liệu của nấm Đông
trùng hạ thảo Cordyceps militaris gồm chất Cordycepin, HEAA, một số
vitamin và một số nguyên tố vi lượng [7]
Trang 27Trần Văn Mão (2002) đã nêu sơ bộ về môi trường nhân giống, kỹ thuật
nuôi trồng thể quả và nuôi cấy sinh khối hệ sợi nấm Cordyceps sinensis Tuy
nhiên, những thông tin này đều tập hợp từ các nguồn tài liệu tham khảo của Trung Quốc
Phạm Quang Thu (2009) đã thử nghiệm nuôi trồng thể quả trên giá thể
nhân tạo chủng nấm CM1 loài Cordyceps militaris, chủng giống đang nuôi
trồng với quy mô công nghiệp tại Quảng Châu, Trung Quốc Kết quả đã thu được thể quả nấm phát triển bình thường trên giá thể [6]
Năm 2015, Trung tâm Công Nghệ Sinh học – Viện Di truyền Nông nghiệp công bố bước đầu nghiên cứu công nghệ nuôi trồng Nhộng trùng thảo
( Cordyceps militaris L.ex Fr.) ở Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho biết loại
gạo Lứt có thể sử dụng làm cơ chất nền phù hợp trong môi trường nuôi trồng nhộng trùng thảo với năng suất sinh học cao nhất [8]
Trên đây là một số kết quả bước đầu về việc nghiên cứu Đông trùng hạ
thảo Cordyceps ở Việt Nam Qua các nghiên cứu trên cho thấy việc tiếp tục
nghiên cứu và đi sâu hơn vào kỹ thuật trồng loài nấm này để cung cấp nguyên liệu cho ngành sản xuất thực phẩm chức năng là hoàn toàn cần thiết tại Việt Nam Đáp ứng nhu cầu bảo vệ sức khỏe con người
Trang 28Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ phần trăm bột nhộng tằm đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng
suất sinh học
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển của
mầm quả thể, năng suất sinh học
3.1.3 Vật liệu nghiên cứu
Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Lò vi sóng Cốc đong, ống đong Glucose
Nồi hấp vô trùng Bình tam giác K2HPO4.3H2O
Tủ an toàn sinh học cấp II Giấy thấm Nhộng tằm
Trang 29Nhiệt kế Bình nuôi 5x10cm Nước dừa
3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
3.2.1 Địa điểm tiến hành nghiên cứu
Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên
3.2.2.Thời gian tiến hành nghiên cứu
Từ tháng 12/2015 đến tháng 6/2016
3.3 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến
khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của bột nhộng tằm đến khả năng
sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và
phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp nghiên cứu
Chuẩn bị Giống (nuôi lắc trong 120 giờ)
Chuẩn bị môi trường
Nuôi trong phòng tối
Nuôi trong phòng chiếu sáng
Cấy giống
Trang 30Hình 3.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo
Trong nội dụng của đề tài sử dụng chủng giống ĐTHT chất lượng tốt từ Viện Khoa học Sự sống Giống sinh trưởng bình thường, không bị nhiễm nấm, không bị nhiễm khuẩn để làm vật liệu tiến hành thí nghiệm
Các bước thí nghiệm (Ting-chi Wen et al, 2014)[30]:
Bước 1: Chuẩn bị giống
Sử dụng môi trường YMK được sử dụng để nhân giống dịch thể: 20 g/l glucose, 5 g/l peptone, 0,5 g/l MgS04, 1.31 g/l K2HPO4.3H2O ở nhiệt độ
23oC, pH 6.3, tốc độ lắc 150 vòng/phút , thời gian nhân giống là 120 giờ
Bước 2: Chuẩn bị môi trường
Sử dụng 20g gạo Lứt và 32ml môi trường nền cho vào bình nuôi thủy tinh được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 30 phút
Bước 3 Cấy giống
Dùng pipet 5ml hút lấy 2ml giống nấm 5 ngày tuổi, cấy vào bình nuôi chứa giá thể và môi trường nền đã được hấp khử trùng Thực hiện cấy giống trong tủ an toàn sinh học cấp 2 đã được bật tia UV trong 30 phút
Bước 4: Nuôi trong phòng tối, nhiệt độ 20oC để thúc đẩy tăng trưởng
hệ sợi làm hệ sợi nấm ăn kín giá thể
Bước 5: Khi sợi nấm ăn kín giá thể, chiếu sáng với cường độ 500lux với thời gian 12h/ngày
Bước 6: Theo dõi, đánh giá theo các nội dung nghiên cứu
3.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, 3 hoặc 4 công thức tùy theo mỗi thí nghiệm , mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 mẫu
Trang 313.4.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học
Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể,
năng suất sinh học Tôi tiến hành thực hiện cấy giống nấm Cordyceps militaris lên 3 môi trường khác nhau
Môi trường A gồm: Glucose 40g/l, peptone 5g/l, MgSO4.7H2O 1,5g/l,
K2HPO4 1,5g/l, NAA 1mg/l
Môi trường B gồm: Glucose 10g/l, peptone 10g/l, MgSO4.7H2O 1g/l,
K2HPO4 1g/l, NAA 1mg/l
Môi trường C: Môi trường nước dừa tự nhiên
Tôi sử dụng gạo lứt Khang dân 18 làm giá thể kết hợp với các công thức môi trường đã được quy định, pH môi trường được điều chỉnh về mức 6,3
Nấm sau khi được cấy trên các loại môi trường được chuyển vào nuôi trong điều kiện nuôi không chiếu sáng để kích hoạt Sau khi sợi nấm ăn kín cơ chất nấm được chuyển sang điều kiện nuôi chiếu sáng 12h/ngày, cường độ chiếu sáng là 500lux và độ ẩm là 80%
Thí nghiệm 1 nghiên cứu giai đoạn phát triển của hệ sợi tới trước khi hình thành quả thể Thí nghiệm 2 nghiên cứu từ giai đoạn hình thành mầm quả thể đến lúc quả thể được thu hoạch Từ đó xác định được môi trường nền phù hợp nhất đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học để phục vụ cho các nội dung tiếp
theo
Thí nghiệm 1: : Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền khác nhau đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm
