Thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho các Enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp βcarotene trong vi khuẩn Escherichia coli

Các nghiên cứu về tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp β-carotene đang gặt hái được những thành công nhất định.. Hiện nay, việc sản x

-

VŨ HOÀI NAM

TÊN ĐỀ TÀI:

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GENE MÃ HÓA CHO CÁC

ENZYME XÚC TÁC CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP β- carotene

TRONG VI KHUẨN Escherichia coli

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành : Công nghệ sinh học

Thái Nguyên, 2015

VŨ HOÀI NAM

TÊN ĐỀ TÀI

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GENE MÃ HÓA CHO CÁC

ENZYME XÚC TÁC CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP β- carotene

TRONG VI KHUẨN Escherichia coli

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi đã nhân được sự giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình Nhân dịp hoàn thành khóa luận: Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo T.s Dương Văn Cường, người đã tận tình giúp đỡ hướng dẫn chỉ bảo, giải đáp thắc mắc và củng cố kiến thức cho tôi

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Th.S Ma Thị Trang, cán bộ phòng thí nghiệm công nghệ gene đã trực tiếp chỉ bảo kĩ năng làm việc, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm đã đào tạo và dạy dỗ tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong quá trình học tập nghiên cứu

Thái Nguyên, tháng 06 năm 2015

Sinh viên

Vũ Hoài Nam

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

EDTA : Etilendiamin tetraaxetic acit

IPTG : Isopropyl Thiogalactoside

NCBI : Nation Cetrer for Biotechnology Information

X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactoside

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Hàm lượng carotenoid có trong thực vật 15

Bảng 3.1: Các thành phần của vector pRSET-A 27

Bảng 3.2: Các thành phần của vector pET22b(+) 28

Bảng 3.3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 31

Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cắt với EcoRI và HindIII 36

Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt với KpnI và EcoRI 36

Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt với EcoRI và XbaI 37

Bảng 3.7: Thành phần phản ứng gắn nối 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của β-carotene 4

Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa β-carotene thành vitamin A 6

Hình 2.3: Biểu đồ khảo sát thị trường carotenoid năm 2010 và dự kiến đến năm 2018 9

Hình 2.4: Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MAV 11

Hình 2.5: Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MEP 12

Hình 2.6: Quá trình sinh tổng hợp carotenoids từ IPP và DMAPP 13

Hình 2.7: Quá trình chuyển hóa phyopene thành lycopene 13

Hình 2.8: Tổng hợp β-carotene từ lycopene 14

Hình 2.9: Sơ đồ tổng hợp β- carotene của BASF 16

Hình 2.10: Sơ đồ tổng hợp β-carotene của Roche 17

Hình 2.11: Quá trình chuyển hóa β-carotene dưới sự tham gia các gene Crt 19

Hình 2.12: Cơ chế kiểm soát sự phiên mã của T7 promoter 20

Hình 2.13: Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pRSET 22

Hình 2.14: Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pET 22

Hình 2.15: Tương tác giữa protein tái tổ hợp chứa 6xHis và giá thể Niken 23

Hình 3.1: Cấu trúc vector biểu hiện pRSET 26

Hình 3.2: Cấu trúc vector biểu hiện pET22b(+) 28

Hình 3.3: Quy trình thiết kế vector pR-iEIBY 33

Hình 3.4: Quy trình thiết kế vector pET22iEIBY 34

Hình 4.1: Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pR-iEIY 41

Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra sự có mặt của gene crtY 42

Hình 4.3: Hình minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn gen crtY trên vector pR-iEIY 43

Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra chiều gắn gene crtY trên pRiEIY 44

Hình 4.5: Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pR-iEIBY 45

Hình 4.6: Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra sự có mặt của gene crtB 46

Hình 4.7: Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pET22-Y 47

Hình 4.8: Kết quả điện di chọn lọc dòng pET22-Y với enzyme EcoRI 47

Hình 4.9: Hình minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn gen crtY trên vector pET22-Y 48

Hình 4.10:Kết quả điện di kiểm tra chiều gắn crtY trên vector pET22-Y 49

Hình 4.11: Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pET22-iEIBY 49

Hình 4.12: Kết quả điện di chọn lọc dòng pET-iEIBY với enzyme XbaI và EcoRI 50

Hình 4.13: Hình minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn cụm gene iEIB trên vector pET22iEIBY 51

Hình 4.14: Kết quả điện di kiểm tra chiều gắn cụm iEIB trên vector pET22-iEIBY 52

Hình 4.15: Kết quả biểu hiện vector pR-iEIBY trong chủng E coli BL21 (DE3) 53

Hình 4.16: Kết quả biểu hiện vector pET22iEIBY trong chủng E coli BL21 (DE3) 54

Hình 4.17: Kết quả so sánh so sánh biểu hiện của hai hệ vector pRSET-A và pET22b(+) 55

MỤC LỤC

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 3

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.4 Ý nghĩa của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Khái quát về sắc tố β-carotene 4

2.1.1 Cấu trúc và tính chất lý hóa 4

2.1.2 Vai trò của sắc tố β-carotene với con người 5

2.1.2.1 Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người 5

2.1.2.2 Ứng dụng của β-carotene trong công nghiệp 8

2.1.3 Con đường tổng hợp β-carotene 10

2.1.4 Nguồn cung cấp β-carotene 14

2.1.4.1 Nguồn cung từ thực vật 14

2.1.4.2 Nguồn cung từ vi sinh vật 15

2.1.4.3 Nguồn cung từ tổng hợp hóa học 16

2.1.5 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene tự nhiên 18

2.2 Vi khuẩn E.coli và các hệ vector biểu hiện trong sản xuất protein tái tổ hợp 19

2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn E coli trong sản xuất protein tái tổ hợp 19

2.2.2 Một số hệ thống vector biểu hiện trong vi khuẩn E coli 21

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 23

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 23

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 25

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Vật liệu nghiên cứu 26

3.1.1 Vi khuẩn 26

3.1.2 Vật liệu 26

3.1.2.1 Enzyme 26

3.1.2.2 Vector 26

3.1.3 Hóa chất 29

3.1.4 Dụng cụ 31

3.1.5 Thiết bị 31

3.1.6 Phạm vi nghiên cứu 31

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 32

3.3 Nội dung nghiên cứu 32

3.4 Phương pháp nghiên cứu 33

3.4.1 Phương pháp thiết kế in silico 34

3.4.2 Phương pháp lập bản đồ giới hạn 35

3.4.3 Phương pháp điện di DNA trong gel agarose 37

3.4.4 Phương pháp thu nhận DNA từ gel agarose 38

3.4.5 Phương pháp gắn đoạn gen mong muốn lên vector biểu hiện 38

3.4.6 Phương pháp chuẩn bị tế bào E coli khả biến 39

3.4.7 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến bằng sốc nhiệt 39

3.4.8 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 40

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

4.1 Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pRSET-A tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY 41

4.1.1 Kết quả gắn gene crtY vào vector pR-iEI tạo vector tái tổ hợp pR-iEIY 41

4.1.2 Kết quả gắn gene crtB vào vector pR-iEIY tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY 45

4.2 Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY 46

4.2.1 Kết quả gắn gene crtY vào vector pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-Y 46

4.2.2 Kết quả gắn cụm gene idi-crtE-crtI-crtB vào vector pET22-Y tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY 49

4.3 Kết quả kiểm tra sự hoạt động của các gene 52

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Carotenoid là một dạng sắc tố tự nhiên xuất hiện chủ yếu ở thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như nấm, tảo và một vài loại vi khuẩn (Schmidt-Dannert, 2000) [57] Chúng có vai trò hình thành màu sắc cho cây, che chắn ánh sáng (Vershinin, 1999) [70] và có khả năng chống oxy hóa mạnh (Stahl and Sies, 2003) [63] Ngày nay có khoảng 600 loại carotenoid được tìm thấy và 40 loại trong

số đó là cần thiết cho chế độ dinh dưỡng của con người (Rao and Rao, 2007) [52]

β-carotene là sắc tố có màu vàng hoặc da cam, thuộc nhóm carotenoid Chúng

được tìm thấy ở một số loại cây như cà rốt, khoai lang, đậu hà lan (Desobry, Netto

et al 1998) [18] β-carotene được biết đến như một tiền chất để tổng hợp vitamin A

– một loại vitamin rất cần thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et al 2003; Stutz, Bresgen et al 2015) [35, 65] Theo tổ chức WHO và FAO mỗi năm có hàng triệu trẻ em bị mắc các bệnh về mắt mà nguyên nhân chủ yếu là thiếu provitamin A trong

khẩu phần ăn (Harjes, Rocheford et al 2008) [26] Ở động vật, β-carotene được sử

dụng trong suốt quá trình sinh trưởng, chúng tham gia vào một loạt các quá trình sinh lý, sinh sản, phát triển biểu bì của mô, cấu trúc xương và tăng cường khả năng

miễn dịch (Sklan, 1987) [60] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-carotene có tác

dụng ngăn ngừa quá trình oxy hóa bằng cách loại bỏ các gốc oxy tự do để bảo vệ tế bào và cơ thể, ngăn ngừa quá trình phát triển của tế bào ung thư, và các bệnh tim mạch (Igielska-Kalwat, Goscianska et al 2015) [29]

Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng Theo

thống kê của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường cho carotenoid đạt 1,2

tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018 Trong đó, nhu

cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD (chiếm 21,8%)

trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiến đến năm

2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) [11] Để đáp ứng nhu cầu đó

β-carotene được sản xuất theo hai con đường chính: Một là con đường tổng hợp hóa

học, hai là chiết xuất từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên (Bernardo Dias Ribeiro, Daniel Weingart Barreto et al 2011, Vachali, Bhosale et al 2012) [12, 69] Sản

phẩm β-carotene tổng hợp hóa học chỉ có chứa 1 đồng phân duy nhất, trong khi đó

β-carotene tự nhiên không những có chứa β-carotene mà còn có α-carotene và

γ-carotene; do đó β-carotene tự nhiên có hoạt tính sinh học cao hơn 10% so với tổng

hợp hóa học (Voutilainen, Nurmi et al 2006; Baky and El-Baroty 2013) [71, 9]

Bên cạnh đó thì các sản phẩm β-carotene tự nhiên cũng được ưa thích hơn, song ở mức độ công nghiệp thì nguồn cung β-carotene tự nhiên có nhược điểm là phụ

thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng và quản lý vùng nguyên liệu Vấn đề đặt ra

là cần phải có phương pháp khác để tạo nguồn cung β-carotene tự nhiên

Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và công nghệ sinh học nói riêng, việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cùng với ứng dụng các kĩ thuật di truyền đã giải quyết được các vấn đề nêu trên Các nghiên cứu về tạo chủng

vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp

β-carotene đang gặt hái được những thành công nhất định Năm 1990, Misawa và

cộng sự tạo chủng sinh vật có khả năng sinh tổng hợp carotene, thành công đầu tiên

trên Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens (Misawa, Yamano et al 1991) [45] và sau đó là trên Escherichia coli (Lee, Momen et al 2003) [36]

Sự biểu hiện của các gene liên quan tới một loạt các yếu tố như: Hệ vector, promoter, chủng chủ; và các cơ chế phiên mã, dịch mã và sau dịch mã (Jana and Deb 2005) [32] Vector là một trong những tiêu chí đầu tiên được quan tâm tới, theo

lý thuyết một hệ vector có số bản sao cao sẽ làm tăng tần số mRNA và tăng năng suất biểu hiện protein tái tổ hợp (Camps 2010) [15] Tuy nhiên, số lượng bản sao cao liệu có phải là tốt nhất? Theo nghiên cứu của Jones KL và cộng sự, một vài hệ vector có số bản sao thấp cũng có khả năng biểu hiện tương đương hoặc có phần tốt hơn so với một hệ vector có số bản sao cao (Jones, Kim et al 2000) [33] Bên cạnh

đó, vị trí tiết cũng là một yếu tố quan trọng Nếu protein lưu lại trong tế bào chất nó

có thể trở nên không tan khi ở mức độ tổng hợp cao, dẫn đến sự hình thành các thể vùi Việc thu hồi protein có hoạt tính sinh học từ những thể vùi này là rất khó

(Anupam Singh, Vaibhav Upadhyay et al 2015) [6] Nhằm giải quyết vấn đề này, ngày nay protein tái tổ hợp sẽ được gắn thêm một chuỗi tín hiệu tiết bằng cách đưa một trình tự mã hóa cho chuỗi tín hiệu đó lên vector biểu hiện Chuỗi tín hiệu này được nhận biết bởi hệ thống tiết và được vận chuyển tới đúng nơi

Hiện nay, việc sản xuất các hợp chất carotenoid ở Việt Nam vẫn còn một vấn

đề mới, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tách chiết từ thực vật và phân lập

các chủng vi sinh vật sản xuất β-carotene ở quy mô nhỏ Việc sử dụng các hợp chất

β-carotene ở Việt Nam chủ yếu do nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao Xuất

phát từ nhu cầu thực tiễn, tôi thực hiện đề tài: “Thiết kế vector biểu hiện các gene

mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo

chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất β-carotene tái tổ hợp

1.2 Mục đích nghiên cứu

Thiết kế thành công vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme liên

quan đến quá trình sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli

Kiểm tra ảnh hưởng của số bản copy tới năng suất biểu hiện β-carotene trong

vi khuẩn E Coli

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

- Nội dung 1: Thiết kế vector biểu hiện mang polycistron chứa 5 gene

idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector pRSET-A

- Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang polycistron chứa 5 gene

idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector pET22b(+)

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu về biểu hiện β-carotene trong

E coli sau này

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng sản xuất

β-carotene mới, rút ngắn thời gian sản xuất đáp ứng nhu cầu thực tiễn

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát về sắc tố β-carotene

2.1.1 Cấu trúc và tính chất lý hóa

Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tìm thấy chủ yếu trong các loài thực vật, chúng có màu vàng, da cam đến đỏ, bao gồm 65-70 sắc tố tự nhiên và là một trong những hợp chất màu quan trọng nhất được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm Carotenoid thường được chia làm hai nhóm: Thứ nhất

là nhóm caroten hydrocacbon như là β-carotene, torulen và nhóm còn lại là xantophyl bị oxy hóa như astaxantin Hiện nay, nhóm caroteonid đang được nghiên cứu rộng rãi, tiêu biểu trong đó phải kể đến β-carotene

Cấu trúc: β-carotene là một trong số hơn 600 loại caroteoid đã được tìn thấy

trong tự nhiên Chúng là một dẫn xuất isoprene chưa bão hòa bao gồm 40 nguyên tử

cacbon và 56 nguyên tử hydro (C40H56) β-carotene có dạng tinh thể hình kim, trong

cấu trúc có các nối đôi đơn xen kẽ tạo nên một chuỗi polyen (hình 2.1)

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của β-carotene

Tính chất lý hóa: β-carotene là hợp chất có màu vàng cam, tan tốt trong dầu và

các dung môi hữu cơ như aceton, etyl-ete, metanol, nhưng lại không tan trong nước Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp dài mà β-carotene có ái lực mạnh với oxy đơn bội

nên dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng hay nhiệt độ (Goodwin 1980) [23]

2.1.2 Vai trò của sắc tố β-carotene với con người

2.1.2.1 Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người

Hiện nay, β-carotene được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu bởi tác dụng hữu ích của nó đối với sức khỏe con người (Nagao 2009) [48] β-carotene

được biết đến như tiền chất vitamin A rất cần thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et

al 2003) [35], bên cạnh đó chúng cũng có khả năng chống oxy hóa mạnh và ngăn ngừa một số bệnh ung thư

Vai trò là chất chống oxy hóa

Gốc tự do là những phân tử bị thiếu hụt điện tích Các gốc tự do này thường không cân bằng và rất dễ phản ứng Chúng luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử từ các phân tử khác, các phân tử bị mất điện tích sẽ lại trở thành những gốc tự do mới Quá trình này được gọi là quá trính oxy hóa và gốc tự do đó được gọi là chất oxy hóa Chất oxy hóa tiêu biểu đến nay được phát hiện là ROS ROS là một sản phẩm phụ của quá trình hô hấp và trao đổi chất trong cơ thể, đồng thời ROS cũng được kích thích sinh ra do các tác động của môi trường như tia UV hay tiếp xúc với nhiệt độ cao ROS tích lũy có thể gây tổn thương tế bào và các phân tử sinh học như DNA, protein (Adetayo O Omoni and Aluko 2005) [4] Theo nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ROS tích lũy trong tế bào và cơ chế quá mức là nguyên nhân gây ra các bệnh thoái hóa như Alzheimer, ung thư, Parkinson, các bệnh mãn tính, bệnh tim mạch Các chất chống oxy hóa là các chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa Chúng ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do (Guerin, Huntley

et al 2003) [25] Carotenoid đã được chứng minh là chất chống oxy hóa sinh học, bảo vệ tế bào và mô từ các tác hại của các gốc tự do (Maiani, Caston et al 2009) [42]

Trong carotenoid, β-carotene có hiệu quả trong việc bảo vệ màng lipid của tế bào

khỏi tác hại của các gốc tự do (Britton 1995) [14], bên cạnh đó cùng với một số nhóm carotenoid khác như lycopene có khả năng loại bỏ oxy tốt nhất, lutein và zeaxanthin có hiệu quả trong việc loại bỏ các gốc tự do là tăng tính toàn vẹn của tế bào (Smith 1998) [61]

Tiền chất vitamin A

β-carotene còn được biết đến với tên gọi là tiền chất vitamin A (Lampert,

Holzschuh et al 2003) [35] Khi vào cơ thể, β-carotene bị phân cắt ở giữa mạch

cacbon trung tâm tạo thành hai phân tử retinal bằng enzyme 15,15’dioxygenase (Biesalski, Chichili et al 2007) [13] Retinal tiếp tục được chuyển hóa bởi enzyme thành retinol Retinol tạo thành có thể được hấp thu trực tiếp từ thức ăn vào thành ruột hay sẽ được vận chuyển nhờ liên kết với protein đến các cơ quan cần thiết hoặc đến gan là nơi tích lũy vitamin A dưới dạng retinyl este Khi cơ thể cần, retinyl este được thủy phân thành retinol tự do và acid hữu cơ trước khi được hấp thụ Quá trình thủy phân này được enzyme dịch tụy xúc tác, axit hữu cơ tạo thành thường là acid palmitat chiếm thành phần chủ yếu trong retinyl este thực phẩm Quá trình chuyển hóa

β-carotene thành vitamin A được kiểm soát chặt chẽ nên không tạo thành lượng dư

thừa vitamin A có độc tính cao Con người và động vật cần β-carotene trong suốt quá

trình sinh trưởng của mình, song bản thân chúng lại không có khả năng tổng hợp được

mà chủ yếu thu nhận qua con đường tiêu hóa (Fujisawa, Watanabe et al 2008) [21]

Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa β-carotene thành vitamin A

Tăng cường thị giác

Trong máu phân tử vitamin A dưới dạng retinol sẽ chuyển hóa thành retinal Trong bóng tối, retinal kết hợp với protein opsin để tạo thành Rhodopsin – một sắc

tố nhạy cảm với ánh sáng ở võng mạc mắt, giúp võng mạc nhận được các hình ảnh trong điều kiện thiếu sáng Sau đó, khi ra sáng Rhodopsin lại bị phân hủy thành opsin và trans-retinal, rồi tran-retinal vào máu để trở lại cis-retinol (Wolf 2001)

[72] Bên cạnh đó, theo một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-carotene có khả năng

làm chậm sự tiến triển của bệnh thoái hóa điểm vàng làm giảm thiểu các nguy cơ

mù lòa (Snodderly 1995; Gordon and Schooff 2002) [62, 24] Việc thiếu hụt vitamin A gây ra một loạt các thay đổi về sinh lý mà trong đó cơ quan bị ảnh hưởng nhiều nhất là mắt Một trong những biểu hiện đầu tiên là sự suy giảm thị lực, điển hình như là bệnh quáng gà (khả năng nhìn giảm mạnh khi độ chiếu sáng thấp) (Roncone 2006) [56]

Giảm thiểu các bệnh về tim mạch

Theo WHO, bệnh tim mạch đang là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở người trên toàn thế giới và chiếm nhiều nhất ở các nước đang phát triển Mỗi năm, người chết do bệnh tim và đột quỵ nhiều hơn cả ung thư, lao, sốt rét và HIV cộng lại (Moran, Forouzanfar et al 2014) [47] Năm 1990, số ca tử vong do các bệnh tim mạch là 13,3 triệu ca chiếm 25,8%, đến năm 2013 con số này đã tăng lên 17,5 triệu người chiếm 31,5% tổng số ca tử vong trên toàn thế giới (Mendis, Shanthi; et al 2014) [44] Bệnh tim mạch bao gồm các bệnh suy tim, sơ vữa động mạch, động mạch vành và nhồi máu cơ tim (GBD 2015) [22] Bệnh tim mạch được hình thành

do sự tích lũy quá nhiều sản phẩm oxy hóa gây nên (Singh, Dhalla et al 1995) [59], đặc biệt là quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) do ROS dẫn đến hình thành các mảng bám trên thành mạch gây sơ vữa thành mạch (Dhalla, Temsah et al

2000) [19] Tác động chính của β-carotene tới các bệnh tim mạch là chống lại quá trình oxy hóa, do β-carotene được vận chuyển trong các lipoprotein tỷ trọng thấp

thông qua đó có thể trực tiếp ức chế quá trình oxy hóa của LDL (Reaven, Ferguson

et al 1994) [53] Chính vì thế, các chuyên gia thường khuyến các sử dụng các thực

phẩm giàu carotene để phòng ngừa và chữa trị các bệnh về tim mạch

Ngăn ngừa bệnh ung thư

Oxy là yếu tố không thể thiếu đối với cuộc sống Khi các tế bào sử dụng oxy

để tạo ra năng lượng, các sản phẩm phụ được tạo ra như là một hệ quả của ATP (adenosine triphosphate) sản xuất bởi các ty thể và lạp thể Những sản phẩm phụ thường là chất oxy hóa (ROS) và các nitơ phản ứng (RNS) ROS và RNS đóng một vai trò kép vừa có lợi, vừa có hại đối với có thể Ở mức độ thấp hoặc trung bình, ROS và RNS phát huy tác dụng có lợi trên các phản ứng của tế bào và chức năng miễn dịch Ở nồng độ cao, chúng tạo ra sự căng thẳng oxy hóa có thể làm hỏng tất

cả các cấu trúc tế bào gây nên các sai hỏng (Young and Woodside 2001, Lien Ai Pham-Huy, Hua He et al 2008) [76, 39] Những đột biến này thường xảy ra ở một

tế bào hoặc một nhóm tế bào dẫn đến sự tăng lên không kiểm soát hình thành các

khối U (Cooper GM 1992) [16] β-carotene tác động mạnh mẽ vào tế bào ung thư

do chúng điều khiển tăng trưởng của tế bào, điều hòa biểu hiện gene, và tác động lên các tế bào miễn dịch, hạn chế các sai khác bất thường dẫn tới sự phát triển

không ngừng của tế bào ung thư β-carotene tác động vào quá trình ung thư theo hai

hướng: Một là chúng tác động vào quá trình oxy hóa tế bào do tính chất chống oxy hóa mạnh, hai là chúng tham gia vào quá trình biệt hóa và phân chia tế bào (Heller, Descamps et al 1998) [27]

2.1.2.2 Ứng dụng của β-carotene trong công nghiệp

β-carotene có tính chống oxy hóa mạnh giúp tăng cường hệ miễn dịch, ngăn

ngừa bệnh ung thư, các bệnh tim mạch và các bệnh mãn tính khác chính vì vậy chúng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm (Luis Carlos Mata-Gómez, Julio César Montanez et al 2014) [40] Trong đó,

có hai mảng ứng dụng lớn là màu thực phẩm và thực phẩm bổ sung Trong công

nghiệp dược phẩm, β-carotene được sản xuất dưới dạng dược chất, sử dụng bổ sung ngoài chế độ ăn của con người Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, β-carotene

được thêm vào với tác dụng bảo vệ da chống lại tác hại của UV (Del Campo,

Moreno et al 2000) [17] Trong lĩnh vực màu thực phẩm, do có khả năng mang

màu sắc nên β-carotene được sử dụng là chất bổ sung màu cho các thực phẩm tự

nhiên như lòng đỏ trứng gà, thịt gà, cá Đồng thời bên cạnh các thuộc tính màu sắc,

β-carotene còn có tác dụng bảo quản thực phẩm, là nguồn cung cấp chất chống oxy

hóa cho thực phẩm Ngoài ra, sử dụng β-carotene từ nguồn vi tảo có thể tận dụng

lượng chất khoáng có trong vi tảo để kích thích quá trình đồng hóa trong tế bào và

cơ thể Việc sử dụng β-carotene làm màu thực phẩm ngày nay rất phổ biến và

không gây độc hại cho sức khỏe

Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng Theo

báo cáo của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường dành cho carotenoid đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018 Trong đó,

nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD trong năm

2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiến đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) [11] (Hình 2.3)

Hình 2.3: Biểu đồ khảo sát thị trường carotenoid năm 2010 và dự kiến đến năm 2018

Để đáp ứng nhu cầu đó, β-carotene được sản xuất bằng hai phương pháp: Đó

là tổng hợp hóa học và chiết xuất từ tự nhiên Những nghiên cứu gần đây cho thấy

việc sử dụng β-carotene tổng hợp hóa học ở liều lượng cao có liên quan đến hiện tượng biến đổi nhiễm sắc thể, dẫn đến nguy cơ ung thư trong khi đó β-carotene tự

nhiên lại có khả năng chống lại sự sai khác này do đó có khả năng ngăn ngừa ung

thư Bên cạnh đó thì các sản phẩm β-carotene tự nhiên cũng được ưa thích hơn, song ở mức độ công nghiệp thì nguồn cung β-carotene tự nhiên có nhược điểm là

phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng và quản lý vùng nguyên liệu Sự chênh

lệch về giá giữa β-carotene tự nhiên (1000-2000 USD/kg) và β-carotene tổng hợp

hóa học (400-800 USD/kg) (Tawfiq Abu-Rezq S., Suad Al-Hooti et al 2010) [67]

cũng luôn thôi thúc các nhà khoa học tìm ra con đường chuyển hóa β-carotene tự

nhiên

2.1.3 Con đường tổng hợp β-carotene

Tất cả các carotenoid nói chung và β-carotene nói riêng quá trình sinh tổng

hợp đều đi theo con đường isoprenoid Con đường tổng hợp isotenoid được chia thành ba giai: (1) hình thành các đơn phân 5 cacbon (C5) gồm IPP và DMAPP, (2) giai đoạn hình thành các hợp chất C40, (3) thay đổi chuỗi C40 trong hệ thống các

carotenoid để tạo thành β-carotene.

 Giai đoạn một: Sinh tổng hợp các chất đầu tiên để đi đến DMAPP và IPP diễn

ra theo 2 con đường riêng biệt: Con đường mevalonate (MAV) và con đường mevalonate (MEP)

non-Sinh vật nhân chuẩn thường sử dụng con đường MAV để chuyển hóa CoA thành IPP, tiếp theo là đồng phân hóa IPP thành DMAPP Sinh vật nhân sơ trừ một số trường hợp ngoại lệ, thường sử dụng con đường MEP để sản xuất IPP và DMAPP qua phản ứng ngưng tụ đầu tiên giữa pyruvateandglyceraldehyde-3-

acetyl-phosphate Thực vật và Streptomycetes thì sử dụng cả hai con đường (Yoon,

Hye-Min Park et al 2007) [74]

Con đường MAV

Con đường MAV lần đầu tiên được phát hiện bởi Bloch và Lynen vào những năm 60 (Lynen, 1967) [41] Trong con đường này, hai phân tử acetyl-CoA đầu tiên

sẽ kết hợp lại với nhau để tạo thành acetoCoA, sau đó một phân tử CoA thứ ba được đưa vào thông qua liên kết cộng aldol để tạo thành beta-Hydroxy-beta-methylglutaryl-CoA (HMG – CoA) Sau đó, dưới sự xúc tác của enzyme HMG –CoA reductase, HMG – CoA được chuyển hóa thành mevalonate Mevalonate sau

acetyl-đó được phosphoryl hóa hai lần và decarbonxyl để tạo ra IPP (Isopentenyl pyrophosphate) IPP sau đó được đồng phân hóa thành một isoprene khác là DMAPP (Dimethylallyl pyrophosphate) nhờ sự xúc tác của enzyme IPP isomerase

Hình 2.4: Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MAV

Con đường MEP

Sau khi con đường MAV được khám phá, các nhà khoa học đã nghiên cứu và

phát hiện một số loại vi khuẩn như E coli và S chromofuscus có con đường sinh

tổng hợp carotenoid không phụ thuộc vào mevalonate, con đường này được gọi là non-mevalonate hay còn gọi là MEP Trong con đường này quá trình sinh tổng hợp

IPP và DMAPP không cần mevallonate Cơ chất đầu tiên là phản ứng ngưng tụ giữa pyruvate với glyceraldehyde-3-phosphate tạo thành DXD nhờ xúc tác của DXD

synthetase, tổng hợp chất trung gian không những cho IPP và DMAPP mà còn để

tổng hợp thiamine và pydoxol DXD có thể được đưa vào E coli và A thaliana làm

tiền chất cho các hợp chất này Sau đó diễn ra một loạt các phản ứng chuyển hóa thành MEOP, MEP và tạo ra IPP và DMAPP Con đường MEP không có mặt trong các loài động vật có vú nhưng có nhiều trong vi khuẩn gây bệnh và kí sinh trùng

Hình 2.5: Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MEP

 Giai đoạn hai: Hình thành các hợp chất C40 Trong giai đoạn tiếp theo này,

DMAPP lần lượt thêm IPP vào nhờ enzyme IPP prenyltransferases tạo nên các

diphosphate tuyến tính geranyl pyrophosphate (GPP, C10, monoterpenoids), các phân tử GPP sau đó lại được liên kết với IPP để tạo thành các fanesy pyrophosphate (FPP, C15, sesquiterpenoids), các FPP cũng tiếp tục liên kết với IPP để tạo thành geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP, C20, diterpenoids) Giai đoạn tạo carotenoid bắt đầu với sự tạo thành các hợp chất C40 đầu tiên phyotene từ hai phân tử GGPP

Hình 2.6: Quá trình sinh tổng hợp carotenoids từ IPP và DMAPP

 Giai đoạn ba: Phyotene được tạo thành ở dạng đồng phân 15C, có ba nối đôi liên hợp, không có màu sẽ chuyển hóa tiếp tục bằng những phản ứng dehydro hóa

tạo sản phẩm là lycopene

Hình 2.7: Quá trình chuyển hóa phyopene thành lycopene

Sau cùng, lycopene tiếp tục đóng vòng ở một hoặc hai đầu tạo ra các sản

phẩm như α- carotene, β-carotene, ε- carotene

Hình 2.8: Tổng hợp β-carotene từ lycopene

2.1.4 Nguồn cung cấp β-carotene

Nguồn cung cấp β-carotene cho con người có thể là tất cả các nguồn có chứa

carotenoid bao gồm từ thực vật, tảo, nấm hay tổng hợp hóa học Tuy nhiên, 80-90%

nguồn cung cấp carotene cho con người là từ thực phẩm Trong công nghiệp,

β-carotene có thể được tổng hợp hóa học hay lên men từ vi sinh vật tùy từng mục

đích

2.1.4.1 Nguồn cung từ thực vật

Nguồn cung cấp β-carotene chủ yếu cho con người là từ các loại rau, củ, quả

(Maiani, Caston et al 2009) [42] Các thực phẩm có chứa hàm lượng β-carotene cao

như bí ngô, cà rốt, khoai lang (Desobry, Netto et al 1998) [18] Hàm lượng

β-carotene liên quan mật thiết đến kiểu gen trong các giống trái cây và rau củ khác

nhau (Maiani, Caston et al 2009) [42] Con người có thể dễ dàng thu nhận trực tiếp

β-carotene thông qua con đường ăn uống Sự hấp thu β-carotene chịu ảnh hưởng

một số yếu tố như chế biến thực phẩm và nấu nướng (Parker, Swanson et al 1999)

[51] Hiện nay ở quy mô công nghiệp đã có nhiều quy trình thu β-carotene từ thực vật đã được xây dựng và thành công β-carotene trích ly từ cà rốt (với khoảng 34%

ở dạng đồng phân cis, còn lại là 66% ở dạng đồng phân trans β-carotene) hoặc từ

quả gấc với sản phẩm ở dạng dầu gấc (ANS 2012) [5] Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là phục thuộc vào thời vụ, quy trình tinh chế phức tạp, thời gian dài và hiệu suất không cao (Smith 1998) [61]

Bảng 2.1: Hàm lƣợng carotenoid có trong thực vật (Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga et al 2007)

2.1.4.2 Nguồn cung từ vi sinh vật

Một số loài vi sinh vật cũng có khả năng tổng hợp β-carotene như một số loài vi

khuẩn có khả năng quang hợp, vi tảo, nấm (Heller, Descamps et al 1998) [27] Con người

có thể thu nhận β-carotene từ vi sinh vật để sử dụng Phương thức thu β-carotene từ vi sinh

vật là thu sinh khối, có thể tách chiết từ sinh khối hoặc sử dụng trực tiếp tùy thuộc yêu cầu

chất lượng β-carotene (Heller, Descamps et al 1998) [27] β-carotene từ vi sinh vật chủ

yếu được sủ dụng trong công nghiệp làm chất phụ gia thực phẩm, thức ăn chăn nuôi (Hyung Seok Choi, Sang Yup Lee et al 2010) [28]

Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật chỉ tổng hợp một lượng nhỏ β-carotene cho bản thân

chúng Chính vì vậy, ngày nay các nhà khoa học đã áp dụng các kỹ thuật khác nhau tác động lên con đường trao đổi chất của vi sinh vật để chuyển chuyển hường, kích thích một

số loại vi sinh vật sản xuất ra hợp chất mong muốn Bắt đầu từ thập niên 90, carotene đã được tổng hợp thành công đầu tiên trên Z mobilis, A tumefaciens (Misawa, Yamano et al

1991) [45] và sau đó là trên E coli(Lee, Momen et al 2003) [36] không mang gene sinh

tổng hợp carotene bằng kĩ thuật DNA tái tổ hợp Có bốn yếu tố quyết định thành công của sản xuất β-carotene tái tổ hợp năng xuất cao: Thứ nhất là cung cấp đầy đủ các tiền chất

(chất nền cho phản ứng), thứ hai là cần có sự cân bằng và đầy đủ các enzyme

carotenogenic để có thể chuyển hóa tối đa mà không tạo ra các hợp chất trung gian, thứ ba

là kết hợp với plastid để giảm thiểu sự tích tụ các các chất trung gian và tăng lượng chất cuối cùng, thứ tư là vật chủ phải có con đường tổng hợp isoprenoids và khả năng tích trữ

β-carotene cao (Sies and Stahl 1998) [58]

2.1.4.3 Nguồn cung từ tổng hợp hóa học

Phương pháp chung cho việc tổng hợp C40 carotenoid là sử dụng phương pháp ngưng tụ Witting giữa C10- dialdehyde với hai phân tử C15- phosphonium đối xứng để tạo nên cấu trúc đối xứng và sau đó thực hiện phản ứng đồng phân hóa và kết tinh tạo nên C40 hoàn chỉnh Phương pháp ngưng tụ Witting là phương pháp có hiệu quả cao được ứng dụng đa dạng trong giai đoạn cuối cùng của công nghiệp tổng hợp carotenoid Trong số

600 loại carotenoid được tìm thấy thì có 8 loại được tổng hợp hóa học trên quy mô công

nghiệp Các carotenoid này bao gồm lycopene, lutein, zeaxanthin, β-carotene,

canthaxanthin, astaxanthin, α- carotene và β- cryptoxanthin Những sản phẩm này được

sử dụng làm chất phụ gia thức ăn chăn nuôi, đặc biệt là trong chăn nuôi gia cầm và thủy sản (Ernst 2002) [20]

β-carotene bắt đầu được tổng hợp hóa học từ những năm 1950 chủ yếu bởi hai công

ty là Hofman La Roche (Thụy sỹ) và BASF (Đức), chiếm khoảng 70% sản lượng thế giới, đạt khoảng 500 tấn/năm

 Tổng hợp hóa học bởi Công ty BASF dựa trên phản ứng của Wittig và được thực hiện bởi Badische Anilin và Soda-Fabrik (BASF) Quá trình tổng hợp được thực bằng cách nối hai phân tử C20 đối xứng với nhau qua trung tâm

Hình 2.9: Sơ đồ tổng hợp β- carotene của BASF

 Cách tổng hợp thứ hai là dựa trên phản ứng Grignard và được thực hiện bởi F

Hoffman-la Roche và công ty (Roche), β-carotene được tổng hợp bằng cách nối ba

phân tử C19, C2 và C19 với nhau

Hình 2.10: Sơ đồ tổng hợp β-carotene của Roche

2.1.5 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene tự nhiên

Công nghệ DNA tái tổ hợp là tập hợp các kỹ thuật tạo nên các DNA tái tổ hợp

để đưa các gene mong muốn vào cơ thể sống DNA tái tổ hợp là phân tử DNA được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự DNA của các loài khác nhau Trong kỹ thuật di truyền DNA tái tổ hợp thường được tạo thành nhờ việc gắn các đoạn DNA có nguồn gốc khác nhau lên vector tách dòng hay vector biểu hiện

Kỹ thuật điều hướng trao đổi chất là phương pháp sử dụng công nghệ DNA tái

tổ hợp nhằm biến đổi mạng lưới trao đổi chất trong các tế bào sống để sản xuất ra các hợp chất mong muốn với hiệu suất cao (Stephanopoulos 1994) [64] Tức là nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật phù hợp để sản xuất ra các hợp chất cần thiết trên quy mô công nghiệp, có thể thương mại hóa sản phẩm (Ikeda and Katsumata 1992) [30] Sản phẩm được tạo ra bằng phương pháp này được coi như là sản phẩm

tự nhiên, do đó việc sử dụng chúng sẽ an toàn hơn so với các phương pháp tổng hợp hóa học (ANS, 2012) [5]

Nhu cầu về β-carotene trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, công nghiệp dược

phẩm ngày càng tăng, do đó yêu cầu đặt ra là phải tìm ra cách đổi mới phương pháp

sản xuất β-carotene để thu được lượng β-carotene cần thiết Điều hướng trao đổi chất ở vi sinh vật có thể giúp sản xuất một cách hiệu quả β-carotene trong các sinh vật không mang gene tham gia sinh tổng hợp β-carotene mà các phương pháp khác

không thể thực hiện được (Lee and Schmidt-Dannert 2002) [37] Việc sử dụng các phương pháp tách chiết truyền thống trước đây có nhược điểm là phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng và quản lý vùng nguyên liệu

Năm 1990 Misawa và cộng sự đã tách dòng và xác định trình tự các gene Crt

tham gia con đường sinh tổng hợp các carotenoid đồng thời làm sáng tỏ con đường sinh tổng hợp các carotenoid trong vi khuẩn Pantoea ananatis Sau đó, nhiều nghiên

cứu sản xuất β-carotene được tiến hành trên các loài sinh vật không chứa các gene tham gia sinh tổng hợp β-carotene như S cerivisiae (Yamano, Ishii et al 1994) [73],

C utilis (Miura, Kondo et al 1998) [46], E coli (Yoon, Lee et al 2009) [75]…bằng

cách biến nạp các gene tham gia sinh tổng hợp β-carotene vào vật chủ khác nhau

Hình 2.11: Quá trình chuyển hóa β-carotene dưới sự tham gia các gene Crt 2.2 Vi khuẩn E coli và các hệ vector biểu hiện trong sản xuất protein tái tổ hợp 2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn E coli trong sản xuất protein tái tổ hợp

Hiện nay, trong các kỹ thuật điều hướng trao đổi chất nhằm tập trung tổng hợp protenin tái tổ hợp có rất nhiều chủng chủ được nghiên cứu sử dụng Song trong số

các chủng biểu hiện protein ngoại lai thì vi khuẩn Gram âm E coli vẫn là một trong

những hệ biểu hiện thu hút nhiều quan tâm của các nhà nghiên cứu, do chúng có tốc

độ tăng trưởng nhanh với mật độ tế bào cao trên cơ chất không đắt tiền cũng như các đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu đầy đủ (Baneyx 1999, Novagen 2006)

[10, 49] Từ đầu thập niên 1990 đến nay, hầu hết người ta sử dụng E coli làm tế bào chủ để sản xuất các protein tái tổ hợp Nhiều chủng E coli khác nhau đã được

nghiên cứu thiết lập để biểu hiện protein tái tổ hợp bằng các vector biểu hiện khác

nhau Vì vậy khi lập phương án sản xuất protein tái tổ hợp trong E coli cần phải lựa chọn các hệ thống vector biểu hiện và chủng E coli thích hợp với protein mục tiêu

E coli BL21

Chủng E coli BL21[F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal] là dạng đột biến khuyết

protease ompT và Lon và là chủng tốt nhất dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp dung hợp với GST (Sugantha priya S, Gowri Shankar J et al 2010) [66] Tuy nhiên,

do có đặc tính biến nạp không tốt nên chủng này không được dùng cho mục đích

dòng hóa Chủng E coli DH5α là chủng mang alen recAl thuận lợi quá trình biến nạp và lưu trữ plasmid nên được dùng cho mục đích tạo dòng thay E coli BL21

E coli BL21 (DE3) pLysS

Chủng E coli BL21 (DE3) pLysS [F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal,

dcm(DE3)] thường dùng trong biểu hiện protein dung hợp với 6xHis Hệ thống này cho phép biểu hiện vượt mức protein đồng thời hạn chế tối đa hiện tượng phiên mã

rõ rỉ khi không có chất cảm ứng DNA hệ gene của chủng này có chứa đoạn gene T7 mã hóa cho T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ bacteriophage DE3 dạng tiềm tan Gene T7 chịu sự điều khiển của promoter lac Gene lacI có khả năng tạo ra một lượng lớn repressol của lac operon (lacO) tham gia kiểm soát sự phiên mã của T7promoter

Hình 2.12: Cơ chế kiểm soát sự phiên mã của T7 promoter

Sự ức chế phiên mã sẽ được hóa giải nhờ IPTG làm bất hoạt lacO (Mbuyi, Dequeker et al 1982, Novagen 2006) [43, 49] Ngoài ra chủng này có thể được thiết

kế chứa thêm plasmid pLysS gọi là E coli BL21 (DE3) pLysS giúp tế bào chủ tổng

hợp được 1 lượng nhỏ T7 lysozyme có vai trò làm bất hoạt T7 RNA polymerase Các hệ thống biểu hiện nhờ T7 promoter chỉ hoạt động khí có mặt của T7 RNA polymerase của tế bào chủ Như vậy chủng này có đặc điểm là hạn chế tối đa sự tổng hợp protein từ hệ thống vector biểu hiện khi không được cảm ứng Cũng như

một số chủng E coli BL21 khác, E coli BL21 (DE3) pLysS cũng bị đột biến

khuyết sản phẩm protease OmpT và Lon nên luôn hạn chế tối đa sự phân hủy của protein tái tổ hợp

E coli M15 (pREP4)

E coli M15 (pREP4) cho phép biểu hiện protein vượt mức bằng hệ thống

vector biểu hiện pQE Chủng này có mang plsmid pREP4 mang gene lacI mã hóa

cho repressor lacI có vai trò ức chế sự phiên mã của gene nằm sau promotor T5 theo cơ chế kiểm soát âm khi không có chất cảm ứng Chủng E coli M15 (pREP4)

có kiểu gene [Nals, Strs, Rifs, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+, Uvr+, Lon+] Một chủng khác có đặc điểm tương tự như M15 (pREP4) là SG13009 (pREP4) Ngoài ra, có thể dùng một số chủng khác để biểu hiện hệ thống pQE như

E coli XL1 Blue, E coli JM109, E coli TG1 Tuy nhiên, chỉ có các chủng mang

pREP4 cho hiệu quả biểu hiện cao và tránh được hiện tượng rò rỉ phiên mã (The QIAexpressionistTM 2003) [68]

2.2.2 Một số hệ thống vector biểu hiện trong vi khuẩn E coli

Vector biểu hiện pRSET

Vector pRSET có nguồn gốc là các vector biểu hiện pUC, với kích thước nhỏ (~ 2,9kb) và số lượng bản sao cao (200-500 bản sao); chúng được thiết kế cho sự

biểu hiện protein và tinh chế protein ở mức độ cao trong E coli Sự biểu hiện ở mức

độ cao của các trình tự DNA được đưa vào vector pRSET do sự điều khiển của T7 promoter Vector biểu hiện này chứa đoạn DNA mã hóa oligo-histidine gọi là thẻ His (His-tag), đoạn này có chứa 6 histidine Đoạn histidine có thể dung hợp với

protein mục tiêu giúp hỗ trợ việc tinh chế và phát hiện protein ở dạng dung hợp nhờ kháng nguyên chuyên biệt với His-tag (invitrogene 2010) [31]

Hình 2.13: Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pRSET Vector biểu hiện pET

Tương tự như vector pRSET, hệ thống vector biểu hiện pET cho phép dòng hóa và biểu hiện protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với một homooligohistidine

(6xHis) trong tế bào E coli dưới sự điều khiển của hệ thống T7 promotor Tùy theo

loại plasmid mà His-tag có thể dung hợp ở đầu N hay C của protein tái tổ hợp Sản phẩm protein tái tổ hợp chứa His-tag có thể được thu hồi với độ tinh sạch trên 90% bằng cách hấp phụ lên cột sắc kí Ni2+-nitrilotriacetic (Ni-NTA), nhờ tương tác giữa 6X His-tag và Ni2+ sau đó ly giải ở pH thấp hoặc sử dụng chất kiềm cạnh tranh là imidazone (Robert Mierendorf, Keith Yeager et al 1994; invitrogene 2010) [55, 31]

Hình 2.14: Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pET

Hình 2.15: Tương tác giữa protein tái tổ hợp chứa 6xHis và giá thể Niken

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các sắc tố carotenoid nói chung và β-carotene nhận được sự quan tâm và bắt đầu được nghiên cứu từ rất sớm Năm 1831, β-carotene được phát hiện đầu tiên khi

tinh chế được từ cà rốt (Olson 1999) [50] Tuy nhiên, các nghiên cứu khi đó chỉ là nghiên cứu về cấu trúc, đặc tính lý hóa, tách chiết và tinh sạch từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên (Armstrong and Hearst 1996) [8]

Vào những năm 1960, các nhà khoa học đã nghiên cứu về gene IPP isomerase

do gene idi mã hóa xúc tác phản ứng đồng phân hóa từ IPP sang DMAPP ở vi

khuẩn Cũng trong năm này, con đường sinh tổng hợp isoprenoid được phát hiện, sau đó các nhà khoa học phát hiện ra rằng đây là con đường chung để tổng hợp carotenoid, con đường này được gọi là con đường MAV

Năm 1981, Các nghiên cứu bắt đầu chuyển hướng sang sản xuất các hợp chất carotenoid trên sinh vật không có khả năng sinh tổng hợp carotenoid, thành công

đầu tiên là các gene (crt) liên quan tới sinh tổng hợp carotenoid đã được phân lập và

tách dòng từ R capsulate (K L Perry, T A Simonitch et al 1986) [34] Sau đó vào năm 1990, Misawa và cộng sự tạo chủng sinh vật có khả năng sinh tổng hợp

carotenoid, thành công đầu tiên trên Z.mobilis, A tumefaciens (Misawa, Yamano et

al 1991) [45] và sau đó là trên E coli (Lee, Momen et al 2003) [36]

Năm 1983, một con đường sinh tổng hợp carotenoid khác được phát hiện trong E

coli, con đường này độc lập không phụ thuộc vào mevalonate, được gọi là con đường

non-mevalonate (MEP) Và từ đó con đường MEP đã được nghiên cứu một cách cụ thể

và chi tiết Các gene mã hóa các enzyme xúc tác các phản ứng này đã được phân lập và nhân dòng Đến năm 1997, chức năng, tác dụng, cơ chế xúc tác của enzyme IPP isomerase đã được làm sáng tỏ

Ngày nay, khi khoa học công nghệ đang phát triển mạnh, cùng với những nền tảng đã có trước đó, các nghiên cứu chuyển sang hướng mới là nghiên cứu cải thiện

năng suất tổng hợp β-carotene Năm 2007, Sang-Hwal Yoon và cộng sự của mình đã nghiên cứu ảnh hưởng của gene idi trong con đường tổng hợp β-carotene Gene idi mã

hóa cho enzyme IPP isomerase xúc tác chuyển đổi qua lại giữa IPP và DMAPP IPP và

DMAPP là các chất trung gian đóng vai trò trung tâm trong con đường tổng hợp

β-carotene Kết quả cho thấy thi được thêm gene idi hàm lượng β-carotene tạo thành đạt

135 mg/L cao gấp 4 lần so với việc không có gene idi 33 mg/L (Yoon, 2007) [75] Trong những năm gần đây, chức năng và vai trò của β-carotene cũng bắt đầu

được chú ý tới Một nghiên cứu cho thấy chế độ ăn uống thiếu vitamin A gây ra hàng loạt các bệnh về mắt Sự thiếu hụt vitamin A làm chậm quá trình phát triển, gây thiếu máu, giảm khả năng đề kháng (Ribaya-Mercado, Maramag et al 2007) [54] Năm 2014, Barzegari, A Pavon-Djavid đã có bài báo công bố các carotenoid có vai trò như những phân tử tín hiệu sinh học giúp điều trị các bệnh về tim mạch, trong đó

β-carotene được sử dụng để phòng ngừa lipoprotein chống sơ vữa động mạch

(Barzegari, 2014)

Việc ứng dụng kỹ thuật di truyền vào sản xuất carotenoid nói chung và

β-carotene nói riêng đã nhận được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế

giới và đã thu được những thành tựu đáng kể trong lĩnh vực này và người ta vẫn nỗ lực tìm ra những hướng nghiên cứu điều hướng trao đổi chất để tăng cường hiệu quả tổng hợp trong cơ thể vi sinh vật nhằm mang lại hiệu quả sản xuất cao hơn

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam các nghiên cứu về carotenoid cũng đã được tiến hành Tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Thị Bích Ngọc và các

cộng sự của mình đã tiến hành phân tích và khảo sát hàm lượng β-carotene trong một số loài thực vật ở Việt Nam Kết quả cho, thấy hàm lượng β-carotene có nhiều

nhất ở lá đu đủ (57,059%); hàm lượng lutein có nhiều nhất ở lá đinh lăng (50,762%), hàm lượng lycopen có nhiều nhất ở quả cà chua (22,483%) (Ha Thi Bich Ngoc 2007) [3]

Trong một nghiên cứu khác, khi phân tích các carotenoid ở thịt quả và màng hạt trong trái Gấc Việt Nam cũng bằng phương pháp HPLC, các tác giả đã chỉ ra trong trái Gấc chứa một lượng carotenoid khá lớn, nhất là ở màng hạt Gấc Trong

một gam thịt quả gấc (phần có màu vàng) chứa 7-37 μg β-carotene, 0,2-1,6 μg

lycopene, còn trong một gam màng hạt gấc chứa 310-460 μg lycopene, 60-140 μg

β-carotene Các tác giả cũng cho rằng nồng độ lycopene trong màng hạt gấc gấp từ

4-10 lần so với lượng lycopene trong một số rau quả được cho là giàu lycopene (Aoki, Kieu et al 2002) [7]

Tại Hội nghị Khoa học và Công nghệ lần thứ 9, hai tác giả Nguyễn Thị Lý

và Trần Thị Hồng Vân đã trình bày báo cáo phương pháp và kết quả nghiên cứu

tách chiết tinh dầu và carotenoid từ lá Trầu Không (Piper betle L.) Kết quả nghiên

cứu của họ cho thấy, tỷ lệ tinh dầu tách chiết được từ lá Trầu Không là 0,9-1% và hàm lượng carotenoid đạt 0,19% Sản phẩm này khá tinh khiết, quang phổ IR không

phức tạp, đồng dạng với phổ IR của β-carotene (Nguyễn Thị Lý 2010) [2]

Trên tạp chí khoa học Nông nghiệp và phát triển nông thôn, tác giả Nguyễn Thị Hương cùng các cộng sự của mình cũng đã công bố kết quả nghiên cứu tạo

chủng E coli có khả năng sản xuất lycopene với năng suất 1.15 mg/l Đây là một

trong những nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về kỹ thuật điều hướng trao đổi chất trong sinh tổng hợp carotenoid (Nguyễn Thị Hương, 2012) [1]

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Vi khuẩn

Chủng vi khuẩn E coli DH5α và E coli BL21 (DE3) được cung cấp bởi phòng thí

nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, viện Công nghệ sinh học

3.1.2 Vật liệu

3.1.2.1 Enzyme

Enzyme giới hạn: các enzyme EcoRI, KpnI, HindIII, SacI, SalI, NcoI, NotI và các

buffer enzyme tương ứng của hãng Thermo Scientific

Enzyme gắn: Enzyme T4 DNA ligase và 10X T4 DNA ligase buffer của hãng Thermo Scientific

3.1.2.2 Vector

Với mục đích kiểm tra ảnh hưởng của số bản copy tới năng suất biểu hiện

β-carotene trong E coli chúng tôi sử dụng 2 hệ vector biểu hiện : pRSET-A và

pET22b(+) Hệ vector pRSET có 300-500 bản copy trong E coli đại diện cho hệ

vector có số bản sao cao Hệ vector pET22b(+) có 15-20 bản copy - đại diện cho hệ vector có số bản sao thấp

 Vector pR-iEI

Vector pR-iEI Vector pRSET-A Hình 3.1: Cấu trúc vector biểu hiện pRSET

Vecotor pR-iEI là vector biểu hiện pRSET-A đã được gắn thành công 3 gene: idi,

crtI, crtE trước đó Về cơ bản các gene được gắn vào vị trí đa tách dòng nên các thành

phần của vector pRSET vẫn được giữ nguyên

Bảng 3.1: Các thành phần của vector pRSET-A

T7 promoter Phiên mã các đoạn gene được

chèn

20-39

6X-Histag Hỗ trợ việc tinh sạch và phát

hiện protein mục tiêu 112- 129 Gene kháng ampicillin Chọn lọc các dòng tế bào

mang vector pRSET-A

1042-1902

pUC origin Điểm nhận biết vị trí khởi đầu

quá trình sao chép

2047-2720

 Vector pLUG-B: Là vector tách dòng pLUG mang gene crtB (930 bp) mã hóa

cho enzyme phytoene desaturase, xúc tác cho quá trình chuyển hóa phytoene thành

lycopene, tách dòng từ vi khuẩn P ananatis

 Vector pLUG-Y : Chứa gene crtY (1161 bp) mã hóa cho enzyme lycopene cyclase,

xúc tác cho quá trình chuyển hóa lycopene thành β-carotene

 Vector pET 22 b(+)

Đây là một vector biểu hiện có các yếu tố cần thiết cho sự biểu hiện các gene sinh

tổng hợp β-carotene

Hình 3.2: Cấu trúc vector biểu hiện pET 22 b(+)

Vector pET22b(+) được thiết kế có vùng đa tách dòng với 15 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn (hình 3.2) cho phép đưa các gene quan tâm vào vector và biểu hiện ra sản phẩm mong muốn Các thành phần cấu tạo trong vector pET22b(+) được thể hiện trong bảng 3.2

Bảng 3.2: Các thành phần của vector pET22b(+)

Thành phần Vị trí

T7 transcription start 360 pelB coding sequence 224-289 Multiple cloning site 158-225 His-tag coding sequence 140-157

Vector pET22b(+) mang trình tự C-terminal His-tag, thuận lợi cho việc tinh sạch

protein, vị trí khởi đầu sao chép tạo ra số bản sao thấp trong vi khuẩn E coli

Promoter T7 cho phép tế bào kiểm soát chặt chẽ sự biểu hiện của gene thông qua hệ thống gene điều hòa, có khả năng biểu hiện cao khi cảm ứng IPTG

Gene kháng ampicilin giúp cho vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp có thể sinh trưởng trong môi trường có chứa kháng sinh giúp chọn lọc những dòng mong muốn Trên vector pET22b(+) có chứa thêm một trình tự chuỗi tín hiệu N-terminal pelB quy định tiết protein vào khoang chu chất, điều này có nhiều ưu điểm đó là giảm sự phân cắt của protein đích Tuy nhiên, trên vector pRSET-A không có vị trí tiết này, do đó

để đảm bảo sự khách quan trong khảo sát ảnh hưởng của số lượng bản coppy

đến năng suất biểu hiện β-carotene, nên chúng tôi tiến hành loại bỏ trình tự này Trình

tự pelB này nằm ở vị trí 224-289 giữa trình tự nhận biết của enzyme EcoRI và XbaI

(192-326), vì thế chúng tôi sử dụng hai enzyme này vừa có thể loại bỏ vị trí pelB vừa có thể mở vòng vector tạo điều kiện gắn nối đoạn gene ngoại lai

3.1.3 Hóa chất

 Môi trường nuôi vi khuẩn E coli: Môi trường LB

- LB lỏng: thành phần cho 1 lít môi trường bao gồm

+ Nước khử ion : 500 ml