Tách dòng gene SBgLR mã hóa protein giàu lysine từ khoai tây

Sử dụng công nghệ gen để cải tiến chất lượng protein ở thực vật là một ứng dụng đầy triển vọng của công nghệ sinh học, vì các phương pháp truyền thống còn nhiều hạn chế.. Xuất phát từ nh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - -

ĐINH THẾ ANH

Tên đề tài:

TÁCH DÒNG GENE SBgLR MÃ HÓA PROTEIN GIÀU LYSINE

TỪ KHOAI TÂY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - -

ĐINH THẾ ANH

Tên đề tài:

TÁCH DÒNG GENE SBgLR MÃ HÓA PROTEIN GIÀU LYSINE

TỪ KHOAI TÂY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ rất tận tình của thầy

cô, bạn bè và gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn:

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Đức Thành –Phòng

Di Truyền Tế Bào Thực Vật – Viện Công Nghệ Sinh Học – Viện Hàn Lâm Khoa

Học Và Công Nghệ Việt Nam _ T.S Phạm Bằng Phương, Bộ Môn Công Nghệ

Sinh Học - Khoa Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Thực Phẩm – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Th.S Trần Thị Lương Cán bộ Phòng Di Truyền Tế Bào Thực Vật – Viện

Công Nghệ Sinh Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam người

đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện

để tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Trưởng phòng Phòng Di Truyền Tế Bào Thực Vật – Viện Công Nghệ Sinh Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các cán bộ, anh chị làm việc tại Phòng Di Truyền Tế Bào Thực Vật – Viện Công Nghệ Sinh Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Đinh Thế Anh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Năng suất protein và năng lượng của một số loài cây lương thực 4

Bảng 3.1: Danh mục các thiết bị 18

Bảng 3.2 Thành phần và nồng độ các chất cho phản ứng nhân gen SBgLR 22

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme 24

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme BamHI và SacI 26

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine [8] 6

Hình 2.2 Cấu trúc không gian của L-lysine [8] 7

Hình 3.1 Kết quả tách DNA tổng số từ giống khoai tây Arkisigen đƣợc điện di trên gel agarose 1% (Giếng 1-3: DNA tổng số từ giống khoai tây Arkisigen; 28

M: Marker 1Kb) 28

Hình 3.2 Kết quả nhân gen SBgLR từ DNA tổng số của giống khoai tây rkisigen với cặp mồi đặc hiệu (Giếng 1-3: gen SBgLR nhân từ 3 mẫu DNA của giống khoai tây Arkisigen; M: Marker 1Kb) 29

Hình 3.3 Kết quả biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E coli khả biến 30

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm colony PCR trên gel agarose 1% 31

Hình 3.5 Kết quả cắt plasmit bằng enzyme giới hạn BamHI và SacI đƣợc điện di trên gel agarose 1% 32

Hình 3.6 Trình tự gene SBgLR khi giải hai chiều 35

Hình 3.7 Trình tự gene SBgLR khi so sánh trên ngân hàng gen Quốc tế 37

Hình 3.8 Kết quả dịch mã gene SBgLR tách dòng 38

Hình 3.9 Kết quả so sánh trình tự protein 39

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PCS polycloning site-vùng nhân dòng đa điểm cắt

X –gal 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside DNA Deoxyribonucleic axit

dNTP Deoxynucleotide Triphotphate

BLAST Basic Local Aligenment Search Tool

DHPS dihydropicolinate synthase

Bp Base pair – cặp base nitơ

Kb Kilo base –kilo base nitơ

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

PCR Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng

trùng hợp TAE Tris- acetate- EDTA

EDTA Etilenduamin tetraacetic acid

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu Cầu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Ý nghĩa khoa học 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY KHOAI TÂY 3

2.1.1 Một số nghiên cứu về nguồn gốc cây khoai tây 3

2.1.2 Một số nghiên cứu về giá trị dinh dưỡng của cây khoai tây 4

2.1.3 Protein trong khoai tây 5

2.2 Tổng quan về Lysine 5

2.2.1 Đặc tính lysine 5

2.2.2 Cấu tạo của lysine 6

2.2.3 Vai trò và ứng dụng của lysine 7

2.2.4 Các phương pháp thu nhận lysine hiện này [22] 8

2.3 Gene SBgLR 9

2.3.1 Cấu trúc của gene SBgLR 9

2.3.2 Vai trò của gen SBgLR 9

2.4 Tình hình nghiên cứu gen mã hóa protein giàu lysine ở Việt Nam và trên Thế giới 9

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới 9

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 11

2.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử sử để tách dòng gene 12

2.5.1 Kỹ thuật PCR 12

2.5.2 Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E coli 13

2.5.3 Kỹ thuật tách dòng gene 14

2.5.4 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 15

2.5.5 Kỹ thuật xác định trình tự nucleotit 16

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu 17

3.1.1 Đối tượng 17

3.1.2 Hóa chất 17

3.1.3 Thiết bị 18

3.1.4 Phạm vi nghiên cứu: 18

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 18

3.2.1 Địa điểm: 18

3.2.2.Thời gian tiến hành: 19

3.3 Nội dung nghiên cứu 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu 19

3.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 19

3.4.2 Phương pháp xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo quang phổ 20

3.4.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 21

3.4.4 Phương pháp nhân gen bằng PCR: 22

3.4.5 Phương pháp tinh sạch DNA 22

3.4.6 Phản ứng nối ghép gene vào vector tách dòng Pjet 1.2/blunt 23

3.4.7 Phương pháp biến nạp vector tạo dòng tái tổ hợp 24

3.4.8 Phương pháp Tách chiết plasmid theo phương pháp Sambrook và cộng sự (1989) 25

3.4.9 Kiểm tra plasmit tái tổ hợp bằng kỹ thuật PCR 26

3.4.10 Phản ứng cắt sử dụng BamHI 26

3.4.11 Đọc trình tự gen đích và so sánh với trình tự trên ngân hàng gen 26

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 27

4.2 Kết quả nhân dòng gen từ DNA tổng số và thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân gen SBgLR 28

4.3 Kết quả biến nạp gene vào E coli 30

4.3.1 Kết quả biến nạp gen SBgLR vào E coli 30

4.3.2 Kết quả colony PCR 31

4.4 Kết quả giải trình tự 33

4.4.1 So sánh sự giống nhau của gen SBgLR ở mức độ nucleotit 33

4.4.2 So sánh sự giống nhau của gen SBgLR ở mức độ axit amin 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong hơn thập kỷ qua, nhờ thành tựu to lớn của công nghệ gen, người ta đã chuyển thành công những gen phân lập từ sinh vật vào những sinh vật khác để tạo

ra cơ thể biến đổi gen mang các đặc tính mong muốn Sản phẩm biến đổi gen đang đem lại những lợi nhuận kinh tế khổng lồ cho nhiều quốc gia

Sử dụng công nghệ gen để cải tiến chất lượng protein ở thực vật là một ứng dụng đầy triển vọng của công nghệ sinh học, vì các phương pháp truyền thống còn nhiều hạn chế Việc tạo ra protein có tỷ lệ lysine cao là cách tiếp cận duy nhất để cải tiến protein hạt [26]

Lysine là một trong 12 axit amin thiết yếu cho cơ thể con người , cần có trong bữa ăn hằng ngày Nó giúp tăng cường hấp thụ và duy trì canxi, ngăn cản sự bài tiết khoáng chất này ra ngoài cơ thể Vì vậy, lysine có tác dụng tăng trưởng chiều cao, ngăn ngừa bệnh loãng xương Để có sức khỏe tốt protein giàu lysine rất cần thiết, nhưng con người và động vật đều không thể tự tổng hợp chúng mà phải hấp thu từ chế độ ăn uống hàng ngày Chế độ ăn uống thiếu protein trong thời gian dài có thể dẫn đến tăng trưởng kém, bệnh tật và trong trường hợp nặng có thể gây tử vong Do đó, cải thiện thành phần protein trong thực vật là việc làm rất cần thiết [26, 11]

Gen SBgLR được phân lập và tách dòng từ thư viện DNA genome của khoai tây bằng việc sử dụng cDNA SB401 làm đoạn dò Gen SBgLR có 3 exon và 2 intron

mã hóa cho protein gồm 211 amino acid, đây là gen mã hóa cho protein giàu lysine

tự nhiên với hàm lượng lysine lên tới 18,93% Kết quả nghiên cứu bước đầu cho

thấy chuyển các gen SBgLR, SB401 (từ khoai tây) dưới sự điều khiển của promotor

đặc thù cho thể hiện protein dự trữ ở hạt ngô P19z đã gia tăng hàm lượng lysine từ 16,1 đến 54,8% [31, 17] so với đối chứng không chuyển gen Gần đây gen tự

nhiên mã hóa cho protein giàu lysine GhLRP (từ cây bông) cũng được phân lập, gen

này mã hóa cho protein giầu lysine (18,97% thể tích/thể tích) và cũng đã được

chuyển vào vào cây ngô dưới sự điều khiển của promotor F128 đặc hiệu cho thể hiện gen ở hạt và hàm lượng lysine trong hạt ngô chuyển gen đã tăng từ 16,2 đến 65% [32] Đây là những cơ sở rất quan trọng cho cải tiến chất lượng protein ở thực vật, bằng các gen tự nhiên mã hóa cho protein chất lượng cao

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài: “TÁCH DÒNG

GENE SBgLR MÃ HÓA PROTEIN GIÀU LYSINE TỪ KHOAI TÂY” phục

vụ chuyển gen tăng cường tổng hợp lysine ở một số cây lương thực nghèo axit amin này như ngô, sắn v.v

- Nắm được phương pháp nhân dòng gene mã hóa protein giàu lysine

- Thực hiện được quy trình nhân dòng gene

- Nhân dòng thành công dòng gene SBgLR mã hóa protein giàu Lysine

- Phân tích được kết quả

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Xác định và nhân dòng gen SBgLR mã hóa protein giàu Lysine từ một số loài

khoai tây làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo

Ý nghĩa thực tiễn

Tạo ra những thực vật có giá trị kinh tế , giá trị dinh dưỡng cao Đặc biệt là thực vật có hàm lượng lysine cao

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

2.1.1 Một số nghiên cứu về nguồn gốc cây khoai tây

Cây khoai tây (họ Solanaceae, loại Solanum L., loài Solanum tuberosum L.) có nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes (nam châu Mỹ) ở độ

cao 2000 – 5000 mét Người Tây Ban Nha lần đầu tiên phát hiện ra cây khoai tây khi họ đặt chân lên thung lũng Magdalenna (Nam Mỹ) của người bản xứ chạy trốn, họ đã tìm thấy cây đậu, ngô và khoai tây Lúc đó người ta gọi khoai tây là Truffles vì hoa có màu sặc sỡ [27]

Các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều di tích lịch sử chứng minh cây khoai tây có từ khoảng 500 năm trước công nguyên Thời kỳ người Tây Ban Nha chinh phục châu Mỹ thế kỷ 16, nông dân đã trồng hàng trăm giống khoai tây dọc miền núi, bây giờ là Bolivia, Chile, Colombia, Ecuador và Peru [12] Ngày nay người da đỏ ở vùng Titicaca (nam Peru, bắc Bolivia) vẫn còn trồng những giống khoai tây khởi thủy (Ducreux, 1989) [10]

Khoai tây được bán đầu tiên ở Seville năm 1573 do những thủy thủ người Tây Ban Nha mang chúng đến, từ đó khoai tây lan truyền khắp châu Âu Nước Anh trồng khoai tây rất sớm, từ năm 1590 do thuyền trưởng người Anh trên tầu buôn Tây Ban Nha đem củ giống về Khoảng năm 1600, diện tích trồng khoai tây

mở rộng sang Italia rồi Đức, trong vòng một trăm năm sau khoai tây đã có mặt ở hầu hết các nước châu Âu và trồng rộng rãi vào những năm 1800

Vào thế kỷ 17, những nhà truyền giáo người Anh đã đưa khoai tây đến nhiều vùng thuộc châu Á Thế kỷ 19 những nhà truyền đạo người Bỉ cũng giới thiệu khoai tây tại Công Gô Tuy nhiên, việc sử dụng khoai tây làm lương thực ở các nước nhiệt đới vẫn còn hạn chế vì những khó khăn cố hữu trong sản xuất và bảo quản khoai tây ở vùng thấp Hiện nay cây khoai tây được trồng rất rộng rãi ở

130 nước trên thế giới, từ 60o vĩ Bắc đến 53o vĩ Nam

2.1.2 Một số nghiên cứu về giá trị dinh dưỡng của cây khoai tây

Khoai tây vừa là cây lương thực, vừa là cây thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, hàm lượng dinh dưỡng của khoai tây chỉ kém trứng [19] Sử dụng 100g khoai tây có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu protein, 3% năng lượng, 10% sắt, 10% vitamin B1 và 20 – 50% nhu cầu vitamin C cho một người trong một ngày đêm [7, 12] Khi xem xét các cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới (từ 300 vĩ Nam) Vander Zagg, (1976) [28] cho rằng, cây khoai tây sinh lợi hơn bất cứ cây trồng nào khác vì

nó cho năng lượng và năng suất protein cao nhất

Bảng 2.1 Năng suất protein và năng lượng của một số loài cây lương thực Loại cây

48,64 45,12 48,93 11,72 35,10 38,97

2,0 0,7 1,5 22,0 7,0 9,5

1,1 0,2 0,5 0,6 0,6 0,8

(Nguồn: Vander Zaag, 1976) [28]

Ngoài việc dùng khoai tây làm lương thực và thực phẩm, các nước phát triển sử dụng khoai tây làm thức ăn cho gia súc, hàng năm ở Pháp sử dụng từ 1 đến 1,4 triệu tấn khoai tây cho chăn nuôi Bên cạnh đó, khoai tây còn được dùng nhiều trong công nghiệp dệt, sợi, gỗ (ván ép), giấy, đặc biệt trong công nghiệp sản xuất axit hữu cơ như axit lactic, axit xitric; các dung môi hữu cơ như etanol, butanol, xeton

2.1.3 Protein trong khoai tây

Khoai tây là một nguồn protein chất lượng cao Hàm lượng protein trung bình của khoai tây là 2% trên trọng lượng tươi và khoảng 10% trên khối lượng khô Protein của củ khoai tây có thể được chia thành protein hòa tan, protein không hòa tan và nitơ phi protein Các phần protein không hòa tan là chủ yếu hiện diện trong vỏ protein khoai tây hòa tan có chứa hàm lượng đáng kể của các axit amin thiết yếu axit amin tự do có trong khoai tây hoàn toàn sẵn sàng cho sự hấp thụ protein khoai tây có một tỷ lệ đầy đủ các axit amin tổng số thiết yếu và một sự cân bằng giữa nồng độ acid amin thiết yếu để đáp ứng nhu cầu của trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ Tuy nhiên, tỷ lệ tiêu hóa của protein khoai tây là tương đối thấp ở trẻ sơ sinh.Hàm lượng protein thô trong khoai tây cao hơn so với cây có củ khác như khoai lang và sắn protein khoai tây có giá trị sinh học rất cao bởi vì tất cả các axit amin thiết yếu có mặt theo tỷ lệ tối ưu trong nó Protein trong khoai tây có chứa hàm lượng lysine cao (6,2% lysine), cao hơn nhiều so với các loại ngũ cốc dùng làm nguồn lương thực chính như gạo (3,7% lysine), ngô (4,7% lysine), lúa mì (2,7% lysine) và cao hơn cả một số loại protein có nguồn gốc động vật như sữa và thịt

bò Với hàm lượng lysine cao, khoai tây có thể bổ sung vào chế độ ăn uống thường xuyên [29]

2.2 Tổng quan về Lysine

2.2.1 Đặc tính lysine

Lysine là một α-amino acid thiết yếu cho hoạt động sống của con người và động vật mà không thể tự tổng hợp được Lysine chứa hai nhóm (-NH2) và một nhóm (-COOH) Trong cấu tạo phân tử lysine có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quang học: D-lysine và L-lysine Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái làm tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác và cơ thể sinh vật sống chỉ hấp thu được lysine dạng L Lysine tồn tại dạng rắn và tinh thể trong điều kiện bình thường, bị phân hủy ở nhiệt

độ 200-300°C, có màu tím xanh khi tương tác với ninhydrin [22] Lysine là một

trong 9 amino acid không thay thế trong tổng số 20 amino acid, tìm thấy trong cấu trúc của những phân tử protein tự nhiên của tất cả sinh vật sống và được tổng hợp từ

vi sinh vật Lysine thuộc họ aspartate, được tổng hợp qua con đường phân nhánh Lysine được chuyển hóa ở động vật có vú để tạo nên acetyl-CoA, đầu tiên phải trải qua phản ứng chuyển amin với α-cetoglutarate Sự phân hủy lysine do vi khuẩn bằng phản ứng hóa

Allysine là một đồng phân của lysine, được dùng trong phản ứng tổng hợp elastin và collagen Nó được tổng hợp từ lysine nhờ enzyme lysyl oxidase ở chất nền ngoại bào và quan trọng trong việc tạo các cầu nối để làm bền vững collagen và elastin [8]

2.2.2 Cấu tạo của lysine

Công thức phân tử: C6H14N2O2, khối lượng phân tử 146,188 g/mol, điểm đẳng điện pH = 9.59, Codon của lysine là AAA và AAG Công thức cấu tạo: NH2-

CH2-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH Lysine còn có tên gọi khác là axit diaminocaproic và 2,6- diaminohexanoic acid [8]

α-e-Hình 2.1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine [8]

Hình 2.2 Cấu trúc không gian của L-lysine [8]

2.2.3 Vai trò và ứng dụng của lysine

Lysine giữ vai trò sống còn trong tổng hợp protein, là chìa khóa trong sản xuất enzyme, hoocmon và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng, chống bệnh tật đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh mụn gộp môi hay mụn gộp sinh dục Cơ thể người và động vật thiếu lysine sẽ không hoạt động bình thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm lớn, trí tuệ phát triển kém Chính vì thế lysine thường được đưa vào phần ăn của trẻ và của gia súc L-Lysine là một thành phần quan trọng của tất cả các protein trong cơ thể L-Lysine đóng vai trò quan trọng trong việc hấp thu canxi; tạo cơ bắp; phục hồi sau chấn thương hay sau phẫu thuật; sự tổng hợp các hormone, enzym, và các kháng thể Nhu cầu dinh dưỡng hằng ngày (miligam lysine trên 1 kilogam khối lượng cơ thể) là: trẻ sơ sinh (3–4 tháng) 103, trẻ em (2 tuổi) 64, trẻ em (10–12 tuổi)

60 đến 44, người lớn 12 (FAO, 2010) Các nguốn thức ăn giàu lysine gồm có trứng, thịt (nhất là thịt đỏ như thịt cừu, thịt gia cầm), đậu nành, pho mát, một vài loại cá

Do đó, bổ sung nguồn giàu D-lysine và L-lysine vào là cần thiết để tăng hiệu quả thức ăn

Các nghiên cứu trên người cũng cho thấy có sự liên quan giữa sự lo lắng và thiếu hụt lysine Một nghiên cứu trên 93 gia đình ở Syria gần như chỉ ăn gạo và do

đó bị thiếu hụt lysine cho thấy rằng, khi tăng cường các loại thức ăn giàu lysine thì

các triệu chứng lo lắng giảm đi, lượng cortisol trong máu tăng lên, và tính đáp ứng của thụ thể benzodiazepine tăng lên. [16]

Lysine cũng cho nhiều hứa hẹn trong việc chữa trị ung thư, bằng cách kết hợp việc sử dụng thuốc với liệu pháp ánh sáng để tiêu diệt các tế bào ung thư mà không làm tổn lại đến các tế bào lành [15]

Các nghiên cứu trên động vật cho thấy sự thiếu hụt lysine dẫn đến suy giảm miễn dịch Cystine niệu là một nguyên nhân dẫn đến sự thiếu hụt lysine, trong đó nguyên nhân tiên phát là do sự suy giảm chức năng tái hấp thu các bazơ hay các axit amin tích điện dương của gan, trong đó có lysine Điều này cũng dẫn đến sự tạo sỏi cystine trong thận do sự giảm tái hấp thu các axit amin ở thận

Một vài nghiên cứu cho thấy chế độ ăn giàu lysine hay được bổ sung lysine monoclorua có ảnh hưởng vừa phải đến huyến áp và tỉ lệ bị đột quỵ [9]

L-2.2.4 Các phương pháp thu nhận lysine hiện này [22]

Phương pháp thủy phân: Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các

nguyên liệu chứa nhiều protein Các phương pháp này hiện nay vẫn đang được sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là thiết bị sản xuất phải chịu được acid hay kiềm Trường hợp sử dụng kiềm để thủy phân sẽ tạo ra nhiều acid amin dạng D, trường hợp sử dụng acid để thủy phân sẽ ô nhiễm môi trường

không khí do lượng acid dư bay hơi trong quá trình thủy phân

Phương pháp tổng hợp hóa học: Ưu điểm của phương pháp là sản xuất ổn

định, có thể tiêu chuẩn hóa điều kiện sản xuất, đảm bảo hiệu suất nhưng nhược điểm là thu được các acid amin dạng Racemic( L và D- acid amin) mà cơ thể không

sử dụng dạng D nên công đọan tách ra rất phức tạp

Phương pháp lên men: Ở đây ta tiến hành nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận

các acid amin Ưu điểm của phương pháp là:Phương pháp này cho phép ta thu nhận acid amin dạng L Nguyên liệu để sản xuất rẻ, dễ kiếm Tốc độ trao đổi chất, tốc độ sinh sản và phát triển mạnh của vi sinh vật cho phép ta được năng suất cao Giá

thành sản phẩm thấp hơn giá thành sản phẩm từ các phương pháp khác

Phương pháp kết hợp: Người ta kết hợp phương pháp hóa học và sinh học

Bằng con đường hóa học, thu nhận hợp chất dạng L-Keto và các tiền chất của acid amin Sau đó sử dụng vi sinh vật để chuyển hóa những chất này thành acid amin Nhìn chung, phương pháp dùng vi sinh vật để chuyển các chất tiền thân của acid amin thành acid amin tương ứng là một phương pháp có nhiều triển vọng và thường được sử dụng trong sản xuất lysine Cơ sở khoa học của phương pháp là: trong quá trình trao đổi chất, vi sinh vật có khả năng tích lũy acid amin trong môi trường Ở điều kiện sống bình thường, lượng acid amin mà chúng tổng hợp được thường đủ đáp ứng nhu cầu bản thân, nhưng trong điều kiện nào đó, lượng acid amin này có thể vượt xa nhu cầu bản thân và tích lũy lại trong tế bào hay thoát ra môi trường Hiện tượng này được gọi là siêu tổng hợp acid amin của vi sinhvật Trong khoảng

10 năm gần đây, trên thị trường có một bước tiến mạnh mẽ trong công nghệ sản xuất Lysine bằng con đường lên men

2.3 Gene SBgLR

2.3.1 Cấu trúc của gene SBgLR

SBgLR được phân lập và tách dòng từ thư viện DNA genome của khoai tây

Gen SBgLR có 3 exon và 2 intron mã hóa cho protein gồm 211 amino acid [18]

2.3.2 Vai trò của gen SBgLR

Gen SBgLR là gen mã hóa cho protein giàu lysine tự nhiên với hàm lượng

lysine lên tới 18,93% Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy chuyển các gen

SBgLR, SB401 (từ khoai tây) dưới sự điều khiển của promotor đặc thù cho thể hiện

protein dự trữ ở hạt ngô P19z, các gen này làm gia tăng hàm lượng lysine từ 16,1

đến 54,8% so với đối chứng không chuyển gen [31; 18]

2.4 Tình hình nghiên cứu gen mã hóa protein giàu lysine ở Việt Nam và trên Thế giới

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới

Hiện nay, cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, việc tăng cường các protein giàu lysine ở trong các cây lượng thưc thiết yếu như ngô, lúa mì, lúa

mạch, bằng phương pháp chuyển gen đang được quan tâm nghiên cứu và công bố

ở một số nước trên thế giới

Để tăng chất lượng protein (tăng lysine hoặc tryptophan) đã có một số nghiên cứu chọn các đột biến làm giảm hàm lượng zein trong đó có các đột biến

mang gen opaque-2 (o2) và floury-2 (fl2) [21; 23] Tuy nhiên, các đột biến này có

nội nhũ trắng xốp dễ bị phá hủy, dễ bị bệnh và năng suất thấp [16; 24] Một hướng nghiên cứu được đề suất để giải quyết vấn đề này là cải biến di truyền cấu trúc của nội nhũ nhưng hướng này khó đưa vào thực tế vì phải biến đổi nhiều gen mới có thể cải tiến được nội nhũ [13]

Segal et al (2003) và Huang et al (2005) [25; 14] đã sử dụng kỹ thuật RNAi

để ức chế tổng hợp 22 kDa α- zein và 19 kDa α- zein ở giống ngô đột biến O2 đã làm gia tăng hàm lượng lysine tới 16 – 20% Khi sử dụng RNA sợi đôi (ds RNA)

để làm giảm sự tổng hợp đồng thời 22 kDa α- zein và 19 kDa α- zein đã gia tằng hàm lượng lysine từ 2,83% lên 5,63% và hàm lượng tryptophan từ 0,69% đến 1,22% Ngoài ra, do tính chất trội của gen chuyển nên dễ dàng duy trì chất lượng so với đột biến lặn O2

Các acid amin không thay thế như lysine, threonine và methionine ở thực vật được tổng hợp từ aspartic acid theo một chu trình phức tạp và thường có hiện tượng

ức chế ngược (feed back inhibition) Aspartate kinase (AK) và dihydropicolinate synthase (DHPS) là các enzyme then chốt của chu trình này AK có vai trò quan trọng ở giai đoạn đầu và bị ức chế bởi lysine và threonine còn DHPS ở giai đoạn

cuối bị ức chế bởi lysine Thể hiện gen mã hóa DHPS từ Corynebacterium ở

aleurone và phôi ngô đã gia tăng lysine tự do 50 – 100% [20] Tuy nhiên lại không

có sự gia tăng lysine khi thể hiện gen này ở nội nhũ Zhu et al (2007) [34] thể hiện DHPS ở ngô đã gia tăng hàm lượng lysine tự do trong hạt từ 2 đến 30% trên tổng acid amin Năm 2006, Monsanto đã đưa vào sản suất giống ngô chuyển gen với

hàm lượng lysine cao bằng thể hiện DHPS gen từ Corynebacterium dưới sự điều khiển của globulin-1 promoter Hàm lượng lysine tự do trong hạt tăng từ 2500 –

2800 ppm lên 3500 – 5300 ppm Tuy nhiên, việc sử dụng các gen từ nguồn vi sinh

vật trong tạo giống cây trồng chuyển gen đã và đang tạo nên sự hoài nghi về tính an toàn của cây chuyển gen

Hiện nay cách tiếp cận sử dụng các gen từ cây trồng trong tạo cây trồng chuyển gen (cistrangenic) đang được quan tâm để phát triển cây chuyển gen thân thiện với môi trường Chiến lược cải tiến di truyền tăng chất lượng protein ở ngô bằng việc gia tăng hàm lượng lysine đặc biệt là lysine tự do ở cây ngô bằng sử dụng

các gen tổng hợp protein giàu lysine như SB401 [31], SBgLR [18], GhLRP [30, 33]

từ một số cây trồng đang được quan tâm

Năm 2014, Yue và cộng sự đã so sánh các giống ngô chuyển gen mã hóa cho

protein giàu lysine được tách dòng từ cây khoai tây gen Sb401 và SBgLR và GhLRP

nhân từ cây bông Kết quả thu được các dòng ngô chuyển gen có hàm lượng lysine cao hơn so với kiểu dại và thay đổi từ 16.2%- 65%.Tổng hàm lượng protein là không khác biệt rõ rệt, ngoại trừ trong 6 dòng chuyển gen Các mức hàm lượng lipid và tinh bột không khác biệt đáng kể trong hạt biến đổi gen mã hóa protein GhLRP giàu lysine khi so sánh với kiểu dại Các đặc tính nông học của tất cả các bắp chuyển gen cũng bình thường GhLRP là một gene mã hóa cho protein giàu lysine để tăng hàm lượng lysine ngô [33]

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam chưa có một công trình nào tiếp cận công nghệ gen để tạo giống cây trồng có chất lượng protein cao Tuy nhiên, cũng có một số nghiên cứu làm tăng chất lượng protein nhờ phương pháp lai

Nhằm tạo ra giống lúa mới, có hàm lượng protein cao, hàm lượng amylose trung bình thích hợp điều kiện sinh thái của các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, từ năm 2001-2005, phòng thí nghiệp di truyền chọn giống và công nghệ sinh học, khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng, Trường Đại Học Cần Thơ đã thực hiện các tổ hợp lai theo phương pháp truyền thống kết hợp với ứng dụng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE đã chọn ra được 2 dòng Nếp có hàm lượng protein cao (trên 10% ), hàm lượng amylose rất thấp (dưới 2%) và 3 dòng lúa đặc sản có hàm lượng protein cao (trên 10%), hàm lượng amylose thấp (dưới 20%) [5]

Xuất phát từ những nhu cầu sử dụng và lợi ích của giống ngô có chất lượng protein cao (QPM), Viện Nghiên cứu Ngô đã nhập nội một số nguyên liệu QPM (1998) và hợp tác với CIMMYT lai tạo thành công giống lai đơn, đặt tên là HQ2000, có năng suất cao tương đương với ngô lai thường nhưng hàm lượng protein cao hơn ngô thường Hàm lượng protein là 11,0% (ngô thường 8,5 –9,0%), trong đó lysine/protein là 4,0%, triptophan/protein là 0,82% (ngô thường là 2,0% và 0,5%) [3]

Gần đây nhất, Giống ngô LVN154 do Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo, có bố

mẹ là V64 x V152, , được công ty CP Đại Thành tiến hành sản xuất thử với tên giống là GS8, từ vụ đông 2009, vụ xuân và vụ đông 2010; năng suất cả 3 vụ đều cao hơn so với đối chứng Với kết quả khảo nghiệm của mạng lưới khảo nghiệm Quốc gia và khảo nghiệm tại các tỉnh đều đạt kết quả tốt: thời gian sinh trưởng trung bình

vụ xuân 110 – 115 ngày, vụ đông 105 – 110 ngày, sinh trưởng phát triển khoẻ, chống đổ, chịu hạn tốt, lá bi bao kín bắp, chắc và mỏng, dễ thu hoạch, không bị mọt ngoài ruộng, tiềm năng năng suất cao, 10 tấn/ha, hàm lượng protein cao hơn ngô thường khoảng trên 3% và lysine/protein, tryptophan cao gấp 1,5 – 2 lần so với ngô thường; khả năng thích ứng rộng; trồng được nhiều vùng, nhiều vụ và nhiều loại đất Kết quả phân tích hàm lượng protein của giống ngô GS8 (LVN154), đạt 11,86% chất khô, cao hơn cả giống ngô HQ2000 (10,12% chất khô), hàm lượng tinh bột khá cao, đạt 68,25% chất khô

2.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử sử để tách dòng gene

2.5.1 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng trùng hợp)

được Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên năm 1985 Đây là kỹ thuật in vitro, tương đối đơn

giản cho phép nhân nhanh một số lượng không hạn chế nguyên bản một đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của DNA polymerase Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần

sự hiện diện của những mồi đặc hiệu Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình

thành mạch mới Quá trình nhân bản bằng enzym này bao gồm 3 bước được lặp lại nhiều lần:

- Biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94-950C trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút

- Gắn mồi (primer) với đoạn DNA cần nhân thông qua hạ nhiệt độ xuống

40-600C, trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút, phụ thuộc vào độ dài và tỉ lệ G+C của đoạn mồi

- Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi Hai phân

tử DNA mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử khuôn ban đầu Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút Để tránh hiện tượng bắt cặp không đặc thù, phản ứng tổng hợp nên được thực hiện ở 720

C Loại polymerase dùng trong

PCR là loại chịu nhiệt (Taq polymerase) được tách chiết từ vi khuẩn Thermus

aquaticus, một loại vi khuẩn được phân lập từ suối nước nóng Hiện nay, enzym

này chủ yếu được sản xuất theo con đường tái tổ hợp

Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng lượng DNA cần nhân bản sẽ tăng gấp đôi, với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có Nx2n sợi DNA được nhân lên Ví dụ, sau khoảng 20 chu kỳ có tới trên 30 triệu bản được nhân lên từ một sợi khuôn ban đầu [1, 2]

2.5.2 Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E coli

Biến nạp theo nghĩa rộng là: đưa bất kỳ DNA nào vào bất kỳ tế bào nào

Trong trường hợp các tế bào E coli thì biến nạp có nghĩa là đưa DNA plasmit vào

trong tế bào

Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn được Frederick Griffith mô tả vào năm

1928 trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lý biến nạp” Trên thực tế, phát minh này về sau đã chứng minh rằng các gen được cấu thành từ DNA Tuy nhiên, không phải tất cả các vi khuẩn đều có thể được biến nạp một cách dễ

dàng Để cho biến nạp ở E coli có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến

(competent) Để đạt được điều này, người ta ngâm các tế bào trong dung dịch CaCl2

lạnh trong đá, khi đó các tế bào trở nên khả biến theo một cách mà cho đến nay vẫn chưa rõ nguyên nhân Việc biến nạp các tế bào khả biến được thực hiện bằng cách

trộn DNA plasmit với các tế bào, rồi ủ trong đá 20-30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn (khoảng 1 phút ở 420C), làm như vậy DNA sẽ chui vào tế bào Sau khi biến nạp,

vi khuẩn được nuôi phục hồi trong môi trường LB ở 370C trong vòng 60 đến 90 phút Sau đó, các tế bào được đưa lên môi trường chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmit

Trong quá trình biến nạp, chỉ có một phần rất nhỏ các tế bào khả biến được biến nạp Mặc dù có nhược điểm rất lớn này, biến nạp vẫn là một kỹ thuật quan trọng, nó có thể tạo ra tới 109 các tế bào biến nạp (tức các thể biến nạp) khi đưa 1 microgam DNA vào thí nghiệm Thường trên thực tế với 1 microgam DNA người ta tạo ra được 106 đến 107 tế bào biến nạp [4]

2.5.3 Kỹ thuật tách dòng gene

Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu được sử dụng trong kỹ thuật di truyền và là bước khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này [27] Mục đích của việc tách dòng là nhằm thu được một lượng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm Đầu tiên, DNA ngoại lai được nối vào một vectơ nhằm tạo ra DNA tái tổ hợp Vectơ sử dụng

là plasmit thích ứng của vi khuẩn E coli Sau đó vectơ tái tổ hợp được biến nạp vào

tế bào chủ và tế bào chủ được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để nhân vi

khuẩn lên nhiều lần Tế bào chủ ở đây là vi khuẩn E coli Cuối cùng qua các bước

tách chiết DNA, người ta sẽ thu được một lượng lớn plasmit tái tổ hợp [2]

Các nhân tố như vectơ, tế bào chủ có thể thay đổi nhưng tiến trình tách dòng nói chung được thực hiện qua 4 bước: xử lý DNA cần tạo dòng, tạo vectơ tái tổ hợp, biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ, chọn dòng

- Xử lý DNA cần tạo dòng

Trước hết DNA cần tạo dòng được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR sau đó được làm sạch để thu được phân đoạn DNA có kích thước như mong muốn, loại bỏ mồi và các thành phần khác trong phản ứng PCR Bước này nhằm tạo điều kiện cho bước chọn dòng được thực hiện nhanh và hiệu quả, tránh những plasmit tái tổ hợp có kích thước không mong muốn

- Tạo vectơ tái tổ hợp

Vectơ tái tổ hợp được tạo ra bằng cách gắn gen quan tâm (đoạn DNA cần tạo dòng) vào vectơ tách dòng Thông thường, sau khi chạy PCR với enzyme Taq polymerase, enzyme này sẽ gắn thêm một nucleotit là adenin vào đầu 3’ của đoạn gen được nhân lên Lợi dụng tính chất này các nhà khoa học đã nghiên cứu thiết kế các thế hệ vectơ tách dòng có mang một nucleotit là Thymin ở đầu 5’ của vectơ đã được mở vòng sẵn tại PCS (polycloning site-vùng nhân dòng đa điểm cắt) Hiện nay, có rất nhiều vectơ tách dòng có đặc tính này, như pCR2.1-TOPO, pGEM-T

Vectơ tách dòng và DNA cần tạo dòng được trộn chung theo một tỷ lệ nhất định dưới sự xúc tác của enzym T4 ligase, DNA sẽ được gắn vào vectơ theo nguyên tắc bổ sung A-T tại vị trí mở vòng

- Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ

Trong quá trình gắn gen vào vectơ sẽ hình thành nên các vectơ tái tổ hợp khác nhau Bước này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vectơ tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao Tuỳ vào mục đích sử dụng, người

ta sẽ chọn tế bào chủ là tế bào E coli hay tế bào nấm men

- Chọn dòng

Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp theo hai cách thông dụng: chọn lọc theo phương pháp kháng sinh (kanamycin hoặc ampicillin) nhằm loại trừ các tế bào vi khuẩn không được biến nạp và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác và chọn lọc theo phản ứng với cơ chất (X-gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn có mang vectơ nhưng không

có đoạn gen được chen vào

2.5.4 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp để xác định tế bào vi khuẩn có plasmit mang gen mong muốn, như phương pháp colony-PCR, cắt plasmit bằng các enzym hạn chế, hoặc PCR từ plasmit Trong đó phương pháp colony-PCR cho phép phát hiện nhanh khuẩn lạc mang plasmit tái tổ hợp mong muốn Phương pháp này có ưu điểm là nhanh, ít tốn kém và đơn giản Hiện nay, kỹ thuật này được ứng dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu sinh học phân tử

Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR dựa trên nguyên tắc kỹ thuật PCR, chỉ khác

ở chỗ mẫu DNA được thay bằng DNA plasmit giải phóng từ khuẩn lạc ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmit tái tổ hợp Plasmit tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu

2.5.5 Kỹ thuật xác định trình tự nucleotit

Những phương pháp đọc trình tự axit nucleic đang được sử dụng hiện nay đều được cải tiến từ phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotit của Sanger và cộng sự (1977) Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ sung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định Đặc trưng của phương pháp là ngoài bốn loại nucleotit thông thường còn

sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotit là những deoxynucleotit trong đó nhóm 3’OH được thay bằng H Điều này khiến cho các dideoxynucleotit không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodiester và do đó ngừng quá trình tổng hợp Trong kỹ thuật đọc trình tự nucleotit tự động, mỗi dideoxynucleotit được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau Như vậy, tất cả oligonucleotit cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotit sẽ có cùng một màu Sau khi điện di trong ống vi mao quản, tạo ra một dãy các phân đoạn DNA hơn kém nhau một nucleotit Thiết

bị phát hiện huỳnh quang (detector) phát hiện các băng theo thời gian, băng nào xa nhất được phát hiện trước Detector phát tín hiệu lên máy tính Detector là một thiết bị khuếch đại tín hiệu Kết quả xác định trình tự sẽ được xử lý bằng phần mềm máy tính chuyên dụng

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu

Hóa chất thực hiện phản ứng PCR bao gồm buffer PCR 1X; dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) của Thermo Scientific; mồi của Intvirogene, Taq polymerase của Thermo Scientific, H2O được khử ion

Hóa chất điện di bao gồm các loại như: Bromophenol blue, ethidium bromide, agarose, tris base, boric acid, EDTA, HCl, marker 1 kb của hãng Fermentas

Hóa chất dùng để biến nạp gene bao gồm: bộ kit tách dòng clone JETTM PCR

cloning của hãng Thermo Scientific; vi khuẩn E coli chủng DH5α; môi trường LB

lỏng (1% tripton, 0,5% cao nấm men, 1% NaCl); môi trường LB đặc (1% tripton, 0,5% cao nấm men, 1% NaCl, 1,5% agarose); kháng sinh ampicillin 50 mg/l

Hóa chất dùng để tách chiết DNA plasmid bao gồm: dung dịch I (50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl PH 8,0; 10 mM EDTA PH 8,0); dung dịch II (10 N NaOH; SDS 10%); dung dịch III (5M Potassium acetate; axit acetic)

Hóa chất dùng để thôi gel bao gồm: GeneJETTM

gel extraction Kit do hãng Themo Scientific cung cấp