Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh tụ cầu vàng kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN TUẤN ANH Tên đề tài: BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU VÀNG Staphylococcus aureus KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN TUẤN ANH

Tên đề tài:

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU

VÀNG (Staphylococcus aureus) KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính Quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 – 2015

Thái Nguyên, năm 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN TUẤN ANH

Tên đề tài:

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU

VÀNG (Staphylococcus aureus) KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính Quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 – 2015 Giảng viên hướng dẫn: 1.BS Nguyễn Thị Huyền

2 TS Nguyễn Văn Duy

Thái Nguyên, năm 2015

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy và đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt những năm học vừa qua

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài

BS Nguyễn Thị Huyền, CN Trần Trung Anh, cùng các KTV Nguyễn Thị Thủy, Trương Thùy Vi, Dương Minh Phương, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi và đã cung cấp các chủng sinh vật để thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ và những người bạn đã luôn ở bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 5 năm 2015

ii

DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

CIAA Hỗn hợp gồm 24 chloroform : 1 isoamylalcohol (v/v)

CFU Colony Forming Unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc

DNA Deoxyribonucleic Acid

dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates (Hỗn hợp gồm dATP,

dGTP, dCTP, dTTP)

OD Optical Density - Mật độ quang

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi trùng

hợp - chỉ quá trình tổng khuếch đại vùng DNA đặc hiệu in vitro

BP Môi trường Baird Parker

ELSA Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Kỹ thuật hấp thụ miễn

dịch liên kết với enzyme

MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus

WHO Tổ chức Y tế Thế giới

VRSA Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus

S aureus Staphylococcus aureus

ANSORP mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á

PBP Biến đổi các protein liên kết với Penicillin

iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 21 Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu 21 Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 4.1: Kiểu hình của 17 chủng S aureus phân lập được tại Bệnh viên Đa khoa

Trung Ương Thái Nguyên 33

Bảng 4.2 Bảng khảo sát tỷ lệ vi khuẩn S aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều

trị tại bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên 36

Bảng 4.3: Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ 17 chủng S aureus phân lập được 39 Bảng 4.4: So sánh sự có mặt của gen mecA với kiểu hình kháng Methicillin của các chủng Staphylococcus aureus thu thập được 43

iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Hình thái Staphylococcus aureus 6 Hình 4.1: Phân lập S aureus trên môi trường thạch máu 31 Hình 4.2: Hình ảnh kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ với chủng S aureus (S4) 32

Hình 4.3: Điện di kiểm tra dung dịch DNA tổng số tách chiết từ một số mẫu S aureus 39 Hình 4.4: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR 41 Hình 4.5: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm Multiplex PCR sử dụng cặp mồi MecAF-MecAR và NucF-NucR 42

v

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 3

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.2.2 Yêu cầu của đề tài 3

1.3 Ý nghĩa của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa trong khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu về Staphylococcus: 4

2.1.1 Lịch sử phát hiện 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái 5

2.1.3 Danh pháp và phân loại của S aureus 5

2.2 Cấu trúc di truyền của S aureus 6

2.3 Các chỉ thị phân tử của S aureus 7

2.4 Đặc tính sinh học của S aureus 8

2.5.Cơ chế gây bệnh 9

2.6 Tình Hình Nghiên Cứu Tính Kháng Thuốc Ở S aureus 9

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

2.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

2.7 Cơ chế đề kháng kháng sinh 13

2.7.1 Ức chế bằng enzyme 13

2.7.2 Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn 14

2.7.3 Biến đổi vị trí gắn kết 15

2.7.4 Bơm đẩy 16

vi

2.7.5 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm β-lactam 17

2.8 Các phương pháp phát hiện S aureus kháng thuốc 18

2.8.1 Phương pháp vi sinh 18

2.8.2 Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC) 18

2.8.3 Kỹ thuật PCR 19

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 20

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 20

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 20

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 20

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 20

3.3 Vật liệu nghiên cứu 20

3.3.1 Các cặp mồi sử dụng trong đề tài 20

3.3.2 Hóa chất sử dụng trong đề tài 21

3.3.3 Dụng cụ, thiết bị 22

3.4 Nội dung nghiên cứu 22

3.4.1 Khảo sát tỷ lệ vi khuẩn S aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 22

3.4.2 Phân lập vi khuẩn S aureus kháng thuốc 22

3.4.3 Phát hiện nhanh S aureus kháng methicillin bằng kỹ thuật PCR 22

3.5 Phương Pháp Nghiên Cứu 23

3.5.1 Phương pháp phân lập S aureus, và làm kháng sinh đồ từ các bệnh nhân làm tại bệnh viên) 23

3.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng hóa chất CTAB 27

3.5.3 Phản ứng PCR 29

3.5.4 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 30

vii

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Kết quả phân lập 17 chủng S aureus kháng thuốc kháng sinh tại Bệnh viện

Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 31

4.2 Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của các chủng S aureus trên các bệnh

nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 36

4.3 Thử nghiệm khả năng phát hiện nhanh S aureus kháng thuốc bằng kỹ thuật

sinh học phân tử 38 4.3.1 Tách chiết DNA tổng số 38

4.3.2 Kiểm định các chủng S aureus 40 4.3.3 Nghiên cứu khả năng phát hiện nhanh vi khuẩn S aureus kháng thuốc 41

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Loài Staphylococcus aureus là một trong số các vi khuẩn ký sinh ở

trên da và niêm mạc, nhiều nhất là ở mũi Có khoảng 10-40% người khỏe

mạnh mang S aureus (Trần Thị Như Hoa, 2012) [6] Khi có những tổn

thương ở da và niêm mạc kèm theo những rối loạn về chức năng thì các

nhiễm trùng do S aureus dễ dàng xuất hiện Hiện nay, hiện tượng S aureus

kháng kháng sinh trở nên khá phổ biến do tình trạng sử dụng kháng sinh ngày càng nhiều ở cộng đồng với những kháng sinh có hoạt phổ rộng, nhiều loại kháng sinh khác nhau với liều lượng không đúng Hiện tượng kháng thuốc không chỉ xuất hiện ở các vi khuẩn trong bệnh viện mà còn trên các vi khuẩn

ở cộng đồng ngoài bệnh viện Việc nghiên cứu mức độ kháng thuốc ở vi khuẩn là vấn đề rất cần thiết nhằm theo dõi diễn biến kháng thuốc, dự báo xu thế kháng thuốc và đề ra những biện pháp thích hợp nhằm hạn chế mức gia tăng tính kháng thuốc từ đó giúp cho việc sử dụng kháng sinh ở cộng đồng hợp lý và tiết kiệm (Trần Thị Như Hoa, 2012) [6]

Theo một kết quả khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành

phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S aureus phân lập từ bệnh

phẩm có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006) [8] Cũng theo một báo cáo khác từ tháng 8/2012 - tháng 8/2013, một nghiên

cứu với 143 chủng S aureus về tỉ lệ đề kháng KS của S aureus trong 4.299

bệnh phẩm, được phân lập tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, Viện Pasteur Thành

phố Hồ Chí Minh Kết quả cho thấy: S aureus chiếm 23,6%, đa số được phân

lập từ bệnh phẩm mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nước tiểu (11,9%) và

phân (10,5%) Qua kết quả từ kháng sinh đồ (KSĐ), tỉ lệ đề kháng của S

2

aureus với các KS là 93,7% với Penicilline G, 65,0% với Erythromycine,

60,8% với Kanamycine, 58% với Clindamycine Tỉ lệ MRSA là 39,2% (Nguyễn Hữu An, 2013) [1]

Với việc phát hiện tính kháng thuốc ở vi khuẩn hiện nay chủ yếu dựa trên cơ sở nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường chứa kháng sinh Đây là phương pháp đã được khẳng định có độ chính xác cao nhưng tốn thời gian và phải thực hiện nhiều thao tác nuôi cấy phức tạp Việc phát hiện chậm tính kháng thuốc ở vi khuẩn cũng là nguyên nhân góp phần làm cho các chủng vi khuẩn kháng thuốc có cơ hội lây lan Do đó, việc phát hiện nhanh vi khuẩn kháng thuốc là một yêu cầu cần thiết góp phần giảm nguy cơ lây lan của các

vi khuẩn kháng thuốc này, đặc biệt trong môi trường bệnh viện

Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu công bố về các chỉ thị phân tử liên

quan đến tính kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn nói chung và S aureus nói

riêng Đây là những tiền đề cho việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện nhanh vi khuẩn kháng thuốc

Có nhiều phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn kháng thuốc đã được nghiên cứu công bố như giải trình tự gen, các kỹ thuật PCR, DNA arrays, ELISA… Trong đó PCR là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp nên rất thuận lợi trong việc áp dụng thực tiễn chẩn đoán

Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu của Khoa CNSH và CNTP - Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại Học

Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Bước đầu nghiên cứu

phương pháp phát hiện nhanh tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus)

kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR”

Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát mức

độ kháng thuốc kháng sinh của S aureus tại các bệnh nhân điều trị tại Bệnh

viện Đa khoa Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5

3 năm 2015 và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh vi khuẩn này kháng Methicillin - 1 trong những thuốc kháng sinh được điều trị phổ biến và có tỷ lệ kháng thuốc cao

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát được thực trạng kháng thuốc của vi khuẩn S aureus tại Bệnh

viện Đa khoa Thái Nguyên và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR

phát hiện nhanh S aureus kháng Methicillin

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

- Khảo sát được tỷ lệ vi khuẩn S aureus kháng thuốc trên bệnh nhân

điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên

- Phân lập được vi khuẩn S aureus kháng thuốc

- Ứng dụng được kỹ thuật PCR phát hiện nhanh S aureus kháng thuốc

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa trong khoa học

Đánh giá được thực trạng S aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị

tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên và nghiên cứu ứng dụng kỹ

thuật phát hiện nhanh S aureus kháng thuốc

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

Nghiên cứu được kỹ thuật phát hiện nhanh S aureus kháng thuốc bằng

kỹ thuật PCR Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho việc xây dựng phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn kháng kháng sinh góp phần điều trị có hiệu quả bệnh nhân nhiễm trùng, hạn chế sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong

cộng đồng

4

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về Staphylococcus:

Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, Staphylo (chùm nho) và coccus (hạt)

Phân loại của vi khuẩn Staphylococcus như sau:

trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày

tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong

lâm sàng S aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878,

phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật (VSV) học Năm

1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa sự hiện diện của hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát hiện này mới

được chấp nhận rộng rãi Báo cáo của (Nguyễn Thị An 2011) [2]

5

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Staphylococcus là vi khuẩn gram dương, hình cầu đường kính 0,5 - 1,5

µm, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và màng nhày của người và động vật máu nóng Năm 1871, Recklinghausen thu được cầu khuẩn trong thận của bệnh nhân chết do bệnh nhiễm khuẩn huyết Năm 1880, Alexander Ogston chứng minh được áp-xe sinh mủ là do cầu khuẩn dạng chùm và Ogston được công nhận là

người khám phá và đặt tên cho tụ cầu - Staphylococcus vào năm 1882 Năm

1884, Rosenbach nghiên cứu và đặt tên cho cầu khuẩn tạo khuẩn lạc màu vàng là

Staphylococcus pyrogen aureus (Scott E Martin, 2000) [41]

2.1.3 Danh pháp và phân loại của S aureus

Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus, tên khoa học là Staphylococcus aureus (Baba T,

2002) [17]

Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm

chính: tụ cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase S aureus gây bệnh

ngộ độc thực phẩm là tụ cầu có coagulase Nhờ enzyme này mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn được gọi là tụ cầu vàng (Phạm Văn Phúc, 2013) [10]

6

 Đặc điểm cấu trúc của Staphylococcus aureus (Hình 2.1)

Hình 2.1: Hình thái Staphylococcus aureus

2.2 Cấu trúc di truyền củaS aureus

Hiện nay người ta đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng

tụ cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315, Mn50, N315, Mu50, RF122… (Baird R.M, Lee W.H, 1995) [18] , Steven và cộng sự đã thành công trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422

bp của chủng S aureus COL Kết quả giải trình tự đã được đăng kí trên

Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen và CP000045 cho hệ gen plasmid Theo đó, trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít nhất các cặp G-C, điều này gây ra mối quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới các tác nhân gây bệnh Gram dương khác (Gill S R,2005) [23]

Trong số các chủng S aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ giống

enterotoxigenic được ước tính khoảng 25% Tại pháp, trong số 61 chủng phân lập

từ phomat và sữ tươi có 15,9% chủng là giống enterotoxigenic Ở pháp, trong số

332 chủng S aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa các

7

gen SEG, SEB, SEI, và SEJ suất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen SEA

và SEE, trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế (Lâm Quốc Hùng, 2009) [7]

2.3 Các chỉ thị phân tử của Staphylococcus aureus

Chủng S aureus sản xuất ra một enzyme ngoại bào chịu nhiệt nuclease

(thermonuclease [Tnase] ) với tần số tương ứng với thời điểm mà nó sản xuất ra coagulase (Brakstad O.G, 1992) [20] Các Tnase là một loại protein có khối lượng phân tử 17.000 Da Nó là một endonuclease, làm giảm cả DNA, RNA và hoạt động của enzyme có thể chống lại nhiệt độ 1000

C trong vòng 1 giờ (Brakstad

O.G, 1992) [20] Trong các phản ứng PCR phát hiện S aureus, người ta thường dùng các mồi chuyên biệt để phát hiện gen nuc mã hóa nuclease chịu nhiệt (Sasaki

T, 2010) [40] Sasaki T và cộng sự (2010) đã sử dụng gen nuc trong việc nhận dạng loài Staphylococci dương tính với cogulase bằng phương pháp mulyiplex-

PCR (Sasaki T, 2010) [40] Brakstad O.G và cộng sự (1992) đã sử dụng gen nuc

làm gen chỉ thị trong phát hiện S aureus bằng phản ứng khuếch đại gen nuc (Brakstad O.G, 1992) [20] Wilson I.G và cộng sự (1991) đã sử dụng gen nuc làm gen chỉ thị để phát hiện S aureus trong sữa nghi ngờ bị nhiễm tụ cầu vàng

(Wilson I G, 1991) [44] Ngoài ra theo nghiên cứu của Pinto B và cộng sự (2004) cho biết có thể dùng các mồi chuyên biệt khác để phát hiện các gen mã hóa độc tố

ruột (enterotoxin), gen tst (gây hội chứng sốc), gen eta và etb (mã hóa độc tố A và

B gây mảng tróc), vùng đệm rDNA 16-23S và (Pinto B, 2005) [37] Còn có nhiều phương pháp dựa trên PCR được dùng để phát hiện nhanh tụ cầu như inter-IS256 PCR, spa typing (Wei H L, 2002) [43], hay phương pháp DNA fingerprinting cũng như phương pháp RLPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) để phân

loại các dòng S aureus và kỹ thuật PCR-RELP (Randomly Fragment Length Polymorphiism) để phân tích gen aroA (Pinto B, 2005) [37]

8

2.4 Đặc tính sinh học của S aureus

S aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme

catalase phân giải oxy già, giải phóng oxy và nước:

Catalase

H2O2 H2O + O2

S aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase Đây được xem là tính chất đặc trưng của S aureus, là tiêu chuẩn để phân biệt S aureus với các tụ cầu khác Có hai dạng coagulase:

coagulase “cố định” (“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase

“tự do” (“free” coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào Có hai phương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thử nghiệm trên lam kính

và trong ống nghiệm Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase

“cố định” bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiện những coagulase “tự do” bằng phản ứng dán tiếp với fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương (Sandel M.K, 2002) [39]

Ngoài ra, chúng còn phản ứng với DNAse, phosphatase dương tính, có khả năng lên men và sinh axit từ manitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng

S aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi

trường chứa đến 15% muối NaCl (Sandel M.K, 2002) [39]

Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S aureus

có mầu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng giộng 25mm ( do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase), (Sasaki T, 2002) [39] Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol), (Sandel M.K, 2002) [39]

9

Đa số các dòng S aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin

trong môi trường có nhiệt độ trên 150

C, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ 35-370C (Trần Linh Thước, 2002) [11]

2.5 Cơ chế gây bệnh:

Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ các bề mặt này bao gồm:

- Da, niêm mạc: Khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu

- Các tổ chức sâu hơn: Tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô

S aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất

polypeptide

Tác nhân gây bệnh như S aureus mới có khả năng khởi động các quá

trình sinh hóa đặc hiệu như: tăng sinh, bài tiết đôc tố, xâm nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu tế bào vật chủ

S aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như:

hyaluronidase, hemolysin, leukocidin… phá hủy các thành phần tế bào vật chủ

Ước tính khoảng 0,1µg S aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở

người (Nguyễn Hữu An, 2013) [1]

2.6 Tình hình nghiên cứu tính kháng thuốc ở Staphylococcus aureus 2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tụ cầu kháng Methicilline (MRSA) Được phân lập tại Châu Âu đầu tiên năm 1960, phát tán nhanh ở Mỹ và trở thành dịch ở nhiều bệnh viện tại

Mỹ ở thập niên 1980 (MRSA gặp với tỷ lệ 10-40%) Ở Canada gặp đầu tiên:

1979, trở thành dịch năm 1981 Từ năm 1995 đến năm 2004 tỷ lệ tăng từ 0,46/1000 ca lên 5,9/1000 ca Nghiên cứu năm 2006 ở 48 BV tại Canada cho

10 thấy : 11.700 /29.000 bệnh nhân nhập viện có mang MRSA gây bệnh nhiễm trùng (Baba T, 2002) [16]

Một báo cáo mới nhất của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công bố ngày 30/4/2014 cho thấy hầu như tất cả các khu vực đều cho kết quả kháng cao với

methicillin trong điều trị S aureus (MRSA); trong đó, Đông Nam Á hơn

25%, Đông Địa Trung Hải hơn 50%, châu Âu 60%, châu Phi 80%, Tây Thái Bình Dương 80%, châu Mỹ 90% (Tổ chức Y tế thế giới, 2014) [12]

Những phân tích gần đây cho thấy tại Hoa Kỳ hàng năm có khoảng

48000 người tử vong vì MRSA (Methicillin resistant S aureus) Ước tính có

khoảng 19000 người Mỹ tử vong vì MRSA trong năm 2005

2.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, hầu hết các cơ sở khám, chữa bệnh đang phải đối mặt với tốc độ lan rộng của các vi khuẩn kháng với nhiều loại kháng sinh Mức độ và tốc độ kháng thuốc ngày càng gia tăng, đang ở mức báo động Gánh nặng do kháng thuốc ngày càng tăng do chi phí điều trị tăng lên, thời gian điều trị kéo dài, ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh, cộng đồng và sự phát triển chung của xã hội Trong tương lai, các quốc gia có thể sẽ phải đối mặt với khả năng không có thuốc để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm nếu không có các biện pháp can thiệp phù hợp

Hiện nay, kháng thuốc không phải là vấn đề mới, nhưng đã trở nên nguy hiểm, cấp bách, đòi hỏi phải có sự nỗ lực tổng hợp nhằm giúp nhân loại tránh khỏi nguy cơ quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nhận định, chúng ta đang sống trong kỷ nguyên phụ thuộc kháng sinh và yêu cầu toàn cầu có trách nhiệm bảo vệ nguồn thuốc kháng sinh quý giá cho thế hệ sau (Trường Đại Học Y Khoa-nhà xuất bản Y học, 1974) [13]

Một khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí

Minh năm 2005 cho thấy các chủng S aureus phân lập từ bệnh phẩm cho

11

thấy có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006) [8]

Từ tháng 8/2012 - đến tháng 8/2013, một nghiên cứu với 143 chủng

S aureus về tỉ lệ đề kháng KS của S aureus trong 4.299 bệnh phẩm, được

phân lập tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh

Kết quả cho thấy: S aureus chiếm 23,6% , đa số được phân lập từ bệnh phẩm

mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nước tiểu (11,9%) và phân (10,5%) Qua

kết quả từ kháng sinh đồ (KSĐ), tỉ lệ đề kháng của S aureus với các KS là

93,7% với Penicilline G, 65,0% với Erythromycine, 60,8% với Kanamycine, 58% với Clindamycine Cho tỉ lệ MRSA là 39,2% (Nguyễn Hữu An, 2013) [1]

Trong một nghiêm cứu khác cũng cho thấy tỉ lệ kháng kháng sinh của

S aureus khác nhau giữa các bệnh viện và giữa các kháng sinh xét nghiệm

Có tới 68,8% các chủng phân lập tại bệnh viện Chợ Rẫy kháng với Gentamicin Tỉ lệ kháng Oxacillin cao nhất tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế với 63,8% Theo báo cáo của Bệnh viện Chợ Rẫy năm 2008, có

8% số chủng S aureus phân lập được đề kháng với Vancomycin Tuy nhiên, đến năm 2009, phần lớn các bệnh viện kể cả Chợ Rẫy không có chủng S aureus nào đề kháng với Vancomycin trừ một số bệnh viện tỉnh và bệnh viện

trực thuộc Sở y tế cho kết quả đáng nghi ngờ về tỉ lệ kháng Vancomycin của

tụ cầu vàng ví dụ như 60,9% S aureus kháng Vancomycin tại bệnh viện

Uông Bí, 24,1% tại bệnh viện Bình Định và 15,6% tại bệnh viện Xanh Pôn (Nguyễn Văn Duy, 2011) [3]

Theo một nghiên cứu khác cho thấy tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam đã ở mức độ cao Trong số các nước thuộc mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức độ kháng Penicillin cao nhất (71,4%) và kháng Erythromycin (92,1%) (Wei H L,

12

(2002) [42] Do tỉ lệ kháng cao, nhiều liệu pháp kháng sinh được khuyến cáo trong các tài liệu hướng dẫn điều trị đã không còn hiệu lực Mặc dù khó đánh giá một cách định lượng nhưng rõ ràng thực trạng kháng kháng sinh đã, đang

và sẽ gây ra những tác động tiêu cực đối với ngành y tế và kinh tế Việt Nam Thực trạng này là hậu quả tất yếu của mức độ sử dụng kháng sinh cao cả trên người và trong nông nghiệp, mà đa phần là tình trạng sử dụng không hợp lý Theo báo cáo của một nghiên cứu dựa trên cộng đồng tiến hành năm 1999, 78% kháng sinh được mua từ các nhà thuốc tư mà không có đơn, 67% khách hàng tham khảo tư vấn của nhân viên bán thuốc trong khi 11% tự quyết định

về việc sử dụng kháng sinh Chỉ có 27% số nhân viên bán thuốc có kiến thức

về sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh (Larsson, M., et al, 2000) [29] Mặc dù có các quy chế và các tài liệu hướng dẫn về kháng sinh, việc bán kháng sinh không có đơn vẫn là tình trạng diễn ra phổ biến ở Việt Nam (Lewis R, 2009) [30] Theo một nghiên cứu khác tại cộng đồng năm 2006 cho thấy tình trạng sử dụng kháng sinh không cần thiết trong điều trị nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp thể nhẹ ở trẻ em dưới năm tuổi tại khu vực nông thôn Việt Nam, 63% trẻ nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp thể nhẹ đã được điều trị với kháng sinh (Kareen N.H, 2013) [25]

Một nghiên cứu khác cũng cho thấy từ khi sử dụng Penicillin vào những năm 1940, tính kháng thuốc đã hình thành ở tụ cầu trong thời gian rất ngắn Nhiều dòng vi khuẩn hiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông thường, và sắp tới sẽ kháng cả những kháng sinh mới Thật sự là trong hai năm gần đây, việc thay thế kháng sinh cũ bằng Vancomycin dẫn đến sự gia tăng các dòng kháng Vancomycin VRSA (Kumarasamy K.K et al, 2010) [27]

13

2.7 Cơ chế đề kháng kháng sinh

2.7.1 Ức chế bằng enzyme

Vi khuẩn sản xuất ra enzyme gây phân hủy hoặc làm bất hoạt kháng sinh

Sự sản xuất enzyme có thể được cảm ứng bỏi một yếu tố bên ngoài (một KS khác) hoặc bất biến (không bị ảnh hưởng bởi kích thích bên ngoài)

Sự sinh men beta-lactamase:

- Các Beta-lactamase là các men do VK sinh ra và lây truyền theo đường nhiễm sắc thể hoặc plasmid Các men này đề kháng KS rất hiệu quả Chúng làm bất hoạt các thuốc nhóm Beta-lactamine bằng cách phá hủy nối amide của vòng Beta-lactam Trên toàn cầu, KS họ Beta-Lactamines được sử dụng nhiều nhất trong tất cả các nhóm, vì thế vấn đề đề kháng với KS nhóm này rất đáng lo ngại (Mary K, 2002) [33], (B M Madison, 1983) [31], (Zmantar T, 2013) [46] Trong

số các VK gram dương, tụ cầu vàng : S aureus và các cầu khuẩn gram dương

đường ruột là các tác nhân gây bệnh thường sinh men Beta-lactamase lây truyền qua plasmid nhất và chúng gây thủy phân KS nhóm Penicillines hoặc Cephalosporines Các trực khuẩn (TK) gram âm, đặc biệt là TK gram âm đường ruột, sản xuất nhiều loại men Beta-lactamases, được phân thành nhiều nhóm nhỏ, và chúng liên tục được phát hiện ra các nhóm mới (Mary K, 2002) [33]

- Vào đầu thập niên 1980, các Cephalosporines thế hệ thứ 3 được lưu hành trên thị trường, nhưng sau khi được sử dụng rộng rãi trong điều trị nhiều bệnh nhiễm trùng, các biến đổi nhỏ trong chuỗi gene gốc đã làm thay đổi đáng

kể tính ái lực của các enzyme đối với cơ chất, và đã hình thành một nhóm enzyme Beta-lactamase phổ rộng, hay còn được gọi là ESBL (Extend Spectra Beta-Lactamases) Phần lớn các ESBL này đến từ phổ TEM-1 và SHV-1 (Sandel M.K, 2010) [38]

- Sự đề kháng này diễn biến nhanh, và việc thay thế một lượng nhỏ acid amine của các men Beta-lactamase làm cho VK càng đề kháng cao hơn nữa, đó

14

là các men Beta-lactamases trung bình có gene ampC hoặc các men

Cephalosporinases cấp độ cao Gần đây, việc sản xuất quá mức các men Cephalosporines từ nhiễm sắc thể ở cấp độ rất cao đã tạo nên một loại mới đề kháng với các Cephalosporine thế hệ 3 Các men này không phân hủy KS mà ức chế sự tiếp cận của KS tại vị trí tác dụng Chúng được sinh ra ở các loài VK tự nhiên sản sinh men cephalosporinases do cảm ứng (trực khuẩn đường ruột,

Pseudomonas aeruginosa), sau khi xãy ra đột biến, các VK sản xuất ra một

lượng rất lớn các men này, đó chính là kiểu hình: “tăng sản cephalosporinases” hoặc “Cephalosporines bức phá” (Sandel M.K, 2002) [38] Thêm nữa, việc sản sinh các men carbapenemases hoặc metallo-beta-lactamases bởi các VK gram

âm có thể làm cho VK đề kháng với tất cả các thuốc nhóm Beta-lactamine, bao gồm cả KS nhóm Carbapenemes

Tóm lại, việc tăng dần đề kháng với các KS nhóm Penicillines, với nhóm Cephalosporine thế hệ 1, 2 và 3, cùng với sự xuất hiện men ESBL, và làm giảm hiệu quả các các thuốc ức chế men Beta-lactamase (Acid clavulanic, sulbactam), đồng thời với việc sản sinh men Carbapenemases gây thu hẹp đáng kể kho vũ khí điều trị chúng ta hiện có và làm cho việc điều trị KS cho các bệnh nhiễm trùng ngày càng phức tạp (Sandel M.K, 2002) [38]

2.7.2 Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn

Các VK là các vi sinh vật đơn bào: màng tế bào chất phân cách tế bào chất với môi trường bên ngoài Các VK gram âm còn được trang bị thêm một vỏ bên ngoài, gọi là thành ngoài, có tác dụng như một hàng rào che chở cho các PBP (biến đổi các protein liên kết với Penicillin) nằm ở bên trong Chất dinh dưỡng

và KS phải đi ngang qua lớp vỏ này để thấm vào bên trong VK, theo cách thức khuếch tán thụ động ngang qua các kênh (lỗ nhỏ) [38] Sự giảm tính thấm của tế bào làm giảm lượng KS đi vào bên trong đến đích tác dụng, nguyên nhân do biến đổi tính thấm lớp màng bên trong hoặc bên ngoài VK Sự biến đổi các lỗ

15 của lớp thành tế bào VK gram âm có thể làm giảm hoặc ngăn cản sự khuyếch tán của KS vào vị trí tác dụng Dạng đề kháng này nói chung xảy ra đối với nhiều KS của nhiều nhóm khác nhau, do có khi các KS khác nhau nhưng có thể dùng chung một loại lỗ Mặt khác, sự đề kháng này là đặc hiệu khi một KS chỉ

dùng riêng một loại lỗ Ví dụ sự đề kháng của Pseudomonas aeruginosa với

imipenem là sự đề kháng đặc hiệu gây ra do mất đi các lỗ riêng dành cho các carbapeneme (Sandel M.K, 2002) [38]

Các đột biến của các lỗ đóng vai trò quan trọng trong việc phát tán đề kháng, đặc biệt tiếp theo sự giảm kích thước lỗ hoặc giảm số lượng các lỗ Tính thấm liên quan đến các lỗ thường phối hợp với việc tổng hợp các beta-lactamases và tạo nên sự đề kháng cho VK Đôi khi, có Vk chỉ trở nên đề kháng

khi xãy ra đồng thời hai hiện tượng trên Ví dụ, với VK Enterobacter sp và VK Serratia sp, sự đề kháng với imipeneme là do sự biến đổi đồng thời tính thấm tế

bào và tăng tổng hợp các men beta-lactamases ở nhiễm sắc thể (Sandel M.K, 2002) [38]

2.7.3 Biến đổi vị trí gắn kết

Hiện tượng này là do nguồn gốc từ nhiễm sắc thể hoặc plasmide, theo cơ chế làm giảm độ ái lực của KS tại vị trí tác dụng Ví dụ:

a Biến đổi các protein liên kết với Penicillin (PBP):

Giảm ái lực của các PBP với các thuốc nhóm beta-lactamines có thể do đột biến gene ở nhiễm sắc thể, hoặc do mắc phải gene bên ngoài có các PBP

mới Cơ chế này thường gặp với các cầu khuẩn gram dương, như S aureus và Streptococcus pneumonia, nhưng rất hiếm gặp ở VK gram âm Trong số các VK gram âm, cơ chế đề kháng này được thấy ở VK Neisseria và hiếm gặp hơn ở Haemophilus influenza (Mary K, 2002) [33]

16

b Biến đổi vị trí gắn kết ở ribosom:

Biến đổi bên trong tế bào VK ở tiểu đơn vị ribosom đích có thể làm giảm hoạt tính của KS Macrolides, Clindamycine, nhóm Aminosides hoặc Chloramphenicol Sự biến đổi này làm cho KS không đủ khả năng ức chế tổng hợp protein cũng như sự tăng trưởng của VK, do không thể gắn kết vào vị trí tác

dụng ở ribosom (Mary K, 2002) [33]

c Biến đổi men DNA-gyrase và men topoisomerase:

DNA-gyrase là men cần thiết cho hoạt tính của các quinolone Sự đột biến nhất thời ở duy nhất một acid amine của DNA-gyrase gây ra đề kháng Tương tự như vậy đối với các đột biến ở men topoisomerase (Mary K, 2002) [33]

d Biến đổi các tiền chất đích ở thành tế bào VK:

Hiện tượng này có thể bị xảy ra khi dùng vancomycine, như trường hợp các cầu khuẩn đề kháng với vancomycine (Mary K, 2002) [33]

e Biến đổi các enzyme đích:

Sự biến đổi của men dihydropteroate synthetase kháng lại sự gắn kết với sulfamide và của men dihydropteroate reductase làm mất nhạy cảm với trimetoprime đồng thời gây ra kháng thuốc Sự đề kháng của các VK gram âm đối với các sulfamide là do plasmide tạo các enzyme đề kháng

2.7.4 Bơm đẩy

KS không thể đạt đến vị trí tác dụng do bơm đẩy chủ động đẩy KS ra khỏi

tế bào VK (efflux) Các chất vận chuyển đẩy thuốc ra là các thành phần bình thường của tế bào VK và góp phần lớn cho tính đề kháng nội sinh của VK chống lại nhiều thuốc KS Các bơm này cần năng lượng Việc tiếp xúc với thuốc KS làm thuận lợi cho việc tăng số lượng bơm do đột biến các chất mang, làm tăng mạnh tính đề kháng của VK Đây cũng có thể là nguyên nhân gây đề kháng chéo Ví dụ, Ciprofloxacine có thể làm thuận lợi việc phát tán đề kháng với Cephalosporine theo cơ chế bơm đẩy Các VK gây bệnh quan trọng trên lâm

17

sàng có mang bơm đẩy gây kháng thuốc là E Coli và Shigella S aureus có thể

cũng có bơm đẩy làm cho VK đề kháng với KS nhóm Macrolides (Mary K, 2002) [33]

2.7.5 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm β-lactam

2.7.5.1 Cơ chế enzyme khử hoạt tính của thuốc kháng sinh

Vi khuẩn sản xuất enzyme có thể thay đổi hoặc làm giảm tác dụng của kháng sinh, bằng cách này chúng phá hủy hoạt tính của kháng sinh Cơ chế này được biết đến nhiều nhất và sớm nhất với Penicillinase phá hủy vòng β-lactam, biến Penicillin thành Penicilloic acid, làm mất tác dụng của thuốc (Hoa, N.Q., et

al, 2007) [24] Sau đó hàng loạt các enzyme β-lactamase có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem được phát hiện Hiện nay đã xác định được hơn 890 loại enzyme kháng kháng sinh của vi khuẩn, nhiều hơn số lượng các loại kháng sinh đã được sản xuất và phần lớn các gene mã hóa các enzyme này nằm trên các plasmid có thể truyền dễ dàng trong quần thể vi khuẩn cùng và khác loài [15], (CLSI, 2010) [21] Β-lactamase phổ rộng, gọi là Carbapenemases có khả năng làm giảm tác dụng của kháng sinh Carbapenem và có thể chịu trách nhiệm kháng với Imipenem và Meropenem,

loại enzyme này có trong P aeruginosa và trực khuẩn gram âm khác (Michael

R, (2009)

2.7.5.2 Cơ chế thay đổi đích của thuốc kháng sinh

Mỗi chất kháng sinh có đích tác động, điểm gắn kết khác nhau ở vi khuẩn Các đích cho kháng sinh có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự gắn kết của một protein, do đó thuốc không thể gắn vào và tác động đến vi khuẩn Cơ chế đề kháng này xảy ra với hầu hết kháng sinh Kháng sinh nhóm β-lactam tác động bằng cách gắn vào cấu trúc trên thành tế bào vi khuẩn gọi là penicillin binding protein (PBP) (Noor H.Kareem, 2013) [35]

18

2.7.5.3 Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào

Làm giảm mức độ thẩm thấu của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong trường hợp kháng tetracycline hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid Việc thâm nhập của các kháng sinh nhóm Beta-lactam được thực hiện qua các kênh vận chuyển (porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn chế sự tác động của nhóm kháng sinh này [15]

2.8 Các phương pháp phát hiện S aureus kháng thuốc

2.8.1 Phương pháp vi sinh

Nguyên tắc: Hiện nay, phương pháp truyền thống để xét nghiệm vi khuẩn kháng thuốc trên mẫu bệnh phẩm được dựa trên nguyên tắc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn, cấy chuyển, kỹ thuật xác định tính chất hóa sinh, làm kháng sinh đồ; quy trình này phải trải qua nhiều bước: đồng nhất mẫu, tăng sinh chọn lọc, xác định tính chất hóa sinh và miễn dịch, làm kháng sinh đồ (Brakstad O.G, 1992) [19]

Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ làm, chi phí đầu tư cho dụng cụ và thiết bị

ít tốn kém

Nhược điểm: Độ nhạy không cao, thời gian phát hiện vi khuẩn gây bệnh

do S aureus lâu, tốn nhiều nhân công, cần có nhân viên có kỹ thuật có kinh

nghiệm về vi sinh vật, yêu cầu kỹ năng thao tác

Tụ cầu dương tính với coagulase không phải là S aureus, thường xuyên được xác định nhầm là S aureus (Scott E Martin, 2000) [40] Rất khó để phát

hiện các loài dựa trên sự khác biệt về kiểu hình bởi vì không có dấu hiệu phản ứng sinh hóa duy nhất (tiêu chuẩn vàng) nào đặc trưng cho nhận dạng các loài (Scott E Martin, 2000) [40]

2.8.2 Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC)

Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch Mueller Hinton (MH) hoặc canh thang có chứa nồng độ kháng sinh khác

19

nhau Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định khi mật độ khuẩn lạc ≤ 3

Ưu điểm: Đây là kỹ thuật chuẩn thức được áp dụng nhằm xác định nồng

độ kháng sinh nhỏ nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn, kết quả giúp các bác

sỹ lựa chọn và tính toán liều kháng sinh cho bệnh nhân (Gill, S, 2005) [22]

Hạn chế: Kỹ thuật này có giá thành cao, phức tạp, đầy đủ trang thiết bị và cán bộ có kinh nghiệm để thực hiện

2.8.3 Kỹ thuật PCR

Nguyên lý: Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý tổng hợp DNA trong tế bào được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Quá trình tổng hợp DNA được bắt đầu theo chu trình: hai sợi DNA làm khuôn mẫu bị tách ra dưới tác dụng của nhiệt

độ Hai đoạn mồi oligonucleotide từ 20 - 40 nucleotide sẽ gắn vào các vị trí bổ sung trên đoạn DNA đích Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ được kéo dài về hai phía, tạo ra đoạn DNA mới bổ sung với đoạn khuôn mẫu

Ưu điểm: Với một cặp mồi đặc hiệu một đoạn DNA nào đó sẽ được tổng hợp sau mỗi chu kỳ nhiệt của PCR Hàng triệu bản sao sẽ được tổng hợp trong thời gian ngắn và chúng ta có thể phát hiện được các đoạn gen đặc hiệu cần khuếch đại trên gel điện di Kỹ thuật PCR hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như Y học, sinh học và nông nghiệp với nhiều mục đích khác nhau như phát hiện các căn nguyên gây bệnh do vi khuẩn hay phát hiện các gen kháng kháng sinh (Larsson M, 2003) [28]

Hạn chế: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại

Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần)

20

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn S aureus phân lập từ các bệnh nhân tại Bệnh viện

Đa khoa Trung ương Thái Nguyên từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5 năm

2015

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Các chủng S aureus kháng thuốc được phân lập từ người bệnh điều trị

tại Bệnh Viện Đa Khoa Trung ương Thái Nguyên từ tháng 12/2014 đến tháng

5/2015

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm -

trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Khoa Vi sinh vật Bệnh Viện Đa Khoa Trung ương Thái Nguyên

3.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ ngày 1/12/2014 - 15/5/2015

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Các cặp mồi sử dụng trong đề tài

Đề tài nghiên cứu này sử dụng 2 cặp mồi bao gồm cặp mồi NucF-NucR

sử dụng để định danh vi khuẩn S aureus và cặp mồi MecAF-MecAR đặc hiệu cho gen kháng Methicillin theo chuẩn quốc tế của S aureus Trong đó, các

mồi MecAF-MecAR: sử dụng theo công bố của (Kareem năm 2013) [36], các mồi NucF và NucR do nhóm nghiên cứu trước thiết kế (Trần Linh Thước, 2002) [10] Trình tự mồi được đặt sản xuất tại công ty Intergrated DNA Technologies của Mỹ (www.IDTDNA.com) Trình tự các cặp mồi sử dụng trong đề tài nghiên cứu này được trình bày trong bảng 2.1

21

Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự nucleotide (5’→3’) Tm

( o C)

Kích thước sản phẩm PCR (bp)

3.3.2 Hóa chất sử dụng trong đề tài

Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu

22

3.3.3 Dụng cụ, thiết bị

Đề tài nghiên cứu sử dụng các thiết bị được thống kê dưới bảng 2.3

Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

12 Micropipet các loại Gillson, Pháp

3.4 Nội dung nghiên cứu

3.4.1 Khảo sát tỷ lệ vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên

3.4.2 Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng thuốc

3.4.3 Phát hiện nhanh Staphylococcus aureus kháng Methicillin bằng kỹ thuật PCR