Sử dụng kỹ thuật PCRRFLP trong nghiên cứu mối tương quan của đoạn Gene GH đến sinh trưởng của lợn rừng lai

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------ NGUYỄN THỊ QUYÊN Tên đề tài: SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP TRONG NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN CỦA ĐOẠN GENE GH ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA LỢN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

- -

NGUYỄN THỊ QUYÊN

Tên đề tài:

SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP TRONG NGHIÊN CỨU MỐI

TƯƠNG QUAN CỦA ĐOẠN GENE GH ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA

LỢN RỪNG LAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2011-2015

Thái Nguyên, năm 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

- -

NGUYỄN THỊ QUYÊN

Tên đề tài:

SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP TRONG NGHIÊN CỨU MỐI

TƯƠNG QUAN CỦA ĐOẠN GENE GH ĐẾN SINH TRƯỞNG

CỦA LỢN RỪNG LAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa

luận tốt nghiệp này bên cạnh sự nỗ lực của bản thân em đã nhận được sự

chỉ bảo, giúp đỡ, hướng dẫn tận tình và những lời động viên từ thầy cô, bạn

bè và gia đình

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Dương Văn

Cường và ThS Ma Thị Trang, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ em

trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh

luận văn tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong Khoa Công Nghệ

Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ em trong suốt

thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ, anh chị làm việc tại Viện

Khoa học sự sống – ĐH Thái Nguyên đã tạo điều kiện để em học tập và hoàn

thành đề tài nghiên cứu

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã

luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ em những lúc khó khăn trong quá trình học

tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Quyên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Vị trí cắt của enzyme giới hạn DdeI 12

Bảng 3.1: Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong đề tài 24

Bảng 3.2: Các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 25

Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gene GH 31

Bảng 3.4: Sản phẩm PCR của đoạn gene GH được xử lý bởi enzyme giới hạn DdeI 32

Bảng 4.1: Tỉ số OD260 nm/OD280 nm và nồng độ của DNA 37

Bảng 4.2: Tỷ lệ các kiểu gene GH ở các quần thể lợn nghiên cứu 41

Bảng 4.3: Tần số các alen D1 và D2 của đoạn gene GH ở các quần thể lợn 43 Bảng 4.4: Sinh trưởng tích lũy của lợn rừng lai và lợn Yorkshire đối chứng (kg) 44

Bảng 4.5: Sinh trưởng tuyệt đối của lợn rừng lai và lợn Yorkshire đối chứng (g/con/ngày) 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Chu kỳ thứ nhất của phản ứng PCR 9

Hình 2.2: Hình ảnh mô phỏng kiểu gene GH ở lợn 13

Hình 2.3: Kích thước các alen có trong quần thể lợn 14

Hình 2.4: Kích thước các đoạn DNA dự kiến thu được khi phân tích đa hình đoạn gene GH bằng DdeI 15

Hình 2.5: Hình ảnh mô phỏng vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI trên đoạn gene GH 16

Hình 2.6: Đoạn gene GH nghiên cứu, vị trí cắt của enzyne DdeI và trình tự dich mã sang protein của đoạn gene GH 17

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình phân tích đa hình gene GH bởi enzyme DdeI 27

Hình 3.2: Sơ đồ các quy trình chiết DNA tổng số 30

Hình 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene GH 31

Hình 4.1: Hình ảnh 2 giống lợn nghiên cứu: Lợn rừng lai và Lợn Yorkshire 35 Hình 4.2: Sản phẩm DNA tách chiết từ mẫu mô tai lợn 36

Hình 4.3: Sản phẩm PCR nhân lên từ cặp mồi GH 39

Hình 4.4: Kết quả phân tích đa hình đoạn gene GH bằng DdeI 40

Hình 4.5: Biểu đồ tần số các kiểu gene ở lợn rừng lai và giống Yorkshire đối chứng 42

Hình 4.6: Biểu đồ tần số alen D1 và alen D2 của đoạn gene GH 44

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate

EtBt : Ethidium bromid

TBE : Tris boric acid – EDTA

RNA : Ribonucleic acid

PCR : Polymerase chain Reaction

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism DNA

MỤC LỤC

Trang

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 2

1.1 Đặt vấn đề 2

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Đặc điểm chung của lợn rừng lai 4

2.2 Đặc điểm chung của lợn Yorkshire 5

2.3 Cơ sở khoa học 5

2.3.1 Khái niệm về sinh trưởng và phát triển 5

2.3.1.1 Khái niệm về sinh trưởng 5

2.3.1.2 Khái niệm về phát triển 6

2.3.1.3 Mối quan hệ giữa sinh trưởng và phát triển 6

2.3.2 Các chỉ tiêu liên quan đến khả năng sinh trưởng của lợn 6

2.3.3 Khái niệm về đa hình gene 6

2.3.4 Khái quát về phần mềm Vector NTI 7

2.3.5 Phương pháp tách chiết DNA 8

2.3.6 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 9

2.3.7 Kỹ thuật PCR-RFLP 10

2.4 Gene hormone sinh trưởng GH (Growth Hormone) 12

2.5 Các kiểu gene trong phân tích đa hình đoạn gene GH bằng enzyme DdeI 14 2.6 Vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI trên gene GH 15

2.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 18

2.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 18

2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 20

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 23

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 23

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 23

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 23

3.2.2 Thời gian tiến hành 23

3.3 Vật liệu, hóa chất và trang thiết bị 23

3.3.1 Vật liệu 23

3.3.2 Hóa chất 24

3.3.3 Trang thiết bị 25

3.4 Nội dung nghiên cứu 26

3.5 Phương pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi 26

3.5.1 Quy trình thực hiện 27

3.5.2 Các chỉ tiêu theo dõi 27

3.5.2.1 Các chỉ tiêu nghiên cứu đa hình gene 27

3.5.2.2 Các chỉ tiêu theo dõi về sinh trưởng 27

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu 28

3.5.3.1 Lấy mẫu mô tai 28

3.5.3.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 28

3.5.3.3 Phương pháp PCR 30

3.5.3.4 Phương pháp PCR-RFLP 32

3.5.3.5 Phương pháp phân tích kết quả 32

3.5.4 Sinh trưởng tuyệt đối và sinh trưởng tương đối của lợn thí nghiệm 33 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Đặc điểm hình thái cơ bản của đối tượng nghiên cứu và đối chứng 35

4.2 Kết quả phân tích đa hình đoạn gene GH 36

4.2.1 Tách chiết DNA tổng số 36

4.2.1.1 Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số 36

4.2.1.2 Kết quả đo OD260nm/OD280nm và nồng độ của DNA 37

4.2.2 Kết quả PCR đoạn gene GH bằng cặp mồi đặc hiệu 38

4.2.3 Kết quả phân tích đa hình đoạn gene GH bằng DdeI 39

4.3 Kết quả phân tích mối tương quan của đoạn gene GH đến khả năng sinh trưởng của lợn rừng lai 44

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.2 Đề nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

I Tiếng Việt 51

II Tiếng Anh 52

III Các tài liệu tham khảo từ Internet 49

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Những năm qua chăn nuôi lợn của nước ta đã có những bước phát triển nhanh chóng và đóng góp khoảng 70% tổng sản phẩm tiêu thụ của ngành chăn nuôi (Cục chăn nuôi, 2012) [1] Hiệu quả của ngành chăn nuôi lợn phụ thuộc rất nhiều vào tốc độ tăng trọng, sản lượng thịt và khả năng sinh sản Hơn nữa, theo xu hướng hiện nay, thị hiếu người tiêu dùng đã quan tâm hơn tới chất lượng sản phẩm và các giá trị dinh dưỡng nhằm đảm bảo vấn đề sức khỏe thay vì chỉ quan tâm đến giá cả sản phẩm như trước đây Trước nhu cầu của thị trường , các nhà chọn giống đã chú ý đến chọn lọc giống vâ ̣t nuôi để nâng cao chất lượng thịt : tỷ lệ nạc, độ mềm, màu sắc và độ ngọt của thịt cũng như khả năng tăng trọng

Một hướng đi mới trong chăn nuôi hiện nay đó là thuần hóa lợn

rừng, lai tạo với lợn nhà được nhiều hộ gia đình miền núi nuôi phổ biến

theo hình thức bán hoang đã đang hứa hẹn trở thành hướng làm kinh tế

hiệu quả cao Lợn rừng lai mang ưu thế lai cao của cả bố và mẹ, do được

nuôi chăn thả tự do, vận động cả ngày nên lợn có sức đề kháng và khả năng chịu đựng kham khổ với môi trường tự nhiên cao, ít dịch bệnh, thịt nhiều nạc, ít mỡ, thịt lợn thơm ngon rất đặc trưng, hàm lượng Cholesteron thấp (Trung Tâm Khuyến Nông Lâm Đồng, 2010) [12]

Trong những thâ ̣p kỷ vừa qua việc chọn lọc giống vâ ̣t nuôi chủ yếu dựa vào kiểu hình Ngày nay, với sự phát triển của các kỹ thuâ ̣t h iện đại các nhà nghiên cứu đã chọn lọc giống vâ ̣t nuôi dựa vào các chỉ thị phân tử , tăng khả năng chính xác, rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả chọn lọc Trong

đó, nghiên cứu các mối liên quan về đa hình gene với các tính trạng sinh trưởng là rất quan trọng trong công tác chọn giống (Nguyễn Văn Nơi, Trần

Văn Phùng et al, 2010) [6] Gene GH (Growth Hormone – Hormone sinh

trưởng) là một trong những gene liên quan đến khả năng sinh trưởng của lợn

đã được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu Hormone sinh trưởng

(GH) là một trong những nhân tố quan trọng nhất cho sự tăng trưởng và phát

triển của tế bào động vật (Mariusz Pierzchała, Tadeusz Blicharski et al, 2004) [22] Số lượng hormone sinh trưởng ở lợn có liên quan đến khả năng

vỗ béo, thành phần thân thịt, chất lượng thịt và khả năng chống lại các stress (C Knorr, G.Moser et al, 1997) [15] Sự đa hình gene hormone sinh trưởng còn ảnh hưởng đến khả năng tăng trọng hằng ngày, tỷ lệ nạc, mỡ và nồng độ hormone sinh trưởng trong huyết thanh (Nielsen, Larsen et al, 1995) [24]

Xuất phát từ những cơ sở khoa học trên, với mục đích ứng dụng những tiến bộ của kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử vào trong chăn nuôi lợn rừng lai

để có được hiệu quả kinh tế cao nhất cho người chăn nuôi mà sản phẩm vẫn giữ

được phẩm chất và hương vị đặc trưng, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Sử dụng

kỹ thuật PCR-RFLP trong nghiên cứu mối tương quan của đoạn gene GH

đến sinh trưởng của lợn rừng lai”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

- Nghiên cứu đa hình đoạn gene GH trên lợn rừng lai

- Nghiên cứu mối tương quan của phân đoạn gene GH đến khả năng

sinh trưởng của lợn rừng lai và lợn Yorkshire đối chứng

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

- Xác định được đa hình đoạn gene GH là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu mối tương quan giữa kiểu gene GH tới tốc độ sinh trưởng của

lợn rừng lai và lợn Yorkshire

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

- Xác định được đa hình trên đoạn gene GH liên quan tới khả năng

sinh trưởng là cơ sở bước đầu cho chọn lọc giống lợn ở mức độ phân tử

- Kết quả nghiên cứu về sinh trưởng của lợn rừng lai là cơ sở tạo tiền

đề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm ứng dụng công nghệ hiện đại vào công tác chọn tạo giống lợn rừng lai mang những đặc điểm nổi trội nhằm mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người chăn nuôi, phát triển loại lợn này phục vụ nhu cầu của thị trường và phát triển kinh tế xã hội ở địa phương

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm chung của lợn rừng lai

Nguồn gốc của lợn rừng lai: Lợn rừng lai là con lai giữa lợn rừng đực

với lợn nái là lợn địa phương thả rông của người đồng bào dân tộc thường nuôi (giống lợn gần như hoang dã) tạo ra con lai với ưu thế lai cao của cả bố

và mẹ (Trung Tâm Khuyến Nông Lâm Đồng, 2010) [12]

Đặc điểm chung của lợn rừng lai

Vóc dáng: Lợn rừng lai cân đối, nhanh nhẹn, di chuyển linh hoạt, hơi gầy, dài đòn, lưng thẳng, bụng thon, chân dài và nhỏ, cổ dài, đầu nhỏ, mõm dài và nhọn, tai nhỏ vểnh và thính, răng nanh phát triển mạnh, da, lông màu hung đen hay xám đen, một gốc chân lông có ba ngọn, lông dọc theo sống lưng và cổ dày, dài và cứng hơn, ánh mắt lấm lét, hoang dã Trọng lượng lúc trưởng thành (con đực thường lớn hơn con cái), con đực nặng 50 - 70kg, con cái nặng 30 - 40kg

Tập tính sinh hoạt và môi trường sống: Lợn rừng lai hơi nhút nhát, thính giác, khứu giác tốt, sinh hoạt bầy đàn và chọn lọc tự nhiên thể hiện tính hoang dã Thích sống theo bầy đàn nhỏ vài ba con, lợn đực thường thích sống một mình (trừ khi lợn cái động dục)

Môi trường sống thích hợp là vườn cây, trảng cỏ gần ao hồ… Thích hoạt động về ban đêm, ban ngày tìm nơi yên tĩnh, kín đáo để ngủ

Chất lượng thịt: Thịt lợn rừng lai màu hơi nhạt, không đỏ như thịt lợn nhà, nhưng nhiều nạc, ít mỡ, tỷ lệ hao hụt rất thấp, da mỏng, thịt thơm ngon rất đặc trưng, hàm lượng Cholesteron thấp (Trung Tâm Khuyến Nông Lâm Đồng, 2010) [12]

2.2 Đặc điểm chung của lợn Yorkshire

Nguồn gốc xuất xứ: Vào những năm đầu thế kỷ XVI, nhiều người chú

ý đến việc phát triển chăn nuôi lợn ở Anh Đến năm 1770, lợn Trung Quốc được nhập vào Anh theo chủng Sus indicus và R cho lai tạo với Sus scrofa Mãi cho tới năm 1851 Joseph BL Luley, là người đã tạo giống lợn Yorkshire ở vùng Bắc Shires Trong thời gian này, nhà chọn giống Bakewell đã cải tạo lợn Leicestershire, của giống lợn đại phương Bắc Shires, Yorkshire và Lancashire, của Lincolnshire và Leicestershire để tạo

ra giống lợn Yorkshire ngày nay nhưng đến năm 1884, Hội đồng giống

Hoàng gia Anh mới công nhận giống lợn Yorkshire

Đặc điểm ngoại hình: Toàn thân có màu trắng, lông có ánh vàng, đầu

nhỏ, dài, tai to dài hơi hướng về phía trước, thân dài, lưng hơi vồng lên, chân cao khỏe và vận động tốt, chắc chắn, tầm vóc lớn

Chỉ tiêu năng xuất: lợn đực trưởng thành nặng tới 330 - 380 kg, lợn

cái trưởng thành nặng 220 - 280 kg Lợn nái đẻ từ 10-12 con/ lứa, nuôi con khéo Lợn nuôi thịt đạt khối lượng 90 kg ở 165 - 185 ngày tuổi Lợn thuộc giống lợn cho nhiều nạc, tỷ lệ nạc đạt 52-55 % (Nguyễn Thanh Sơn, Phạm Văn Duy et al, 2008) [7]

Lợn Yorkshire là giống lợn phổ biến nhất trên thế giới Đến 1964, lợn được nhập vào miền Bắc thông qua Liên Xô cũ Những năm sau 1990, Yorkshire được nhập vào ta qua nhiều con đường của nhà nước, công ty và

từ nhiều dòng khác nhau như Yorkshire Pháp, Bỉ, Anh, Úc, Mỹ, Nhật [29]

2.3 Cơ sở khoa học

2.3.1 Khái niệm về sinh trưởng và phát triển

2.3.1.1 Khái niệm về sinh trưởng

Sinh trưởng là sự gia tăng về kích thước và khối lượng cơ thể (ở mức

độ tế bào, mô, cơ quan và toàn bộ cơ thể) theo thời gian

Đặc điểm:

- Tốc độ sinh trưởng không đồng đều qua các giai đoạn

- Tốc độ sinh trưởng các bộ phận, cơ quan, hệ cơ quan không giống nhau

- Quá trình sinh trưởng của cơ thể đạt tối đa khi cơ thể trưởng thành

2.3.1.2 Khái niệm về phát triển

Phát triển là quá trình tăng lên về khối lượng, kích thước, thể tích trong từng giai đoạn khác nhau và các tế bào mới sinh hình thành nên các cơ quan tổ chức với một chức năng mới

2.3.1.3 Mối quan hệ giữa sinh trưởng và phát triển

Sinh trưởng và phát triển của cơ thể có liên quan mật thiết với nhau, đan xen lẫn nhau và luôn luôn liên quan đến môi trường

- Sinh trưởng tạo tiền đề cho phát triển

- Phát triển làm thay đổi tốc độ sinh trưởng

2.3.2 Các chỉ tiêu liên quan đến khả năng sinh trưởng của lợn

Các chỉ tiêu sinh trưởng thường dùng khi nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vâ ̣t nuôi là:

- Sinh trưởng tích luỹ : là khối lượng , kích thước , thể tích của vật nuôi tích luỹ được qua thời gian khảo sát Các thông số thu được qua các lần cân đo là biểu thị sinh trưởng tích luỹ của vâ ̣t nuôi

Sinh trưởng tuyệt đối (A): là khối lượng, kích thước, thể tích của vâ ̣t nuôi tăng lên trong một đơn vị thời gian Đối với lợn, đơn vị sinh trưởng tuyệt đối thường là g/con/ngày

Sinh trưởng tương đối (R): là tỷ lệ % của phần khối lượng (thể tích, kích thước) tăng lên so với khối lượng (thể tích, kích thước) thời điểm cân

đo Đơn vị sinh trưởng tương đối thường là %

2.3.3 Khái niệm về đa hình gene

Đa hình là sự tồn tại ở nhiều dạng khác nhau của một tính trạng trong quần thể Đa hình cũng được định nghĩa như là các dạng khác nhau của một gene trong quần thể (Phạm Thành Hổ, 2008) [4]

Trong chọn giống động vật nuôi dựa vào tính trạng, cần phải lưu ý tới

sự đa hình, đây là khái niệm mô tả một hiện tượng biểu hiện di truyền mà ở

đó, nhiều tính trạng khác nhau của một đặc tính nào đó cùng biểu hiện ở vật nuôi Trong sinh học, sự đa hình có thể định nghĩa như là sự xảy ra hai hay nhiều dạng (hình) của cùng một tính trạng

Sự đa hình DNA là những biến đổi trong trình tự DNA của một cá thể,

sự biến đổi đó có thể, hay không thể ảnh hưởng lên kiểu hình Sự biến đổi này thường được phát hiện qua nhiều phương pháp sinh học phân tử khác nhau Những biến đổi được phát hiện có ảnh hưởng lên kiểu hình được xem như một marker đặc hiệu cho biến đổi đó Điều đó có nghĩa là nếu một cá thể có cùng sự đa hình đó, có thể sẽ biểu hiện một vài đặc điểm tương tự khác

Các marker DNA được thiết lập nhằm phát hiện sự đa hình DNA của từng cá thể Sự đa hình này sẽ được chọn là marker cho những biểu hiện tính trạng Vì thế, trong công nghiệp, người ta sử dụng chúng trong chọn giống, chọn các đối tượng mạng tính trạng tốt Có thể chia thành các nhóm chính sau: Các marker cổ điển: phân tích DNA ty thể (mtDNA), các DNA marker dựa vào PCR (PCR-base marker), marker dựa vào phương pháp lai (Hybridization based marker), các marker dựa vào giải trình tự (Sequencing based marker) (Phạm Thành Hổ, 2008) [4]

2.3.4 Khái quát về phần mềm Vector NTI

Phần mềm Vector NTI được phát triển bởi hãng Invirogen Phần mềm này có một số chức năng sau:

- Phân tích trình tự đã lựa chọn và thiết kế mồi PCR cho trình tự

đó, dựa trên các thông số như: nhiệt độ nóng chảy, %GC và chiều dài đoạn khuếch đại

- Phân tích phân tử DNA/RNA và xác định khung đọc mở (ORFs)

- Phân tích phân tử DNA/RNA và xác định các vị trí giới hạn trên phân tử đó

- Sắp xếp thành hàng các trình tự của hai hoặc nhiều phân tử DNA/RNA

- Sử dụng để lắp ghép các đoạn DNA (cả các trình tự nguyên bản và sắc phổ) thành trình tự tiếp giáp dài hơn

2.3.5 Phương pháp tách chiết DNA

Tách chiết DNA là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gene đều tiến hành với DNA DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong quá trình thao tác cần tránh mọi tác nhân cơ học hoặc hóa học mạnh

để đảm bảo độ nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo

Các phương pháp tách chiết cơ bản đều được tiến hành theo bốn bước: Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote) Thông thường tế bào, mô được nghiền trong nitơ lỏng -196o

C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) và proteinase K Khi đó màng tế bào, màng nhân sẽ bị phá vỡ và giải phóng DNA ra môi trường và phân hủy các protein liên kết với DNA

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamine tỷ lệ 25:24:1) và lắc mạnh, dung dịch này có tác dụng làm biến tính và kết tủa protein đồng thời không hòa tan DNA, sau khi ly tâm sẽ tủa thành lớp nằm giữa pha nước và pha phenol/chloroform Pha nước có chứa DNA được thu nhận lại

Bước 3: Kết tủa DNA Mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận DNA dưới dạng cô đặc, một phần nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme Việc kết tủa DNA được thực hiện bằng một chất alcohol, phổ biến nhất là ethanol và isopropanol, với sự có mặt của các cation hóa trị một (Na+, K+, hay NH4

+) DNA kết tủa được thu lại bằng ly tâm Một số muối lẫn trong dung dịch sẽ được loại bỏ bằng cách rửa với cồn 70%

Bước 4: Hòa tan DNA Kết tủa DNA sau khi rửa bằng cồn và để khô

tự nhiên được hòa tan trong TE hoặc nước cất để bảo quản DNA phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

2.3.6 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 Phương pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo ra số lượng bản sao rất lớn của gene trong một thời gian ngắn Phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA Trên cơ sở trình tự của đoạn DNA khuôn, đoạn mồi, các nucleotide tự do và enzyme DNA polymerase có thể tổng hợp được đoạn DNA đích mong muốn (Khuất Hữu Thanh, 2006) [8]

Hình 2.1: Chu kỳ thứ nhất của phản ứng PCR

Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen đích mong muốn được lặp lại nhiều lần các chu kỳ nhân gen, trong một thời gian ngắn số lượng bản sao DNA tạo thành sẽ tăng theo cấp số nhân

 Nguyên lý chung của phương pháp PCR

PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Biến tính: Hai mạch đơn của phân tử DNA được tách đôi dưới tác dụng của nhiệt độ Ở nhiệt độ cao 90-95oC sẽ làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA, hai mạch DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn, làm khuôn cho quá trình tổng hợp Giai đoạn này kéo dài khoảng 30 giây đến 1 phút

Giai đoạn 2: Gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp Trong hỗn hợp phản ứng lúc này có mặt hai mạch đơn DNA vừa tách khỏi nhau và hai mồi Mỗi đoạn mồi sẽ nhận biết và bám vào một sợi DNA mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung Cặp mồi được thiết kế ở hai đầu của trình tự đích và do

đó sự tổng hợp DNA mới chỉ xảy ra với đoạn DNA đích nằm giữa hai mồi Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào độ dài và trình tự của mồi, thông thường nằm trong khoảng 40-70oC và kéo dài khoảng 30 giây đến 1 phút

Giai đoạn 3: Kéo dài: Nhiệt độ 70-72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme DNA polymerase Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp các nucleotide tự do vào cuối đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung và cuối cùng một đoạn DNA mới được tổng hợp

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, thông thường thực hiện khoảng 20-40 chu kỳ (Khuất Hữu Thanh, 2006) [8]

2.3.7 Kỹ thuật PCR-RFLP

Sau khi PCR ra đời, có hàng nghìn công trình nghiên cứu liên quan đến PCR Các nhà khoa học đã xây dựng thành công nhiều phương pháp khác nhau ứng dụng trong di truyền phân tử dựa trên nguyên tắc của PCR Những phương pháp di truyền dựa trên nguyên tắc PCR là con số chưa có

giới hạn (Ngô Xuân Bình, 2004) [2] Hiện nay việc ứng dụng phương pháp PCR-RFLP trong nghiên cứu đa hình di truyền là rất phổ biến

Phương pháp PCR-RFLP: Là phương pháp nghiên cứu đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các loại enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt bằng điện di đồ Các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân tay (Fingerprinting)” đặc trưng cho từng phân tử DNA Phương pháp này được sử dụng để xác định sự khác biệt về cấu trúc gene quan tâm giữa các mẫu nghiên cứu

Nguyên lí: Các mẫu nghiên cứu được tách chiết, tinh sạch DNA, sau

đó thực hiện phản ứng PCR nhân đoạn gene mong muốn, rồi xử lý bằng emzyme giới hạn khác nhau Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhâ ̣n biết và cắt đặc hiệu DNA ở những vị trí xác định Do đó, các bộ gene có cấu trúc khác nhau tạo nên số lượng đoạn cắt DNA khác nhau, và có thể có kích thước khác nhau Ngược lại, những bộ gene hoàn toàn giống nhau tạo nên số lượng và kích thước các đoạn cắt DNA giống nhau, có thể phát hiện nhờ điện di đồ (Khuất Hữu Thanh, 2012) [9]

Sau khi nhân đoạn DNA nhờ một cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR được cắt bằng một hoặc một số enzyme giới hạn Sau khi phân tích các sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn, điện di trên gel có thể thấy được sự thay thế các bazơ nitrơ tại vị trí cắt trên DNA được nhân lên (Nguyễn Văn Nơi, Trần Văn Phùng et al, 2010) [6]

Kỹ thuật PCR-RFLP có thể phát hiện một số thay đổi trong trình tự nucleotide liên quan đến vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, phương pháp này hiện nay được ưa thích và sử dụng phổ biến trong nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới do tính đơn giản và chi phí thấp, có khả năng tiến hành phân tích đồng thời với số lượng mẫu lớn, thời gian cho kết quả nhanh (Wang, Zhang et al, 2009) [27]

Trong nghiên cứu này tôi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân đoạn gene GH với kích thước 605 bp và sử dụng enzyme cắt giới hạn DdeI để nghiên cứu đa hình gene GH trong quần thể lợn nghiên cứu Vị trí cắt của enzyme giới hạn DdeI được

5’ CTNAG 3’

3’ GANTC 5’

5’ C TNAG 3’ 3’ GANT C 5’

2.4 Gene hormone sinh trưởng GH (Growth Hormone)

Hormone sinh trưởng (GH) là một trong những nhân tố quan trọng nhất

cho sự tăng trưởng và phát triển của tế bào động vật (Mariusz Pierzchała,

Tadeusz Blicharski et al, 2004) [22] Growth Hormone (GH) là một protein được

tiết ra bởi các tế bào ưa acid hoặc somatotropic của thùy trước tuyến yên (Kato,

Shimokawa et al, 1990, Yerle, Lahbib-Mansais et al, 1993) [20,28] Gene GH

nằm trên cánh tay p của nhiễm sắc thể số 12 của lợn (Yerle, Lahbib-Mansais et

al, 1993, Chowdhary, Thomsen et al, 1994) [28,18], vùng mã hóa gồm 5 exon với tổng chiều dài phiên mã là 1,7 kb (Vize PD and Wells JR, 1987) [26]

Cogan JD và Phillips JA (1998)[16] nghiên cứu cho thấy gene GH có

vai trò quan trọng và liên quan tới đặc điểm tăng trọng của lợn (Cogan and Phillips, 1998) [16] Số lượng hormone sinh trưởng ở lợn có liên quan đến khả năng vỗ béo, thành phần thân thịt, chất lượng thịt và khả năng chống lại các stress (C Knorr, G.Moser et al, 1997) [15] Cheng và cs (2000)[17] đã xác nhận ảnh hưởng của khả năng sinh trưởng ở lợn (Duroc, Yorkshire, Tao-Yoan) có

tương quan với kiểu gene GH (Cheng, Lee et al, 2000) [17] Nielsen và Larsen (1991)[23] đã quan sát những thay đổi mức độ GH trong máu cho thấy biến thể

di truyền trong các locus GH có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự biểu hiện của

protein liên quan Sự đa hình hormone tăng trưởng còn ảnh hưởng đến khả năng tăng trọng hằng ngày, tỷ lệ nạc, mỡ và nồng độ hormone tăng trưởng trong huyết thanh (Nielsen VH and Larsen NJ, 1991) [23]

Trình tự gene GH đã được công bố trong ngân hàng gene (GenBank

accession: M17704.1)

Trong nghiên cứu này tôi sử dụng phần mềm Vector NTI để mô phỏng

kiểu gene GH Gene được mô phỏng một cách khái quát trong hình dưới đây:

Hình 2.2: Hình ảnh mô phỏng kiểu gene GH ở lợn

 Trình tự nucleotide của gene GH được trình bày ở phụ lục 1

* Gene GH ở lợn có 5 vùng exon:

- Vùng exon 1 từ nucleotide 240 đến nucleotide 249

- Vùng exon 2 từ nucleotide 492 đến nucleotide 652

- Vùng exon 3 từ nucleotide 863 đến nucleotide 979

- Vùng exon 4 từ nucleotide 1177 đến nucleotide 1338

- Vùng exon 5 từ nucleotide 1617 đến nucleotide 1817

Phân đoạn gene GH (605 bp) nghiên cứu nằm ở đầu 3’ của gene GH (2231 bp), đoạn gene GH chứa exon 1 và exon 2

Phân đoạn gene

GH (605 bp)

2.5 Các kiểu gene trong phân tích đa hình đoạn gene GH bằng enzyme DdeI

Phân tích đa hình đoạn gene GH bằng enzyme DdeI thu được các

dạng alen được tương ứng như sau:

Alen D1: 335 bp; 148 bp; 122 bp

Alen D2: 457 bp; 148 bp

Từ đó ta có các kiểu gene tương ứng như sau:

- Kiểu gene D1D1: những cá thể mang kiểu gene D1D1 là những cá

thể đồng hợp tử cắt về gene GH Khi điện di trên gel agarose sẽ thu được 3

băng tương ứng với kích thước: 335 bp; 148 bp; 122 bp

- Kiểu gene D1D2: những cá thể mang kiểu gene D1D2 là những cá thể dị hợp tử Khi điện di trên gel agarose sẽ thu được 4 băng tương ứng với kích thước: 457 bp; 335 bp; 148 bp; 122 bp

- Kiểu gene D2D2: những cá thể mang kiểu gene D2D2 là những cá

thể đồng hợp tử cắt về gene GH Khi điện di trên gel agarose sẽ thu được 2

băng tương ứng với kích thước: 457 bp; 148 bp

Sơ đồ mô phỏng 2 alen D1 và D2 được thể hiện ở hình 2.3

Hình 2.3: Kích thước các alen có trong quần thể lợn

Sơ đồ mô phỏng 3 kiểu gene D1D1; D1D2 và D2D2 tương ứng được thể hiện ở hình 2.4

Hình 2.4: Kích thước các đoạn DNA dự kiến thu được khi phân tích đa

hình đoạn gene GH bằng DdeI

2.6 Vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI trên đoạn gene GH

Trình tự đoạn gene GH sau khi được lấy trên ngân hàng GeneBank

(Mã số M17704.1) được đưa vào phần mềm Vector NTI Bằng phần mềm Vector NTI cùng với một số thao tác cơ bản vị trí cắt giới hạn của enzyme

DdeI trên đoạn gene GH đã được xác định Vị trí cắt giới hạn của enzyme DdeI được thể hiện trên hình 2.5

148 bp

457 bp

Hình 2.5: Hình ảnh mô phỏng vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI trên

đoạn gene GH

Hình 2.5 cho thấy, trên phân đoạn gene GH (605 bp) chỉ chứa một vị trí cắt duy nhất của enzyme DdeI Theo kết quả nghiên cứu của Franco MM (2005) [19] trên phân đoạn gene GH, đoạn gene GH sau khi cắt bằng enzyme DdeI thu được 2 kiểu gene D1D1 với các băng kích thước là: 335

bp, 148 bp, 122 bp và kiểu gene D1D2 với các băng 457 bp, 335 bp, 148 bp,

122 bp (Franco, Antunes et al, 2005) [19] Để xuất hiện kiểu gene D1D2 thì

trên đoạn gene GH phải có hai vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI Điều này

có thể giải thích rằng: Các cá thể lợn có sự đa hình khác nhau, do cá thể

được nhà khoa học nghiên cứu và giải trình tự gene GH là một cá thể khác

mà trên đoạn gene GH chỉ chứa một vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI, do

đó mạch chỉ bị cắt tại một điểm duy nhất

Trình tự đoạn gene GH nghiên cứu, vị trí cắt của enzyne DdeI và

trình tự dịch mã sang protein được thể hiện chi tiết ở hình dưới đây:

Phân đoạn gene

GH (605 bp)

Hình 2.6: Đoạn gene GH nghiên cứu, vị trí cắt của enzyme DdeI và trình

tự dich mã sang protein của đoạn gene GH

Chú ý:

- (1) Trình tự màu tím l vị trí đoạn gene GH có thể bị cắt bởi enzyme DdeI để làm xuất hiện kiểu gene D1D1, D1D2

- (2) Hai trình tự mầu đỏ là hai vị trí bám của mồi xuôi và mồi ngược

trong phản ứng PCR nhân đoạn gene GH (605 bp) Trình tự phân đoạn gene

GH bắt đầu từ vị trí bám của mồi xuôi đến vị trí bám của mồi ngược

- Trình tự của enzyme DdeI là CTNAG Trong đó trình tự N là trình

tự có thể bắt cặp với bất kỳ nucleotide nào (A, T, G, C)

Khi xử lý đoạn gene GH với enzyme DdeI sẽ làm xuất hiện hai dạng

alen D1, D2, từ đó ta có các kiểu gene có thể xuất xuất hiện là: D1D1, D1D2, D2D2 với kích thước các băng tương ứng sau: 335 bp, 148 bp, 122 bp; 457 bp, 335 bp, 148 bp, 122 bp và 457 bp,122 bp Để có thể xuất hiện

hai kiểu gene D1D1 và D1D2 thì trên đoạn gene GH phải có vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI Tuy nhiên, trên đoạn gene GH đã được giải trình tự

trên chỉ chứa một vị trí bị cắt bởi enzyme DdeI ở vị trí 209, do đó, để có thể xuất hiện hai kiểu gene D1D1, D1D2 thì trên đoạn gene GH phải có thêm một vị trí cắt của enzyme DdeI ở vị trí 544

Quan sát hình 2.6 ta thấy, tại trình tự (1) có hai bộ ba mã hóa Leucine và Glycine Tại bộ ba mã hóa cho Leucine sự thay thế nucleotide loại C ở ngoài cùng (ở giữa trình tự 1) thành bất kỳ nucleotide loại nào cũng không làm thay đổi amino acid này thành amino acid loại khác Tuy nhiên,

trình tự (1) có thể trở thành vị trí cắt của enzyme DdeI khi nucleotide loại G

đầu tiên trong bộ ba mã hóa Glycine trở thành nucleotide loại A, sự thay đổi nucleotide loại G thành A sẽ làm thay đổi bộ ba mã hóa GGG thành AGG

mã hóa cho Arginine Theo nghiên cứu của Franco MM (2005)[19], sự đa hình thay đổi một amino acid trong trình tự protein có thể ảnh hưởng đến số lượng hormone sinh trưởng được tiết ra (Franco, Antunes et al, 2005) [19],

từ đó ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng ở lợn

2.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Baskin L.C và D.Pomp (1997) đã tiến hành phân tích đa hình gene

GHRH ở lợn sử dụng enzyme hạn chế AluI Kết quả thu được sản phẩm PCR

dài 455 bp với 2 alen được xác định: A (250 bp, 100 bp) và B (230 bp, 100 bp) tương ứng với 3 kiểu gene AA, AB và BB (Baskin and Pomp, 1997) [14]

Cheng WTK, Lee CH và Hung CM (2000) đã nghiên cứu đa hình

gene GH và đặc điểm hiệu suất tăng trưởng trong ba giống lợn Duroc,

Landrace và Tao-Yuan Thí nghiệm được tiến hành với 81 giống Tao-Yuan,

60 giống Landrace và 48 giống Duroc Sử dụng 2 enzyme giới hạn TaqI và DraI để phân tích đa hình Kết quả cho thấy giống Tao-Yuan cho năng suất

tăng trưởng kém hơn Duroc và Landrace Tác giả đưa ra kết luận rằng đặc

điểm hiệu xuất tăng trưởng của mỗi giống lợn có liên quan chặt chẽ với kiểu

gene GH của chính giống lợn đó (Cheng, Lee et al, 2000) [17]

Nielsen VH và Larsen NJ (1991) tiến hành phân tích đa hình đoạn

gene GH trên hai giống lợn Đan Mạch và Thụy Điển sử dụng hai enzyme giới hạn DraI và TaqI Kết quả cho thấy những biến thể di truyền trong locus

GH có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự biểu hiện của các protein liên kết với

con đường này (Nielsen VH and Larsen NJ, 1991) [23]

Nielsen VH và Larsen NJ (1993) phân tích đa hình đoạn gene GH ở lợn, dùng 2 enzyme giới hạn ApaI và CfoI Kết quả thu được lần lượt như sau: Dùng enzyme ApaI sẽ xuất hiện 2 Alen ( A1: 448 bp, 102 bp, 64 bp và A2: 315 bp, 113 bp, 102 bp, 64 bp), dùng enzyme CfoI 4 sẽ xuất hiện 4 Alen

(C1: 614 bp; C2: 501 bp, 113 bp; C3: 452 bp, 162 bp; C4: 512 bp, 113 bp,49 bp) (Larsen and Nielsen, 1993) [21]

Franco MM và cs (2005) đã tiến hành phân tích đa hình gene PIT1,

GH và GHRH với hiệu suất và đặc tính thân thịt ở lợn Landrace Franco đã

sử dụng phương pháp nghiên cứu PCR-RFLP và enzyme giới hạn DdeI để phân tích đa hình đoạn gene GH Kết quả thu được sản phẩm PCR với kích

thước 605 bp và hai alen D1 (335 bp, 148 bp, 122 bp) và D2 (457 bp, 148 bp) Tần số kiểu gene không đồng đều với D1D2 (33,8%), D1D1 (66,2%) và tần số alen D1 (0,083), D2 (0,169) Kết quả cho thấy kiểu gene D1D2 có tăng trọng bình quân/ngày cao hơn D1D1 (Franco, Antunes et al, 2005) [19]

Mauriusz và cs (2004) sử dụng enzyme giới hạn phân tích đa hình các

gen PIT1, GH và GHRH của lợn Landrace cho thấy đa hình gene PIT1 liên quan với độ dày mỡ lưng, trong khi đó đa hình gene GH liên quan với độ dày

mỡ lưng và tốc độ tăng trọng trung bình hàng ngày, đa hình gene GHRH liên

quan tới tăng trọng trung bình hàng ngày (Mariusz Pierzchała, et al, 2004) [22]

Song CY, Gao B và cs (2003) đã tiến hành nghiên cứu đa hình đoạn

gene GH giữa giống lợn thịt miền Tây và các giống địa phương Trung

Quốc bằng phương pháp PCR-RFLP Kết quả cho thấy tốc độ tăng trưởng của các giống địa phương Trung Quốc thấp hơn các giống lợn thịt miền Tây (Song, Gao et al, 2003) [25]

2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây các gene, locus liên quan đến tính trạng kinh tế đã được quan tâm và nghiên cứu ở Việt Nam (Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Thu Thúy et al 2004) Tuy nhiên các hướng nghiên cứu chính chủ yếu tập trung vào việc phân tích đa hình di truyền một số gene riêng lẻ liên quan đến tính trạng kinh tế

Nguyễn Văn Nơi, Trần Văn Phùng, Trần Xuân Hoàn (2010) đã tiến

hành phân tích đa hình gene Mc4R và GHRH của lợn đực rừng và con lai giữa đực rừng và nái địa phương Pác Nặm sử dụng hai enzyme tương ứng là TaqI

và AluI Kết quả cho thấy lợn rừng lai giữa lợn đực rừng Thái Lan và nái địa phương Pác Nặm mang gene Mc4R dạng đồng hợp tử GG với tỷ lệ 100% và mang gene GHRH ở cả 3 dạng AA, AB và BB với tỷ lệ tương ứng là: 18,75%, 52,25% và 25% Tần số alen A và B tương ứng là 0,47 và 0,53 Con lai mang

gene GHRH dạng đồng hợp tử AA có tốc độ tăng trọng hàng ngày cao hơn so

với lợn mang kiểu gene AB và BB Lợn rừng lai sinh trưởng châ ̣m (đạt trung bình 100,33 g/con/ngày ), tiêu tốn và chi phí thức ăn/kg tăng khối lượng của lợn rừng lai cao hơn, tuy nhiên khả năng sản xuất thịt của lợn rừng lai cao hơn

so với lợn địa phương (Nguyễn Văn Nơi, Trần Văn Phùng et al, 2010) [6]

Nguyễn Văn Hậu và cs (1999) đã tiến hành giải trình tự đoạn gene

hormone sinh trưởng (GH) từ nucleotide 381 đến nucleotide 802 trên 3

giống lợn nội Việt Nam là lợn Ỉ, lợn Móng Cái và lợn Hmông Kết quả phân tích cho biết ở vị trí nucleotide 507 thì C đổi thành T để GCG ->GTG, ở

nucleotide 555 thì C đổi thành A để GGC ->GGA, ở nucleotit 556 thì C đổi thành A để GCA ->GAA Đây mới chỉ là kết quả nghiên cứu bước đầu về gene hormone sinh trưởng lợn ở Việt Nam, nhưng các tác giả đã cho thấy các giống lợn địa phương của Việt Nam có mức đa hình thấp hơn so với các giống lợn ngoại (Nguyễn Văn Hậu, Phạm Doãn Lân et al, 1999) [3]

Lưu Thị Thúy, Lưu Quang Minh, Trần Thu Thủy, Nguyễn Trọng Bình, Nguyễn Văn Ba (2004) đã tiến hành nghiên cứu đa hình kiểu gene

Leptin liên quan đến tính trạng kinh tế của một số giống lợn nuôi tại Việt Nam Sử dụng enzyme HindIII: Kết quả là đã xác định được sự khác biệt rõ ràng về kiểu gene Leptin trên 2 giống lợn ngoại (Landrace, Yorkshire) so với

2 giống lợn nội (Móng Cái và Lợn Bản) Bước đầu kết luận đa hình kiểu

gene Leptin có liên quan đến tính trạng thịt và khả năng tăng trọng của lợn

(Lưu Thị Thúy, Lưu Quang Vinh et al, 2004) [10]

Nguyễn Đăng Vang (2005) sử dụng kỹ thuâ ̣t PCR -RFLP phân tích

đa hình các gene RYR1, H-FABP, PIT1, GNRHR, GH, OPN, ESR của các

giống lợn và giải trình tự một số đoạn gene này của lợn Tác giả cho biết lợn

Móng cái và Yorkshire có kiểu gene ESR BB có số con sơ sinh/lứa cao hơn lợn mang kiểu gene ESR AA Nhưng các giống lợn như Landrace, Duroc có các kiểu gene ESR khác nhau , không có sự sai khác về số con sơ sinh /lứa

Đây là một trong những kết quả nổi bâ ̣t của đề tài Tuy nhiên tác giả chưa chỉ ra số con sơ sinh /lứa được theo dõi theo những lứa đẻ nào , cũng như điều kiện phối giống và nuôi dưỡng (Nguyễn Đăng Vang, 2005) [13]

Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Thu Thúy, Nguyễn Văn Cường đã nghiên cứu đa hình di truyền gene hormone sinh trưởng ở giống lợn Móng

Cái bằng kĩ thuật PCR-RFLP Đoạn gene GH có độ dài 605 bp đã được nhân

lên đặc hiệu nhờ kỹ thuật PCR Đoạn gene sau đó được cắt bởi enzyme

HinPI Kết quả cho thấy sự khác nhau trong trình tự alen giữa 3 giống lợn

nghiên cứu Trong số những mẫu phân tích, alen C1 hoàn toàn không xuất hiện ở giống lợn Móng Cái nhưng lại xuất hiện ở lợn ngoại với tần số tương đối cao Tần số xuất hiện alen C2 ở lợn Móng Cái lại cao hơn hẳn so với hai

giống lợn ngoại Sự khác nhau ở vị trí cắt của HinPI này gợi ý cho mối

tương quan nào đó về kiểu gene đối với sự khác nhau về khả năng tăng trọng của giống lợn ngoại và giống lợn nội Móng Cái (Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Thu Thúy et al, 2004) [11]

Các gene liên quan đến khả năng sinh trưởng ở lợn được các nhà khoa học nghiên cứu tương đối phổ biến bằng cách sử dụng các enzyme giới hạn khác nhau Các nghiên cứu đã cho thấy được mối tương quan của các

kiểu gene tới tốc độ sinh trưởng ở lợn Trong đó, gene GH liên quan đến khả

năng sinh trưởng ở lợn cũng được nghiên cứu khá phổ biến Tuy nhiên, các nghiên cứu hầu hết chỉ thực hiện trên các giống lợn ngoại và lợn nội thuần, các giống lợn lai vẫn chưa được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Lợn Rừng Lai

- Lợn đối chứng (Yorkshire)

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên 2 giống lợn:

- Lợn Rừng Lai được nuôi tại Chi nhánh nghiên cứu và phát triển động thực vật bản địa, xã Tức Tranh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên

- Lợn Yorkshire làm đối chứng được nuôi tại trại lợn Trần Đức Hùng,

xã Minh Lập, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái nguyên

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen, Viện Khoa học sự sống

Đại học Thái Nguyên

3.2.2 Thời gian tiến hành

Đề tài: “Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong nghiên cứu mối tương quan của đoạn gene GH đến sinh trưởng của lợn rừng lai” được thực hiện từ tháng