Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các loại auxin 2,4-D, NAA hay IBA và cytokinin TDZ, Kin hay BA lên khả năng phát sinh phôi soma ở lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam
Trang 1BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUY ỄN THANH HOÀI
CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
Trang 2BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUY ỄN THANH HOÀI
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Trang 3Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác
NGUY ỄN THANH HOÀI
Trang 4Lời cảm ơn
giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn
Em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Quỳnh, người cô kính mến đã hết lòng dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến TS Lê Thị Trung, người cô đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, các thầy cô, đặc biệt là các thầy cô
giúp đỡ rất nhiều để em hoàn thành được luận văn tốt nghiệp
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn đã cho
em những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này
Xin chân thành cảm ơn chị Vân, anh Hiến, chị Hạnh, Nhung, Duy, Duyên ở phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện những nghiên cứu trong luận văn này
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị, các bạn ở phòng Sinh lý thực
học chuyên ngành Sinh học thực nghiệm khóa 20, đặc biệt là “ột” Thư đã động viên, giúp đỡ tôi trong những lúc gặp khó khăn
Và cuối cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến ông bà, bố mẹ, em trai và
“người dưng khác họ” thân thương đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn
Ngày 30 tháng 03 năm 2012 NGUY ỄN THANH HOÀI
Trang 5MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY SÂM VIỆT NAM 4
1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây sâm Việt Nam 4
1.1.1.1.Phân loại 4
1.1.1.2.Đặc điểm hình thái 4
1.1.1.3.Phân bố và đặc điểm sinh thái 8
1.1.1.4.Thành phần hóa học 9
1.1.2 Nguồn gốc, lịch sử phát triển trồng và khai thác cây sâm Việt Nam 11
1.1.3 Tác dụng dược lý của sâm việt Nam 13
1.1.3.1 Bộ phận dùng làm thuốc 13
1.1.3.2.Tính năng và tác dụng dược lý 14
1.1.4 Bảo tồn và nhân giống 14
1.1.5 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trong nước và trên thế giới 16
1.1.5.1.Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trong nước
16
1.1.5.2.Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trên thế giới 19
1.2 NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG 20
1.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 20
Trang 61.2.2 Sự phát sinh mô sẹo 21
1.2.3 Sự phát sinh cơ quan trong nuôi cấy in vitro 22
1.2.3.1 Sự phát sinh rễ 22
1.2.3.2 Sự phát sinh chồi 23
1.2.4 Sự phát sinh phôi soma 25
1.2.4.1 Khái niệm phôi soma 25
1.2.4.2 Sự phát sinh phôi soma 27
1.2.4.3 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự phát sinh phôi soma 30
CHƯƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39
2.1 VẬT LIỆU 40
2.1.1 Nguồn mẫu nuôi cấy ban đầu 40
2.1.2 Các thiết bị và dụng cụ 41
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42
2.2.1 Thí nghiệm 1: Nuôi cấy tạo mô sẹo từ lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở các vị trí cắt khác nhau trên môi trường MS có bổ sung NAA, IBA và TDZ 42
2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các loại auxin (2,4-D, NAA hay IBA) và cytokinin (TDZ, Kin hay BA) lên khả năng phát sinh phôi soma ở lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 44
2.2.3 Thí nghiệm 3: Vai trò của ánh sáng lên sự phát sinh phôi soma trong nuôi cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 48
2.2.4 Thí nghiệm 4: Sự tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro dưới ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin 50
Trang 72.2.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây
sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 52
2.3 PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ LIỆU 53
2.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 55
CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56
3.1 THÍ NGHIỆM 1: Nuôi cấy tạo mô sẹo từ lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro ở các vị trí cắt khác nhau trên môi trường MS có bổ sung NAA, IBA và TDZ 57
3.2 THÍ NGHIỆM 2: Ảnh hưởng của các loại auxin (2,4-D, NAA hay IBA) và cytokinin (TDZ, Kin hay BA) lên khả năng phát sinh phôi soma ở lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 67
3.3 THÍ NGHIỆM 3: Vai trò của ánh sáng lên sự phát sinh phôi soma trong nuôi cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 83
3.4 THÍ NGHIỆM 4: Sự tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro dưới ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin 88
3.5 THÍ NGHIỆM 5: Ảnh hưởng của các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 94
CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99
4.1 KẾT LUẬN 100
4.2 ĐỀ NGHỊ 101
TÀI LIỆU THAM KHẢO 102
Trang 8DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
khoai lang của Cheé và cs đề xuất năm 1992 Môi trường cho
sự tăng trưởng mô sẹo sinh phôi (CP)
1962
SH : Môi trường khoáng do Schenk & Hildebrandt đề xuất năm
1972
Trang 9DANH MỤC CÁC BẢNG
B ảng 1 1. Phân biệt phôi soma với phôi hợp tử 25
B ảng 2.1 Bố trí thí nghiệm 1a 42
B ảng 2.2 Bố trí thí nghiệm 1b 43
B ảng 2.3 Bố trí thí nghiệm 2a 45
B ảng 2.4 Bố trí thí nghiệm 2b 45
B ảng 2.5 Bố trí thí nghiệm 3a 48
B ảng 2.6 Bố trí thí nghiệm 3b 49
B ảng 2.7 Bố trí thí nghiệm 4 50
B ảng 2.8 Bố trí thí nghiệm 5 52
B ảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA và TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị trí tạo mô sẹo từ phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày nuôi cấy thứ 56 58
B ảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA và TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị trí tạo mô sẹo từ thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày nuôi cấy thứ 56 62
B ảng 3.3 Ảnh hưởng của các loại auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái từ lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 84
68
B ảng 3.4 Ảnh hưởng của các loại auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 84
75
B ảng 3.5 Ảnh hưởng của CĐHSTTV và ánh sáng lên sự phát sinh hình thái từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 35
85
Trang 10B ảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin lên khả
năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày
thứ 42 90
B ảng 3.7 Ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường
sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy
in vitro ở ngày thứ 49 95
Trang 11DANH M ỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của cây sâm Việt Nam 5
Hình 1.2. Đặc điểm hình thái của một số loài sâm trong chi Panax 7
Hình 1.3. Vị trí địa lý của núi Ngọc Linh 8
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Majonoside-R2 10
Hình 1.5. Rễ củ khô của cây sâm Việt Nam 13
Hình 1.6. Viên ngậm sâm Việt Nam (Vinaginseng pastilles) 13
Hình 1.7. Sắc kí đồ của sinh khối cây sâm Việt Nam in vitro nuôi cấy tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới 19
Hình 1.8. Sự phát triển rễ phụ từ trụ bì của rễ chính 24
Hình 1.9. Sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cây sâm Việt Nam in vitro 24
Hình 1.10. Sự phát triển của phôi hợp tử ở Capsella 26
Hình 1.11. Sự phát sinh phôi soma ở xoài (Mangifera indica L.) 26
Hình 1.12. Sự phát sinh phôi soma trực tiếp từ lá cây Phalaenopsis ‘Little Steve’. 27
Hình 1.13. Các giai đoạn của sự phát sinh phôi soma ở dịch treo tế bào cà rốt 29
Hình 1.14. Cấu trúc của auxin tự nhiên (IAA) và auxin tổng hợp (2,4-D, NAA và IBA) 31
Hình 1.15. Các giai đoạn chính của sự thu nhận phôi soma 31
Hình 1.16. Cấu trúc của một số dạng cytokinin 34
Hình 1.17. Cấu trúc của GA3 35
Hình 1.18. Cấu trúc của ABA 35
Hình 1.19. Cấu trúc của ethylene 36
Trang 12Hình 2.1 Cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực
vật, Viện Sinh học Nhiệt đới 40
Hình 2.2 Cây sâm Việt Nam nuôi cấy trong tủ điều khiển khí hậu Percival 40
Hình 2.3 Thân khí sinh và phiến lá của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 43
Hình 2.4 Mẫu cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam
in vitro 47
Hình 2.5 Cách bố trí mẫu cấy phiến lá và đoạn thân khí sinh trên đĩa petri 47
Hình 2.6 Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 51
Hình 3.1 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của lớp mỏng phiến lá cây
sâm Việt Nam in vitro 57
Hình 3.2 Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 5 của lớp mỏng phiến lá cây sâm
Việt Nam in vitro ở ngày thứ 56 59
Hình 3.3 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của đoạn thân khí sinh cây
sâm Việt Nam in vitro 61
Hình 3.4 Các thể giống phôi hình cầu và hình tim của phôi soma hình thành tại vị
trí thứ 3 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở nghiệm thức có
2 mg l-1 NAA và 0,2 mg l-1 TDZ 61
Hình 3.5 Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 1 của thân khí sinh cây sâm Việt
Nam in vitro sau 56 ngày nuôi cấy 63
Hình 3.6 So sánh tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ mẫu cấy phiến lá và đoạn thân khí sinh
của cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 56 65
Hình 3.7 Chồi và rễ bất định hình thành trên đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt
Nam in vitro sau 4,5 tháng nuôi cấy 66
Hình 3.8 Hình thái mô sẹo từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro
trên môi trường không có 2 mg l-1
NAA sau 9 tuần cấy chuyển 66
Trang 13Hình 3.9 Hình thái mô sẹo và rễ hình thành từ lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt
Nam in vitro ở các vị trí khác nhau trên môi trường MS1/2 bổ sung 2
mg l-1 2,4-D và 0,2 mg l-1 Kin ở ngày thứ 84 70
Hình 3.10 Rễ hình thành từ vị trí thứ 6 của lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt Nam in
vitro trên môi trường MS1/2 bổ sung 2 mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 BA ở ngày thứ 84 70
Hình 3.11 Mẫu cấy tại vị trí thứ 1 của phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro sau 84
ngày nuôi cấy 72
Hình 3.12 Cụm phôi soma tại vị trí gốc lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam
in vitro sau 84 ngày nuôi cấy trên môi trường ban đầu có 2 mg l-1 IBA
và 0,2 mg l-1 Kin 73
Hình 3.13 Số rễ hình thành trên thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro 76
Hình 3.14 Sự hình thành mô sẹo, chồi và rễ bất định trên mẫu cấy tại vị trí thứ 1
của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 84 77
Hình 3.15 Đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro trên môi trường
MS1/2 bổ sung 2 mg l-1
NAA và 0,2 mg l-1 BA mang một phôi hình tim ở ngày nuôi cấy thứ 84 81
Hình 3.16 Phôi soma nẩy mầm thành cây hoàn chỉnh có chồi và rễ từ vị trí thứ 4
của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro trên môi trường bổ sung 2
mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 Kin ở ngày thứ 84 81
Hình 3.17 Chồi bất định hình thành từ vị trí thứ 4 của thân khí sinh cây sâm Việt
Nam in vitro ở ngày thứ 84 82
Hình 3.18 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ phiến lá của cây sâm Việt Nam in vitro vào
ngày thứ 35 84
Hình 3.19 Mẫu cấy từ vị trí thứ 5 của phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày
thứ 35 84
Trang 14Hình 3.20 Mẫu cấy từ vị trí thứ 3 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở
ngày thứ 35 86
Hình 3.21 Số rễ hình thành từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro ở
các nghiệm thức khác nhau theo thời gian nuôi cấy 86
Hình 3.22 Gia tăng số chồi/mẫu theo thời gian nuôi cấy của cụm chồi cây sâm Việt
Nam in vitro ở các nghiệm thức khác nhau 89
Hình 3.23 Số rễ hình thành từ cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro ở các nghiệm
thức khác nhau theo thời gian nuôi cấy 91
Hình 3.24 Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 42 ngày nuôi cấy với
ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin 92
Hình 3.25 Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 49 ngày nuôi cấy với
ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường sucrose 96
Trang 15MỞ ĐẦU
Tại các nước châu Á, nhân sâm được coi là vị thuốc quý đứng đầu trong các vị thuốc đông y “sâm nhung quế phụ”, là thuốc bổ tăng lực và có nhiều tác dụng dược
lý khác Cây sâm Việt Nam là loại nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới Các
năm loại sâm quý nhất thế giới cùng với sâm Hàn Quốc, sâm Nhật Bản, sâm Mỹ, sâm Trung Quốc Một số nghiên cứu cho thấy số lượng và hàm lượng các ginsenoside của sâm Việt Nam vượt trội hơn các loài sâm khác (Nguyễn Ngọc
Hiện nay, sâm Việt Nam được bán trên thị trường với giá ngày càng cao, cao hơn sâm Triều Tiên nhiều lần, dẫn đến tình trạng bị khai thác quá mức Cây sâm
Việt Nam hiện nằm trong số 250 loài thực vật quý hiếm và đang có nguy cơ bị tuyệt
chủng trong Sách đỏ Việt Nam Vì vậy, việc bảo tồn và phát triển loài thực vật quý
hiếm này đòi hỏi sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý và là nhiệm vụ vừa quan trọng vừa cấp bách về phương diện khoa học lẫn kinh tế, xã hội Trong thời gian qua, một số công trình nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng cây sâm Việt Nam trong điều kiện tự nhiên đã được công bố, song kết quả thu được còn nhiều hạn chế Cây sâm trồng từ hạt sinh trưởng rất chậm và phải mất 5 – 7 năm mới tạo củ có hoạt chất Hạt sâm gieo khoảng 6 tháng mới có thể nẩy mầm, tỷ
lệ nẩy mầm thấp, lại bị dịch bệnh, chuột bọ phá hoại, cây sâm cho hoa đậu hạt cũng
ít, một cây chỉ có 1 – 2 hạt mà sau 3 năm cây mới ra hoa Do đó, nhu cầu về các kỹ thuật mới về nhân giống, nuôi trồng và nhân nhanh sinh khối từ cây sâm Việt Nam đang trở nên rất bức thiết (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)
Nghiên cứu nhân giống vô tính bằng con đường nuôi cấy mô tế bào thực vật
đã mở ra một hướng mới trong sản xuất nguyên liệu từ cây sâm Việt Nam: chủ động được nguồn nguyên liệu dồi dào trong thời gian ngắn, phục vụ công tác nghiên cứu, sản xuất thuốc và các sản phẩm thực phẩm chức năng Một số phòng thí nghiệm trong nước đã chứng minh việc nuôi cấy mô cây sâm tạo được các hợp chất
Trang 16thứ cấp như cây trồng tự nhiên, hạn chế ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy khách quan bên ngoài (Nguyễn Ngọc Dung, 1995) Sự phát sinh phôi soma là một con đường quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Đây là một phương pháp
ưu việt được sử dụng để sản xuất nhiều loại cây trồng (Ammirato và cs., 1983) Ứng
dụng con đường phát sinh phôi soma ở thực vật không chỉ phục vụ công tác vi nhân
giống mà còn được phát huy trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản về di truyền học, sinh học phân tử và chuyển gen ở thực vật (Nguyễn Hữu Hổ, 2009)
SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) TRONG NUÔI CẤY IN
VITRO” được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới nhằm mục đích tìm hiểu và xây dựng nên quy trình tạo phôi soma của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro, từ đó có thể nhân giống vô tính loài sâm quý hiếm
này và góp phần bảo tồn loài sâm đặc hữu của Việt Nam
GI ỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài chỉ tập trung khảo sát hai nguồn vật liệu từ cây sâm Việt Nam in vitro là
phiến lá và thân khí sinh, ảnh hưởng của một số CĐHSTTV và ánh sáng đến sự cảm ứng và phát sinh phôi soma Đồng thời, đề tài cũng nghiên cứu tìm hiểu loại môi
trường nuôi cấy nhằm tăng khả năng phát triển thành cây in vitro sau khi hình thành
phôi soma, nhằm tăng số lượng và khả năng sống sót trước khi chuyển ra trồng trong bầu đất
