Nghiên cứu nhân giống Keo lai BV32 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.

Được sự giúp đỡ của Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm và Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, em đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân giống Keo la

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ CHÍNH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG KEO LAI BV32 BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ CHÍNH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG KEO LAI BV32 BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Thái Nguyên, năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Thực tập tốt nghiệp là bước rất quan trọng trong quá trình học tập của mỗi sinh viên nhằm hệ thống lại toàn bộ kiến thức đã học, vân dụng vào thực tiễn và làm quen với nghiên cứu khoa học Qua đó, sinh viên ra trường sẽ hoàn thiện về kiến thức lý luận và phương pháp nghiên cứu, năng lực làm việc nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn của công việc sau này

Được sự giúp đỡ của Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm và Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, em đã tiến

hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân giống Keo lai BV32 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường Đại học Nông Lâm, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học, Lãnh đạo viện Khoa học sự sống- Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các chuyên viên bộ môn Công nghệ

tế bào (Viện khoa học sự sống), các thầy cô giáo trong bộ môn CNSH (khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm) Đặc biệt, em xin trân trọng

cảm ơn hai thầy giáo ThS Dương Mạnh Cường và Th.S Đào Duy Hưng đã

dành nhiều thời gian quý báu, tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn này.Em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè

đã giúp đỡ về mọi mặt để em hoàn thành khóa luận này

Do thời gian cò hạn và trình độ chuyên môn còn nhiều hạn chế, bản thân mới bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, nên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót Kính mong quý thầy cô giáo và bạn bè quan tâm góp ý để đề tài được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 30 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Chính

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 35 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 38 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 41 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 44 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai 47 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai 49 Bảng 4.7.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Keo lai 51

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai (sau

30 ngày) 37 Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 40 Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 43 Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 45 Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai 48 Biểu đồ 4.6 Ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai 50

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 4.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Keo lai BV32 36 Hình 4.2 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh 39 Hình 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 42 Hình 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 45 Hình 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai 48 Hình 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai 50 Hình 4.7:Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Keo lai 52

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BAP : Benzylamino purine

IBA : Indol butyric acid

NAA : Naphthyl acetic acid

MS : Murashige & Skoog Medium

MS* : MS cải tiến (có sự thay đổi hàm lượng một số khoáng

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.3 Mục đích nghiên cứu 3

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Nguồn gốc của cây Keo lai giống BV32 5

2.1.1 Lai giống nhân tạo 5

2.1.2 Dòng Keo lai BV32 5

2.2 Tình hình nghiên cứu về cây Keo lai trong và ngoài nước 7

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 8

2.3 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.4 Cơ sở khoa học của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.4.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật 9

2.4.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật 10

2.5 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.5.1 Giai đoạn chuẩn bị 11

2.5.2 Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động 11

2.5.3 Giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi 12

2.5.4 Giai đoạn tạo cây mô hoàn chỉnh 12

2.5.5 Giai đoạn chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm 12

2.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy mô – tế bào 13

2.6.1 Điều kiện vô trùng 13

2.6.2 Vật liệu nuôi cấy 14

2.6.3 Môi trường nuôi cấy 15

2.7 Những vấn đề trong nhân giống in vitro 26

2.7.1 Tính bất định về mặt di truyền 26

2.7.2.Sự nhiễm mẫu 27

2.7.3 Sự hoá thuỷ tinh thể 27

2.7.4 Kiểu gen 28

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Đối tượng (vật liệu) 29

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 29

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 29

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 29

3.3 Nội dung nghiên cứu 29

3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng (BAP, Kinetin, IBA, IAA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Keo lai 29

3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng (NAA, IBA) đến khả năng ra rễ của cây Keo lai 29

3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến tỷ lệ sống của cây Keo lai 30

3.4 Phương pháp nghiên cứu 30

3.4.1 Điều kiện thí nghiệm 30

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng (BAP, Kinetin, IBA, IAA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Keo lai 30

3.4.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng (NAA, IBA) đến khả năng ra rễ của cây Keo lai 32

3.4.4 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến tỷ lệ sống của cây Keo lai 33

3.5 Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 33

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 35

4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 35

4.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai (Acacia hybrids) 38

4.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 40

4.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai 43

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai 46

4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai 46

4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai 49

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Keo lai nuôi cấy mô ngoài vườn ươm 51

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

5.1 Kết luận 53

5.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHỤ LỤC 4

auriculiformis) (Lê Đình Khả, 1999) Đây là giống có nhiều đặc điểm hình

thái trung gian giữa bố và mẹ, đồng thời ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng nhanh, có hiệu suất bột giấy, độ bền cơ học và độ trắng của giấy cao hơn hẳn các loài bố mẹ (Lê Đình Khả và cs, 1997), có khả năng cố định đạm khí quyển trong đất nhờ các nốt sần ở hệ rễ, bảo vệ độ phì nhiêu cho đất (Lê Đình Khả, 1999) Keo lai BV32 có ưu thế là khó gây cháy rừng vì thân Keo lai có nước nhiều, dưới rừng Keo ít có thực bì, cây Keo lại ít lá Chống chịu bệnh tốt, chất lượng gỗ tốt, ít cành nhánh Năng suất đạt 15-20 m3/ha/năm ở lập địa xấu, 20-25 m3/ha/năm ở lập địa trung bình, 30-35 m3/ha/năm ở lập địa tốt

Cây Keo lai đã từng bước khẳng định giá trị kinh tế: Sau chu kỳ kinh

doanh 06 năm khu vực xã Đăk Rồ cho lãi cao nhất 32 124 063 đồng/ha, tiếp đến là Cư K’Roá lãi 26 815 388 đồng/ha, thấp nhất là Quảng Khê lãi 14 830 980đồng/ha Hiệu quả xã hội: Một chu kỳ trồng rừng Keo lai 6 năm ở Cư K’Roá tạo ra 303 công/ha/chu kỳ; Đăk Rồ là 275 công/ha/chu kỳ; Quảng Khê

là 356 công/ha/chu kỳ (Lê Đình Khả và cs, 1997)

Keo lai tạo nên đột phá trong cơ cấu sản xuất lâm nghiệp, cơ cấu cây trồng lâm nghiệp, không chỉ rút ngắn chu kỳ kinh doanh, trồng rừng, mang lại hiệu quả kinh tế bước đầu khá cao mà còn góp phần cân bằng, làm phong phú thêm nguồn tài nguyên rừng đang bị suy giảm (Lê Đình Khả, 1999)

Với đă ̣c tính có thể sống, sinh trưởng và phát triển trên đất trống đồi núi trọc, đất thoái hoá , cằn cỗi và nghèo dinh dưỡng nên Keo là một trong các nhóm loài đư ợc chọn làm cây trồng rừng chính ở Việt Nam Nhóm loài cây này được trồng ở hầu khắp các tỉnh trung du, miền núi và đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển kinh tế xã hội ở Việt Nam, đặc biệt là đối với đời sống của người dân các tỉnh miền núi Hơn nữa, đây cũng là loài cây cho gỗ tốt, có giá trị kinh tế cao, có thị trường về nguyên liệu giấy, dăm và đồ gỗ xuất khẩu (Lê Đình Khả, 1999)

Ở Việt Nam, năng suất rừng trồng quảng canh chỉ đạt 5-7 m3/ha/năm, thì năng suất trồng rừng bằng dòng vô tính các giống được cải thiện, với Keo lai có thể đạt 20-30 m3/ha/năm tùy từng lập địa (Lê Đình Khả và cs, 2003) Trong chương trình trồng mới 5 triệu ha rừng ở nước ta, có đến 2 triệu ha là cây lâm nghiệp, trong đó 70% là các loài cây mọc nhanh bao gồm các loài Keo, Bạch đàn, Nên nhu cầu về giống, đặc biệt là giống có năng suất và chất lượng cao cho các đối tượng này là rất lớn

Ứng dụng Công nghệ sinh học vào lai giống là một hướng đi mới, giảm chi phí cây giống lên cả trăm tỉ đồng mỗi năm nhờ triển khai nhân giống theo

phương pháp invitro Cùng với lợi ích cụ thể về kinh tế, kỹ thuật sản xuất giống invitro còn là kỹ thuật ưu việt trong việc tạo ra cây giống sạch bệnh, có

sức kháng bệnh rất cao, có thể sản xuất cây giống rất nhanh với quy mô lớn một cách dễ dàng Khả năng tái tạo, phục hồi các nguồn gen đã biến mất trong tự nhiên, hạn chế khả năng mất nguồn gen, nhất là các nguồn gen có nguy cơ xói mòn cao, các loài có nguy cơ bị tuyệt chủng (Đoàn Thị Mai và

cs, 2011)

Do đó, việc xác định và tối ưu hoá phương pháp nhân chồi, ra rễ và điều kiện nuôi cấy, Cho các giống mới được chọn tạo bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào là hướng đi thích hợp nhất, cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn

trong sản xuất lâm nghiệp Vì vậy, chúng tôi thực hiện làm đề tài: “Nghiên

cứu nhân giống Keo lai BV32 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh, ra rễ và giá thể phù hợp với cây Keo lai BV32 được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến tỷ lệ sống của cây Keo lai

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học:

+ Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại kiến thức đã học

+ Giúp sinh viên rèn luyện kỹ năng và học tập nghiên cứu khoa học + Biết được các phương pháp nghiên cứu một số vấn đề khoa học, xử lý

và phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học

+ Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm nâng cao hệ số nhân

và chất lượng cây Keo mới

- Ý nghĩa thực tiễn:

Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, làm giảm chi phí giá thành, tăng năng suất, chất lượng và đáp ứng nhu cầu cấp giống Keo mới ra thị trường

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc của cây Keo lai giống BV32

2.1.1 Lai giống nhân tạo

Lai giống (tạp giao) là phương pháp nhằm kết hợp nhiều đặc trưng, đặc tính tốt của các giống cây trồng (Nguyễn Đức Lương và cs, 1999)

Lai giống nhân tạo bằng thụ phấn có kiểm soát là phương thức cho phép kết hợp các tính trạng mong muốn trong một giống lai, làm cơ sở chọn giống trong các giai đoạn kế tiếp

Từ phương thức chọn lọc cây trội làm bố mẹ, tạo ra các tổ hợp lai cần thiết, khảo nghiệm đánh giá và chọn lọc cây lai đời F1, và các thế hệ tiếp theo

là cách tốt nhất để tạo ra các giống lai mong muốn

2.1.2 Dòng Keo lai BV32

Keo lai BV32 có tên khoa học là Acacia hybrids là tên gọi của giống lai

tự nhiên giữa Keo tai tượng (Acacia mangium) và Keo lá tràm (Acacia

auriculiformis) (Lê Đình Khả, 2006), có nhiều đặc điểm hình thái trung gian

giữa bố và mẹ, sinh trưởng nhanh, có hiệu suất bột giấy, độ bền cơ học và độ trắng của giấy cao (Lê Đình Khả và cs, 1997), có khả năng cố định đạm khí quyển trong đất, bảo vệ độ phì nhiêu cho đất (Lê Đình Khả, 2006)

 Thông tin về dòng Keo lai BV32:

- Tên thường gọi: BV32

- Tên loài: Keo lai nhân tạo

- Tên la tinh: Acacia mangium × Acacia auriculiformis

- Thuộc họ: Đậu (Fabacae)

- Thuộc phân họ: Trinh nữ (Mimosoideae)

- Lý lịch giống mới: Giống quốc gia

 So sánh về thể tích thân cây trung bình sau 5 năm trồng:

- Keo tai tượng: 103 dm3/ cây

- Thân, tán, lá: Cây gỗ cao đến 25-30 m, đường kính 60-80 cm Thân

gỗ thẳng, tròn đều, tán phát triển cân đối, màu vàng trắng có vân, có giác lõi phân biệt Lá có 3-4 gân mặt chính, hình mác

- Hoa, quả, hạt: Hoa lưỡng tính mọc cụm, màu trắng hơi vàng, mọc ở náchlá

 Đặc điểm sinh lý, sinh thái:

- Tốc độ sinh trưởng: Nhanh

- Phù hợp với: Cây ưa sáng, chủ yếu trồng trên đất xám, đất feralit Chịu được khô hạn, nhiệt độ trung bình Độ cao khoảng từ 500-800 m so với mực nước biển, độ dốc thấp

- Cây có khả năng cải tạo đất, chống xói mòn, chống cháy rừng Gỗ thẳng, có tác dụng nhiều mặt

2.2 Tình hình nghiên cứu về cây Keo lai trong và ngoài nước

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Những năm gần đây, việc sử dụng tiến bộ kỹ thuật mới về công nghệ tế bào thực vật trong công tác chọn giống cây rừng đã được thực hiện tại nhiều nước trên thế giới như: Thụy Điển, Braxin, Úc, Trung Quốc,

Nuôi cấy mô phân sinh Keo lai đã được Darus tiến hành đầu tiên bằng môi trường cơ bản Murashige và Skooge (MS) có thêm 6-BenzyllaminoPyrine (BAP) 0,5 mg/l và cho ra rễ trong phòng thành công (Gamborg.O.L và cs, 1995)

Darus H Ahmas thuộc viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy mô tế bào cây Keo tai tượng bằng môi trường MS có bổ sung 3% đường; 0,6% thạch và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi Những chồi có chiều cao >0,5 cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA 1000 ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% (Gamborg.O.L và cs, 1995)

W.Nitiwattanachai và cộng sự (1990) đã nuôi cấy thành công cây Keo

lá tràm (Acacia auriculiformis) Môi trường nhân nhanh chồi là MS (1962) +

10 μM BAP + 0,5 μM IBA, môi trường sử dụng cho tạo rễ là White (1963) +

2 μM IBA + 1 μM NAA ( Trindate H và cs, 1990)

Cũng với cây Keo tai tượng, Hartney và cộng sự đã sản xuất cây con

thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro Môi trường nuôi cấy được sử dụng là

WPM + 3% Sucrose + 0,8 % Agar + 1 μM BAP + 1 μM NAA Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 25 o

C (± 4 oC), giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối Hypoclorite 4% và khử trùng trong thời gian 20 phút (Sharma.J.K, 1994)

Có thể nói phương pháp nhân giống sinh dưỡng cho cây lâm nghiệp đang được áp dụng trên quy mô lớn ở nhiều nước trên thế giới Đây là công

cụ tối ưu để nâng cao năng suất rừng trồng trong các chương trình chọn giống cho cây rừng

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam nuôi cấy mô được phát triển từ những năm 70 và những cơ

sở hiện nay đang nhân giống trong nuôi cấy mô ở quy mô lớn như: Viện CNSH, Viện KHKT NN, Viện di truyền Nông nghiệp, Viện lúa ĐBSCL, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh, Phú Thọ, Trung tâm ứng dụng KHSX nông lâm nghiệp Quảng Ninh, Xí nghiệp giống lâm nghiệp thành phố

Hồ Chí Minh, Nghiên cứu ứng dụng thành công cho một số loài cây trồng đặc biệt là cây nông nghiệp và cây cảnh (Lê Đình Khả và cs, 2006)

Tuy nhiên, các ứng dụng về nuôi cấy mô trong lâm nghiệp còn nhiều hạn chế, diện tích rừng trồng từ cây mô chưa nhiều vì có những đặc điểm như: Cây rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, phản ứng của các kiểu gen rất khác nhau đối với cùng một điều kiện môi trường nên trong cùng một loài các dòng khác nhau thì hiệu quả nhân giống cũng rất khác nhau, thậm chí có những dòng khả năng nhân giống là bằng không Mặt khác giá thành cây con sản xuất từ nuôi cấy mô thường cao hơn 3- 4 lần so với cây hom và 8-10 lần so với cây con từ hạt (Lê Đình Khả, 2006)

Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một số giống Keo lai có năng suất cao Ngoài những nghiên cứu nuôi cấy mô Keo lai đã được giới thiệu khi tổng kết đề tài KH03.03 năm 1996 trên cơ sở

kế thừa các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự (1996), nhóm nghiên cứu nuôi cấy mô của Đoàn Thị Mai đã thực hiện nghiên cứu bổ sung cho một số dòng Keo lai và thu được một số kết quả như sau: Khử trùng mẫu vật bằng HgCl2 0,1% với thời gian 2, 4, 6, 8, 10, 12 phút trong tháng 2, 5, 8,

10 và 12 cho thấy trong 8 - 10 phút cho kết quả tốt Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng nảy chồi là BAP (2 ppm) và BAP (2 ppm) + Kn

(0,05 ppm) và môi trường MS là công thức cho mẫu vật đẻ chồi nhiều nhất Ảnh hưởng của chất kích thích ra rễ đến khả năng ra rễ của các dòng Keo lai riêng biệt là: IBA (3 ppm) cho tỷ lệ ra rễ cao (80-92) đối với BV10, BV29, BV32, BV33 Nồng độ IBA 1ppm ra rễ tốt cho dòng BV16 (65%), BV5 (50%) (Đoàn Thị Mai và cs, 2011); Lê Đình Khả và cs, 2006)

Để đáp ứng nhu cầu gây trồng Keo lai và phát triển các dòng được tuyển chọn, việc tiến hành nhân nhanh một khối lượng lớn bằng phương pháp nuôi cấy mô là phương thức rất có ý nghĩa

2.3 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là phương pháp nhân giống được thực hiện bằng nuôi cấy cơ quan, mô (thậm chí là tế bào) trong môi trường dinh dưỡng đặc biệt hoàn toàn vô trùng và được kiểm soát Vì vật liệu nuôi cấy thường rất nhỏ và thực hiện trong môi trường nhân tạo nên phương pháp nhân giống này còn được gọi là vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân

giống in vitro (Ngô Xuân Bình và cs, 2003)

Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật:

- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (nuôi cấy chop đỉnh và chồi bên)

- Nuôi cấy mô sẹo

- Nuôi cấy tế bào đơn thu nhận các chất có hoạt tính sinh học

- Nuôi cấy protoplast - chuyển gen

- Nuôi cấy hạt phấn

2.4 Cơ sở khoa học của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào được coi là nền tảng của việc nuôi cấy mô Điều này được nhà thực vật học người Đức Haberlandt đề xuất lần đầu tiên vào năm 1902 Tác giả cho rằng mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ về cá thể

đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Giả thuyết đó đến nay đã được thực nghiệm chứng minh trên nhiều loài thực vật bậc cao (Vũ Văn Vụ và cs, 2005)

2.4.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật

Sự phân hoá và phản phân hoá cũng là cơ sở quan trọng trong nuôi cấy

mô tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một thể thống nhất bao gồm nhiều

cơ quan chức năng, tất cả các loại tế bào đó đều có nguồn gốc từ tế bào phôi sinh và được tạo nên bởi quá trình phân hóa Đó là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể (Vũ Văn Vụ và cs, 2005)

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các mô chức năng chúng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia của mình Nếu tách một tế bào hoặc một nhóm tế bào ra khỏi cơ thể và nuôi cấy chúng trong những điều kịên môi trường thích hợp, chúng lại quay trở lại dạng tế bào phôi sinh ban đầu và lại có khả năng phân chia mạnh mẽ và phân hóa để tái sinh cây hoàn chỉnh Quá trình này gọi là phản phân hoá (Phan Hữu Tôn (2005)

Về bản chất, sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá (trước đó bị ức chế) giúp cơ thể biểu hiện tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động (Đặng Ngọc Hùng, 2009) Sự phân hóa và phản phân hóa được biểu thị bằng sơ đồ:

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh nên không thể biểu hiện các đặc tính mới Nếu các tế bào này được tách riêng rẽ và gặp điều kiện môi trường thuận lợi thì bộ gen được hoạt hoá, quá trình phân hoá và phản phân hoá xảy ra theo một chương trình đã được định sẵn trong genom

2.5 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.5.1 Giai đoạn chuẩn bị

Giai đoạn này được xem như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy (cây giống) được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên hoặc ra khỏi các khu khảo nghiệm để chúng thích ứng với môi trường mới, giảm bớt nguồn bệnh và tạo điều kiện chủ động về nguồn mẫu vật cho công tác nuôi cấy Trong điều kiện cần thiết có thể tác động các biện pháp trẻ hoá vật liệu nhân giống hoặc thụ phấn nhân tạo cho những loài rất khó thụ phấn trong điều kiện

tự nhiên (Đoàn Thị Mai và cs, 2011)

2.5.2 Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động

Mục tiêu của giai đoạn này là tạo được mẫu sạch và non trẻ cho các giai đoạn nuôi cấy tiếp theo nên cần đảm bảo tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Bộ phận của cây được chọn làm mẫu cấy phụ thuộc vào hình thức nhân giống thích hợp cho từng loài cây và đặc biệt đúng giai đoạn phát triển Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng cho thí

nghiệm nuôi cấy mô ở hầu hết các loại cây trồng Ngoài ra, chóp đỉnh và chồi non nảy mầm từ hạt cũng được sử dụng Mẫu trước khi cấy vào môi trường

cơ bản được làm sạch nguồn bệnh bằng cách rửa nhiều lần bằng nước sạch, sau đó ngâm trong dung dịch khử trùng ở nồng độ thích hợp để làm sạch nguồn bệnh Tuỳ thuộc vào từng vật liệu mà chọn loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp Trong quá trình khử trùng mẫu cấy phải hết sức thận trọng để không làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu cấy Sau đó đặt mẫu vào môi trường tùy từng cây như MS, NN… Khi nuôi cấy cần chú ý điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm và có thể hàm lượng CO2 thích hợp (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

2.5.3 Giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn cực kỳ quan trọng và quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nhân giống Trong giai đoạn này, vai trò của chất điều hoà sinh trưởng là cực kỳ quan trọng để sản sinh ra lượng chồi tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của vật liệu nuôi cấy (Trần Thị Lệ và cs, 2008)

2.5.4 Giai đoạn tạo cây mô hoàn chỉnh

Tạo rễ là giai đoạn quan trọng để có được cây con hoàn chỉnh Khi tạo

rễ cần loại bỏ các chất kích thích tạo chồi, phân chia chồi và thay vào đó là một số Auxin kích thích tạo rễ Tuỳ theo loài cây mà sử dụng loại và nồng độ Auxin cho phù hợp Thông thường các chất IBA, NAA, IAA với hàm lượng

từ 1- 5 mg/l thích hợp trong quá trình kích thích tạo rễ cho nhiều loài cây thân

gỗ Một số trường hợp đặc biệt nếu chồi tạo được quá nhỏ và ngắn, có thể sử dụng 1-5 mg/l GA3 và một số hợp chất hữu cơ như nước dừa non, Bổ sung vào môi trường để đạt tiêu chuẩn cây con trước khi chuyển sang khu huấn luyện (Đoàn Thị Mai và cs, 2011)

2.5.5 Giai đoạn chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm

Cây con đạt được những tiêu chuẩn về hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây) sẽ được chuyển dần từ ống nghiệm ra nhà kính hay nhà lưới,

sau đó chuyển ra vườn ươm Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn

định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vô trùng tốt nên khi chuyển ra ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ bị stress, dễ mất nước và mau héo (Phan Hữu Tôn, 2005)

Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải thoáng mát, cường

độ chiếu sáng thấp, ẩm độ cao, Cây con thường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm Trong những ngày đầu cần phải được phủ nilon để giảm quá trình thoát nước ở lá (thường 7- 10 ngày

kể từ ngày cấy) (Đặng Ngọc Hùng, 2009)

2.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy mô – tế bào

2.6.1 Điều kiện vô trùng

Trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô

trùng tuyệt đối Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng và bốt cấy vô trùng

Dụng cụ khử trùng cơ bản gồm:

- Nồi hấp tiệt trùng: Sử dụng cho việc khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng cụ nuôi cấy bằng hơi nước có áp suất và nhiệt độ cao (1,2- 1,5 atm; 120-

130oC)

- Tủ sấy (60-600oC): Để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy

- Dung dịch khử trùng: Để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người

ta thường sử dụng các dung dịch như: HgCl2, NaClO (hypoclorit natri); Ca(OCl)2 (hypoclorit canxi); H2O2 (oxy già), Cồn dùng để khử trùng mẫu sơ

bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy

- Màng lọc: Dùng để loại bỏ các tác nhân lây nhiễm có kích thước 0,025-10 µm khỏi môi trường nuôi cấy, nước cất… Đây là phương pháp phù hợp với những môi trường mà thành phần của chúng bị phân hủy bởi nhiệt độ cao Những môi trường đó được lọc vô trùng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm qua các màng có lỗ siêu nhỏ Có hai loại màng phổ biến: Màng lọc bằng thép không rò rỉ (màng Swinney); màng lọc bằng polypropylene (màng Swinex), đây là loại màng chỉ dung một lần rồi bỏ (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

- Buồng cấy và bốt cấy vô trùng:

+ Buồng vô trùng: Nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo sạch sẽ Buồng phải được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc

+ Bốt cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bốt cấy Laminair Flow box, thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không khí vô trùng về phía người ngồi thao tác

- Buồng nuôi cấy: Là buồng đặt các mẫu nuôi cấy Buồng này cần đảm bảo các điều kiện: Nhiệt độ 25-30o

C, ánh sáng đạt 2000- 3000 lux, sạch sẽ và tránh tiếp xúc với bên ngoài (Đoàn Thị Mai và cs, 2009)

2.6.2 Vật liệu nuôi cấy

Về nguyên tắc mọi tế bào của mô chuyên hoá như thân, rễ, lá, chồi Trên cơ thể sinh vật đều có khả năng làm vật liệu nuôi cấy Tuy nhiên, thực tế cho thấy tuỳ từng loại tế bào và các loại mô khác nhau mà mức độ nuôi cấy thành công khác nhau Vật liệu nuôi cấy ở giai đoạn non tốt hơn giai đoạn già, mức độ tinh khiết càng cao thì hiệu quả nuôi cấy thành công càng cao Khi lấy mẫu làm thí nghiệm nuôi cấy cần chú ý đến các yếu tố như mùa vụ lấy vật liệu, kích thước vật liệu, tuổi cây mẹ, vị trí lấy mẫu trên cây mẹ và dòng cây

mẹ (Trần Thị Lệ và sc, 2008)

- Mùa vụ lấy vật liệu: Thường lấy mẫu ở thời điểm cây sinh trưởng và phát triển mạnh nhất: Mùa xuân hay đầu mùa hè Các mùa khác lấy mẫu

sinh trưởng kém hơn, đồng thời mang nhiều mầm bệnh (Phan Hữu Tôn, 2005)

- Kích thước và vị trí mẫu cấy: Kích thước của mẫu cấy ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng của mô với môi trường nuôi cấy Mẫu có kích thước càng nhỏ càng khó nuôi cấy Thường trên cây, mẫu ở vị trí cao sẽ ít mầm bệnh hơn, các mô, cơ quan tiếp xúc với nước, đất như rễ, củ, thân ngầm có lượng vi sinh vật rất cao và khó loại bỏ hoàn toàn chúng ra khỏi nguồn mẫu

- Chất lượng cây cho mẫu: Lấy từ những cây có đặc điểm ưu việt mà ta quan tâm: Sinh trưởng và phát triển mạnh, chống chịu tốt với điều kiện bất lợi hoặc sâu bệnh, cho sản lượng và chất lượng ngon của củ, quả… (Dương Công Kiên, 2002)

- Mục đích và khả năng nuôi cấy: Để phục vụ cho nhân giống vô tính thường chọn chồi ngọn, chồi bên (chồi muộn) Nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy phôi: có thể sử dụng là mầm, trụ là mầm, thân, là, phôi… Để thu cây đơn bội phục vụ cho lai tạo giống dùng bao phấn và hạt phấn cho nuôi cấy

- Phụ thuộc vào mẫu có nuôi cấy thành công hay không Nếu nuôi cấy

mô sẹo hay nuôi cấy phôi không thể thực hiện với một đối tượng nào đó thì phải chuyển sang chọn đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy và ngược lại … ( Nguyễn Kim Thanh và cs, 2005)

2.6.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy bao gồm cả môi trường hóa học và điều kiện bên ngoài được xem là vấn đề quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy

2.6.3.1 Môi trường hoá học

Môi trường hóa học được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi

cấy in vitro Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh: Thành phần, hàm

lượng các chất trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng

phát sinh hình thái của các bộ phận nuôi cấy Khả năng tái sinh chồi, lá, rễ của cây hoàn chỉnh cũng như sự sinh trưởng và phát triển của toàn cây Tuỳ từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy, thậm chí tuỳ cơ quan khác nhau trên cùng cơ thể mà nhu cầu dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng là khác nhau (Phan Hữu Tôn, 2005)

Cho đến nay rất nhiều môi trường dinh dưỡng đã lần lượt được tìm ra như: White (1934), Knudson (1946), Vaccin and Went (1949), Murashige - Skoog (1962), Knop (1974) Mỗi môi trường thích hợp với một số loài cây

nhất định nên trong nuôi cấy in vitro tuỳ thuộc vào từng giai đoạn phát triển

mà chọn môi trường dinh dưỡng phù hợp Các môi trường khác nhau đều gồm các thành phần sau: Thành phần vô cơ, thành phần hữu cơ, các chất điều hòa sinh trưởng, nguồn Cacbon và các thành phần khác (Trần Thị Lệ

và cs, 2008)

a Thành phần vô cơ

Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng đa lượng và vi lượng Các loại muối khoáng đa lượng: Nhu cầu muối khoáng của mô và cơ

quan thực vật trong nuôi cấy in vitro, về cơ bản giống như cây trồng tự nhiên

Các nguyên tố đa lượng cần có trong môi trường nuôi cấy là: N, P, K, Ca,

Mg, S với thành phần hàm lượng thay đổi tuỳ từng đối tượng nuôi cấy Môi trường giàu Kali sẽ xúc tiến quá trình trao đổi chất mạnh mẽ, môi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho sự hình thành chồi mới

- Nito vô cơ: Được sử dụng ở dạng NO3- (nitrat) và NH4+ (amoni) riêng

rẽ hoặc phối hợp với nhau, trong đó việc hấp thụ NO3

của các tế bào thực vật

tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4+ Nhưng đôi khi NO3

gây ra hiện tượng

“kiềm hoá” môi trường Vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả hai nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất Các muối khoáng có Nito thường dùng là: Canxi nitrat (Ca(NO3)2.4H2O), Kali nitrat (KNO3), Natri Nitrat

(NaNO3), hoặc Amoni nitrat (NH4NO3) Các muối Amôn thường dùng là: Amon sunphat (NH4)2SO4, Hoặc Amon Nitrat (NH4NO3) (Vũ Văn Vụ và cs, 2005)

- Hai dạng photpho thường dùng là: NaHPO4.7H2O và KH2PO4

- Kali được cung cấp cho môi trường dưới dạng Kali nitrat (KNO3), Kali Clorua (KCl), KaliDehidro Photphat (KH2PO4)

- Nguồn canxi trong môi trường cung cấp dưới dạng muối Canxi Nitrat: Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2 6H2O, CaCl2.2H2O

- Nguồn Mg và S được cung cấp dưới dạng MgSO4.7H2O hoặc (NH4)2SO4

- Các Ion Na+ và Cl- cần ở nồng độ thấp và được đưa vào môi trường cùng các muối khoáng khi điều chỉnh pH môi trường (Dương Công Kiên, 2002)

Các loại muối khoáng vi lượng: Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 mg/l dung dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô là: Sắt, Đồng, Kẽm, Mangan, Moliden, Bo, Iốt, Coban Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của Enzym, chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các yếu tố đa lượng

- Sắt (Fe): Thiếu Fe tế bào giảm khả năng phân chia, thiếu Fe làm giảm lượng ARN và sinh tổng hợp Protein nhưng làm tăng lượng ADN và Axit amin tự do dẫn đến giảm phân bào Fe trong môi trường thường được đưa dưới dạng muối FeSO4.7H2O, Fe(SO4)3… Nhưng chúng sẽ bị kết tủa và mẫu cấy khó hấp thụ các loại muối này Do đó phải cho thêm vào môi trường nuôi cấy NaFeEDTA (Sodium ethylenediamine tetraacetate), để tạo muối phức NaFeEDTA (dạng selat) có chứa Na, Fe và mô nuôi cấy hấp thụ dễ dàng (Trần Thị Lệ và cs, 2008)

- Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các Axit amin tự

do và ADN tăng lên, nhưng ARN và sinh tổng hợp Protein giảm dần đến kém phân bào

- Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa Auxin

vì thực tế B làm cho các chất ức chế Auxin Oxydase trong tế bảo giảm Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hoá mạnh, nhưng thường là mô sẹo xốp, mọng nước, kém tái sinh

- Molypden (Mo): Tác động trực tiếp lên quá trình trao trong tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

b Thành phần hữu cơ

Các vitamin: Các Vitamin, các Axit amin và các chất phụ gia hữu cơ thường được bổ sung vào môi trường sinh dưỡng nhằm thúc đẩy quá trình sinh trưởng, phát triển của mô nuôi cấy Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào

thực vật nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp được hầu hết các loại

Vitamin nhưng thường không đủ về lượng nên phải bổ sung thêm từ bên ngoài Tuỳ từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy mà các Vitamin được bổ sung một lượng thích hợp để mô đạt sinh trưởng tối ưu Các Vitamin B1 (Thiamin), B2 (Ribofravin), B5 (Axit panthotenic); B3 (Axit nicotinic), B6 (Piridoxin) thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2005); Phan Hữu Tôn, 2005)

- Thiamin (B1): Cần cho trao đổi chất Hydratcacbon và sinh tổng hợp một số Amino acid, hàm lượng sử dụng 0,1-5,0 mg/l

- Acid nicitimic (vitamin B3, PP, niacin): Tham gia tạo Coemzym của chuỗi hô hấp, sử dụng với hàm lượng 0,1-5,0 mg/l

- Pyridoxin (B6): Là một Coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất, sử dụng với hàm lượng 0,1-1,0 mg/l

Ngoài ra môi trường nuôi cấy còn bổ sung một số Vitamin khác:

- Biotin (H): Là Coenzym của các enzyme như Hexokinaza, Cacboxilaza và nhiều enzyme khác tham gia trao đổi Glixit, Lipit và Protein Chúng có vai trò điều chỉnh sự sinh trưởng của sinh vật Được sử dụng với hàm lượng 0,1-5,0 mg/l

- Acid foclic (B9, M): Cần thiết cho sự phân bào, thường sử dụng với hàm lượng 0,1-5,0 mg/l

- Riboflavin (B2): Nó là Coenzyme của các enzym thuộc hệ oxi hóa khử khác nhau, nhất là Flavin oxidaza Hàm lượng sử dụng 0,1-10,0 mg/l

- Acid ascorbic (C): Có mặt trong nhiều loại quả, các loại củ như củ cải, khoai tây, hành Nó là thành phần quan trọng của các phản ứng oxi hóa khử Hàm lượng sử dụng 1,0-100,0 mg/l

- Acid pantothetic (B3): Có tác dụng trong sự phân giải Carbonhydrat, ngoài ra nó còn có tác dụng cường hóa Vitamin C Hàm lượng sử dụng 0,5-2,5 mg/l

- Tocopherol (E): Hàm lượng sử dụng 1,0-50,0 mg/l (Dương Công Kiên, 2002)

Myo – Inositol: Là một loại đường rượu liên quan đến quá trình tổng hợp Phospholipit, Pectin của thành tế bào và hệ thống màng trong tế bào, tham gia vào dinh dưỡng khoáng, vận chuyển đường, trao đổi Hydratcacbon Ngoài ra, Myo – Inositol còn tham gia tích trữ, vận chuyển, giải phóng Auxin (Vũ Văn Vụ và cs, 2005)

Hàm lượng sử dụng 20-1000 mg/l môi trường Myo-Inosito có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng và phát triển giống như các vitamin và trong nhiều trường hợp có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy (Edwin F.George Ph.D, 1993)

Các Amino acid và Amit: có vai trò quan trọng đối với sự phát sinh hình thái Các Amino acid dạng L dễ dàng được mô nuôi cấy hấp thụ

- L-arginin dùng cho nuôi cấy rễ

- L-tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi

- L-serin dùng cho nuôi cấy hạt phấn

Hàm lượng sử dụng mỗi loại: 10-100 mg/l

- Glycin là dạng aminoacid đơn giản nhất, nhưng là nguồn tổng hợp ra Purin, một thành phần cấu trúc của vòng pophyrin trong các phân tử clorophin

- Các dạng Amit dùng trong nuôi cấy là L-glutamin, L-asparagin… Một

số trường hộ tham gia vào cảm ứng và duy trì trong quá trình phát sinh phôi

vô tính Ngoài ra Amino acid và Amit còn là nguồn cung cấp Nito hữu cơ cho

mô nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2005)

Các thành phần hữu cơ phức hợp:

- Cazein thủy phân (CH, casein hydrolysate) có chức nhiều Amino acid Czein thủy phân có chứa khoảng 18-20 aminoaxit Hàm lượng sử dụng là 0,05-0,1% (W/v)

- Dịch chiết nấm men (YE, Yeast extract) có chứa hàm lượng khá cao của nhiều vitamin nhóm B, hàm lượng sử dụng 0,025-0,2% (W/v)

- Dịch chiết malt (malt extract): 0,05-0,1 (W/v)

Các loại nước ép hoa quả, củ:

Nước ép cà chua: 30% (V/v)

Nước ép cam: 3-10% (V/v)

Nước ép chuối xanh: 150 g/l

Nước dừa (CM, Coconut milk): Là nội nhũ lỏng cung cấp các chất dinh dưỡng nuôi phôi dừa Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật thường sử dụng nước quả từ bánh tẻ và quả dừa già Thành phần của nước dừa khá phong phú nhưng có chứa Inositol và các chất thuộc nhóm Cytokinin như Zeatin… Các thành phần này thay đổi, khác nhau giữa quả non, quả già, thậm chí giữa các

quả thuộc cùng độ tuổi Vì vậy, nước dừa cũng là thành phần phức hợp không xác định, hàm lượng sử dụng của nước dừa: 10-20% (V/v) (Lê Trần Bình và

cs, 1997)

c Các chất điều hoà sinh trưởng:

Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả

nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy, nó

ảnh hưởng đến sự biệt hoá, phản biệt hoá và sự sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ Nhu cầu về chất điều hoà sinh trưởng đối với từng loại cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau, nên tuỳ theo từng mục đích nuôi cấy có thể chọn các nồng độ và tổ hợp các chất điều hoà sinh trưởng phù hợp Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thường sử dụng 3 nhóm chất chính là: Auxin, Cytokinin, Gibberellin

- Nhóm Auxin: Là Phytohocmon đầu tiên được phát hiện vào năm

1934, có tác dụng kích thích kích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào Các Auxin được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và dãn nở tế bào, tăng cường quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất Auxin kích thích sự hình thành rễ bất định theo cơ chế, nó hoạt hóa các tế bào vùng xuất hiện rễ để tạo nên mầm rễ bất định, sau đó các mầm rễ sinh trưởng dài ra thành rễ bất định (Nguyễn Kim Thanh và cs, 2005) Ngoài ra Auxin còn tham gia các phản ứng sinh phôi vô tính (Bhojwani S.S, 1983) Trong thực vật

cơ quan chính tổng hợp Auxin là chồi ngọn, các cơ quan còn non đang sinh trưởng cũng có khả năng tổng hợp một lượng nhỏ Auxin như lá non, quả non, phôi hạt… Sự vận chuyển Auxin trong cây phân cực khá nghiêm ngặt theo hướng gốc (Nguyễn Kim Thanh và cs, 2005) Có 4 loại auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: IAA (Indol axetic acid), NAA (Naphthyl acetic acid); 2,4 D (2,4-Dicloro phenoxy axetic acid) và IBA (Indol butyric acid)

Nồng độ Auxin dùng trong nuôi cấy dao động tuỳ từng chất và đối tượng nuôi cấy nhưng thường trong khoảng 0,001-10 mg/l

- Cytokinin: Là nhóm Pytohocmon được phát hiện thứ ba vào năm

1963 Cơ quan tổng hợp Cytokinin ở thực vật là hệ thống rễ và một số cơ quan non đang sinh trưởng Cytokinin có tác dụng hoạt hóa sự phân chia tế bào, hiệu quả này có được là do nó kích thích sự tổng hợp acid nucleic, protein và có mặt trong RNA vận chuyển Kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan Việc sử dụng tỷ

lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy quyết định sự phân hoá của mô theo hướng tạo rễ, tạo chồi hay mô sẹo Cytokinin còn là hoocmon hóa trẻ, nó

ức chế quá trình phân hủy, tăng quá trình tổng hợp đặc biệt là tổng hợp protein, acid nucleic và diệp lục (Lê Trần Bình và cs, 1997) Nó có tác dụng kìm hãm sự già hóa và kéo dài tuổi thọ của cây Các Cytokinin thường được

sử dụng trong nuôi cấy bao gồm: Kinetin; BAP; Zeatin; trong các chất này BAP và Kinetin được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao và giá cả không đắt

Theo những nghiên cứu của Miller và Skoog cho thấy trong môi trường nuôi cấy nếu tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao thì mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo rễ, nếu thấp mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo chồi, còn nếu tỷ lệ này gần bằng 1 thì mẫu nuôi cấy sẽ biệt hoá theo hướng tạo mô sẹo (Lê Trần Bình và

cs, 1997) Theo Das (1958) và Nistach (1968) cho rằng chỉ khi có tác dụng đồng thời của auxin và Cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN dẫn đến quá trình phân chia tế bào Hàm lượng Cytokinin sử dụng dao động từ 0,5-5 mg/l

- Gibberellin: Là nhóm pytohocmon được phát hiện thứ hai vào năm 1955-1956 Vào thời điểm năm 2003, đã có 126 chất Gibberellin được biết đến thuộc nhóm Gibberellin acid thông dụng nhất trong nuôi cấy

mô là GA3 Gibberellin được tổng hợp chủ yếu trong lá non, một số cơ quan non đang sinh trưởng như phôi hạt đang nảy mầm, quả non, rễ non… Vận chuyển không phân cực Hợp chất này có tác dụng kích thích sự giãn tế bào, kéo dài lóng, đốt, thân cây, phá ngủ các phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ Ngoài ra GA3 còn ảnh hưởng đến

sự ra hoa của một số loài thực vật và rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây Ngoài các chất có tác dụng kích thích trên còn có các chất có tác dụng ức chế sinh trưởng, phát triển khác như ABA, Etylen cũng gây ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của một số cây trồng trong

nuôi cấy in vitro (Dương Công Kiên, 2002)

d Nguồn cacbon

Mẫu cấy tuy có thể quang hợp được song ở giai đoạn nuôi cấy ban đầu khả năng này còn rất yếu, nên việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon dưới dạng hữu cơ là bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối Nguồn cacbon trong nuôi cấy mô thường được sử dụng là đường Hai loại đường thường được sử dụng là Saccarose và Glucose với hàm lượng từ 2-6% (W/v) cho 1lít dung dịch Trường hợp cần thiết có thể sử dụng các loại đường khác như: Maltose, Lactose và Glactose Hàm lượng đường thấp sử dụng trong nuôi cấy tế bào trần do hàm lượng cao của đường sẽ làm mất nước trong tế bào do hiện tượng thẩm thấu, ngược lại các hàm lượng cao hơn có thể dung cho nuôi cấy hạt phấn… (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

e Các thành phần khác

Tác nhân tạo gel (gelling agent): Quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy Các môi trường đặc chứa đủ hàm lượng chất tạo gel làm cho chúng đông lại ở nhiệt độ bình thương (25-30o

C) (Phan Hữu Tôn, 2005)

- Chất tạo gel được sử dụng phổ biến là Agar (thạch) gồm một số polisaccarit có khối lượng phân tử cao lấy từ rong biển Các polisaccarit kết

hợp với các phân tử nước tạo thành polime và đông lại tạo thành gel ở nhiệt

độ sấp xỉ 45o

C Khả năng ngậm nước của Agar khá cao: 6-12 g/l nước Độ thoáng khí của môi trường thạch ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của mô nuôi cấy Hàm lượng thạch dùng trong môi trường nuôi cấy dao động tùy thuộc vào độ tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy thông thường từ 6-

10 g/l (Dương Công Kiên, 2002)

Trong thành phần của agar có chứa một số thành phần như Cu, Fe, Mg, Cl… Và một số thành phần hữu cơ: acid béo chuỗi dài, acid hữu cơ… (Vũ Văn Vụ và cs, 2005)

Môi trường lỏng không có hoặc có ít chất tạo gel Dùng môi trường lỏng trong nuôi cấy thường phải lắc nhẹ, sử dụng các thành phần hỗ trợ như cầu giấy lọc, tấm polietylen

- Than hoạt tính (Activated charcoal, AC)

Được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp… Trong trường hợp những chất đó có tác dụng gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu

Than hoạt tính hút các chất hữu cơ như Phytohoocmon, Vitamin, sắt chelat… (Nissen.S.J và cs, 1990) Hàm lượng sử dụng là 0,2-0,3 (W/v)

Than hoạt tính làm giảm hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng Làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có than hoạt tính, có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ

Một số trường hợp, thúc đẩy phát sinh phôi vô tính và kích thích sinh trưởng, phát sinh cơ quan ở các loài cây gỗ (Trigiano.R.N và cs, 1999)

Chất chống oxi hóa: Than hoạt tính là một trong những chất chống oxi hóa tốt, ngoài ra có thể đưa vào môi trường nuôi cấy một số chất chống oxi hóa khác như: Acid xitric, Thiourea, Poliviny pyrrolidon (PVP, 250-1000 mg/l), Acid ascorbic (Trần Thị Lệ và cs, 2008)

- pH của môi trường

pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5-6,0 pH < 5,5 làm cho Agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH > 6,0 agar có thể rất cứng

Nếu trong thành phần của môi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị

pH của phạm vi nói trên Vì ở pH kiềm hoặc quá acid, GA3 sẽ chuyển sang dạng không có hoạt tính sẹo (Lê Trần Bình và cs, 1997)

Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm xuống, do một số mẫu thực vật có thể sản sinh ra các acid hữu cơ

Độ pH của môi trường là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng hoà tan các chất khoáng trong môi trường, sự ổn định của môi trường khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cây Vì vậy đối với loại môi trường nhất định và đối với từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường ổn định về mức ban đầu Nếu pH thấp (pH < 4,5) hoặc cao (pH > 7,0) đều gây ức chế đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây triển của cây

trong nuôi cấy in vitro Đối với mô sẹo của nhiều loài cây, pH ban đầu thường

là 5,5- 6,0 và sau 4 tuần nuôi cấy đạt được 6,0- 6,5 Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc axit cao như Acid amin, Vitamin thì nhất định phải dùng NaOH để làm tăng hoặc dùng HCl loãng để làm giảm pH môi trường về 5,5- 6,5 (Vũ Văn Vụ và cs, 2005)

2.6.3.2 Môi trường vật lý

Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường được giữ ổn định ở 25 ± 2o

C (Nguyễn Kim Thanh và cs, 2005)

Ánh sáng: Các nghiên cứu đã cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát sinh phát triển hình thái của mẫu cấy Các loại mẫu cấy khác nhau có

nhu cầu về thời gian chiếu sáng, cường độ và các lại ánh sáng khác nhau (Dương Công Kiên, 2002)

- Thời gian chiếu sáng với đa số các loài cây thích hợp là 12- 18h/ngày

- Cường độ ánh sáng: Là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, với những cường độ ánh sáng khác nhau Để kích thích mô nuôi cấy tạo mô sẹo có thể chiếu sáng hoặc không cần chiếu sáng (để trong tối), để mô sẹo sinh trưởng mạnh có thể chiếu sáng với cường

độ cao, để kích thích mô sẹo theo hướng tạo chồi dùng cường độ ánh sáng thấp Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000- 10.000 lux (Trần Thị Lệ và cs, 2008)

- Loại ánh sáng: Có thể sử dụng ánh sáng tự nhiên cho những loại mô tế bào cần cường độ ánh sáng thấp, ánh sáng đỏ kích thích kéo dài chồi và thân, còn ánh sáng trắng lại ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng của mô sẹo hơn Do vậy trong các phòng thí nghiệm, sử dụng nguồn cung cấp năng lượng ánh sáng là các đèn huỳnh quang, đặt cách phía trên các bình nuôi cấy khoảng 20- 25 cm,

sẽ cho cường độ ánh sáng đạt tiêu chuẩn 2000-2500 lux (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn 100% nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến vấn đề độ ẩm khi nuôi cấy (Nguyễn Kim Thanh và cs, 2005)

2.7 Những vấn đề trong nhân giống in vitro

2.7.1 Tính bất định về mặt di truyền

Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh trưởng, tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại Việc nuôi cấy

mô sẹo, tế bào đơn thường có tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Tần số biến dị xảy ra còn phụ thuộc vào các yếu tố:

+ Kiểu di truyền hay giống cây nuôi cấy