Định lượng Paraquat bằng phương pháp sắc ký lỏng, W14, E45

Định lượng Paraquat bằng phương pháp sắc ký lỏng, W14, E45Bộ tài liệu sưu tập gồm nhiều Bài tập THCS, THPT, luyện thi THPT Quốc gia, Giáo án, Luận văn, Khoá luận, Tiểu luận…và nhiều Giáo trình Đại học, cao đẳng của nhiều lĩnh vực: Toán, Lý, Hoá, Sinh…. Đây là nguồn tài liệu quý giá đầy đủ và rất cần thiết đối với các bạn sinh viên, học sinh, quý phụ huynh, quý đồng nghiệp và các giáo sinh tham khảo học tập. Xuất phát từ quá trình tìm tòi, trao đổi tài liệu, chúng tôi nhận thấy rằng để có được tài liệu mình cần và đủ là một điều không dễ, tốn nhiều thời gian, vì vậy, với mong muốn giúp bạn, giúp mình tôi tổng hợp và chuyển tải lên để quý vị tham khảo. Qua đây cũng gởi lời cảm ơn đến tác giả các bài viết liên quan đã tạo điều kiện cho chúng tôi có bộ sưu tập này. Trên tinh thần tôn trọng tác giả, chúng tôi vẫn giữ nguyên bản gốc.Trân trọng.ĐỊA CHỈ DANH MỤC TẠI LIỆU CẦN THAM KHẢOhttp:123doc.vntrangcanhan348169nguyenductrung.htmhoặc Đường dẫn: google > 123doc > Nguyễn Đức Trung > Tất cả (chọn mục Thành viên)DANH MỤC TẠI LIỆU ĐÃ ĐĂNGA.HOÁ PHỔ THÔNG1.CHUYÊN ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC HÓA HỮU CƠ PHẦN 1, PDF2.CHUYÊN ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC HÓA HỮU CƠ PHẦN 1, Word3.CHUYÊN ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC HÓA HỮU CƠ PHẦN 2. PHẦN HỢP CHẤT CÓ NHÓM CHỨC4.CHUYÊN ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC HÓA HỌC VÔ CƠ PHẦN 1. CHUYÊN Đề TRÌNH HÓA VÔ CƠ 10 VÀ 115.CHUYÊN ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC HÓA HỮU CƠ PHẦN 2. PHẦN HỢP CHẤT CÓ NHÓM CHỨC6.BỘ ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC MÔN HÓA HỌC 1407.BỘ ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC MÔN HÓA HỌC 41708.ON THI CAP TOC HỌC HÓA HỮU CƠ PHẦN 1, PDF9.TỔNG HỢP KIẾN THỨC HÓA HỌC PHỔ THÔNG10.70 BỘ ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC MÔN HÓA HỌC, word11.CHUYÊN ĐỀ VÔ CƠ, LỚP 11 – 12. ĐẦY ĐỦ CÓ ĐÁP ÁN12.Bộ câu hỏi LT Hoá học13.BAI TAP HUU CO TRONG DE THI DAI HOC14.CAC CHUYEN DE LUYEN THI CO DAP AN 4815.GIAI CHI TIET CAC TUYEN TAP PHUONG PHAP VA CAC CHUYEN DE ON THI DAI HOC. 8616.PHUONG PHAP GIAI NHANH BAI TAP HOA HOC VA BO DE TU LUYEN THI HOA HOC 27417.TỔNG HỢP BÀI TẬP HÓA HỌC LỚP 1218.PHAN DANG LUYEN DE DH 20072013 14519.BO DE THI THU HOA HOC CO GIAI CHI TIET.doc20.Tuyển tập Bài tập Lý thuyết Hoá học luyện thi THPT Quốc gia21.PHÂN DẠNG BÀI TẬP HOÁ HỌC ÔN THI THPT QUỐC GIA 5722.BỘ ĐỀ LUYỆN THI THPT QUỐC GIA MÔN HOÁ CÓ ĐÁP ÁN 29 ĐỀ 14523.BỘ ĐỀ LUYỆN THI THPT QUỐC GIA MÔN HOÁ CÓ ĐÁP ÁN PHẦN 2B.HỌC SINH GIỎI1.Bồi dưỡng Học sinh giỏi Hoá THPT Lý thuyết và Bài tập2.Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm thực hành học sinh giỏiolympic Hoá học 543.CHUYÊN ĐỀ BỒI DƯỠNG HỌC SINH GIỎI HOÁ LÝ THUYẾT VÀ BÀI TẬP 174.ĐỀ THI CHUYÊN HOÁ CÓ HƯỚNG DẪN CHI TIẾT PHẦN ĐẠI CƯƠNG VÔ CƠ 5.Tuyển tập Đề thi Bồi dưỡng Học sinh giỏi Hoá THCS Lý thuyết và Bài tập6.Chuyên đề Bồi dưỡng HSG Hoá học, 12 phương pháp giải toán7.Hướng dẫn thực hành Hoá Hữu cơ Olympic hay dành cho sinh viên đại học, cao đẳngC. HOÁ ĐẠI HỌC, SAU ĐẠI HỌC1.ỨNG DỤNG CỦA XÚC TÁC TRONG HÓA HỮU CƠ2.CƠ CHẾ PHẢN ỨNG TRONG HÓA HỮU CƠTIỂU LUẬN3.TL HÓA HỌC CÁC CHẤT MÀU HỮU CƠ4.GIÁO TRÌNH HÓA HỮU CƠ DÀNH CHO SINH VIÊN CĐ, ĐH, Hóa học Hữu cơ, tập 1 của tác giả Đỗ Đình RãngHóa học Hữu cơ, tập 2 của tác giả Đỗ Đình RãngHóa học Hữu cơ, tập 3 của tác giả Đỗ Đình RãngHóa học Hữu cơ, tập 1 của tác giả Thái Doãn TĩnhHóa học Hữu cơ, tập 2 của tác giả Thái Doãn TĩnhHóa học Hữu cơ, tập 3 của tác giả Thái Doãn TĩnhCơ chế Hóa học Hữu cơ, tập 1 của tác giả Thái Doãn TĩnhCơ chế Hóa học Hữu cơ, tập 2 của tác giả Thái Doãn TĩnhCơ chế Hóa học Hữu cơ, tập 3 của tác giả Thái Doãn Tĩnh5.VAI TRÒ SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT VÔ CƠ 446.BÀI TẬP NHIỆT ĐỘNG LỰC HỌC 407.Giáo trình Hoá học phân tích8.Giáo trình Khoa học môi trường. http:baigiang.violet.vnpresentshowentry_id4897549.Giáo trình bài tập Hoá Hữu cơ 110.Giáo trình bài tập Hoá Hữu cơ 211.Giáo trình bài tập Hoá Phân tích 112.Thuốc thử Hữu cơ13.Giáo trình môi trường trong xây dựng14.Bài tập Hóa môi trường có đáp án đầy đủ nhất dành cho sinh viên Đại họcCao đẳng15.Mô hình, mô hình hóa và mô hình hóa các quá trình môi trường16.Cây trồng và các yếu tố dinh dưỡng cần thiết17.Đất đồng bằng và ven biển Việt Nam18.Chất Hữu cơ của đất, Hóa Nông học19.Một số phương pháp canh tác hiện đại,Hóa Nông học20.Bài tập Hoá Đại cương có giải chi tiết dành cho sinh viên Đại học21.Hướng dẫn học Hoá Đại cương dành cho sinh viên ĐH, CĐ22.Bài giảng Vai trò chất khoáng đối với thực vật PP23.Giáo trình Thực hành Hoá vô cơ dành cho sinh viên ĐH, CĐ24.Bài tập Vô cơ dành cho sinh viên Đại học, Cao đẳng có giải chi tiết25.Bài tập Vô cơ thi Olympic dành cho sinh viên Đại học, Cao đẳng có giải chi tiết26.Bài giảng Hoá học Phức chất hay và đầy đủ27.Bài giảng Hoá học Đại cương A1, phần dung dịch28.Bài tập Hoá lý tự luận dành cho sinh viên có hướng dẫn đầy đủ29.Bài tập Hoá lý trắc nghiệm dành cho sinh viên có đáp án đầy đủ30.Khoá luận Tốt nghiệp bài tập Hoá lý31.Giáo trình Hoá Phân tích dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng32.Bài giảng Điện hoá học hay dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng33.Bài tập Hoá học sơ cấp hay dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng34.Bài giảng phương pháp dạy học Hoá học 135.Bài giảng Công nghệ Hoá dầu36.Hóa học Dầu mỏ và Khí37.Bài tập Hóa dầu hay có hướng dẫn chi tiết dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng38.Bài tập Công nghệ Hóa dầu, công nghệ chế biến khi hay có hướng dẫn chi tiết dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng39.Bài giảng Hóa học Dầu mỏ hay dành sinh viên Đại học, cao đẳng40.Hướng dẫn thực hành Hoá Hữu cơ hay dành cho sinh viên đại học, cao đẳng41.Phụ gia thực phẩm theo quy chuẩn quốc gia42.Hướng dẫn thực hành Hoá Vô cơRC0 Các phản ứng Hoá học mang tên các nhà khoa học hay dành cho sinh viên43.Bài tập trắc nghiệm Hoá sinh hay dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng44.Bài tập Hoá học Hữu cơ có giải chi tiết dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng P145.Bài giảng Hoá học Hữu cơ 1 powerpoint hay46.Bài tập cơ chế phản ứng Hữu cơ có hướng dẫn chi tiết dành cho sinh viên47.Bài giảng Hoá học Hữu cơ dành cho sinh viên48.Bài tập Hoá sinh học hay có đáp án dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng49.Hoá học hợp chất cao phân tử50.Giáo trình Hoá học Phức chất dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng51.Bài giảng Hoá học Đại cương dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng52.Bài giảng Cơ sở Lý thuyết Hoá Hữu cơ dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng53.Bài giảng Hoá Hữu cơ dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng phần Hidrocacbon54.Bài giảng Hoá Hữu cơ dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng phần dẫn xuất Hidrocacbon và cơ kim55.Bài giảng Hoá học Hữu cơ file word đầy đủ và hay nhấtD.HIỂU BIẾT CHUNG1.TỔNG HỢP TRI THỨC NHÂN LOẠI2.557 BÀI THUỐC DÂN GIAN3.THÀNH NGỬCA DAO TỤC NGỬ ANH VIỆT4.CÁC LOẠI HOA ĐẸP NHƯNG CỰC ĐỘC5.GIAO AN NGOAI GIO LEN LOP6.Điểm chuẩn các trường năm 2015E.DANH MỤC LUẬN ÁNLUẬN VĂNKHOÁ LUẬN…1.Công nghệ sản xuất bia2.Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong hạt tiêu đen3. Giảm tạp chất trong rượu4.Tối ưu hoá quá trình điều chế biodiesel5.Tinh dầu sả6.Xác định hàm lượng Đồng trong rau7.Tinh dầu tỏi8.Tách phẩm mầu9.Một số phương pháp xử lý nước ô nhiễm10.Tinh dầu HỒI11.Tinh dầu HOA LÀI12.Sản xuất rượu vang13.Vấn đề mới và khó trong sách Giáo khoa thí điểm14.Phương pháp tách tạp chất trong rượu15.Khảo sát hiện trạng ô nhiễm arsen trong nước ngầm và đánh giá rủi ro lên sức khỏe cộng đồng16.REN LUYEN NANG LUC DOC LAP SANG TAO QUA BAI TAP HOA HOC 10 LV 15117.Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật tomhum18.Chọn men cho sản xuất rượu KL 4019.Nghiên cứu sản xuất rượu nho từ nấm men thuần chủng RV 4020.NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN21.LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHẾ TẠO KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH ĐIỆN HOÁ CỦA ĐIỆN CỰC 2122.NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI UVARIA L. HỌ NA (ANNONACEAE)23.Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết từ đài hoa bụp giấm file word RE02324.Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong quả mặc nưa25.Nghiên cứu xử lý chất màu hữu cơ của nước thải nhuộm …bằng phương pháp keo tụ điện hóa26.Nghiên cứu và đề xuất hướng giải quyết các vấn đề khó và mới về hoá hữu cơ trong sách giáo khoa hoá học ở Trung học phổ thông27.Nghiên cứu chiết xuất pectin từ phế phẩm nông nghiệp, thực phẩm28.Chiết xuất quercetin bằng chất lỏng siêu tới hạn từ vỏ củ Hành tây29.Thành phần Hóa học và hoạt tính Kè bắc bộ pp30.Nghiên cứu phương pháp giảm tạp chất trong rượu Etylic31.Tối ưu hoá quá trình điều chế biodiesel từ mỡ cá tra với xúc tác KOHγAl2O3 bằng phương pháp bề mặt đáp ứng32.Tối ưu hoá quá trình chiết ANTHOCYANIN từ bắp cải tím33.Chiết xuất và tinh chế CONESSIN, KAEMPFEROL, NUCIFERIN từ dược liệu (Ko) RE03334.Phương pháp tính toán chỉ số chất lượng nước cho một số sông thuộc lưu vực sông Nhuệ sông Đáy 35.Xử lý suy thoái môi trường cho các vùng nuôi tôm (Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ tiến tiến, phù hợp xử lý suy thoái môi trường nhằm sử dụng bền vững tài nguyên cho các vùng nuôi tôm các tỉnh ven biển Bắc bộ và vùng nuôi cá Tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long)36.Đánh giá học sinh dùng lý thuyết tập mờ, W813E0036 (Xây dựng một hệ thống thông tin hỗ trợ đánh giá học sinh dùng lý thuyết tập mờ)37.Công nghệ lên men mêtan xử lý chất thải làng nghề“Nghiên cứu hiện trạng ô nhiễm và công nghệ lên men mêtan nước thải chế biến tinh bột sắn của một số làng nghề thuộc huyện Hoài Đức, Hà Nội”38.Tính chất của xúc tác Fe2O3 biến tính bằng Al2O3(Tổng hợp và tính chất xúc tác của Fe2O3 được biến tính bằng Al2O3 và anion hóa trong phản ứng đồng phân hóa nankan”)39.Tác động môi trường của việc thu hồi đất, Word, 5, E0039 “Đánh giá ảnh hưởng môi trường của việc thu hồi đất tại quận Tây Hồ, Hà Nội” 540.Không gian hàm thường gặp, W8, E40 (“Về một số không gian hàm thường gặp”. 41.Xác định hoạt chất trong thuốc kháng sinh, W 10, E41 (Nghiên cứu xây dựng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng đồng thời một sốhoạt chất có trong thuốc kháng sinh thuộc họ βLactam”42.Phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tửW10.2E42 “Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”43.Động lực học của sóng biển, W12, E43. NGHIÊN CỨU ĐỘNG LỰC HỌC CỦA SÓNG SAU ĐỚI SÓNG ĐỔ TẠI BÃI BIỂN NHA TRANG44.Xử lý chất thải tại nhà máy giấy hiệu quả, file word 13, E44 (NÂNG CAO HIỆU QUẢ XỬ LÝ CỦA CÁC BỂ HIẾU KHÍ BẰNG CÁCH ĐIỀU CHỈNH DINH DƯỠNG THÍCH HỢP CHO VI KHUẨN ĐỐI VỚI HỆ THỐNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI CỦA NHÀ MÁY GIẤY45.Định lượng Paraquat bằng phương pháp sắc ký lỏng, W14, E45. (Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao)F.TOÁN PHỔ THÔNG1.TUYEN TAP CAC DANG VUONG GOC TRONG KHONG GIAN2.Luyện thi THPT Quốc gia môn Toán 500 câu có đáp án3.Phân dạng Luyện thi THPT Quốc gia môn Toán4.Bộ đề Trắc nghiệm Luyện thi THPT Quốc gia môn Toán5.Chuyên đề Trắc nghiệm Luyện thi THPT Quốc gia môn Toán6.Bộ đề Thi thử Trắc nghiệm THPT Quốc gia môn Toán7.Bộ đề kiểm tra trắc nghiệm 1 tiết phút môn Toán lớp 128.Bài tập trắc nghiệm môn toán lớp 12, luyện thi THPT quốc gia tổng hợp rất nhiều P19.Bài tập trắc nghiệm môn toán lớp 12, luyện thi THPT quốc gia tổng hợp rất nhiều P210.Bài tập trắc nghiệm môn toán lớp 12, luyện thi THPT quốc gia tổng hợp rất nhiều P311.Bài tập trắc nghiệm môn toán Giải tích lớp 12, luyện thi THPT quốc gia P1 có đáp án12.Bài tập trắc nghiệm môn toán Giải tích lớp 12, luyện thi THPT quốc gia P213.Phân dạng Bài tập trắc nghiệm môn toán lớp 12, luyện thi THPT quốc gia14.Bài tập trắc nghiệm môn toán Hình học lớp 12, luyện thi THPT quốc gia.15.Bài tập trắc nghiệm môn toán Hình học lớp 12, luyện thi THPT quốc gia có đáp án16.Phân dạng Bài tập trắc nghiệm môn toán Hình học lớp 12, luyện thi THPT quốc gia17.Đề Thi thử Trắc nghiệm THPT Quốc gia môn Toán18.Đề Thi thử Trắc nghiệm THPT Quốc gia môn Toán có đáp án19.Đề Thi thử Trắc nghiệm THPT Quốc gia môn Toán có giải chi tiết20.Ôn tập Toán 12, luyện thi THPT Quốc gia21.Phân dạng bài tập hình học 11 rất hay có giải chi tiết các dạng22.Bài tập trắc nghiêm Toán 1123.Đề trắc nghiệm toán đại số 12 dành cho kiểm tra 1 tiêt, 15 phút có đáp ánG.LÝ PHỔ THÔNG1.GIAI CHI TIET DE HOC SINH GIOI LY THCS

TUYỂN TẬP BÀI TẬP PHỔ THÔNG, ĐẠI HỌC, SAU ĐẠI HỌC LUẬN ÁN-ĐỒ ÁN-LUẬN VĂN-KHOÁ LUẬN-TIỂU LUẬN

LUẬN VĂN THẠC SĨNGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

DANH SÁCH HÌNH

Chương 1.

Chương 3.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

% RSD % Relative standard deviation % Độ lệch chuẩn tương đối

% RSDR

% Reproducibility standard deviation

% Độ lệch chuẩn tái lặp tương đối

ATP Adenosin Triphophate Adenosin Triphophat

DAD diode-array detector detector mảng diode

GC - MS Gas chromatography - Mass

HPLC High performance liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC - MS Liquid Chromatography - Mass

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

R Relative coefficient Hệ số tương quan

ROC Receiver operating characteristics Đường cong ROC

RP-HPLC Reverse phase-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo

SIPP Severity Index of Paraquat

Poisoning

Chỉ số độ nặng của ngộ độc Paraquat

TCA Trichloroacetic acid Acid Tricloacetic

UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại và khả kiến

ĐẶT VẤN ĐỀ

Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ giá thành rẻ,

hiệu quả diệt cỏ dại nhanh chóng, ít ảnh hưởng tới môi trường do đóhiện đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau Tuy nhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng độc với người Liều tử vong của PQ ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20% Tại nhiều nước phát triển, PQ đã bị cấm sử dụng nhưng ở Việt Nam việc thiếu các chính sách và biện pháp quản lý sử dụng hóa chất này nên trong những năm vừa qua có rất nhiều trường hợp ngộ độc PQ đến cấp cứu [1] Trên thế giới, nhiều ca tử vong do ngộ độc PQ đã được báo cáo [10][19][27] Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca trong năm 2013 và năm 2014 lên tới 391

ca Tỉ lệ tử vong do ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80% theo nhiều nghiên cứu của các tác giả nước ngoài [29][32] Tại Trung tâm chống độc (TTCĐ) bệnh viện Bạch Mai, tỉ lệ tử vong năm 2007 là 72,5% [4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu tại bệnh viện Chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh là 85%

Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếu các biện pháp điều trị hiệu quả Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác giả nước ngoài và một số tác giả Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọc máu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải PQ cho kết quả khả quan, cứu sống một số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ Xét nghiệm định lượng nồng độPQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này

Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng ở mức độ định tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc PQ mà chưa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độPQ máu với kết quả đáng tin cậy Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn đoán, tiên lượng cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu làm cho việc điều trị ngộ độc PQ tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên cả nước gặp rất nhiều khó khăn

Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phương pháp sắc

ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình chuẩn định lượng PQ huyết

tương Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về paraquat

1.1.1 Công thức paraquat

Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là

1,1'-dimethyl-4,4' bipyridilium là thuốc diệt cỏ phổ biến nhất hiện nay do đặc tính diệt cỏ nhanh và triệt để PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium, được tổng hợp đầu tiên vào năm 1882, ứng dụng trong nông nghiệp làm thuốc trừ cỏ từ những năm 1950 [42]

PQ có khối lượng phân tử tương đối 186,2 có công thức hóa học như hình 1.1:

Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat

1.1.2 Tính chất lý, hóa học của paraquat

PQ thường có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20oC là 1,240 - 1,260, điểm chảy 175 - 180oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ trong nước 6,5 - 7,5

PQ thường ở dạng dimethylsulphate hoặc dichloride Dạng dichloride tinh thể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa PQ ổn định trong dung dịch môi trường acid hoặc trung tính và không ổn định trong môi trường kiềm

PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20oC), ít tan trong cồn và hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ khác

PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề mặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc vớiđất PQ không bay hơi Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [43]

PQ được sản xuất bởi nhiều công ty khác nhau với các tên thương mại và hàm lượng khác nhau, nói chung thường đều ở dạng dung dịch màu xanh Một số tên gọi thường gặp của PQ như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone, Owen [42]

Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các nước phát triển đều đã cấm sử

dụng PQ như là một loại hóa chất bảo vệ thực vật (Mỹ và các nước Châu Âu) Một số nước như Nhật Bản chỉ cho phép lưu hành PQ dạng dung dịch với hàm lượng thấp 4,5%

sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ nếu bị ngộ độc Thực tế hiện nay trên thế giới vẫn có gần 130 nước cho phép sử dụng PQ trong đó có Việt Nam [42] Hiện ở Việt Nam thuốc từ cỏ PQ được lưu hành dạng dung dịch 20% do đó nguy cơ ngộ độc cấp tính rất lớn

Một điều đáng nói là công ty sản xuất PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là Syngenta hay còn gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc và Anh Trên đất nước họ đã cấm hoàn toàn PQ, hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nước thứ ba [39]

1.1.3 Cơ chế gây độc của paraquat

Cơ chế gấy độc của PQ được mô tả theo sơ đồ sau [37]:

Hình 1.2 Cơ chế gây độc của paraquat [15]

Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ2+ cùng với NADPH trải qua một phản ứng tạo ra ion paraquat bị khử (PQ+) và NADP+ PQ+ phản ứng hầu như ngay lập tức với oxy tái tạo lại PQ2+ và gốc superoxid Có sẵn NADPH và oxy, chu trình oxy hoá - khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và không ngừng tạo ra gốc superoxid Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bản thân nó để tạo ra peroxid hydro (H2O2), và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự do hydroxyl [18] [31] Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào Chu trình oxy hoá - khử tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thương tế bào: phản ứng với lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA

và các protein tối cần thiết cho tế bào sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [12] [39] [40]

Hậu quả lên tế bào do việc hình thành các gốc tự do (superoxid và các gốc tự do khác) là đối tượng của rất nhiều nghiên cứu Các thử nghiệm điều trị nhằm vào việc thay đổi các gốc tự do bằng các chất như desferioxamin, superoxid dismutase, α-tocopherol và vitamin C cùng với bài niệu cưỡng bức Tuy nhiên, cho đến hiện nay không có chất nào trong số này được khuyến cáo dùng.

Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các gốc tự do do PQ sinh ra vẫn chưa được biết nhưng những gì người ta đã biết về cơ sở để ngộ độc là sự tương tác giữa PQ, NADPH và oxy Sau đó, ở mức độ tế bào, oxy là yếu tố tối cần thiết cho việc hình thành bệnh lý do PQ Đây là cơ sở cho việc hạn chế cung cấp oxy trong việc điều trị ban đầu bệnh nhân ngộ độc PQ

PQ có tính ăn mòn và gây tổn thương giống như kiềm khi tiếp xúc với da, mắt và các niêm mạc Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc toàn thân PQ là đường tiêu hoá, thận và phổi Dạ dày, ruột bị tổn thương nặng nề do tác dụng ăn mòn trực tiếp khi bệnh nhân uống PQ có chủ ý với nồng độ cao Thận là cơ quan đào thải PQ và DQ và có nồng

độ bipyridyl cao hơn so với các cơ quan khác Riêng ở phổi, PQ vào các phế bào týp I và

II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP

Do vậy PQ gây tổn thương hầu hết tất cả các cơ quan trong cơ thể vì đều có liên quan đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ hoặc liên quan đến thải trừ PQ thì tổn thương đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong như tổn thương phổi gây suy hô hấp, suy thận, viêm gan, loét niêm mạc đường tiêu hóa và biến chứng nhiễm trùng [6][13][37] Việc tiếp xúc với lượng PQ ít hơn sẽ làm chậm nguy cơ tử vong do xơ phổi tiến triển và suy thận [33] Một số nghiên cứu gần đây còn cho thấy phơi nhiễm PQ có liên quan với hội chứng Parkinson [21][23]

Trong ngộ độc cấp PQ, có thể tiên lượng bệnh dựa trên nồng độ PQ trong huyết tương Một số báo cáo cho thấy nồng độ PQ huyết tương vượt qua 2 µg/ml thì hầu hết tử vong, tuy nhiên một vài trường hợp bệnh nhân vẫn hồi phục khi nồng độ trong máu cao hơn 2 µg/ml[7][10][22]

1.1.4 Dược động học paraquat

1.1.4.1 Hấp thu

Ở đường tiêu hoá PQ được hấp thu rất nhanh nhưng ít (5-10%) Hấp thu chủ yếu ở ruột non Khi dạ dày ruột bị tổn thương lan rộng, số lượng chất độc được hấp thu sẽ tăng

lên PQ không gắn với protein huyết tương Nồng độ đỉnh của PQ trong huyết tương đạt được trong vòng 2 giờ sau uống [6] [37] Tiếp xúc qua da, hấp thu vào cơ thể nói chung chỉ xảy ra khi tiếp xúc kéo dài hoặc da bị tổn thương Tiếp xúc với PQ qua đường hô hấp không làm cho lượng PQ được hấp thu đến mức đủ để gây nhiễm độc Bởi vì kích thước các hạt chứa PQ lớn (hầu hết trên 100 µm) làm cho PQ không đi sâu được xuống đường

hô hấp để hấp thu [11] Mắt tiếp xúc với PQ sẽ bị tổn thương, nhưng không đủ để gây nhiễm độc toàn thân

1.1.4.2 Phân bố

Sau khi uống, PQ phân bố nhanh chóng nhất tới tất cả các cơ quan chính như phổi, thận, gan và cơ, đặc biệt là phổi, PQ sẽ bị khử thành dạng gốc tự do hoạt tính cao [8][22] Thể tích phân bố của PQ là 1,2 - 1,6 l/kg

PQ đạt được nồng độ cao và tồn tại lâu hơn trong phổi, nồng độ trong phổi có thể cao hơn so với nồng độ huyết tương gấp 50 lần Sau uống 5-7 giờ, nồng độ PQ trong tổ chức phổi đạt cao nhất Tuy nhiên, lượng PQ huyết tương cũng cần đạt đến một ngưỡng tới hạn để cho quá trình hấp thu ở phổi diễn ra [11]

PQ qua được nhau thai Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch ối và máu dây rốn, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 4-6 lần [11] Không có bào thai nào sống sót Tuy nhiên nếu mẹ ngộ độc PQ còn sống thì đến lần có thai sau không nguy hiểm đến bào thai

1.1.4.3 Chuyển hoá, thải trừ

PQ được đào thải hầu như hoàn toàn qua thận nhờ cả quá trình lọc của cầu thận và quá trình bài tiết tích cực của ống thận Trong vòng 12-24 giờ sau uống, trên 90% PQ được đào thải dưới dạng không đổi qua thận, nếu chức năng thận bình thường [11].Tuy nhiên có thể xét nghiệm thấy PQ trong nước tiểu vài ngày sau do có sự tái phân bố PQ từ các cơ quan Thời gian bán thải của PQ có thể kéo dài 12-120 giờ hoặc lâu hơn khi có suy thận Ngoài ra PQ còn đào thải qua phân dưới dạng không đổi [8][22]

1.1.5 Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương.

Tiên lượng bệnh nhân uống PQ có thể dựa vào nồng độ PQ huyết tương theo thời gian Nồng độ PQ phải đo trước khi điều trị vì các biện pháp điều trị có thể làm giảm nồng độ PQ (dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…) Proudfoot và cộng sự [29] lần đầu tiên trình bày biểu đồ tiên lượng khả năng sống từ kết quả định lượng nồng độ PQ huyết tương tại nhiều thời điểm khác nhau trên 79 bệnh nhân Những BN sống có nồng độ dưới 2,0;

0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/l tương ứng ở 4, 6, 10, 16, và 24 giờ sau uống PQ Schermann và cộng sự [35]mở rộng đường cong tiên lượng BN này lên đến ngày thứ 7 sau nhiễm độc,

và nghiên cứu này cho thấy những BN nồng độ PQ huyết tương trên 10 mg/l (định lượng trong vòng 8 giờ), thường chết vì sốc tim trong 24h, trong khi những BN có nồng độ thấp hơn (nhưng vẫn trên đường tiên lượng), chết vì xơ phổi và suy hô hấp muộn hơn 24 giờ sau uống Suzuki và cộng sự (1991) [36]đã kết hợp dữ liệu của Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann (1987), Sawada (1988) và thêm một nhóm 78 BN, kết luận rằng đồ thị tiên lượng chính xác 101 trong 102 trường hợp tử vong và 61 trong 63 BN sống được đánh giá trong vòng 24 h sau uống PQ Mặc dù đồ thị khá chính xác, giúp xác định mức độ nặng và tiên lượng tử vong nếu định lượng được PQ ngay lập tức, đồ thị này cũng đôi khi tiên đoán sai Nguyên nhân do ước tính thời gian từ khi uống PQ dễ sai, đặc biệt trong vài giờ đầu tiên nồng độ PQ huyết tương giảm nhanh sai số về thời gian thậm chí 0,5 đến 1h có thể thay đổi hoàn toàn mối quan hệ nồng độ và tiên lượng Ngoài ra, nồng độ PQ trong huyết tương có thể không hoàn toàn chính xác vì được phân tích bằng một số phương pháp khác nhau và các nghiên cứu thường không trình bày rõ nồng độ của ion hay là muối PQ, và thực tế có thể có khác biệt giữa các bệnh nhân về mức độ nhạy cảm với tác dụng độc của PQ, tuy khác biệt này chưa được nghiên cứu

Hình 1.3: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tương (µg/ml), thời gian sau

uống, và khả năng sống

Năm 1988Sawada và cộng sự[34] báo cáo chỉ số tiên lượngngộ độc PQ dựa trên nghiên cứu nồng độ PQ huyết thanh ở 30 bệnh nhân, 20 tử vong và 10 BN sống.Chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ (SIPP: severity index of PQ poisoning) tính bằng thời gian từ khi

uống (giờ) cho đến khi bắt đầu điều trịnhân với nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml) khi vào viện.

SIPP = [nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)]× [thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị(h)]Khi điểm SIPP ít hơn 10, bệnh nhân có thể sống sót; điểm 50 phân biệt tử vong muộn do suy hô hấp (10 <SIPP <50) vớitử vong sớm do suy tuần hoàn(SIPP> 50) Mặc

dù đây là nghiên cứu quan trọng, Sawada xét nghiệm định lượng dùng huyết thanh không phải huyết tương Suzuki và cộng sự (1991) đã so sánh SIPP với đồ thị tiên lượng sống trên 167 BN nhập viện trong vòng 24 h sau uống PQ Các kết cục của BN

dự đoán theo đồ thị của Proudfoot đã sai ở 1 trường hợp tử vong và 2 BN sống; trong khi đó, SIPP sai ở 1 BN sống và 10 trường hợp tử vong Những khác biệt này có ý nghĩa thống kê, và tác giả kết luận rằng dựa trênnồng độPQtrong24h đầusau uống, đồ thị của Proudfoot tiên lượng chính xác hơn SIPP [36]

1.2 Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương

1.2.1 Phương pháp quang phổ

Rai M.K và cộng sự [30] định lượng PQsử dụng NaBH4 để khử PQ trong môi trường kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 600nm trong khi

Kato K và cộng sự [20]lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester (TBPE) phản

ứng với PQ để tạo ra dung dịch hữu cơ PQ-TBPE màu xanh da trời, có thể chiết được

bằng dichloromethane Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định lượng PQ trong huyết tương

dựa bằng đo quang phổ của dẫn xuất khi phản ứng với Na2S2O4 10% và NaOH 5M

Ưu điểm của phương pháp khử PQ bằng NaBH4là độ nhạy cao, với các điều kiện khử PQ là nhiệt độ 35-40°C, pH 10-11 thì màu có độ ổn định lên đến 12hvà không cần đệm để ổn định màu, khoảng nồng độ 0,05 - 0,5 µg/ml tuân theo định luật Lambert – Beer, trong khi giới hạn phát hiện là 0,03 µg/ml Trong khi đó, phương pháp sử dụng TBPE thì mẫu được phép để tối đa trong 20 phút Cả 2 phương pháp này đều đề cập đến

DQ, trong khi Rai M.K [30]loại bỏ DQ thì Kato K [20] lại định lượng đồng thời cả PQ và

DQ

Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã loại được sự ảnh hưởng của các thuốc trừ sâu thông thường và các ion kim loại khác DQ, có cấu trúc gần giống PQ, sẽ gây ảnh hưởng khi định lượng PQ Tuy nhiên DQ, nếu có, sẽ bị loại khi thêm NaOH 0,2 N, trong khi PQ không bị mất đi Các ion kim loại như Fe3+ và Al3+, có thể ảnh hưởng do làm kết tủa hydroxide, sẽ bị loại đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5% trước khi thêm dung dịch

NaOH [30] Còn theo Kato K[20], DQ cũng có thể chiết được với TBPE trong

dichloromethane cũng giống như PQ nhưng PQ-TBPE có quang phổ hấp thụ hơi khác với DQ-TBPE Đo độ hấp phụ của PQ ở bước sóng 603 nm & DQ ở bước sóng 608 nm với dãy nồng độ (4,5 - 45,0)×10-7 M Giới hạn phát hiện 4,77.10-7 M

Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã được ứng dụng để định lượng PQ trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân như máu, nước tiểu, sữa mẹ cũng như các mẫu thực phẩm và các mẫu trong môi trường

Với phương pháp đo quang phổ thông thường, không phát hiện được PQ tại bước

sóng 257 nm Nên Chang-bin Li và cộng sự[24] đã định lượng nồng độ PQ trong huyết

tương dựa trên việc đo quang phổ dẫn xuất thứ 2 (tuân theo định luật Lambert Beer với

r=0,996) Dung dịch nước chuẩn PQ 10 μg/ml được quét bước sóng từ 200 đến 300 nm,

với mẫu trắng là nước cất Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50

và 10 μg/ml được thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1, v/v) Lắc xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong

5 phút Lấy dịch trong phần trên đi đo quét bước sóng từ 200 đến 300 nm Sau khi xử lý mẫu như trên, dịch trong phần trên được chuyển vào ống Eppendorf mới, bảo quản tránh ánh sáng Trước khi đo, 400 μl mẫu được lắc trộn nhẹ nhàng và hoàn toàn với 100 μl hỗn hợp đồng thể tích Na2S2O4 10% và NaOH 5M Làm tương tự với mẫu huyết tương trắng đối chiếu và đo độ hấp thụ quang trong khoảng bước sóng từ 300 đến 500 nm (khoảng bước sóng Δλ=0,5 nm) Từ đó dẫn xuất thứ 2 này có thể được tính toán theo công thức

Δ2Abs/(Δλ)2 (khoảng bước sóng dẫn xuất Δλ=4 nm) [24]

1.2.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ

Phương pháp GC-MS là phương pháp đơn giản có độ nhạy và độ tin cậy cao, từ

lâu đã được sử dụng để định lượng PQ trong dịch sinh học L Gao [16] và Almeida R M.

[5] cùng sử dụng phương pháp GC-MS để định lượng PQ Trong cả hai nghiên cứu, các tác giả đã sử dụng hệ thống chọn lọc ion (selected ion monitoring – SIM)để nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn, khí He được dùng như là khí mang để đưa chất phân tích vào cột Dung dịch mẫu phân tích đều được khử bằng NaBH4 trước khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí Tuy nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau

Tác giả L Gao và cộng sự [16] lại sử dụng cột mao quản (10m 0,18 mm, độ dày màng 0,25 µm) Nhiệt độ của bơm tiêm, interface và nguồn ion lần lượt là 280, 280,

200oC Khí mang được bơm đẳng dòng với tốc độ là 1,01 ml/phút Mẫu được đưa vào

bằng chế độ tiêm chia dòng (10:1) và nhiệt độ giải hấp phụ lúc đầu là 70oC trong 1 phút

và tăng đến 295oC với tốc độ 25oC/phút Nhiệt độ 295oC được duy trì trong 10 phút Trong đó các mảnh ion 196 và 224 được dùng để định lượng PQ & EPQ Độ thu hồi của mẫu máu và nước tiểu lần lượt là 94,00 - 99,85% và 95,00 - 100,34%, khoảng tuyến tính 0,1 - 50 µg/ml Giới hạn phát hiện (S/N = 3) là 0,01 µg/ml đối với cả máu và nước tiểu Phương pháp này đã được áp dụng để phân tích các mẫu sinh học thu được từ các nạn nhân chết do uống PQ

Trong khi đó, Almeida R M.và cộng sự[5] sử dụng trên hệ máy sắc ký GC-MS

(Gas chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972) với cột mao quản fused-silica HP-5MS (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,1 µm) và chế độ đẳng dòng với tốc độ 0,6 ml/phút Nhiệt độ của bơm và interface (bộ phận ghép nối giữa

GC và MS) là 270oC Bơm hoạt động ở chế độ chia dòng Nhiệt độ cột duy trì 80oC trong

1 phút, tăng nhiệt 10oC/phút đến 200oC và 20oC/phút đến 270oC và duy trì 270oC trong 4 phút Số khối của các mảnh ion được chọn cho các hợp chất là: m/z 108, 135, 190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220 (EPQ), trong đó các mảnh ion 192 và 162 được dùng để định lượng PQ & EPQ

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Hai tác giả ZhaohongWang và Proenca P.đều định lượng PQ trong mẫu sinh học

bằng sắc ký lỏng - ion hóa tia điện - khối phổ [28] [41]

ZhaohongWang sử dụng hệ thống Waters UPLC với Tiêm mẫu 5 μl với cột

ACQUITY BEH HILIC (50 mm × 2,1 mm × 1.7 μm) ở 30oC Còn Proenca P.sử dùng hệ

thống sắc ký LC Water 2695 Alliance System và cột silica HILIC (150 × 2,1 mm × 5 µm) Nhiệt độ cột duy trì 35oC Bơm mẫu 10 µl Detector mảng photodiode Water 996 hoạt động từ bước sóng 210-400 nm với độ phân giải 1,2 nm Độ hấp thụ UV được đo ở

258 nm

Cả hai tác giả đều sử dụng pha động là ammonium formate và acetonitrile Trong

khi ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (điều chỉnh đến pH 3,7 bằng acid

formic) và acetonitrile Và chạy pha động theo chế độ gradient với tốc độ dòng 0,3 ml/phút Ngay sau khi tiêm mẫu, % acetonitrile giảm từ 60% đến 20% trong 0,5 phút, sau

đó tăng tới 60% ở 1,5 phút và duy trì 60% ở 1,5 phút tiếp Tổng thời gian chạy là 3 phút

Thì tác giả Proenca P dùngpha động gồm acetonitrile và đệm ammonium formate (200

mM) pH 3,6 với chế độ đẳng dòng (30:70, v/v) và tốc độ 300 µl/phút

Các tác giả trên đều sử dụng nguồn ion hóa tia điện dương để ion hóa PQ và chuẩn nội nhưng có khác nhau về điều kiện khối phổ.

Tác giả ZhaohongWang sử dụng bộ phân tích phổ khối ACQUITY

BSM_SM_Quattro Premier XE MS Tối ưu hóa điều kiện MS-MS bằng cách tiêm dòng

PQ và ethyl viologen trong acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250 mM (40:60, v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc độ dòng khí làm khô là 651 l/h ở 350oC Điện áp mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là 4,0 V và điện áp thấu kính RzFl à 0,5 V Định lượng bằng kỹ thuật quét ion (multi-reaction monitoring, MRM), bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sản phẩm có m/z 155 và 171 đối với PQ; mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sản phẩm có m/z 158 và 185 đối với chuẩn nội ethyl viologen [41]

Còn với tác giả Proenca P [28]phát hiện phổ (MS) được thực hiện trên máy khối

phổ tứ cực Water ZQ 2000 Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120oC; nhiệt độ làm khô

400oC; tốc độ dòng khí cone (N2) 0l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N2) 600 l/h Điện thế capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lượng ion 0,5 V; Quét phổ từ m/z 130-500, thời gian quét 0,5 s và thời gian trễ (interscan) 0,1s Đường chuẩn độ PQ

trong máu tuyến tính từ 0,010-2,0 µg/ml trong máu (y=0,0142x+0,1497 với r2=0,9994) và

tuyến tính từ 0,025-10,0 µg/ml trong nước tiểu (y = 0,0141x + 1,347 với r2 = 0,9994) Giới hạn phát hiện của PQ trong máu và nước tiểu lần lượt là 0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml

(LOD, S/N = 3) và giới hạn định lượng (LOD, S/N = 10) là 0,0012 µg/ml trong máu và

0,024 µg/ml trong nước tiểu Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng không có pic nào trùng thời gian lưu với PQ và chất chuẩn nội

1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ trong dịch sinh học [7][17][26]

Arys K.và cộng sự [7] sử dụng hệ thống HPLC Gồm bơm model 126 và tiêm

mẫu type 210A với vòng tiêm mẫu 50 µl Bước sóng hoạt động là 230 nm Cột phân tích Aluspher 100 RP-select B (125 mm × 4,0 mm, kích thước hạt 5 µm) với cột bảo

vệ 100 RP-select B (4 mm × 4,0 mm, kích thước hạt 5 µm) Pha động là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125 M trong nước (dung dịch A) và dung dịch NaOH 0,0125 M trong methanol (dung dịch B), tốc độ dòng 1ml/phút Chạy pha động chế độ gradient, dung

dịch A từ 90% đến 10% trong thời gian 15 phút Sau khi chạy xong, chạy lại điều kiện ban đầu trong 5 phút trước khi chuyển sang chạy mẫu mới Giới hạn phát hiện PQ của phương pháp trong máu và nước tiểu lần lượt là 63 và 32 µg/l.

Paixão P.[26] định lượng PQ trong huyết thanh và huyết tương người được làm

đơn giản và nhanh bằng phương pháp HPLC sử dụng 1,19-diethyl-4,49-bipyridyldiylium (diethyl paraquat) làm nội chuẩn Hệ thống HPLC gồm bơm mẫu model 1100, ổn định nhiệt, detector UV-VIS.Vòng bơm mẫu 50 µl, cột NovaPar C18 (150×4,6 mm, 5µm) Tiền cột C18 (100×4,6 mm, 10µm) PQ và chất nội chuẩn được rửa giải ở 25oC với tốc độ dòng 0,8 ml/phút và bước sóng hấp thụ 258 nm Pha động gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine Acetonitrile nồng độ 10% (v/v) Kết quả: Thời gian lưu của PQ và chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút Giới hạn phát hiện (LOD) 0,1 µg/ml, giới hạn định lượng (LOQ) 0,4 µg/ml trong huyết tương và huyết thanh Độ đúng trong ngày không vượt quá 3,5%; 3,2% đối với huyết tương, huyết thanh Độ đúng trong khác ngày không vượt quá 4,7%; 3,1% đối với huyết tương, huyết thanh Độ thu hồi trong huyết tương và huyết thanh lần lượt là 98,9% và 98,7%

Shuuji Hara [17] định lượng đồng thời PQ và DQ trong huyết tương bằng phương

pháp HPLC Hệ sử dụng bơm L-7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơm mẫu (20 µl) Rheodyne 7125 PQ, DQ, IS được tách trên cột pha đảo Capcell PaK C18 UG120 (150-4,6 mm, cỡ hạt 5µm, của Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dung dịch rửa giải của methanol và 200 mM axit phosphoric với diethyl amine 0,1M và sodium 1-heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v) Tốc độ dòng của pha động 0,5 ml/phút và nhiệt độ cột trong khoảng từ 15-20oC Dịch rửa từ cột HPLC được trộn với dung dịch kiềm của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn Tốc độ dòng 0,4 ml/phút Hỗn hợp được dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và được làm ấm trong bể nước SB-9 (EYELA, Tokyo, Nhật) ở nhiệt độ

20oC và đo ở bước sóng 391 nm bằng detector UV Hitachi L- 7405 Độ cao của pic được dùng để định lượng bằng máy C-R6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật) Giới hạn phát hiện của PQ và DQ là 50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết tương

Định lượng PQ trong huyết tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo cặp

ion đã được Brunetto M.R.thực hiện trên hệ thống sắc ký được sử dụng có 2 bơm, 1 bơm

2 nòng để chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model 64 để chuyển pha

động vào cột chiết Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100 hoặc 200 µl để đưa mẫu vào cột chiết Sử dụng các cột 25 - 4 mm được lấp đầy các hạt LiChrospher RP-18 ADS (kích thước hạt 25 µm) và cột VARIAN ODS C-18 (25 cm × 4,6 mm, hạt 5 µm) lần lượt là cột chiết và cột phân tích Cột chiết và cột phân tích được gắn với van xoay 6 cửa Rheodyne được điều khiển bằng bơm 2 nòng Sử dụng detector UV-DAD Perkin-Elmer

LC 235 ở bước sóng 258 nm với flowcell 12 µm để phát hiện các tín hiệu

Các pha động:

- Pha động để chiết (Pha động 1): chứa natri octane sulfonate (SOS) 10mM và acid orthophosphoric 0,05 M được pha bằng nước cất 2 lần, và lọc màng 0,45

µm Điều chỉnh pH đến 2,8 bằng TEA và thêm 2-propanol nồng độ 3% (v/v)

- Pha động để phân tích (Pha động 2): methanol 40 % và SOS 10 mM trong acid orthophosphoric 0,05 M Điều chỉnh đến pH 2,8 bằng TEA

Các dung dịch và pha động được lọc màng 0,45 µm và loại khí trong bể siêu âm trước khi sử dụng Giới hạn phát hiện, tỉ lệ tín hiệu (Signal) / Nhiễu đường nền (Noise) với S/N > 3, là 0,005 µg/ml PQ với thể tích tiêm mẫu 200 µg [9]

Chen Lu và cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để

xác định PQ trong huyết thanh người Trong thí nghiệm này, các mẫu huyết thanh đã được kết tủa protein lần lượt 30% acid perchloric, acetonitrile và dichlormethane, thu được 50 ml dung dịch Pha động acetonitrile-đệm (10:90), dung dịch đệm chứa natri heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 0,26 M, điều chỉnh pH đến 2,0 bằng triethylamine Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước sóng phát hiện 256 nm, nhiệt độ cột 40oC Đường chuẩn tuyến tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1 - 40 mg/l (r = 0,9999) Giới hạn phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3) Độ lệch chuẩn (RSD) của các mẫu chứng nồng độ thấp, trung bình và cao là trong vòng 3,061% - 6,149%, độ lệch chuẩn giữa các lô 0,705%

- 2,796%, và độ thu hồi của phương pháp xử lý mẫu 96,79 % - 100,07%, và độ thu hồi phương pháp là 91,66% - 108,49% Phương pháp này là đơn giản, nhạy cảm, chính xác, nhanh chóng và cũng chỉ ra rằng có thể được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng

* Ngoài ra, một vài phương pháp khác cũng đã được nghiên cứu để định lượng PQ trong máu như: miễn dịch phóng xạ [14], điện di mao quản [38]…

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat

Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định lượng đó là phương pháp xử lý mẫu

Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu sinh học trong phân tích PQ [5][16][20][28][41] Một số tác giả dùng đệm phosphate để thêm vào mẫu thử trước khi cho qua cột chiết pha rắn [5][16][41]

Cột chiết pha rắn C18 thường được dùng để chiết PQ & DQ trong mẫu thử [20] Dung dịch mẫu đã loại protein được chỉnh pH đến 11 bằngNaOH Cột được hoạt hóa bằng

5 ml nước, 5 ml methanol và 20 ml nước trước khi bơm mẫu vào cột 3 ml nước cất được bơm qua cột để loại bỏ hoàn toàn các hợp chất khác trong máu Sau đó, 3 ml acid hydrochloric 0,2 M và 1 ml × 3 nước khử khoáng được cho qua cột để rửa giải PQ & DQ Với dịch thu được thêm 3 ml dung dịch NaOH 0.2 M Mẫu này được mang đi đo quang [20]

Chang-bin Li[5] cũng dùng cột C18 để chiết PQ, cột được rửa với 2 ml methanol

và 2 ml đệm phosphate (pH 8,0) Dung dịch mẫu được đưa qua cột rồi rửa với 2 ml nước khử khoáng Cuối cùng, rửa giải với 2 ml methanol và dịch rửa giải được bay hơi ở nhiệt

độ phòng dưới dòng khí nitrogen Hòa tan cắn trong 100 µl methanol và bơm 1 µl vào hệ thống GC-MS

Zhaohong Wang[41] xử lý 1,0 ml máu, thêm 3 ml đệm phosphate 0,1M (pH 7) và

dung dịch chuẩn nội 100ng/ml Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút Các cột Waters Oasis WCX 3 ml được cho chạy qua lần lượt 3 ml methanol, 3 ml nước khử khoáng và 1

ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7) Sau khi cho mẫu chạy qua cột, rửa cột với 3 ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7), 3 ml nước khử khoáng và 3 ml methanol Sấy khô chân không cột trong 10 phút Chất phân tích được rửa giải bằng 2 ml dung dịch acid formic 2% trong acetonitrile 80% Bay hơi dịch rửa giải bằng dòng khí nitrogen ở 45oC Hòa tan cắn bằng

50 μl pha động (dung dịch acetonitrile và ammonium formate 250 mM tỉ lệ 1:1)

Proenca P [28]xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml máu hoặc 1 ml nước tiểu thêm 50 µl

chuẩn nội (10 µg/ml) và 2 ml acetonitrile Lắc, ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút Cột chiết pha rắn (Oasis, 3 cc) được rửa với lần lượt 1 ml methanol và 1 ml nước khử khoáng Đưa mẫu qua cột chiết pha rắn Rửa cột với 1 ml đệm phosphate pH 7,1 ml nước khử khoáng và 1 ml methanol Sau khi làm khô 10 phút trong chân không, rửa giải cột với 1,5

ml acetonitrile/water/TFA (84:14:2, v/v/v) Dịch rửa giải được bay hơi đến cắn dưới dòng

khí nitrogen ở 40oC Cắn được hòa tan trong 100 µl methanol và bơm 10 µl vào hệ thống LC-ESI-MS.

Kyoko KATO, P Paixão đều dùng acid perchloric để loại protein [20][26].Tuy

nhiên, một số công trình khác sử dụng acid trichloracetic để kết tủa protein trong mẫu huyết tương [7][17][24][30] rất đơn giản và cho hiệu quả cao vì vậy có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị xét nghiệm

Phương pháp này được Rai M.K và cộng sựáp dụng để định lượng PQ trong máu,

nước tiểu và sữa mẹ Thêm 1 ml dung dịch EDTA 5% và 1ml acid trichloracetic 1% vào

để loại sự ảnh hưởng của các ion kim loại và loại protein Ly tâm 1850 vòng/phút trong

10 phút Lấy phần dịch trong ở trên đem đo quang [30]

Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml được thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1) Lắc xoáy, li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút Lấy dịch trong phần trên đi đo quét bước sóng từ 200 đến 300 nm [24]

Arys K [7]xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml (hoặc 1 g) mẫu, thêm 50 µl chuẩn nội và

thêm nước vừa đủ 4 ml Tủa protein bằng acid trichloroacetic là bước làm sạch đầu tiên của các mẫu máu, gan, thận Thêm 1,5 ml dung dịch acid trichloroacetic 25%, lắc 10 phút,

ly tâm 400 vòng/phút trong 5 phút Sau khi chuyển dịch trong ở trên sang ống nhựa sạch, phần tủa protein phía dưới được hòa tan lại bằng 2,5 ml dung dịch acid trichloroacetic 5%, lắc 10 phút, ly tâm 1100 vòng/phút trong 5 phút, gộp phần dịch trong lại, chuyển sang ống silan hóa Tuy nhiên ở một số trường hợp đã được chứng minh cần thêm bước ly tâm nữa (2200 vòng/phút trong 10 phút) để thu được phần dịch sạch hoàn toàn Đối với nước tiểu và dịch dạ dày, bước loại protein có thể bỏ qua và làm ngay bước tiếp theo là khử PQ bằng natri borohydride Điều chỉnh pH của dung dịch đến pH lớn hơn 10 bằng 1 ml NaOH 1M (đối với nước tiểu và dịch dạ dày) hoặc 1 ml NaOH 5M (đối với các mẫu khác) Sau đó, thêm 250 mg bột NaBH4 và lắc ở 60oC trong 25 phút Sau khi làm mát ở nhiệt độ phòng, chiết dung dịch với 8 ml diethyl ether bằng máy trong 15 phút Sau khi ly tâm (1100 vòng/phút trong 10 phút), chuyển lớp hữu cơ phía trên sang ống silan hóa hình nón Bay hơi dịch chiết đến khô bằng dòng khí nitrogen Cắn được hòa tan trong 60 µl pha động (dung dịch A : dung dịch B là 50:50, v/v) và tiêm 50 µl vào hệ thống HPLC

Theo nghiên cứu của Shuuji Hara và cộng sự [17]chỉ cần lấy 200 µl huyết thanh

trộn với 20 µl dung dịch nội chuẩn (10 µg/ml) và 120 µl TCA 10% và lắc xoáy trong 20 giây, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút Sau đó, lấy 20 µl dịch nổi ở trên bơm vào máy

Tóm lại, tổng quan tài liệu tham khảo cho thấy việc định lượng PQ trong mẫu huyết tương chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp HPLC Trong đó mẫu huyết tương được loại bỏ protein bằng cách kết tủa với TCA và định lượng trên hệ HPLC cột tách C8 dung môi pha độngtheo thể tích (5:95) gồm ACN – Đệm photphat pH=2,5 gồm (natri heptanesulfonate;KCl;PEG; triethylamine; MeOH)

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Để xây dựng và xác định giá trị sử dụng củaphương pháp phân tích PQ trong huyết tương người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng sau:

- Mẫu trắng: là huyết tương người của viện Huyết học và truyền máu trung ương

- Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm lượng xác định PQ tạo thành mẫu

- Mẫu thử: là huyết tương bệnh nhân ngộ độc PQ thu được từ mẫu máu, ly tâm lấy phần huyết tương

2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị

- KCl tinh thể, độ tinh khiết: 99,5% của hãng Merck

- Acid trichloroacetic tinh khiết 98,5% của hãng Merck

- Acid phosphoric (H3PO4) đặc (d=1,685 g/cm3) của hãng Merck

- Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu của hãng Merck và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.)

- Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá

- Dung dịch đệm pha động pH = 2,5 được chuẩn bị bằng cách sau: gồm 1,1 g natri heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 200 ml MeOH; 0,5 ml triethylamine thêm nước xấp xỉ 1000 ml Điều chỉnh pH của pha động bằng H3PO4 đến các giá trị pH mong muốn Định mức vừa đủ 1000 ml bằng nước deion

- Pha dung dịch chuẩn gốc PQ: Hòa tan 100 mg chất chuẩn paraquat dichloride (C12H14Cl2N2.xH2O), hòa tan trong 100 ml nước để được dung dịch gốc Từ đó pha thành các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,1 - 20 µg/ml trong nước Trộn các nồng độ dung dịch chuẩn thứ cấp với huyết tương trắng để có nồng độPQ 0,02 - 10 µg/ml để khảo sát và xác định giá trị sử dụng của phương pháp

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ

• Thiết bị

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, gồm bơm trộn dung môi gradient áp suất cao, bộ đuổi khí trực tuyến bằng chân không, buồng ổn nhiệt, thiết bị tiêm mẫu tự động, detector mảng Diode (DAD), thư viện phổ độc chất sử dụng detector mảng Diode, máy tính, máy in.

- Cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm)

- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ đọc của cân 0,0001 g

- Bể siêu âm Model: S30/H Hãng ELMA, Đức

- Máy đo pH Meter 744, giá trị đọc ± 0,01, khoảng đo pH = 0,00 – 14,00

- Máy ly tâm Universal 320 hãng Hettich, Đức, tốc độ tối đa 4000 vòng/phút

- Máy lắc xoáy model: 3005 của hãng GFL, Đức

- Tủ sấy model: 500 của hãng Memmert, Đức

- Máy cất nước hai lần Model: A4000D/Aquatron hãng Stuart - Barloworld Scientific, 4 l/h, Anh

- Bộ lọc nước siêu sạch Model: WaterPro PS/HPLC/UF hybrid - Labconco, 115V, 60Hz, Mỹ

• Dụng cụ

- Bình định mức dung tích: 5, 10, 25, 50, 100 ml

- Pipetman các loại từ 0 - 1000 µl

- Bộ lọc dung môi của hãng Agilent, Mỹ

- Ống nghiệm lấy máu chứa EDTA và ống nghiệm có nút xoáy

Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sau đó tráng bằng MeOH và để khô, tráng n-hexan 3 lần sau đó sấy ở 105oC trong vòng 1 giờ, lấy ra để nguội trước khi sử dụng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat.

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn

Theo như tính chất đã biết của paraquat dichloride là tan tốt trong nước và ít tan trong dung môi hữu cơ như EtOH, MeOH… Tham khảo các tài liệu và so sánh về độ phân cực của nước và các dung môi, chúng tôi lựa chọn nước để hòa tan PQ vì nước không độc hại, thân thiện với môi trường hơn EtOH, MeOH

2.3.1.2 Phương pháp tách PQ từ huyết tương

Dựa theo tính chất lý hóa của PQ, theo các tài liệu đã công bố và trang thiết bị phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện để tách PQ từ huyết tương như sau:

Với 1 ml mẫu huyết tương, thêm dung dịch TCA để loại protein, lắc xoáy và ly tâm với nồng độ dung dịch TCA thay đổi là: 2,0%; 4,0%; 5,0%; 6,0% và thời gian lắc xoáy:

30 giây, 1 phút, 2 phút

2.3.1.3 Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ trong huyết tương

Để đánh giá khả năng tách PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương, các mẫu chuẩn chiết

PQ trong nền mẫu được chuẩn bị bằng cách cho TCA, lắc xoáy, ly tâm, lọc rồi chạy sắc

ký Dựa trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù hợp của điều kiện đo

* Cột sắc ký: Cột tách có vai trò quan trọng trong việc quyết định quá trình tách có

độ phân giải tốt hay không [3] Để chọn loại pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích Dựa trên khảo sát các tài liệu tham khảo và điều kiện cơ sở vật chất sẵn có tại Trung tâm Chống độc, chúng tôi sử dụng cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm) trong nghiên cứu này

* Bước sóng (λ): là cực đại hấp thụ của PQ trong mẫu thử, xác định cực đại hấp thụ của PQ dựa vào phổ hấp thụ UV trong khoảng 210 - 400 nm theo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector DAD

* Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm mẫu từ 10 - 50 µl

* Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các hệ pha động có khả năng tách, thời gian lưu phù hợp và cho các pic cân đối thuận lợi cho phân tích định lượng gồm các hệ pha động sau:

- Hệ A: Kênh 1 là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125M trong nước và kênh 2 là dung dịch NaOH 0,0125M trong methanol Tốc độ dòng 0,5 ml/phút Tỷ lệ thể tích 2 kênh tương ứng là 90 : 10

- Hệ B: Gồm kênh 1 là ACN kênh 2 là dung dịch đệm pH = 3 (10:90, v/v) Thành phần đệm gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900

ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine

- Hệ C: ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) pH = 2,5 gồm 1,1 g natri heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 0,5 ml triethylamine; 200 ml MeOH thêm nước xấp xỉ 1000 ml Điều chỉnh pH bằng H3PO4 đặc Định mức vừa đủ

1000 ml bằng nước deion

* Sau khi chọn được hệ dung môi pha động phù hợp chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần của pha động Giá trị pH pha động cũng được khảo sát trong khoảng từ 2,5 đến 4,5

* Khảo sát thành phần dung dịch đệm: nồng độ natri heptanesulfonate, KCl

&polyethylenglycol

* Tốc độ dòng: thay đổi tốc độ pha động từ 0,2 - 0,8 ml/phút để xác định được tốc

độ phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu

* Các kết quả thu được ứng với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu của các chất phân tích (tR), độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS) Phương pháp đánh giá này dựa trên lý thuyết Van Deemter sao cho 0,9 < AS< 1,2, tR của các chất phải không quá lớn nhưng đảm bảo phải tách xa nhau

2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương

2.3.2.1 Tính chọn lọc

Chuẩn bị mẫu huyết tương trắng không có PQ và mẫu huyết tương trắng có PQ Tiến hành xử lý và phân tích mẫu, đánh giá hiệu quả tách PQ ra khỏi nền mẫu

2.3.2.2 Khoảng nồng độ tuyến tính

Chuẩn bị các mẫu huyết tương trắng, thêm PQ để thu được các mẫu chuẩn có nồng

độ PQ từ 0,02 - 10 µg/ml Chúng tôi xây dựng đường chuẩn với 8 nồng độ PQ được them vào mẫu huyết tương trắng lần lượt là 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 và 10 µg/ml Sau đó

xử lý mẫu và tiến hành phân tích

2.3.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Tiến hành xử lý các mẫu huyết tương trắng và mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 0,01

- 0,1 µg/ml và phân tích trên hệ thống HPLC, tính độ lệch chuẩn của phương trình hồi quy và xác định LOD theo quy tắc 3ϭ, LOQ theo quy tắc 10 ϭ

2.3.2.4 Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại)

- Độ đúng: chuẩn bị các mẫu PQ trong huyết tương trắng ở5 nồng độ khác nhau,

mỗi nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký rồi so sánh giá trị trung bình giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị chất thêm vào trong mẫu

- Độ lặp lại:

+ Độ lặp lại trong ngày: chuẩn bị các mẫu PQ trong huyết tương trắng ở 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký như phần độ đúng, đánh giá độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu theo từng nồng độ

+ Độ lặp lại khác ngày : tiến hành tương tự như trên nhưng làm ở 5 ngày khác nhau

2.3.2.5 Độ ổn định

Xác định độ ổn định của chất phân tích trong dịch sinh học trong thời gian phân tích và thời gian bảo quản

- Độ ổn định trong thời gian phân tích: chuẩn bị 3 mẫu PQ nồng độ 1 µg/ml trong

huyết tương, xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký ngay và tiếp tục cứ mỗi giờ 1 lần trong vòng

5 giờ, xác định RSDr

- Độ ổn định trong thời gian bảo quản: chuẩn bị 3 mẫu như trên, lấy 1 phần ra xử

lý và tiến hành sắc ký ngay, phần còn lại bảo quản ở -30oC trong 21 ngày Lấy các mẫu đang bảo quản ra để xử lý và tiến hành sắc ký ngay vào các ngày thứ 7, 14 và 21

2.3.3.Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng

bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ

2.3.3.1 Đối tượng nghiên cứu

31 bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2015

Chẩn đoán ngộ độc PQ dựa vào: bệnh nhân có 1 trong 2 tiêu chuẩn:

- Bệnh nhân uống thuốc trừ cỏ PQ và có biểu hiện lâm sàng ngộ độc PQ

- Xét nghiệm định tính độc chất nước tiểu tìm thấy PQ

2.3.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân

- Bệnh nhân có tiền sử bệnh phổi, thận, gan

- Những bệnh nhân ngộ độc đồng thời các chất độc khác

Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu loạt ca bệnh.

Tiến hành nghiên cứu:

* Thu thập các số liệu bệnh nhân khi nhập viện từ bệnh án (theo đánh giá của bác

sĩ điều trị):

- Tên loại thuốc trừ cỏ có PQ, hàm lượng PQ trong thuốc trừ cỏ, lượng PQ uống, thời gian đến viện, thời gian bắt đầu điều trị

- Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng.

- Điều trị lọc máu hấp phụ được áp dụng

- Các điều trị khác: than hoạt, ức chế miễn dịch, liệu pháp lipid

Các số liệu này được dùng trong đánh giá hiệu quả điều trị và mức độ nhiễm độc

* Lấy mẫu định lượng PQ huyết tương khi vào viện, trước và sau các lần lọc máu hấp phụ:

- Tiến hành lấy máu bệnh nhân ngộ độc PQđiều trị tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai ngay vào viện khi được chẩn đoán xác định ngộ độc PQ Các bệnh nhân lọc máu hấp phụ được lấy máu ngay trước và sau lọc Lấy máu tĩnh mạch cánh tay vào ống nghiệm có chứa EDTA, ly tâm lấy huyết tương

- Mẫu huyết tương được xử lý và phân tích bằng phương pháp HPLC đã xây dựng Mỗi mẫu được phân tích lặp lại 3 lần (n=3), tính kết quả trung bình Phương pháp định lượng là phương pháp đường chuẩn

- Kết quả nồng độ PQ trong mẫu (µg/ml) trong dung dịch thử được tính dựa vào đường chuẩn

* Thu thập kết quả điều trị Tỷ lệ tử vong tại viện, sau 3 tháng: ghi số điện thoại của BN và người nhà, gọi điện thoại xác định tình trạng BN sống/tử vong sau 3 tháng

Các chỉ số nghiên cứu chính:

* Tỷ lệ tử vong sau 3 tháng

* Nồng độ PQ huyết tương khi vào viện, dùng nồng độ này tính điểm SIPP sửa đổi (severity index of PQ poisoning: chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ) – liên quan tỉ lệ tử vong.SIPP = [nồng độ PQ huyết tương (µg/ml)]× [thời gian từ khi uống đến bắt đầu định lượng

(h)]

* Hiệu quả lọc PQ của lọc máu hấp phụ (HP) (dựa vào nồng độ PQ huyết tương trước và sau các lần lọc máu hấp phụ)

*Xử lý số liệu: bằng phần mềm SPSS for Windows 16.0 Số liệu được trình bày

dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn, hoặc trung vị và tứ phân vị nếu phân bố không chuẩn, đánh giá giá trị tiên lượng tử vong của nồng độc Paraquat vào viện bằng cách tính diện tích dưới đường ROC, so sánh giá trị nồng độc Paraquat giá trị trước sau điều trị bằng test Wilcoxon

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu năng cao

3.1.1 Xác định bước sóng phát hiện chất phân tích với detector DAD

Detector là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký chảy ra một cách liên tục Nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích [4] Paraquat là chất có tính hấp thụ quang tốt trong vùng UV do đó detector DAD (Diode - Array Detector) rất tốt cho việc định tính và định lượng chất phân tích

Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã kiểm tra phổ hấp thụ ánh sáng của PQ trong dải bước sóng 210 tới 400 nm trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 với detector DAD

Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV của PQKết quả trên cho thấy PQ hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng 259nm Do đó chúng tôi chọn bước sóng phát hiện chất phân tích đối với PQ là 259 nm

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột

Trên thực tế, một trong những khó khăn của phép tách sắc ký là: sự doãng chân pic dẫn đến hiện tượng chồng pic, trong đó thể tích bơm mẫu vào cột cũng là một nguyên nhân gây ra hiện tượng này; nếu lượng mẫu bơm vào cột quá lớn dẫn đến hiện tượng một phần mẫu vào cột tách trước, một phần ra sau dẫn đến trong quá trình tách trên cột sẽ có một phần chất phân tích ra trước và một phần ra sau gây ra hiện tượng doãng chân pic Tuy nhiên, nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số sẽ rất lớn Hệ thống HPLC Agilent

1200 có trang bị bộ phận tiêm mẫu tự động do đó chúng tôi tiến hành khảo sát để lựa chọn thể tích mẫu tiêm vào cột sao cho hiệu quả tách là tốt nhất Thể tích tiêm mẫu được khảo sát giới hạn trong khoảng 10 µl đến 50 µl Quá trình khảo sát được thực hiện trong điều kiện cố định như sau: sử dụng pha động là ACN – dung dịch đệm pH 2,5 (5:95, v/v) với tốc độ dòng là 0,5 ml/phút, PQ có nồng độ 5,0 µg/ml

Hình 3.2: Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫua: 10 µl, b: 20 µl, c: 30 µl, d: 40 µl, e: 50 µl

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫuThể tích tiêm mẫu (µl) Thời gian lưu(phút) AS

3.1.3 Khảo sát lựa chọn loạipha động

Khảo sát khả năng phân tách PQ trong huyết tương trắng với các hệ pha động chuẩn bị như trong mục 2.3.1.3 Sắc đồ quá trình tách PQ ra khỏi nền mẫu khi sử dụng các hệ khác nhau thu được ở hình 3.3, hình 3.4, hình 3.5

Hình 3.3: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi A (dung dịch NaOH 0,0125M trong nước

và dung dịch NaOH 0,0125M trong methanol theo tỷ lệ 90:10, v/v)

Hình 3.4: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi B(ACN và dung dịch đệm pH = 3 tỷ lệ 10:90, v/v)

Hình 3.5: Sắcđồ phân tích PQ với hệ dung môi C(ACN -dung dịch đệm tỷ lệ 5:95, v/v)

Kết quả khảo sát cho thấy sử dụng hệ pha động ACN - đệm (5:95, v/v) pha tĩnh cột C8 là phù hợp nhất, có khả năng tách tốt và chọn lọc đối với PQ trong huyết tương,

cho pic cân đối và có thời gian lưu hợp lý Do vậy trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cột C8 và chọn hệ dung môi ACN - Đệm (5:95, v/v) làm pha động.

3.1.4 Khảo sátthành phần pha động

Thành phần pha động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách chất Pha động có thể ảnh hưởng tới những vấn đề sau trong phép tách sắc ký:

- Độ chọn lọc của hệ pha

- Thời gian lưu trữ của chất tan

- Hiệu lực cột tách (đại lượng Nef)

- Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh

- Độ rộng của pic sắc ký

Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao thường là nước có trộn với một số dung môi hữu cơ để thu được dung dịch có độ phân cực từ cao tới thấp, phù hợp với quá trình tách Căn cứ theo tài liệu số [3] ta có chỉ số độ phân cực của nước là 10,2 đơn vị, của ACN là 5,8 đơn vị, từ đó ta tính được độ phân cực của các hệ dung dịch pha động ACN

và đệm ứng với các tỷ lệ thể tích khác nhau từ 3:97, 5:95, 10:90, 15:85 và 20:80 Công thức tính độ phân cực là:

PI = %V i x PI i / 100 (CT 2)Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng C7H15SO3- để tạo phức liên hợp ion với ion PQ2+, phức chất này là chất không phân cực Trong khi đó, pha tĩnh được chọn cũng là cột pha đảo kém phân cực, vậy pha động dùng để tách phải có độ phân cực vừa phải thì quá trình tách mới tối ưu

Kết quả khảo sát được cho trong bảng 3.2

Hình 3.6: Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ pha động ACN : Đệm %v/va: 20:80; b: 15:85; c: 10:90; d: 5:95; e: 3:97 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của tỉ lệ pha động tới độ phân cực, thời gian lưu, hệ số đối xứng pic

Tỉ lệ pha động (ACN: Đệm, v/v)

PI (đơn vị)

Thời gian lưu

(phút)

AS

-10 : 90 9,18 8,60 7,36

“-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu

Kết quả cho thấy khi tăng thành phần ACN trong pha động độ phân cực của pha động giảm, thời gian lưu ngắn hơn Ở tỷ lệ thể tích 15:85 và 20:80, độ phân cực của pha động thấp, làm cho PQ không tách ra khỏi nền mẫu Ở tỷ lệ 10:90, đã tách được PQ ra khỏi nền mẫu tuy nhiên tín hiệu đo thấp và pic không cân đối Khi độ phân cực của dung dịch pha động tăng, chất bị giữ trong cột lâu làm cho thời gian lưu tăng dài, pic doãng Ở

tỷ lệ 5:95, pic chất cân đối AS: 0,87, thời gian lưu ngắn hơn, pic tách tốt ra khỏi nền mẫu

Do đó, chúng tôi chọn tỷ lệ thể tích 5:95 là điều kiện tối ưu

3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng pH của pha động

Sau khi chọn được hệ dung môi pha động phù hợp là ACN - đệm tỷ lệ 5:95, chúng tôi khảo sát lại pH của pha động Trong sắc ký lỏng pha đảo RP - HPLC, pH có vai trò quan trọng, nó ảnh hưởng tới dạng tồn tại của chất phân tích, dạng tồn tại thay đổi thì thời gian lưu trữ chất phân tích trên cột cũng thay đổi Do đó phải lựa chọn pH cho phù hợp với quá trình tách và sự an toàn của cột tách Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn khảo sát pH trong khoảng từ 2,5 tới 4,5 Vì PQ có pKa ~ 9 – 9,5 trong nước nên cần duy trì pH < pKa để PQ tồn tại ở dạng ion dương RN+H, tạo liên hợp ion với natri heptanesulfonate Tiến hành khảo sát tại các pH khác nhau sử dụng pha động

là ACN - đệm (5:95, v/v) với tốc độ dòng là 0,5 ml/phút, PQ có nồng độ 5 µg/ml, thể tích bơm mẫu là 30 µl

Kết quả khảo sát các giá trị pH được cho trong bảng sau:

Hình 3.7: Sắc đồ khảo sát ảnh hưởng của pHa: pH=4,5; b: pH=4,0; c: pH=3,5; d: pH=3,0; e: pH=2,5

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH tới thời gian lưu, hệ số đối xứng pic

pH Thời gian lưu

-3,50 12,36

“-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu

Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH pha động ở bảng trên, chúng tôi nhận thấy:Tại giá trị pH = 2,5, pic sắc nét và khá ổn định Thời gian lưu thấp hơn so với các giá trị pH khác, hệ số đối xứng và độ phân giải tương đối ổn định Khi pH tăng, các pic bị tách đỉnh dẫn tới pic không cân đối và độ rộng pic lớn, do ion PQ2+ bị chuyển thành dạng PQ(OH)2 (N+ trong phân tử PQ kết hợp với OH-) trong dung dịch pha động, vì vậy làm giảm khả năng tạo cặp ion với C7H15SO3- và khả năng hấp thụ ánh sáng của PQ

Do đó, để các pic tách nhau rõ ràng, tiết kiệm thời gian phân tích, và bảo vệ tuổi thọ của cột, chúng tôi chọn pH=2,5 cho pha động và giữ ổn định cho các khảo sát tiếp theo

3.1.6 Khảo sát thành phần dung dịch đệm

Sau khi chọn được pH của dung dịch đệm, chúng tôi tiếp tục khảo sát nồng độ của các chất trong dung dịch đệm Thành phần của các chất trong dung dịch đệm khác nhau thì khả năng tách chất của pha động là khác nhau Do đó thành phần của dung dịch đệm ảnh hưởng rất lớn tới quá trình rửa giải chất phân tích ra khỏi cột Vì vậy, phải tối ưu hóa nồng độ các chất trong dung dịch đệm để sự tách hiệu quả hơn Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn khảo sát 3 yếu tố chính: natriheptanesulfonate, PEG và KCl

3.1.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ natriheptanesulfonate

Trong nghiên cứu này, chất phân tích PQ là một cation, do đó natri heptanesulfonate được sử dụng để tạo cặp ion với chất phân tích PQ Liên kết này giúp cho chất phân tích được giữ lại trong cột mà không bị rửa giải ngay sau khi được bơm vào cột Nồng độ của natri heptanesulfonate ảnh hưởng lớn tới hiệu quả tách và thời gian lưu của chất,do đó phải khảo sát và chọn nồng độ tối ưu Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát nồng độ của natriheptanesulfonate trong khoảng 1 tới 1,25 % Các khảo sát được thực hiện ở điều kiện : sử dụng pha động là ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) với tốc độ dòng là 0,5 ml/phút, thể tích bơm mẫu là 30 µl