Phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tửW10.2E42

Phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tửW10.2E42 Bộ tài liệu sưu tập gồm nhiều Bài tập THCS, THPT, luyện thi THPT Quốc gia, Giáo án, Luận văn, Khoá luận, Tiểu luận…và nhiều Giáo trình Đại học, cao đẳng của nhiều lĩnh vực: Toán, Lý, Hoá, Sinh…. Đây là nguồn tài liệu quý giá đầy đủ và rất cần thiết đối với các bạn sinh viên, học sinh, quý phụ huynh, quý đồng nghiệp và các giáo sinh tham khảo học tập. Xuất phát từ quá trình tìm tòi, trao đổi tài liệu, chúng tôi nhận thấy rằng để có được tài liệu mình cần và đủ là một điều không dễ, tốn nhiều thời gian, vì vậy, với mong muốn giúp bạn, giúp mình tôi tổng hợp và chuyển tải lên để quý vị tham khảo. Qua đây cũng gởi lời cảm ơn đến tác giả các bài viết liên quan đã tạo điều kiện cho chúng tôi có bộ sưu tập này. Trên tinh thần tôn trọng tác giả, chúng tôi vẫn giữ nguyên bản gốc.Trân trọng.ĐỊA CHỈ DANH MỤC TẠI LIỆU CẦN THAM KHẢOhttp:123doc.vntrangcanhan348169nguyenductrung.htmhoặc Đường dẫn: google > 123doc > Nguyễn Đức Trung > Tất cả (chọn mục Thành viên)DANH MỤC TẠI LIỆU ĐÃ ĐĂNGA.HOÁ PHỔ THÔNG1.CHUYÊN ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC HÓA HỮU CƠ PHẦN 1, PDF2.CHUYÊN ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC HÓA HỮU CƠ PHẦN 1, Word3.CHUYÊN ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC HÓA HỮU CƠ PHẦN 2. PHẦN HỢP CHẤT CÓ NHÓM CHỨC4.CHUYÊN ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC HÓA HỌC VÔ CƠ PHẦN 1. CHUYÊN Đề TRÌNH HÓA VÔ CƠ 10 VÀ 115.CHUYÊN ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC HÓA HỮU CƠ PHẦN 2. PHẦN HỢP CHẤT CÓ NHÓM CHỨC6.BỘ ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC MÔN HÓA HỌC 1407.BỘ ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC MÔN HÓA HỌC 41708.ON THI CAP TOC HỌC HÓA HỮU CƠ PHẦN 1, PDF9.TỔNG HỢP KIẾN THỨC HÓA HỌC PHỔ THÔNG10.70 BỘ ĐỀ LUYỆN THI ĐẠI HỌC MÔN HÓA HỌC, word11.CHUYÊN ĐỀ VÔ CƠ, LỚP 11 – 12. ĐẦY ĐỦ CÓ ĐÁP ÁN12.Bộ câu hỏi LT Hoá học13.BAI TAP HUU CO TRONG DE THI DAI HOC14.CAC CHUYEN DE LUYEN THI CO DAP AN 4815.GIAI CHI TIET CAC TUYEN TAP PHUONG PHAP VA CAC CHUYEN DE ON THI DAI HOC. 8616.PHUONG PHAP GIAI NHANH BAI TAP HOA HOC VA BO DE TU LUYEN THI HOA HOC 27417.TỔNG HỢP BÀI TẬP HÓA HỌC LỚP 1218.PHAN DANG LUYEN DE DH 20072013 14519.BO DE THI THU HOA HOC CO GIAI CHI TIET.doc20.Tuyển tập Bài tập Lý thuyết Hoá học luyện thi THPT Quốc gia21.PHÂN DẠNG BÀI TẬP HOÁ HỌC ÔN THI THPT QUỐC GIA 5722.BỘ ĐỀ LUYỆN THI THPT QUỐC GIA MÔN HOÁ CÓ ĐÁP ÁN 29 ĐỀ 14523.BỘ ĐỀ LUYỆN THI THPT QUỐC GIA MÔN HOÁ CÓ ĐÁP ÁN PHẦN 2B.HỌC SINH GIỎI1.Bồi dưỡng Học sinh giỏi Hoá THPT Lý thuyết và Bài tập2.Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm thực hành học sinh giỏiolympic Hoá học 543.CHUYÊN ĐỀ BỒI DƯỠNG HỌC SINH GIỎI HOÁ LÝ THUYẾT VÀ BÀI TẬP 174.ĐỀ THI CHUYÊN HOÁ CÓ HƯỚNG DẪN CHI TIẾT PHẦN ĐẠI CƯƠNG VÔ CƠ 5.Tuyển tập Đề thi Bồi dưỡng Học sinh giỏi Hoá THCS Lý thuyết và Bài tập6.Chuyên đề Bồi dưỡng HSG Hoá học, 12 phương pháp giải toán7.Hướng dẫn thực hành Hoá Hữu cơ Olympic hay dành cho sinh viên đại học, cao đẳngC. HOÁ ĐẠI HỌC, SAU ĐẠI HỌC1.ỨNG DỤNG CỦA XÚC TÁC TRONG HÓA HỮU CƠ2.CƠ CHẾ PHẢN ỨNG TRONG HÓA HỮU CƠTIỂU LUẬN3.TL HÓA HỌC CÁC CHẤT MÀU HỮU CƠ4.GIÁO TRÌNH HÓA HỮU CƠ DÀNH CHO SINH VIÊN CĐ, ĐH, Hóa học Hữu cơ, tập 1 của tác giả Đỗ Đình RãngHóa học Hữu cơ, tập 2 của tác giả Đỗ Đình RãngHóa học Hữu cơ, tập 3 của tác giả Đỗ Đình RãngHóa học Hữu cơ, tập 1 của tác giả Thái Doãn TĩnhHóa học Hữu cơ, tập 2 của tác giả Thái Doãn TĩnhHóa học Hữu cơ, tập 3 của tác giả Thái Doãn TĩnhCơ chế Hóa học Hữu cơ, tập 1 của tác giả Thái Doãn TĩnhCơ chế Hóa học Hữu cơ, tập 2 của tác giả Thái Doãn TĩnhCơ chế Hóa học Hữu cơ, tập 3 của tác giả Thái Doãn Tĩnh5.VAI TRÒ SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT VÔ CƠ 446.BÀI TẬP NHIỆT ĐỘNG LỰC HỌC 407.Giáo trình Hoá học phân tích8.Giáo trình Khoa học môi trường. http:baigiang.violet.vnpresentshowentry_id4897549.Giáo trình bài tập Hoá Hữu cơ 110.Giáo trình bài tập Hoá Hữu cơ 211.Giáo trình bài tập Hoá Phân tích 112.Thuốc thử Hữu cơ13.Giáo trình môi trường trong xây dựng14.Bài tập Hóa môi trường có đáp án đầy đủ nhất dành cho sinh viên Đại họcCao đẳng15.Mô hình, mô hình hóa và mô hình hóa các quá trình môi trường16.Cây trồng và các yếu tố dinh dưỡng cần thiết17.Đất đồng bằng và ven biển Việt Nam18.Chất Hữu cơ của đất, Hóa Nông học19.Một số phương pháp canh tác hiện đại,Hóa Nông học20.Bài tập Hoá Đại cương có giải chi tiết dành cho sinh viên Đại học21.Hướng dẫn học Hoá Đại cương dành cho sinh viên ĐH, CĐ22.Bài giảng Vai trò chất khoáng đối với thực vật PP23.Giáo trình Thực hành Hoá vô cơ dành cho sinh viên ĐH, CĐ24.Bài tập Vô cơ dành cho sinh viên Đại học, Cao đẳng có giải chi tiết25.Bài tập Vô cơ thi Olympic dành cho sinh viên Đại học, Cao đẳng có giải chi tiết26.Bài giảng Hoá học Phức chất hay và đầy đủ27.Bài giảng Hoá học Đại cương A1, phần dung dịch28.Bài tập Hoá lý tự luận dành cho sinh viên có hướng dẫn đầy đủ29.Bài tập Hoá lý trắc nghiệm dành cho sinh viên có đáp án đầy đủ30.Khoá luận Tốt nghiệp bài tập Hoá lý31.Giáo trình Hoá Phân tích dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng32.Bài giảng Điện hoá học hay dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng33.Bài tập Hoá học sơ cấp hay dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng34.Bài giảng phương pháp dạy học Hoá học 135.Bài giảng Công nghệ Hoá dầu36.Hóa học Dầu mỏ và Khí37.Bài tập Hóa dầu hay có hướng dẫn chi tiết dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng38.Bài tập Công nghệ Hóa dầu, công nghệ chế biến khi hay có hướng dẫn chi tiết dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng39.Bài giảng Hóa học Dầu mỏ hay dành sinh viên Đại học, cao đẳng40.Hướng dẫn thực hành Hoá Hữu cơ hay dành cho sinh viên đại học, cao đẳng41.Phụ gia thực phẩm theo quy chuẩn quốc gia42.Hướng dẫn thực hành Hoá Vô cơRC0 Các phản ứng Hoá học mang tên các nhà khoa học hay dành cho sinh viên43.Bài tập trắc nghiệm Hoá sinh hay dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng44.Bài tập Hoá học Hữu cơ có giải chi tiết dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng P145.Bài giảng Hoá học Hữu cơ 1 powerpoint hay46.Bài tập cơ chế phản ứng Hữu cơ có hướng dẫn chi tiết dành cho sinh viên47.Bài giảng Hoá học Hữu cơ dành cho sinh viên48.Bài tập Hoá sinh học hay có đáp án dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng49.Hoá học hợp chất cao phân tử50.Giáo trình Hoá học Phức chất dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng51.Bài giảng Hoá học Đại cương dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng52.Bài giảng Cơ sở Lý thuyết Hoá Hữu cơ dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng53.Bài giảng Hoá Hữu cơ dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng phần Hidrocacbon54.Bài giảng Hoá Hữu cơ dành cho sinh viên Đại học, cao đẳng phần dẫn xuất Hidrocacbon và cơ kim55.Bài giảng Hoá học Hữu cơ file word đầy đủ và hay nhấtD.HIỂU BIẾT CHUNG1.TỔNG HỢP TRI THỨC NHÂN LOẠI2.557 BÀI THUỐC DÂN GIAN3.THÀNH NGỬCA DAO TỤC NGỬ ANH VIỆT4.CÁC LOẠI HOA ĐẸP NHƯNG CỰC ĐỘC5.GIAO AN NGOAI GIO LEN LOP6.Điểm chuẩn các trường năm 2015E.DANH MỤC LUẬN ÁNLUẬN VĂNKHOÁ LUẬN…1.Công nghệ sản xuất bia2.Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong hạt tiêu đen3. Giảm tạp chất trong rượu4.Tối ưu hoá quá trình điều chế biodiesel5.Tinh dầu sả6.Xác định hàm lượng Đồng trong rau7.Tinh dầu tỏi8.Tách phẩm mầu9.Một số phương pháp xử lý nước ô nhiễm10.Tinh dầu HỒI11.Tinh dầu HOA LÀI12.Sản xuất rượu vang13.Vấn đề mới và khó trong sách Giáo khoa thí điểm14.Phương pháp tách tạp chất trong rượu15.Khảo sát hiện trạng ô nhiễm arsen trong nước ngầm và đánh giá rủi ro lên sức khỏe cộng đồng16.REN LUYEN NANG LUC DOC LAP SANG TAO QUA BAI TAP HOA HOC 10 LV 15117.Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật tomhum18.Chọn men cho sản xuất rượu KL 4019.Nghiên cứu sản xuất rượu nho từ nấm men thuần chủng RV 4020.NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN21.LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHẾ TẠO KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH ĐIỆN HOÁ CỦA ĐIỆN CỰC 2122.NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI UVARIA L. HỌ NA (ANNONACEAE)23.Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết từ đài hoa bụp giấm file word RE02324.Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong quả mặc nưa25.Nghiên cứu xử lý chất màu hữu cơ của nước thải nhuộm …bằng phương pháp keo tụ điện hóa26.Nghiên cứu và đề xuất hướng giải quyết các vấn đề khó và mới về hoá hữu cơ trong sách giáo khoa hoá học ở Trung học phổ thông27.Nghiên cứu chiết xuất pectin từ phế phẩm nông nghiệp, thực phẩm28.Chiết xuất quercetin bằng chất lỏng siêu tới hạn từ vỏ củ Hành tây29.Thành phần Hóa học và hoạt tính Kè bắc bộ pp30.Nghiên cứu phương pháp giảm tạp chất trong rượu Etylic31.Tối ưu hoá quá trình điều chế biodiesel từ mỡ cá tra với xúc tác KOHγAl2O3 bằng phương pháp bề mặt đáp ứng32.Tối ưu hoá quá trình chiết ANTHOCYANIN từ bắp cải tím33.Chiết xuất và tinh chế CONESSIN, KAEMPFEROL, NUCIFERIN từ dược liệu (Ko) RE03334.Phương pháp tính toán chỉ số chất lượng nước cho một số sông thuộc lưu vực sông Nhuệ sông Đáy 35.Xử lý suy thoái môi trường cho các vùng nuôi tôm (Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ tiến tiến, phù hợp xử lý suy thoái môi trường nhằm sử dụng bền vững tài nguyên cho các vùng nuôi tôm các tỉnh ven biển Bắc bộ và vùng nuôi cá Tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long)36.Đánh giá học sinh dùng lý thuyết tập mờ, W813E0036 (Xây dựng một hệ thống thông tin hỗ trợ đánh giá học sinh dùng lý thuyết tập mờ)37.Công nghệ lên men mêtan xử lý chất thải làng nghề“Nghiên cứu hiện trạng ô nhiễm và công nghệ lên men mêtan nước thải chế biến tinh bột sắn của một số làng nghề thuộc huyện Hoài Đức, Hà Nội”38.Tính chất của xúc tác Fe2O3 biến tính bằng Al2O3(Tổng hợp và tính chất xúc tác của Fe2O3 được biến tính bằng Al2O3 và anion hóa trong phản ứng đồng phân hóa nankan”)39.Tác động môi trường của việc thu hồi đất, Word, 5, E0039 “Đánh giá ảnh hưởng môi trường của việc thu hồi đất tại quận Tây Hồ, Hà Nội” 540.Không gian hàm thường gặp, W8, E40 (“Về một số không gian hàm thường gặp”. 41.Xác định hoạt chất trong thuốc kháng sinh, W 10, E41 (Nghiên cứu xây dựng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng đồng thời một sốhoạt chất có trong thuốc kháng sinh thuộc họ βLactam”42.Phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tửW10.2E42 “Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”F.TOÁN PHỔ THÔNG1.TUYEN TAP CAC DANG VUONG GOC TRONG KHONG GIAN2.Luyện thi THPT Quốc gia môn Toán 500 câu có đáp án3.Phân dạng Luyện thi THPT Quốc gia môn Toán4.Bộ đề Trắc nghiệm Luyện thi THPT Quốc gia môn Toán5.Chuyên đề Trắc nghiệm Luyện thi THPT Quốc gia môn Toán6.Bộ đề Thi thử Trắc nghiệm THPT Quốc gia môn Toán7.Bộ đề kiểm tra trắc nghiệm 1 tiết phút môn Toán lớp 128.Bài tập trắc nghiệm môn toán lớp 12, luyện thi THPT quốc gia tổng hợp rất nhiều P19.Bài tập trắc nghiệm môn toán lớp 12, luyện thi THPT quốc gia tổng hợp rất nhiều P210.Bài tập trắc nghiệm môn toán lớp 12, luyện thi THPT quốc gia tổng hợp rất nhiều P311.Bài tập trắc nghiệm môn toán Giải tích lớp 12, luyện thi THPT quốc gia P1 có đáp án12.Bài tập trắc nghiệm môn toán Giải tích lớp 12, luyện thi THPT quốc gia P213.Phân dạng Bài tập trắc nghiệm môn toán lớp 12, luyện thi THPT quốc gia14.Bài tập trắc nghiệm môn toán Hình học lớp 12, luyện thi THPT quốc gia.15.Bài tập trắc nghiệm môn toán Hình học lớp 12, luyện thi THPT quốc gia có đáp án16.Phân dạng Bài tập trắc nghiệm môn toán Hình học lớp 12, luyện thi THPT quốc gia17.Đề Thi thử Trắc nghiệm THPT Quốc gia môn Toán18.Đề Thi thử Trắc nghiệm THPT Quốc gia môn Toán có đáp án19.Đề Thi thử Trắc nghiệm THPT Quốc gia môn Toán có giải chi tiết20.Ôn tập Toán 12, luyện thi THPT Quốc gia21.Phân dạng bài tập hình học 11 rất hay có giải chi tiết các dạng22.Bài tập trắc nghiêm Toán 1123.Đề trắc nghiệm toán đại số 12 dành cho kiểm tra 1 tiêt, 15 phút có đáp ánG.LÝ PHỔ THÔNG1.GIAI CHI TIET DE HOC SINH GIOI LY THCS

TUYỂN TẬP BÀI TẬP PHỔ THÔNG, ĐẠI HỌC, SAU ĐẠI HỌC

LUẬN ÁN-ĐỒ ÁN-LUẬN VĂN-KHOÁ LUẬN-TIỂU LUẬN

LUẬN VĂN THẠC SĨPHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ

THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

{{{

: Deoxyribonucleotide Triphosphate: Extensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng): Ethambutol.

: Ba loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin: Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin và ethambutol: Isoniazid

: Isopropyl-thio-β-D-galactoside: Kilo base

: Luria - Bertani: Multidrugs resistant (Kháng đa thuốc) : Paraminosalicylic acid

: Pyrazinamid: Polymerase Chain Reaction: Rifampicin

: Acid Ribonucleic : Rifampin resistance determining region (Vùng quyết định kháng rifampicin)

: Thermus aquaticus DNA polymerase

: Tổ chức Y tế Thế giới: Volume (thể tích): 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside

MỞ ĐẦU

Bệnh lao và vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) đã được biết rõ từ một thế kỷ

nay Hiện nay tỷ lệ nhiễm lao được ước tính là 1/3 dân số thế giới, khoảng 9 triệu người mắclao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm Bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơnvới sự xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc (Multi-Drugs Resistant - MDR), tức là thể laovới vi khuẩn kháng ít nhất hai loại thuốc chống lao mạnh nhất là isoniazid (INH) vàrifampicin (RMP) Theo số liệu thống kê của chương trình chống lao Quốc gia năm 2007,thế giới có khoảng 511.000 trường hợp nhiễm lao kháng đa thuốc, trong đó có hơn 130.000trường hợp tử vong Do những khó khăn trong việc điều trị những bệnh nhân mang cácchủng lao kháng thuốc phổ rộng và đa kháng mà việc phát hiện sớm các chủng lao kháng đathuốc sẽ trở nên rất quan trọng trong điều trị bệnh lao

Hiện nay nhiều nơi chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc vẫn dựa vào phương phápnuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ là chủ yếu, tuy nhiên, việc ứng dụng sinh học phân

tử cũng đang tạo ra những đột phá trong phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc Cơ chế khángthuốc ở vi khuẩn lao là do trong quá trình tiến hóa, có nhiều đột biến xuất hiện trong một số

gen chức năng, trước hết là ở gen rpoB và katG Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn chỉ còn

vài ngày, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn.Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn đoán lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loạikháng thuốc là do xuất hiện các đột biến trên gen tương ứng chịu trách nhiệm Chính vì vậyviệc xác định các trường hợp nhiễm lao kháng thuốc thường đi kèm với những chẩn đoánphát hiện đột biến gen đối với các chủng lao phát hiện được Các chủng vi khuẩn lao kháng

isoniazid là do có liên quan tới đột biến tại codon 315 trên gen katG, đối với các chủng

kháng rifampicin do xuất hiện các đột biến ở một vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung

tâm của gen rpoB

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát hiện vi

khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”

Với mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc

thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR.

Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành một số nội dung nghiên cứu nhưsau:

1 Xác định trình tự gen rpoB và katG.

2 Phân tích đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân lập tại

Việt Nam trên cơ sở trình tự nucleotide của hai gen rpoB và katG.

3 Tối ưu hóa thành phần và chu trình bộ kit multiplex real-time PCR phát hiệnnhanh vi khuẩn lao kháng thuốc

vào ngày 24/3/1882 Trong thời gian này ở Mỹ và châu Âu, cứ 7 người thì có 1 người chết vì

lao, do vậy, phát hiện của Robert Koch là một bước ngoặt quan trọng trong việc khống chế

và loại trừ căn bệnh này Trước đây, lao được xem là một trong những căn bệnh truyềnnhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới, lưu hành với tỷ lệ mắc bệnh khá cao, đặc biệt ở cácnước thuộc châu Phi và khu vực châu Á, trong đó có Việt Nam

Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu Trongkhu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philippines về sốbệnh nhân lao, cũng như số bệnh nhân lao xuất hiện hằng năm Hiện nay nguy cơ nhiễm laoở nước ta hằng năm được ước tính là 1,5% dân số (ở các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnhphía Bắc là 1%) Trên thực tế chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5%, nhưvậy, các con số nêu trên còn có thể lớn hơn Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với côngtác phòng chống lao không những trong các năm tới mà có thể trong thời gian khá dài, cóthể đến hàng chục năm, ngay cả khi ở thiên niên kỷ mới [3, 35]

1.2 TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC

Bệnh lao ngày càng trở nên phức tạp và có ảnh hưởng nặng nề khi xuất hiện thêm vikhuẩn lao kháng thuốc tạo nên một dạng bệnh khó phòng chống Các chủng lao kháng thuốcđược chia làm hai thể, đó là lao kháng đa thuốc (Multi-drugs resistant - MDR) và lao khángthuốc phổ rộng (Extensively drug resistant - XDR), những chủng vi khuẩn lao kháng thuốcnày là nguồn lây nhiễm và là mối đe dọa cho sức khỏe của cộng đồng Theo ước tính của Tổchức Y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 42 vạn người mắc lao kháng đa thuốc,chiếm số lượng lớn nhất là ở khu vực Tây Thái Bình Dương có 15 vạn trường hợp, kế đến là

khu vực Đông Nam Á và sau đó là khu vực Châu Phi và Đông Âu Một số chủng lao vừa

kháng đa thuốc vừa kháng thuốc phổ rộng, có thể coi là loại siêu kháng thuốc [17] Tình

hình lao siêu kháng thuốc cũng ngày càng trở nên trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến11/2005, WHO và Trung tâm Kiểm soát Bệnh Hoa Kỳ đã phân tích 17.890 mẫu đờm gửi từ

40 quốc gia trên toàn thế giới, và thấy rằng có 20% trường hợp là kháng đa thuốc và 2%trường hợp là kháng thuốc phổ rộng Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Chương trình Chốnglao Quốc gia thì có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới mang vi khuẩn lao kháng thuốc [1,3]

Vi khuẩn lao kháng thuốc là một thách thức lớn, đe dọa công cuộc phòng chống laotrên toàn cầu, vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao kháng lạinhất là kháng đa thuốc [10] Thuốc chống lao có nhiều loại, tác dụng của mỗi thuốc trên trựckhuẩn lao không giống nhau Hiện nay người ta chia thuốc chống lao thành hai loại: (1) cácthuốc chống lao chủ yếu (còn gọi là các thuốc chống lao loại một, thuốc chống lao hàngđầu), (2) các thuốc chống lao thứ yếu (còn gọi là các thuốc chống lao loại hai, thuốc chốnglao hàng thứ hai) Trong khi các thuốc chống lao loại một là những thuốc có hiệu quả nhất

và cũng ít độc tính nhất, thì các thuốc chống lao hàng thứ hai là những thuốc có tác dụngkém hơn lại có độc tính cao và giá thành rất đắt Ở New York, chi phí điều trị bệnh nhânnhạy với thuốc chỉ mất 2.000 USD trong khi đó điều trị bệnh nhân kháng thuốc hết 250.000USD Hiện nay số tử vong hàng năm do lao trên thế giới còn lớn hơn số tử vong do HIV, sốtrét và các bệnh nhiệt đới cộng lại Tổ chức Y tế Thế giới đã nhận định bệnh lao hiện nay đãquay trở lại và trở nên tồi tệ hơn bởi sự kháng thuốc của vi khuẩn lao [17]

Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng vài năm saukhi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy hiện tượng đề kháng lạistreptomycin của vi khuẩn lao Sau đó các kháng sinh chống lao khác tiếp tục ra đời: para– aminosalysilic, isoniazid, rifampicin nhưng đều không mang lại hiệu quả sau một thờigian điều trị nhất định [7] Nghiên cứu tìm kiếm hoá dược mới có hiệu quả điều trị lao, đặcbiệt là lao kháng thuốc luôn luôn được thực hiện và càng ngày càng có nhiều hợp chấtchống lao mới được đưa vào sử dụng, ví dụ, gần đây là linezolid [43] Tuy nhiên, theo cơchế và áp lực, vi khuẩn không ngừng biến đổi tạo nên nhiều chủng mới hơn có khả năng

kháng thuốc nhanh chóng hơn [52] Khả năng điều trị thành công có thể đạt 95-100% đốivới những bệnh nhân mắc lao thông thường, trong khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắclao kháng thuốc chỉ là 20 – 30%, thậm chí còn không điều trị được khi mắc lao kháng đathuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trịlao Vì vậy, việc phát hiện và ngăn chặn sự lan truyền các chủng lao kháng đa thuốc là vấn

đề quan trọng nhất trong điều trị lao hiện nay [7, 10, 35]

1.3 VI KHUẨN LAO

1.3.1 Cấu tạo

Trực khuẩn lao có dạng hình que, thân mảnh dẻ, không có nha bào, kích thước 2 - 3

µm, dày 0,3 µm, kháng cồn, kháng acid (hình 1.1) Khi được nhuộm bằng phương phápZiehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, do không bị cồn và acid làm mất màucarbonfuchsin Ở môi trường nuôi cấy có độ acid đậm đặc nhất định, trực khuẩn lao vẫn pháttriển được, vì vậy, chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilli -AFB), đây là đặc điểm nổi bật của vi khuẩn thuộc chi mycobacteria Đặc điểm này rất quantrọng để phát hiện trực khuẩn lao bằng phương pháp hình thái học (nhuộm màu) trong cácmẫu bệnh phẩm Một số giả thiết cho rằng mức kháng acid là do độ dài của các chuỗi

mycolic acid M tuberculosis có khả năng thể hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp

các vitamin, amino acid và các enzyme cofactor thiết yếu của tế bào Mycobacteria có cấutrúc gần giống với vi khuẩn Gram dương nhưng chúng không được xếp vào loại vi khuẩnGram dương do các phân tử gắn với thành tế bào là lipid chứ không phải protein haypolysaccharide Do đó, chúng không giữ lại tinh thể màu tím xuất hiện trong nhuộm Gram[2, 5, 37, 38]

Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất ở 37oC và dưới áp suất của O2 là 100mmHg Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn thường hay mắc lao nhất vì có áp suất O2 từ

120 – 130 mmHg (khi đứng) rồi đến thân xương và đầu xương vì áp suất O2 ở đây là 100mmHg Lách, gan, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn vì áp suất O2 thấp

Trực khuẩn lao sinh sản rất chậm, cứ 20 giờ mới có một lần phân chia tế bào, trong

điều kiện phòng thí nghiệm thì cứ 12 đến 24 giờ M tuberculosis phân chia một lần trên môi

trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng Loewenstein [46] Tốc độ phát triển chậm có thể là do tính

thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ chất dinh dưỡng và liên quan đến tốcđộ tổng hợp ribosome (Hình 1.2).

37, 38]

- Lớp tiếp theo là peptidoglucan liên kết với đường arabinose và các phân tử mycolicacid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn có độ cứng nhất

định Thành tế bào của mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất được biết ở prokaryote, có

một số thành phần hóa học và liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglucan

ở thành tế bào M tuberculosis là 70 - 80% trong khi ở vi khuẩn E coli là 20 - 30% [38]

- Lớp ngoài được tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các chất phứctạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc phức tạp làm tăng khảnăng chống thấm nước của thành tế bào vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn tại lâu với môitrường bên ngoài, chống khả năng bị hủy diệt bởi đại thực bào và các tế bào miễn dịch[38]

- Lớp vỏ ngoài cùng có vai trò rất quan trọng, có cấu trúc peptidoglyolipid Nóđảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững với hiện tượng thựcbào, giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu nên khi vào cơ thể trực khuẩn khó bi tiêu diệt

Hình 1.3 Cấu tạo thành tế bào của M tuberculosis

(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis/Research/basicResearch/biology cell.htm)

1.3.2 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn lao có thể xâm nhập vào cơ thể qua nhiều con đường khác nhau: thường làđường hô hấp, hoặc có thể qua đường tiêu hóa, da, kết mạc mắt Sau khi gây tổn thương tiênphát, vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu để đến gây tổn thương thứphát ở các cơ quan khác: Phổi, thận, màng não, xương, hạch nhưng thường bị hơn cả là đỉnhphổi, nơi có áp suất oxy là 120 mmHg vì đây là điều kiện hoạt động tốt cho vi khuẩn lao

Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord factor” (trehalose - 6,6’- dimycolate) là

chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu, gây nên những u hạt mạn tính [7]

Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể, trong cơ thể xuất hiện đáp ứng miễn dịch quatrung gian tế bào Lúc này, đại thực bào, các tế bào lympho T, lympho B và các nguyên bàosợi kết tập lại tạo các u hạt, với các tế bào lympho vây quanh đại thực bào Chức năng của

các u hạt không chỉ ngăn cản sự lan tỏa của tế bào M tuberculosis mà còn tạo môi trường tại

chỗ cho các tế bào của hệ miễn dịch trao đổi thông tin [23] Bên trong các u hạt, tế bàolympho T tiết ra các cytokine, như γ interferon, hoạt hóa đại thực bào khiến chúng diệtkhuẩn tốt hơn Tế bào lympho T cũng tiêu diệt trực tiếp các tế bào bị nhiễm Nhưng điềuquan trọng là vi khuẩn không bị u hạt loại trừ hoàn toàn mà trở nên bất hoạt tạo dạng nhiễmkhuẩn “tiềm ẩn” (latent tuberculosis) [18]

1.3.3 Đặc điểm hệ gen

Toàn bộ hệ gen của vi khuẩn lao M tuberculosis chủng H37Rv được giải trình tự,

phân tích và công bố năm 1998 gồm 4.411.529 bp, với đặc tính là chứa nhiều guanine vàcystosine (G + C khoảng 65 %) Trên 90% trình tự được dự đoán là có mã hóa cho protein

và chỉ có 6 gen giả (pseudogene - gen không mang thông tin di truyền mã hóa cho protein)

[28, 38, 44] Dữ liệu hệ gen của một số vi khuẩn thuộc chi Mycobacterium, trước hết là của

vi khuẩn lao (M tuberculosis) và vi khuẩn phong (M leprae) có tầm quan trọng đặc biệt

trong nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử hỗ trợ dịch tễ học, di truyền học và nghiên cứukháng thuốc, số liệu đã được lưu giữ tại một số trung tâm và có thể sử dụng một số chươngtrình để truy cập khám phá và sử dụng [11, 53]

1.4 CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO

1.4.1 Kháng sinh trong điều trị lao

Thuốc chống lao có nhiều loại, và tác dụng của chúng lên trực khuẩn lao cũng khônggiống nhau Hiện nay người ta chia thuốc chống lao làm hai loại: (1) Các thuốc chống laochủ yếu: gồm năm thuốc chủ yếu đó là: isoniazid (INH), rifampicin (RMP), ethambutol(EMB), pyrazinamid (PZA), streptomycin (SM) Đây là những thuốc kháng lao hiệu quả vàcũng ít độc tính nhất (2) Các thuốc chống lao thứ yếu: là những thuốc chống lao có tác dụngkém hơn và có độc tính cao, không được dùng trong phác đồ điều trị lao nhưng lại đượcdùng trong các trường hợp điều trị thất bại do vi khuẩn lao kháng lại các loại thuốc chống

lao loại một Các thuốc này gồm có: ethionamide, prothionamide, paraminosalysilic acid(PAS), cycloserine, kanamycin, capreomycin, thiacetazone, ofloxacin, các quinolone…

Các thuốc isoniazid, cycloserine, kanamycin có tác dụng ức chế tổng vách tế bào Cácthuốc streptomycin, kanamycin, capreomycin có tác dụng ức chế tổng hợp protein Cácthuốc rifampicin và ethambutol có tác dụng ức chế sự tổng hợp nucleic acid Thuốcparaminosalicylic acid có tác dụng chống chuyển hóa [7, 35, 37, 38]

1.4.2 Nguyên nhân gây kháng thuốc

Vi khuẩn lao kháng thuốc là khi chúng không chịu sự tác động của các loại kháng sinhdùng điều trị chúng Thường nói tới vi khuẩn lao kháng thuốc là nói tới những trường hợp vikhuẩn lao kháng với một trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất: isoniazid, rifampicin,pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin [7, 35]

Tính kháng thuốc bao gồm chủ yếu 3 nguyên nhân chính:

- Thuốc hoặc các gen đích bị làm biến đổi trong các chủng kháng thuốc do đó cácthuốc không còn tác dụng nữa trong việc tiêu diệt vi khuẩn

- Sản phẩm của gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc được vi khuẩn sảnxuất thừa ra, do đó lượng thuốc mà bệnh nhân uống vào không đủ để ức chế hoàntoàn vi khuẩn lao

- Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vào bêntrong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt tới nồng độtối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh

Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn lao có thể xảy ra trước khi xâm nhập (tiên phát)hoặc sau khi nhập vào cơ thể người bệnh (thứ phát) Vi khuẩn lao kháng thuốc tiên phát làhiện tượng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đề kháng tựnhiên Vì vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩn lao xâm nhậpvào cơ thể đã có sự đề kháng với thuốc đang sử dụng Còn hiện tượng kháng thuốc thứ phátxảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng thuốc chống lao không đúngquy định, không đúng liều lượng, thời gian sử dụng thuốc do đó đã chọn lọc vi khuẩn laokhang thuốc [1, 38]

Các chủng vi lao kháng thuốc được chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng đathuốc (MDR – TB): Là trường hợp khi các chủng vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốcchống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin (2) Các chủng lao kháng thuốc phổrộng (XDR – TB): Là trường hợp khi vi khuẩn lao đã ở tình trạng kháng đa thuốc và có thêmtính kháng một trong ba loại thuốc chống lao là capreomycin, kanamycin, amikacin [49].

Ngày nay khi nghiên cứu về sinh học phân tử, người ta đã xác định được cơ chếkháng lại nhiều loại kháng sinh có liên quan đến các gen tương ứng Trong hình 1.4 mô tảcác cơ chế phân tử của hiện tượng kháng đa thuốc ở vi khuẩn lao Trong đó, kháng isoniazid

được cho là liên quan đến các gen: KatG, inhA, aphC và kasA Kháng streptomycin có thể là

do đột biến ở gen rpsL Kháng pyrazinamid có thể liên quan đến gen pncA Kháng quinolone

có thể liên quan tới gen gyrA Kháng rifampicin được xác định là liên quan đến đột biến ở vùng gần lõi của gen rpoB, gen mã hóa tiểu phần β của RNA polymerase [7, 25] Trong luận

văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu cơ chế kháng đa thuốc, tức là trường hợp vi khuẩnlao kháng đồng thời hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin, điều

đó đồng nghĩa với việc nghiên cứu các đột biến trên gen rpoB với katG.

Hình 1.4 Cơ chế kháng đa thuốc của vi khuẩn lao

(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis)

1.4.3 Rifampicin và cơ chế kháng

Rifampicin tên khoa học là 3 –[[(4 – methyl – 1 – pipeainyl) imino] methyl] (hình

1.5A) Rifampicin là dẫn xuất bán tổng hợp từ rifampicin B, một kháng sinh được chiết xuất

từ nấm Streptomyces mediterranei, là thuốc có hoạt tính diệt khuẩn mạnh, tiệt khuẩn, thuốc

diệt vi khuẩn lao trong và ngoài tế bào Rifampicin không có hiện tượng kháng thuốc chéovới các loại thuốc chữa lao khác Nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory

concentration - MIC) đối với vi khuẩn là 5 - 200 ng/ml (in vitro) Đây là thuốc ức chế RNA

polymerase mạnh nhất [29, 48]

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của rifampicin (A) và isoniazid (B) [48]

Cơ chế tác động của rifampicin liên quan đến khả năng ức chế hoạt động củaRNA polymerase Enzyme này là một phức hợp oligomer gồm bốn tiểu đơn vị khácnhau (α, β, β’, ω), và được mã hóa tương ứng bởi các gen rpoA, rpoB, rpoC, rpoD [7,20]

Khi rifampicin gắn với tiểu đơn vị β của RNA polymerase (rpoB), làm ức chế cáchoạt động sao chép tạo ra các mRNA của vi khuẩn lao và do đó làm ngưng trệ các hoạt độngsống của vi khuẩn lao Đây là cơ chế cơ chế tác dụng của RMP đối với vi khuẩn lao (hình1.6)

Hình 1.6 Cấu trúc tinh thể liên kết giữa rifampicin và RNA polymerase [20]

Gen rpoB có kích thước 3519 bp, mã hóa cho tiểu phần β của RNA polymerase

(Tuberculosis, 2007) Những đột biến kháng kháng sinh rifampicin thường xảy ra trên đoạn

gen rpoB, nhất là đoạn nằm gần trung tâm của gen dài 81 bp được giới hạn từ bộ ba 507 đến

533, người ta gọi đây là vùng “nóng” – “hot-spot region” (hình 1.7) Đột biến ở bộ ba thứ

526, 516, 531, cho kết quả đề kháng với rifampicin cao; đột biến ở bộ ba 510, 515 và 512 thìcho khả năng kháng rifampicin ở mức độ thấp hơn [47] Đoạn nucleotide của vùng nónggồm:

507-GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCGCTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG-533

Mỗi nucleotide trên đoạn này có thể bị thay thế, hoán đổi vị trí, mất đi, thêm vào đểtạo ra các đột biến được thể hiện trên hình 1.7 như sau: [41]

Hình 1.7 Trình tự nucleotide và các vị trí có khả năng xảy ra đột biến trên đoạn “nóng” của

gen rpoB [41]

- Khi xảy ra đột biến gần vùng lõi của gen rpoB sẽ làm thay đổi cấu trúc tiểu phần β

của RNA polymerase mà nó mã hóa nên làm cho khả năng kết hợp của RMP với tiểu phầnnày giảm đi Kết quả là tác dụng của rifampicin đối với vi khuẩn lao giảm hoặc mất đi Như

vậy đột biến trên vùng gen này của rpoB đã làm cho vi khuẩn lao trở nên kháng thuốc với

rifampicin

- 90 - 95 % các chủng M tuberculosis kháng rifampicin được xác định là do các đột biến trên vùng gen nóng 81 bp này của rpoB Như vậy còn 5 - 10 % các chủng vi khuẩn lao không có đột biến trên vùng này của gen rpoB Điều này cho thấy cần phải xác định thêm những đột biến

khác trên gen này hoặc những gen khác có liên quan để xác định chính xác và toàn bộ cơ chếkháng rifampicin của vi khuẩn lao [19, 37]

1.4.4 Isoniazid và cơ chế kháng

Isoniazid có tên khoa học là isonicotinylhydrazine (INH) (hình 1.5B), là thuốc chống

lao đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại M tuberculosis và các loại Mycobacterium không điển hình khác như M bovis, M kansasii Isoniazid diệt khuẩn phụ thuộc vào nồng độ thuốc

ở vị trí tổn thương và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn Cơ chế tác dụng của isoniazid có liênquan tới sự hình thành phức hệ acyl isonicotinic-NADH và như đã trình bày ở trên chúng ứcchế sự tổng hợp acid mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao

Gen katG có kích thước 2223 bp mã hóa catalase – peroxidase Enzyme này hoạt hóa

INH bằng cách kết hợp acyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ acyl

isonicotinic-NADH Phức hệ này liên kết chặt chẽ với ketoenoylreductase (mã hóa bởi gen InhA), theo

đó làm ngăn cản sự hình thành cơ chất enoyl-AcpM và hoạt động tổng hợp acid béo Quátrình này làm ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao

Hình 1.8 Cơ chế kháng INH ở vi khuẩn lao

có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng

M tuberculosis kháng isoniazid.

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC

1.5.1 Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng

*) Đặc điểm lâm sàng

Nhìn chung các dấu hiệu lâm sàng của bệnh lao có vi khuẩn kháng thuốc không khácnhiều với bệnh lao mà vi khuẩn nhạy cảm với thuốc.

Trường hợp nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc tiên phát có thể có triệu chứng cấp tínhhơn, sốt cao hơn

Đối với kháng thuốc mắc phải phần lớn gặp ở những bệnh nhân lao mạn tính, đượcđiều trị ít nhất 2 lần Những bệnh nhân này cũng chiếm tỷ lệ chủ yếu trong số bệnh nhân laokháng đa thuốc Hầu hết bệnh lao kháng đa thuốc bệnh tiến triển, hay gặp dò phế quản –màng phổi mà điều trị gặp nhiều khó khăn [7]

*) Xét nghiệm lâm sàng

- Phản ứng Tuberculin: thường thì phản ứng da ở những bệnh nhân kháng thuốc tiên phát có

mức độ mạnh hơn so với những bệnh nhân có vi khuẩn nhạy cảm với thuốc Đối với khángthuốc mắc phải, đặc biệt là kháng đa thuốc ở bệnh nhân đồng nhiễm HIV (+) thì tỷ lệ phảnứng này âm tính khá cao

- Hình ảnh X Quang: khi chụp phổi thẳng, kết quả cho thấy hình ảnh về bệnh lao phổigiữa trường hợp lao kháng thuốc tiên phát với trường hợp nhạy cảm với thuốc không

có sự khác biệt Nhưng những trường hợp kháng thuốc mắc phải thì gặp nhiều là thể

xơ hang, diện tích phổi tổn thương nhiều hơn và có nhiều hang, kích thước của hanglớn hơn

- Xét nghiệm vi khuẩn:

+ Về hình thể: các vi khuẩn bình thường có cấu tạo thành tế bào 3 lớp nhưng ở vikhuẩn kháng thuốc thành tế bào có cấu tạp 4 lớp (vi khuẩn có thêm một lớppeptidoglycolipid ở ngoài cùng) Vi khuẩn kháng với rifampicin có thành tế bàocũng dày hơn hẳn so với vi khuẩn nhạy với thuốc Khuẩn lạc của vi khuẩn khángthuốc có thể không điển hình khi nuôi cấy, mọc cằn cỗi [7]

+ Về số lượng vi khuẩn khi soi kính và nuôi cấy: những bệnh nhân kháng thuốc thứphát có số lượng vi khuẩn khi soi kính cao hơn nhiều so với bệnh nhân thôngthường Không có sự khác nhau nhiều giữa bệnh nhân kháng thuốc tiên phát vàbệnh nhân thông thường Khi nuôi cấy trên môi trường đặc số khuẩn lạc mọc ởbệnh nhân kháng thuốc mắc phải là cao hơn và thời gian mọc nhanh hơn so với

kháng thuốc tiên phát và ở những bệnh nhân này số khuẩn lạc lại cao hơn ở bệnhnhân thông thường [7].

+ Về đặc điểm kháng sinh đồ: kháng thuốc tiên phát thường kháng hay kháng vớinồng độ thấp, kháng thuốc mắc phải thường kháng với nồng độ cao hơn Khángthuốc tiên phát hay gặp với một thuốc, kháng thuốc thứ phát thường tỷ lệ khángcùng lúc với nhiều thuốc cao hơn [7]

Như vậy không thể dựa vào lâm sàng hay thời gian điều trị hiệu quả để chẩn đoánbệnh nhân lao kháng thuốc được Các xét nghiệm cận lâm sàng khác chỉ có giá trị gợi ý.Chẩn đoán bệnh lao kháng thuốc hiện nay vẫn phải lấy kết quả kháng sinh đồ làm tiêuchuẩn

1.5.2 Xác định kiểu hình

Gồm các phương pháp sau: Phương pháp xác định tương quan, phương pháp xác định

tỷ lệ kháng, phương pháp đo màu, phương pháp khử nitrate và nhiều phương pháp khác[13] Các phương pháp này đều xác định khả năng phát triển của vi khuẩn lao trong môitrường nuôi cấy có kháng sinh, từ đó đưa ra kết luận về khả năng kháng thuốc của chủng vikhuẩn lao đang nghiên cứu [12] Nhược điểm của các phương pháp này là vi khuẩn lao mọcchậm, trên môi trường Lowenstein-Jensen thường mất 4-6 tuần Sử dụng hệ thống môitrường lỏng được cải tiến như MGIT, BATEC cũng mất 2 tuần Điều này làm cho công tácđiều trị và kiểm soát tình hình bệnh lao cũng như bệnh lao kháng thuốc còn khó khăn

1.5.3 Xác định kiểu gen

Hiện nay có nhiều phương pháp xác định kiểu gen được ứng dụng để chẩn đoán vikhuẩn lao kháng thuốc [1, 4], giải trình tự gen [6] , lai trên pha rắn [36], Real – time PCR[14]

Các phương pháp chẩn đoán xác định kiểu gen dựa trên cơ sở phát hiện đột biến ở cácgen có liên quan tới tính kháng thuốc tương ứng [51], sử dụng các kỹ thuật cao, đòi hỏi thiết

bị hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình độ chuyên sâu nhưng thời gian chẩn đoán bằngphương pháp này nhanh hơn, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Để xác định đột biến trên gen có liên quan tới kháng thuốc (gen rpoB và katG) hiện

nay giải trình tự gen vẫn là phương pháp xác định cơ bản, chính xác nhất và thời gian cho

kết quả từ 3 - 5 ngày Sau khi giải trình tự đoạn gen vừa được tách dòng từ chủng lao nghiêncứu ta sẽ so sánh trật tự sắp xếp các nucleotide ở mẫu thí nghiệm với trật tự nucleotidechuẩn để biết được các vị trí sai lệch [22, 16]

Việc xác định các đột biến có liên quan kháng thuốc rifampicin và isoniazid bằng kỹthuật giải trình tự cho biết chính xác vị trí đột biến cũ và mới trên gen cần nghiên cứu, manglại hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng của cấu trúc quần thể vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao khángthuốc, đánh giá được tỷ lệ đột biến liên quan kháng thuốc trên các chủng lao phân lập từ cácvùng địa lý khác nhau Qua đó làm tiền đề xây dựng một số bộ kit real-time PCR, nhằm pháthiện nhanh vi khuẩn lao kháng rifampicin và isoniazid tại Việt Nam

1.5.4 Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngaysau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thínghiệm không cần thiết phải làm tiếp các bước thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả đểxác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếchđại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại Như vậy, nên có thể nóireal-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựavào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc vớiphản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được

Chìa khóa của kỹ thuật real-time PCR chính là hóa chất và thuốc thử có trong phảnứng, trong đó chất huỳnh quang được thêm vào hỗn hợp phản ứng là yếu tố đầu tiên màngười làm real-time PCR cần quan tâm Chất huỳnh quang này phải làm thế nào để ống phảnứng có thể phát được huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích một khi trong ốngphản ứng này có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại từ DNA đích, và sẽ không thể phátđược huỳnh quang nếu không có sản phẩm khuếch đại trong ống Cho đến nay, nhiều chấthuỳnh quang như vậy đã được tìm ra và sử dụng rộng rãi Trong phạm vi khóa luận này,chúng tôi chỉ xin trình bày chất huỳnh quang thường được sử dụng nhất đó là Taqman probe[8]

Probe hay còn gọi là “đoạn dò” là những đoạn oligonucletides sợi đơn có trình tự cóthể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích (trong PCR, đó là sản phẩm

khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích) Đoạn dò này với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang(gọi là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất dập tắt huỳnh quang tương ứng (gọi là quencher) đểdập tắt được ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter Cơ chế của sự phát tín hiệuhuỳnh quang khi có sản phẩm khuếch đại là nhờ hoạt tính 5’-3’ exonuclease của enzyme

Taq polymerase có khả năng cắt bỏ các probe khi các probe bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu

3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi để tổng hợp sợi bổ sung (hình 1.9)

Hình 1.9 Nguyên lý hoạt động của real-time PCR sử dụng Taqman probe

(http://www.asuragen.com/Services/services/gene_expression/ab_taqman.aspx)

Trên hình 1.9 minh họa nguyên lý hoạt động của Taqman probe trong real-time PCR.Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào

sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị Taq polymerase cắt bỏ để

kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xaquencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Càng nhiều sảnphẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đócường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnhquang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích Ngược lại, khi không

có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn cònnguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher của probe hấp phụ(dập tắt tín hiệu) do đó ống thử nghiệm sẽ không phát được tín hiệu huỳnh quang khi nhậnđược nguồn sáng kích thích [8].

Multiplex real-time PCR là một dạng thay đổi của phản ứng real-time PCR thôngthường, ở đó trong cùng một lúc hai hay nhiều gen đích được khuyếch đại bằng cách sửdụng đồng thời các cặp mồi và các probe khác nhau

Kỹ thuật multiplex real-time PCR cho phép tiết kiệm thời gian, công sức và đóng vaitrò rất quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa hìnhDNA và phân tích định lượng, phản ứng multiplex real-time PCR rất hữu ích cho việc phát

hiện trực tiếp các đột biến của M tuberculosis từ các mẫu lâm sàng

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn lao nhạy cảm với thuốc kháng sinh, kháng đơn thuốc (kháng mộtloại thuốc INH hoặc RIF), kháng đa thuốc (kháng ít nhất hai loại thuốc dòng thứ nhất là INH

và RIF) và siêu kháng thuốc (kháng tất cả các thuốc chống lao hiện tại) được thu thập từ cácvùng miền khác nhau như Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch (TP Hồ Chí Minh), Bệnh việnTrung ương Huế và bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung ương Các chủng lao được phân lập

từ các loại bệnh phẩm của bệnh nhân lao như: đờm, dịch màng phổi, dịch rửa phế quản, dịchmàng bụng Ngoài ra, trong nghiên cứu có sử dụng chủng chuẩn quốc tế H37Rv làm đốichứng

DNA tổng số của các chủng lao nghiên cứu được tách chiết tại Học viện Quân y.Nồng độ DNA được đo trên máy NanoDrop® để tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫunhư nhau để khi đưa vào hỗn hợp phản ứng PCR cùng một thể tích DNA khuôn, và đạtkhoảng 100 ng/thể tích 25µl phản ứng

Kết quả đo nồng độ DNA tổng số của từng mẫu nghiên cứu được trình bày trongphần phụ lục 2

2.1.2 Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Bảng 2.1 Các sinh phẩm hóa chất chính

1 H/c sinh phẩm dùng trong tách dòng

Accuprep plasmid Mini Extraction Kit

*) Các máy và thiết bị chính

Bảng 2.2 Các máy và thiết bị chính

Tủ ấm ổn nhiệt

Máy PCR (GenAmp PCR System 9700)

Máy ly tâm (Biofuge Primo R)

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)

Máy chụp ảnh Gel-Doc

Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire

Máy quang phổ tử ngoại khả biến NanoDrop

Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100-Avant

Sanyo (Nhật Bản)Applied BioSciences (Mỹ)Heraeus (Mỹ)

Thommas Scientific (Mỹ)Dolphin (Mỹ)

Nuaire (Mỹ)Analitika (Đức)Applied BioSciences (Mỹ)

2.1.3 Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Dựa trên trình tự gen rpoB và katG của chủng dại H37Rv (Accesion: NC_000962)

đã được công bố trên ngân hàng giữ liệu gen quốc tế NCBI Trên cơ sở đó, các mồi đặc hiệuđược thiết kế:

Bảng 2.3 Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Gen

KT(bp)

katG katG-F 5’- GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG - 3’

684katG-R 5’- GTC TCG GTG GAT CAG CTT GT - 3’

rpoB rpoB-FrpoB-R 5’- GGC GGT CAG GTA CAC GAT CT - 3’5’- ACC GAC GAC ATC GAC CAC TT - 3’ 528

Trong đó, cặp mồi katG-F và katG-R nhân đoạn gen katG có chứa codon 315 liên quan kháng thuốc isoniazid, cặp mồi rpoB-F và rpoB-R nhân đoạn gen rpoB có chứa đoạn

nóng 81 bp liên quan tới kháng thuốc rifampicin

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.2.2 PCR nhân đoạn gen đích

Phản ứng PCR nhân đoạn gen katG và rpoB đặc

hiệu được thực hiện:

Bảng 2.4 Thành phần cho một phản ứng PCR

Thiết kế các probe phát hiện đột biến Multiplex real time PCR

BamHI BamHI

BamHI BamHI

6 Taq polymerase (5 unit) 1,25 unit 0,25

Theo chu kỳ nhiệt như sau

Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kì

1 Biến tính 95 5 phút 1

2 Biến tính 94 1 phút

3 Gắn mồi 56 45 giây 32

4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút

5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1

6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng chạy điện di trên gel agarose 0,8% Để phục vụ

cho giải trình tự gen, đoạn gen katG và rpoB được tinh sạch và dòng hóa vào vector tách

dòng pBT để tạo vector tái tổ hợp

2.2.3 Tạo dòng gen

*) Tạo sản phẩm nối ghép

Bảng 2.6 Thành phần hỗn hợp phản ứng nối ghép

*) Biến nạp và nuôi cấy tế bào có vector tái tổ hợp

Sản phẩm nối ghép được biến

nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α (đã đươc xử lý bằng CaCl2 theo phương phápchuẩn) bằng sốc nhiệt 42oC trong 90 giây Sản phẩm biến nạp được bổ sung 200 µl LBlỏng, lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 37oC và trải trên đĩa thạch có bổ sung ampicillin

100 mg/l, IPTG 100 mg/l và X-gal 200 mg/l Đĩa thạch được ủ qua đêm ở 37oC Chọnmột khuẩn lạc trắng trên mỗi đĩa tiếp tục được chọn nuôi qua đêm trong môi trường LBlỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 mg/l

*) Tách chiết Plasmid và kiểm tra

Khuẩn nuôi qua đêm sẽ được thu lại bằng ly tâm và tách plasmid theo protocol của bộkit AccuPrep Plasmid mini Extraction (Bioneer – Hàn Quốc) Plasmid tái tổ hợp được kiểm

tra có đoạn gen nghiên cứu qua phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế BamHI Kết quả sau khi

thực hiện phản ứng cắt sẽ thu được hai phần: tạo 1 band trên ảnh điện di có kích thước 684

bp (đối với gen katG) hoặc kích thước 528 bp (đối với gen rpoB) và một band là phần còn

lại của plasmid khoảng 2,7 kb

Bảng 2.7 Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme

*) Phân tích kết quả

Kết quả xác định trình tự trên máy ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer

Khai thác dữ liệu từ genbank, thiết lập chủng wild type để so sánh: Chủng H37Rv

trên genbank (ID: 83332, ACCESSION NC_000962) với gen katG và rpoB đã được công bố

ký hiệu lần lượt là Rv1908c và Rv0667

Xử lý, phân tích các trình tự đoạn gen katG 684bp và rpoB 528bp của các chủng vi

khuẩn lao nhạy và kháng bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit So sánh đối chiếu vớicác dữ liệu ngân hàng gen để có kết quả các vị trí đột biến của từng chủng nghiên cứu

2.2.4 Multiplex real-time PCR

Sau khi tách dòng và giải trình tự đoạn gen katG và rpoB của các chủng vi khuẩn lao

nghiên cứu được phân lập tại các vùng miền khác nhau tại Việt Nam, qua phân tích các độtbiến, các probe sẽ được thiết kế nhằm phát hiện các đột biến có liên quan kháng INH và RIFở vi khuẩn lao bằng phản ứng multiplex real-time PCR Do trong phản ứng multiplex real-time PCR sử dụng 2 probe khác nhau trong cùng một phản ứng nên việc lựa chọn 2 probenày phải gắn 2 reporter (chất phát huỳnh quang) khác nhau để có thể phân biệt ở các bướcsóng khác nhau

Probe dùng cho phản ứng real-time PCR sử dụng cho nghiên cứu này được thiết kếtheo công nghệ TaqMan MGB (Minor Groove Binding) probe (TaqManR Chemistry) củahãng Applied Biosystems dạng TaqMan này có ưu điểm đó là có thể thực hiện phản ứngreal-time PCR ở nhiệt độ cao, từ đó làm tăng độ đặc hiệu của các probe Hơn nữa các loạiprobe thuộc dạng này được dễ dàng phân biệt dựa trên nhiệt độ nóng chảy Chính vì vậy cácloại probe này thường được dùng để thực hiện các phản ứng multiplex real-time PCR với độđặc hiệu và độ nhạy cao TaqMan hay phương pháp nuclease đầu 5’ là một trong những thí

dụ về các loại probe thủy phân, tín hiệu huỳnh quang phát ra do sự thủy phân các đoạn probeđược dùng để phát hiện các đoạn sản phẩm PCR Các đoạn probe được gắn với một reporterở đầu 5’ và một quencher (chất dập tắt tín hiệu huỳnh quang) ở đầu 3’ Trong nghiên cứuchúng tôi sử dụng 2 probe có gắn 2 reporter khác nhau, reporter gắn FAM cho phép pháttín hiệu huỳnh quang khi đo ở bước sóng 530 nm và reporter còn lại được gắn VIC pháthuỳnh quang ở bước sóng 560 nm Các quencher được gắn ở đầu 3’ của mỗi probe là cácBHQ phát nhiệt, các BHQ phát nhiệt hiện nay được ưa chuộng sử dụng vì khả năng hấpthụ huỳnh quang rất mạnh, các BHQ được xem như các lỗ đen (black hole quencher –BHQ) hút lấy tất cả các huỳnh quang từ reporter không cho bất cứ huỳnh quang nào phát

ra được từ reporter, đồng thời rất dễ dàng để thiết kế các Taqman probe dùng chomultiplex real-time PCR mà không lo đến phổ huỳnh quang của các reporter có bị trùngvới phổ huỳnh quang của quencher vì quencher không hề phát huỳnh quang

3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ

3.1.1 Kết quả nhân gen katG và rpoB từ DNA tách từ vi khuẩn lao

Hai gen katG và rpoB được khuếch đại từ tổng số 93 chủng vi khuẩn lao, trong đó

gồm có một chủng chuẩn quốc tế H37Rv, miền Bắc có 9 chủng đơn kháng và 13 chủng đakháng; miền Nam có 10 chủng nhạy, 11 chủng kháng đơn, 14 chủng kháng đa và 12 chủngsiêu kháng; miền Trung có 11 chủng kháng đơn và 12 chủng đa kháng Đặc tính kháng thuốccủa từng chủng thuộc các miền khác nhau được trình bày trên bảng 3.1 và phần phụ lục 2

Bảng 3.1: Đặc tính kháng thuốc của chủng vi khuẩn lao nghiên cứu

Chú thích: S: Streptomycin, H: Isoniazid, E: Ethambutol, R: Rifampicin, Ofx: Ofloxacin,

Th: Thioacetazone, Eto: Ethionamide, Cs: Cycloserine, Km: Kanamycin, PAS: aminosalicylic acid

P-Kết quả nhân hai gen katG và rpoB bằng kỹ thuật PCR được trình bày trong hình 3.1A và 3.1B Kết quả ở hình 3.1A là kết quả đại diện sản phẩm PCR nhân gen katG, còn hình 3.1B là kết quả đại diện của sản phẩm PCR nhân gen rpoB.

3.1.2 Kết quả tách dòng gen

Bước đầu tiên của quá trình tách dòng là thực hiện phản ứng ghép nối gen đích vàovector tách dòng pBT, Phản ứng nối được xúc tác bởi T4 DNA ligase Sau khi đoạn gen đích

đã được gắn vào vector pBT, để làm gia tăng số lượng bản sao của vector tái tổ hợp này mộtcách nhanh chóng, chúng tôi tiến hành biến nạp plasmid tái tổ hợp vào trong tế bào khả biến

E.coli DH5 và nuôi cấy trên môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 1 giờ để

làm phục hồi tế bào E.coli mang plasmid tái tổ hợp đó Sản phẩm biến nạp sau đó được cấy

trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicillin 50 µg/ml, X-gal 20mg/ml và IPTG 100 mM và được nuôi tĩnh ở 370C trong 18h Kết quả biến nạp được trìnhbày ở hình 3.2

bp

Hình 3.2 Chọn dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp trên môi trường LB có bổ sung

ampicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml và IPTG 100 mM.

Sau 18 giờ nuôi cấy, trên môi trường LB thạch có chứa kháng sinh ampicillin, X-gal

và IPTG, xuất hiện hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng Tất cảcác khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng khángsinh ampicillin, tuy nhiên chỉ có những khuẩn lạc màu trắng là mang plasmid tái tổ hợp

Do đó, chúng tôi lựa chọn các khuẩn lạc trắng này đem nuôi cấy qua đêm ở 370C, lắc 200vòng/phút trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh phù hợp Sản phẩm nuôi cấyđược ly tâm để thu khuẩn phục vụ cho quá trình tách plasmid

*) Tách plasmid

Quy trình tách chiết DNA plasmid được thực hiện theo đúng hướng dẫn của bộ kitAccuPrep Plasmid mini Extraction (Bioneer – Hàn Quốc) Để kiểm tra sản phẩm táchplasmid, chúng tôi điện di kiểm tra trên gel agarose 1% Kết quả được trình bày trong hình3.3A và 3.3B

*) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn

Quy trình cắt plasmid bằng enzyme BamHI được trình bày như đã miêu tả ở phần

phương pháp (Bảng 2.7) Sau đó sản phẩm được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gelagarose 1% Kết quả được chỉ ra trong hình 3.4A và 3.4B

kb kb

Hình 3.3A Điện di sản phẩm tách

plasmid tái tổ hợp đoạn gen katG

Hình 3.3B Điện di sản phẩm tách

plasmid tái tổ hợp đoạn gen rpoB

Hình 3.4A Điện di sản phẩm cắt plasmid

tái tổ hợp gen katG bằng enzyme BamHI.

Hình 3.4B Điện di sản phẩm cắt plasmid

tái tổ hợp gen rpoB bằng enzyme BamHI.

này chúng tôi kết luận rằng plasmid đã mang đoạn gen chèn Do đó sản phẩm tách plasmidtiếp tục được gửi đọc trình tự.

3.1.3 Kết quả phân tích trình tự gen katG

Qua phân tích trình tự gen katG của 93 chủng lao, trong đó có 82 chủng lao kháng

thuốc, 10 chủng nhạy kháng sinh và 1 chủng chuẩn quốc tế H37Rv Trong 82 chủng laokháng thuốc này có 64 chủng kháng Isoniazid (69,6%); 46 chủng kháng rifampicin (50%),

68 chủng kháng streptomycin (74%) chúng tôi thu được kết quả như sau (Bảng 3.2)

Bảng 3.2: Tỷ lệ đột biến làm thay đổi amino acid tại codon 315 của gen katG trong các chủng

kháng thuốc phân lập tại các miền khác nhau tại Việt Nam.

Miền

Đột biến Không

12/13(92.3%)

7/12(58.3%)

12/14(85.7%)

2/14(14.3%)

6/12(50%)

6/12(50%)Toàn

quốc

10/31 (32.3%)

21/31(67.7%)

31/39 (79.5%)

8/39(20.5%)

6/12 (50%)

6/12(50%)

Kết quả giải trình tự gen katG của 82 chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, trong đó 64

chủng kháng isoniazid cho thấy, 65/82 (79,3%) mẫu xảy ra đột biến trên đoạn gen nghiên

cứu, đột biến có thể xảy ra ở một điểm hoặc nhiều điểm trên gen katG, 47/64 (73,4%) chủng

kháng INH xảy ra đột biến tại codon 315 Các mẫu nhạy cảm với INH và chủng chuẩn quốc

tế H37Rv đều không phát hiện đột biến nào trên đoạn gen này

Mỗi amino acid có thể được mã hóa bởi nhiều bộ ba Vì vậy không phải tất cả các độtbiến đều dẫn đến sự hình thành một amino acid mới Các đột biến làm xuất hiện bộ ba mãhóa mới, nhưng không dẫn đến sự hình thành amino acid mới thì không làm thay đổi cấutrúc bậc một của protein, do đó cấu trúc không gian của protein vẫn được giữ vững nên cácđột biến này không liên quan tới tính kháng thuốc Hillemann và cộng sự (2005) khi nghiêncứu trên 143 chủng vi khuẩn lao phân lập từ Đức đã phát hiện ra 103 chủng kháng đa thuốc

và 40 chủng nhạy cảm với thuốc chữa lao, trong đó 91/103 (88,4%) chủng kháng đa thuốcxuất hiện đột biến tại codon 315 (Ser à Thr) và tất cả 40 chủng nhạy cảm với thuốc chốnglao đều không phát hiện thấy đột biến nào [30] Một nghiên cứu khác của Ahmad cũng xácđịnh các đặc tính phân tử ở 28 chủng lao kháng INH được phân lập từ Dubai và 17 chủng từ

Beirut thấy rằng tỷ lệ đột biến tại codon 315 trên gen katG lần lượt đạt tỷ lệ 64% và 35%,

đối với các chủng nhạy cảm với thuốc chống lao, tác giả cũng đã không phát hiện thấy đột

biến nào trên gen katG [9], từ đó, các tác giả đã đưa ra kết luận về sự khác nhau giữa tỷ lệ đột biến trên gen katG liên quan kháng INH được phân lập từ các vùng địa lý khác nhau.

Đối với các chủng phân lập tại Việt Nam trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ đột

biến tại codon 315 trên gen katG là khá cao (73,4%), do đó việc áp dụng phương pháp sinh

học phân tử để phát hiện đột biến liên quan kháng INH sẽ mang lại hiệu quả cao đối vớibệnh nhân Việt Nam

Nghiên cứu của Cavusoglu et al (2002) cũng chỉ ra rằng, ngoài đột biến

S315T là đột biến phổ biến liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid thìvẫn tồn tại các đột biến khác như tại điểm 258 có đột biến G258D Năm

2008 khi Aslan và đồng tác giả nghiên cứu về xác định đột biến liên quan tớitính kháng thuốc isoniazid cũng cho thấy, ngoài codon 315 là đột biếnchính thì vẫn tồn tại các đột biến tại các codon khác, tác giả tìm thấy 2đột biến khác đó là G279T và A293T Tuy nhiên, cả hai công bố trênkhông đưa ra được những chứng cứ về đột biến tại các điểm này có liênquan tới tính kháng thuốc [15; 22] Trong nghiên cứu của chúng tôi,chúng tôi phát hiện ra một số điểm đột biến mới, ngoài ra còn có đột biếnkiểu thêm nucleotide, đột biến đảo đoạn Các đột biến này chưa từngđược công bố trước đây Với số lượng mẫu hạn chế và chưa có khả năngxét nghiệm protein nên chúng tôi chưa khẳng định được các đột biến nàycó liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid hay không Có thể đột biếnnày là các đột biến mới phát sinh không ảnh hưởng tới tính kháng thuốc,hoặc cũng có thể các đột biến này có liên quan tới tính kháng thuốc