Các Điều Kiện Công Nghệ Tách, Thu Hồi Alpha Cyclodextrin Và Bước Đầu Ứng Dụng Alpha Cyclodextrin Vào Cố Định Hương

Để nâng cao giá trị kinh tế của nông sản, tạo ra đợc sản phẩm mới theo kịp xuhớng phát triển công nghệ của thế giới, việc sử dụng tinh bột để sản xuất ra nhữngmặt hàng có giá trị kinh tế

Mục lục

Mở ĐầU 2

Chơng 1 Tổng quan tài liệu 5

1.1.alpha cyclodextrin 5

1.1.1 Giới thiệu về cyclodextrin 5

1.1.2 Cấu tạo và cấu trúc của - CD 5

1.1.3 Tính chất của - CD 8

1.1.4 ứng dụng của - CD 12

1.1.5 các phơng pháp tinh sạch - CD 17

1.1.6 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng CD

trên thế giới và ở Việt Nam 19

1.2 Tinh bột sắn 21

1.2.1 Cấu tạo của tinh bột sắn 21

1.2.2 Tính chất của tinh bột sắn 23

1.3 Nấm men 23

1.3.1 Hình thái và đặc điểm chung của nấm men 23

1.3.2 Cấu tạo của tế bào nấm men 23

1.3.3 Hoạt động của tế bào nấm men 24

1.4.quá trình đồng hoá đờng 25

1.4.1 Các khái niệm cơ bản 25

1.4.2 Các yếu tố ảnh hởng tới quá trình đồng hoá 25

Chơng 2 Nguyên vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 28

2.1 Nguyên vật liệu 28

2.1.1 Nguyên liệu 28

2.1.2 Thiết bị 28

2.2 Phơng pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Xác định DE theo phơng pháp DNS 29

2.2.2 Phơng pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC 31

2.2.3 Phơng pháp làm sạch dịch 31

2.2.4 Xác định mật độ tế bào bằng phơng pháp đo mật độ quang 31

2.2.5 Xác định độ hấp thụ màu Abs 31

2.2.6 Xác định nồng độ chất khô 31

2.2.7 Xác định pH 31

2.2.8 Xác định độ ẩm 31

2.2.9 Đánh giá cảm quan theo phép thử cho điểm Fisher 32

Chơng 3 Kết quả và thảo luận 33

3.1 Sản xuất dịch -CD từ tinh bột sắnCD từ tinh bột sắn 33

3.2 sử dụng nấm men để làm sạch dịch -CD từ tinh bột sắnCD 37

3.2.1 Chọn nồng độ dịch thích hợp cho quá trình đồng hoá 37

3.2.2 Chọn tỷ lệ nấm men thích hợp cho quá trình đồng hoá 39

3.2.3 Chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình đồng hoá 40

3.2.4 Chọn thời gian thích hợp cho quá trình đồng hoá 42

3.2.5 Chọn mức độ thông khí thích hợp cho quá trình đồng hoá 45

3.3 tẩy màu và làm sạch dịch -CD từ tinh bột sắnCD 48

3.4 Thu hồi -CD từ tinh bột sắnCD bằng phơng pháp kết tinh 49

3.4.1 Chọn nồng độ dịch thích hợp cho quá trình kết tinh -CD 49

3.4.2 Chọn thời gian thích hợp cho quá trình kết tinh 50

3.4.3 Chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình kết tinh 51

3.5 ứng dụng của -CD từ tinh bột sắn CD trong việc cố định hơng 55

Kết luận 61

Hiện nay, trên thế giới cyclodextrin đợc sản xuất rất rộng rãi, các nghiên cứu vàứng dụng liên quan đến cyclodextrin đã lên đến con số hàng nghìn từ khi nó đợc pháthiện cách đây hơn 100 năm

Còn Việt Nam cho đến nay vẫn cha có một cơ sở nào sản xuất alpha cyclodextrin,lợng alpha cyclodextrin sử dụng trong nớc hoàn toàn thông qua nhập khẩu từ nớc

Nam tăng trởng mạnh, từ một nớc nhập khẩu lơng thực Việt Nam đã trở thành mộttrong ba quốc gia đứng đầu về xuất khẩu gạo Tuy nhiên, giá trị hàng hoá của sảnxuất nông nghiệp vẫn còn hạn chế, đời sống của nông dân tuy đợc cải thiện nhng còn

ở mức nghèo Lý do chủ yếu là sản xuất nông nghiệp phần lớn vẫn cung cấp cho thịtrờng trong và ngoài nớc với các sản phẩm ở dạng thô Các chế phụ liệu cha khaithác hiệu quả, gây lãng phí và ô nhiễm môi trờng Để phát triển kinh tế và cải thiện

đời sống của ngời dân việc tập trung khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ sinhhọc nhằm tiêu thụ đầu ra, tăng giá trị hàng hoá của sản xuất nông nghiệp đang là cấpthiết

Sản xuất lơng thực chiếm tỷ trọng lớn chính, đặc thù của nền nông nghiệp ViệtNam Bên cạnh gạo, Việt Nam còn có rất nhiều sản phẩm chứa tinh bột nh ngô,khoai, sắn là nguồn nguyên liệu dồi dào Theo niên giám thống kê năm 2003 thìdiện tích trồng sắn trên cả nớc là 329.000 ha và sản lợng đạt là 4.157.000 tấn sắn.Hiện nay, chế biến tinh bột đang đợc Chính phủ quan tâm đặt lên hàng đầu Do vậy,việc tiếp thu và tăng giá trị của sản phẩm nông nghiệp sẽ là chìa khoá cho việc thúc

đẩy sản xuất nông nghiệp cũng nh phát triển bền vững của ngành công nghệ sinhhọc Để nâng cao giá trị kinh tế của nông sản, tạo ra đợc sản phẩm mới theo kịp xuhớng phát triển công nghệ của thế giới, việc sử dụng tinh bột để sản xuất ra nhữngmặt hàng có giá trị kinh tế cao với giá cả hợp lý nh cyclodextrin nhằm phục vụ côngnghiệp thực phẩm, dợc phẩm và mỹ phẩm là một việc làm cần thiết, đầy tính thựctiễn và kinh tế

Công đoạn quan trọng nhất của quá trình công nghệ sản xuất alpha cyclodextrin

là công đoạn tinh sạch alpha cyclodextrin Công đoạn này sẽ quyết định phần lớn

đến hiệu quả sản xuất và giá thành sản phẩm Điều này đặt ra yêu cầu cần phải tìm ranhững điều kiện thích hợp cho việc tinh sạch alpha cyclodextrin sao cho đạt hiệu suấtcao nhất Trên cơ sở kế thừa và phát huy những công trình nghiên cứu đã có, tôi tiến

hành nghiên cứu các điều kiện công nghệ tách, thu hồi alpha cyclodextrin và bớc

đầu ứng dụng alpha cyclodextrin vào cố định hơng phục vụ cho ngành đồ uống,

thực phẩm, mỹ phẩm…

Chơng 1

tổng quan tài liệu

1.1 alpha cyclodextrin

1.1.1 Giới thiệu về cyclodextrin

Cyclodextrin (CD) là các oligosacarit vòng đợc cấu tạo từ các đơn vịglucopyranoza hình ghế 4C1 nối với nhau bằng liên kết -1,4-glucozit

CD (còn đợc gọi là dextrin Schardinger) đã đợc biết đến từ hơn 100 năm nay

Năm 1881, CD lần đầu tiên đợc sản xuất từ tinh bột bằng vi khuẩn Bacillus amylobacter Năm 1903, cấu trúc và tính chất của các hợp chất này đã đợc biết đến

qua mô tả của Schardinger [18] Sau đó, Tilden và Hudson (1939) đã chứng minhenzim cyclodextrin glucosyltransferaza, chiết xuất từ môi trờng nuôi cấy vi khuẩn

Bacillus macerans, là tác nhân chuyển hoá tinh bột thành CD Từ năm 1950 cho tới

nay, rất nhiều nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu các tính chất của CD, cũng nhviệc sản xuất và ứng dụng nó Kể từ năm 1981, các thành tựu trong lĩnh vực này đợccông bố thờng xuyên trong các hội thảo quốc tế về CD đợc tổ chức hai năm một lần[20]

1.1.2 Cấu tạo và cấu trúc của - CD

Các CD thờng gặp là -CD, -CD và -CD chứa tơng ứng 6, 7 và 8 đơn vịglucoza trong phân tử Các CD lớn hơn (đến 31 đơn vị glucoza) và các CD nhỏ hơn(ít hơn hoặc bằng 5 đơn vị glucoza) đều rất kém bền [12] Kích thớc và thể tích lỗhang của các CD do số phân tử glucoza trong vòng CD quyết định

Trong vòng CD nói chung và -CD nói riêng, các gốc glucoza đợc xắp xếp saocho các nhóm hydroxyl bậc 2 (C2 và C3) nằm về một phía của vòng, còn các nhómhydroxyl bậc 1 (C6) nằm ở phía bên kia Kết quả là tạo ra phân tử có dạng hình nóncụt với phía chứa C6 hẹp hơn do khả năng quay tự do của C6 [9] (Hình 1.1) Cấu trúcnày đợc giữ chặt bởi các liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl bậc 2 của các gốcglucoza kề nhau [4] Các nhóm hydroxyl bậc 1 và bậc 2 hớng ra bên ngoài mạchvòng, trong khi đó, mặt trong là các nguyên tử hydro không cực (ở C3 và C5) và cácnguyên tử O cầu nối Nhờ đó, phân tử có bề mặt bên ngoài háo nớc trong khi bề mặttrong kỵ nớc Cấu trúc này cho phép -CD và CD tạo phức bao bền vững với cácphân tử kỵ nớc (các chất hữu cơ, muối, halogen …)

H×nh 1 1 CÊu tróc vµ kÝch thíc cña CD [20]

mà - CD tan trong nớc tốt hơn so với - CD Nhng lực căng vòng của - CD lại nhỏhơn - CD nên khả năng tan trong nớc thấp hơn so với -CD.

Các phân tử khách thể có ảnh hởng đáng kể đến độ tan của CD Một số hợpchất có thể tạo phức không tan với CD, trong khi đó số khác có thể tạo phức tan rấttốt, thậm chí tan tốt hơn CD khi cha tạo phức Hiện tợng này là do các phân tử kháchthể tơng tác với các CD và làm thay đổi hớng quay của chúng Vì vậy, có trờng hợpphức tạo thành từ một chất khách thể với - CD có thể kém tan hơn phức với - hay

- CD

Khi - CD bị biến đổi (thay thế các nhóm hydroxyl bằng metyl hoá, amin hoá,este hoá, ete hoá), độ hoà tan có thể tăng hoặc giảm Chẳng hạn, biến đổi nhóm 2-hoặc 3-hydroxyl của - CD sẽ phá vỡ cầu nối hydro ở miệng vòng - CD, làm chocác nhóm hydroxyl tơng tác tốt hơn với nớc; do đó, - CD trở nên tan tốt hơn

* Khả năng tan trong các dung môi hữu cơ

Nhìn chung, - CD không tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ, tuy nhiênchúng tan trong một số dung môi hữu cơ phân cực và aprotic (chẳng hạn metanol,etanol, propanol, isopropanol, axeton )

* Độ bền nhiệt

- CD khá bền nhiệt ở nhiệt độ trên 250C, - CD nóng chảy và sự phân huỷnhiệt bắt đầu xảy ra.

* Khả năng hút ẩm

Hàm ẩm cân bằng của - CD trong môi trờng có độ ẩm tơng đối 85% tơng ứng

là 12 ở 30C - CD vẫn giữ ở trạng thái bột mịn, không bị hoá lỏng ngay cả khi đểlâu ở môi trờng có độ ẩm tơng đối cao

* Độ bền hoá học

So với các oligosacarit mạch thẳng thì - CD và các CD là những phân tử rấtbền Các axít mạnh nh axít clohydric có thể thuỷ phân - CD, tạo ra hỗn hợp cácoligosaccarit khác nhau (từ mạch thẳng do phân tử - CD bị mở vòng cho đến tậnglucoza) Tốc độ thuỷ phân tăng khi nhiệt độ tăng nhng chậm hơn 3 - 5 lần so vớicác oligosacarit mạch thẳng tơng ứng [4] Trong môi trờng axít yếu nh các axít hữucơ, sự thuỷ phân hầu nh không xảy ra

Cũng nh các oligosaccarit và polisaccarit không có tính khử khác, - CD và các

CD không bị thuỷ phân bởi bazơ, thậm chí ở nhiệt độ cao và trong dung dịch kiềm

đặc (trong dung dịch NaOH 0,35N, ở 70C không thấy có sự thuỷ phân CD)

- CD khá bền với nhiệt độ, tia UV hay IR Với các tác nhân oxi hoá, - CD cóthể bị oxi hoá làm mở vòng glucoza, nhng không tạo ra formaldehyt hay axít focmic(vốn là các chất độc) do - CD không có tính khử

- CD khá bền dới tác dụng của các enzim thuỷ phân amilolytic, trong khi đó

-CD bị thuỷ phân dễ dàng hơn bởi -amylaza

* Khả năng biến đổi hoá học

Bằng phơng pháp hoá học hoặc enzim có thể thay thế các nhóm hydroxyl của

- CD bằng các nhóm khác (metyl, amin, este, ete ) Khi đó đờng kính của - CDkhông bị thay đổi nhng chiều sâu của các lỗ hang giảm xuống [4] Mục đích của cácbiến đổi này là nhằm làm thay đổi độ hoà tan, thay đổi khả năng tạo phức (độ bềnphức, độ chọn lọc khách thể) hoặc thêm các nhóm có chức năng đặc hiệu dùng xúctác

và amin [11] Đây là hiện tợng một chất khách thể bị giữ, bị bao bọc trong lỗ hang

của phân tử chủ thể - CD ở phức này, - CD đợc gọi là phân tử "chủ thể", cácphân tử đợc bao bọc bên trong đợc gọi là phân tử "khách thể" Các phân tử khách thể

sẽ đợc bao bọc một phần hay toàn bộ vào trong lỗ hang của phân tử chủ thể - CD[9] Nhìn chung, một phân tử - CD sẽ bao chứa đợc một phân tử khách thể Trongtrờng hợp chất khách thể có khối lợng phân tử nhỏ hơn hoặc lớn hơn, tỷ lệ đó có thể

là 1/2 hay 2/1

Kích thớc lỗ hang khác nhau của các CD làm cho chúng ít nhiều có tính chấtchọn lọc khi tạo phức với các phân tử có kích thớc khác nhau Chẳng hạn, phân tửphenyl ăn khớp hoàn toàn với lỗ hang của -CD, nhng với lỗ hang của -CD vẫn còntrống một khoảng không nhỏ do đó phân tử phenyl có thể lung lay nhẹ bên trong lỗ.Với lỗ hang lớn hơn của -CD, vòng phenyl càng lung lay hơn do phần khoảngkhông còn trống lớn hơn Trong nhiều trờng hợp, những phân tử liên kết đợc với -

CD cũng sẽ liên kết với -CD, những phân tử liên kết với -CD sẽ liên kết với -CD

Để phức tạo thành đợc bền, phân tử khách thể cần đợc bao khít bởi lỗ hang CD Điềunày có nghĩa là phụ thuộc vào kích thớc của CD cũng nh của phân tử đợc bao Cácphân tử nhỏ (có ít hơn hoặc bằng 4 đơn vị cácbon) liên kết tốt nhất với các -CD,còn các phân tử lớn hơn sẽ liên kết tốt nhất với các -CD

So với một số chất chủ thể tạo phức khác (nh urê, thiourê ), - CD tỏ ra là chấtchủ thể tốt hơn cả nhờ bản chất tơng đối ít phản ứng, độ bền cao, không độc hại và

có khả năng tạo phức rộng rãi với nhiều hợp chất Đặc điểm nổi bật nữa của - CD là

nó có thể tạo phức ở trong dung dịch và ở trạng thái rắn, trong khi nhiều chất chủthể khác đòi hỏi phải có sự kết tinh thành mạng lới mới tạo đợc lỗ hang thích ứng

Đặc biệt, khả năng phản ứng của các nhóm hydroxyl có thể tạo ra biến đổi hoáhọc - CD, do đó mở rộng tính chất chức năng cũng nh khả năng tạo phức của -CD

* Quá trình tạo phức

Quá trình tạo phức là sự ăn khớp về mặt kích thớc giữa lỗ hang - CD và phân

tử khách thể [18] Lỗ hang kỵ nớc của phân tử - CD tạo ra một vi môi trờng trong

đó các phân tử khách thể không cực có thể đi vào để tạo thành phức Lúc đầu lỗ hangchứa đầy nớc, khi hình thành phức bao, các phân tử nớc bị đẩy ra ngoài nhờng chỗcho phân tử khách thể vốn kỵ nớc hơn đang có mặt trong dung dịch Kết quả là mộtliên kết không cực - không cực đợc tạo ra, làm giảm sức căng vòng - CD và đa đếntrạng thái năng lợng thấp hơn, bền vững hơn Trong quá trình tạo phức, không có liênkết đồng hoá trị nào bị phá vỡ hay tạo ra [10]

Chính tác động tơng hỗ của lực nguyên tử (lực Van der Waals), lực nhiệt động(cầu nối hydro) và lực dung môi (tơng tác kỵ nớc) làm bền phức Nói chung các phân

tử đợc bao đều ở cùng độ nghiêng chắc chắn theo hớng có lợi cho lực Van der Waals

Phức tồn tại trong một cân bằng động vốn phụ thuộc vào nồng độ của - CD,của chất khách thể và nớc Tốc độ tạo thành phức phụ thuộc phần lớn vào độ khớpvừa của phân tử khách thể vào lỗ hang của - CD và độ lớn của các lực nhiệt động.Kích thớc của phân tử khách thể càng phù hợp với lỗ hang của - CD, sự tạo phứccàng diễn ra dễ dàng và phức tạo ra càng bền Ngoài ra, tốc độ tạo phức còn phụthuộc vào độ pha loãng - CD và chất khách thể trong dung dịch, dung môi sử dụng

và nhiệt độ

* ảnh hởng của sự tạo phức

Phức bao - CD có ảnh hởng rõ rệt đến tính chất lý hoá của chất khách thể và

đợc thể hiện ở các điểm dới đây:

- Làm bền các chất nhạy cảm với ánh sáng, với oxi hoá, nhiệt

- Làm bền các hợp chất dễ bay hơi, dễ thăng hoa

- Thay đổi khả năng phản ứng hoá học

- Tăng độ tan

- Thay đổi mùi, vị sản phẩm, che giấu mùi vị khó chịu

- Thay đổi hợp chất từ thể lỏng sang thể bột rắn

- Tăng khả năng phân tách các hợp chất

1.1.4 ứng dụng của - CD

- CD đợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trên cơ sở khả năng tạo phức bao vớinhiều hợp chất, qua đó thay đổi các tính chất lý hoá của chúng Các ứng dụng nàynhằm:

- Tăng độ hoà tan của các hợp chất a béo, ít tan trong nớc

- Chuyển các chất từ dạng lỏng sang dạng rắn

- Gắn cố định các chất dễ bay hơi, bảo vệ các chất dễ hút ẩm

- Loại các mùi vị khó chịu trong sản phẩm

- Làm bền các chất nhạy cảm với ánh sáng, nhiệt, oxy

- Phối trộn đợc các phân tử hoạt động mạnh mà không xảy ra tơng tác giữa chúng(bằng cách che khuất cục bộ một số hợp chất trong hỗn hợp)

Với u điểm là độ hoạt động tơng đối thấp lại ít độc nên - CD đợc sử dụng rộngrãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng, đặc biệt đối với công nghiệp dợcphẩm và thực phẩm

* Trong công nghệ thực phẩm và hơng liệu

- CD đợc dùng chủ yếu để bảo vệ chất thơm, chất màu, các chất dễ bị oxi hoá,hoặc dùng để loại cholesterol hay các chất gây mùi vị khó chịu trong thực phẩm.Hầu hết các chất thơm tự nhiên hay tổng hợp đều dễ bay hơi Khi đợc tạo phứcvới - CD, các chất thơm này đợc bảo vệ khỏi bị thất thoát trong quá trình công nghệhoặc tàng trữ, bảo quản [14] Các chất béo hay vitamin trong thực phẩm là nhữngchất dễ bị phân huỷ do oxi hoá và nhiệt Việc tạo phức với - CD khiến chúng khótiếp xúc với các tác nhân gây h hỏng do đó độ bền của chúng tăng lên Ví dụ,apartame và neotame là các thành phần tạo vị ngọt trong thực phẩm và đồ uống vốn

dễ bị thuỷ phân làm mất độ ngọt, khi đợc tạo phức với - CD thì độ bền của chúngtăng lên rõ rệt [16]

- CD còn là một chất hỗ trợ công nghệ hiệu quả trong chế biến và bảo quảnthực phẩm Đầu tiên phải kể đến đó là tác dụng loại cholesterol trong các sản phẩmthực phẩm nh trứng, sữa, dầu béo Khi trộn dung dịch - CD với dầu béo, - CD tạophức với cholesterol, phức hoà tan trong lớp nớc và đợc tách ra khỏi lớp dầu Vớicách xử lý nh vậy có thể loại đến 80% cholesterol trong sản phẩm Tơng tự, có thểdùng - CD để loại các axít béo tự do khỏi chất béo để tăng tính chiên rán của dầu(nh giảm tạo khói, tạo bọt, bị biến màu hay đóng cặn dầu) [21]

- CD cũng đợc dùng để che giấu các mùi vị khó chịu trong thực phẩm Khihợp chất này đợc tạo phức với - CD, nó trở nên bị “cô lập” và khó tiếp xúc với bềmặt tiếp nhận cảm giác Chẳng hạn, có thể dùng - CD để giảm độ đắng cho sảnphẩm nớc chanh, cam (gây ra do các hợp chất limonoid hoặc flavonoid) -CD cũng

đợc dùng để kiểm soát độ đắng ở hydrolysat sữa đặc hay trà, cà phê [21]

- CD cũng đợc sử dụng để tăng độ hoà tan của một số thành phần của thựcphẩm, chẳng hạn với flavonoid và terpenoid là những chất có lợi cho sức khoẻ nhng

do chúng kém tan nên khó sử dụng đợc trong thực phẩm.Chính lí do này, ngời ta sử dụng -CD để làm tăng độ đàn hồi, độ mềm dẻo của bộtnhào trong sản xuất các sản phẩm từ bột mỳ nh mỳ sợi, bánh pie, pizza

- CD cũng đợc dùng để phát hiện aflatoxin trong mẫu thực phẩm bằng sắc kýlỏng [8]

* Trong công nghiệp dợc

- CD đợc ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp dợc với khả năng nổi bật làlàm tăng hoạt tính sinh học của thuốc (thông qua làm tăng độ hoà tan, độ bền, độ hấp

Yêu cầu đối với một dợc chất là nó phải đủ tan trong nớc để đến đợc màng tếbào nhng đủ kỵ nớc để có thể thấm qua màng tế bào Hầu hết các dợc chất đềukhông đạt độ tan trong nớc yêu cầu Vì vậy trong một công thức thuốc thờng phải cóthêm các phụ gia khác nh các dung môi hữu cơ, chất hoạt động bề mặt, điều kiệnpH nhng chúng thờng độc và đôi khi gây tác dụng ngợc - CD có u điểm là không

độc, giảm tác dụng phụ cũng nh có thể làm bền các thành phần hoạt động của thuốc,

đồng thời che giấu vị đắng khó chịu của thuốc - CD đợc dùng rộng rãi trong cáccông thức thuốc giảm đau, thuốc chống nhiễm trùng, thuốc chống dị ứng, co giật,thuốc lợi niệu, các chất chống nghiện [4]

* Trong các quá trình chuyển hoá sinh học và lên men

- CD có thể tạo phức với các chất độc hay các chất cạnh tranh sinh học làmgiảm các yếu tố ức chế enzim hoặc vi sinh vật Ngoài ra, - CD có thể làm tăng độhoà tan của các cơ chất hữu cơ vốn ít tan trong nớc, tạo điều kiện nâng cao hiệu suấtcủa quá trình Chẳng hạn, hiệu suất quá trình chuyển hoá cholesterol thành androst -

4 - ene - 3, 17 - dione bằng vi sinh vật chỉ 40%, nhng với sự có mặt của - CD, hiệusuất này đạt 90%; ảnh hởng có lợi này là nhờ độ tan trong dung dịch của cholesterol(một steroid) tăng lên khi đợc tạo phức với - CD - CD cũng cho thấy có tác dụng

xúc tiến quá trình lên men sản xuất kháng sinh nhóm lankacidin bằng Streptomyces

sp hay chuyển hoá andehyt thành rợu thơm bằng S cerevisiae, nhờ làm tăng độ tan

của các cơ chất a béo

- CD có khả năng tạo phức không tan với một số sản phẩm của quá trìnhchuyển hoá, do đó có thể dùng để tách chọn lọc sản phẩm [13]

* Trong công nghệ môi trờng

- CD đóng vai trò quan trọng trong công nghệ môi trờng nhờ tác dụng làmhoà tan các chất ô nhiễm hữu cơ, hấp thụ và loại bỏ các chất hữu cơ cũng nh các kimloại nặng từ đất, nớc và không khí bằng quá trình tạo phức

Trong môi trờng có chứa trichlorfon từ thuốc trừ sâu, trichlorfon không kết tinh

sẽ bị tạo phức với - CD và đợc loại ra đến 90% - CD cũng đợc dùng để lọc cácchất thải khí từ công nghiệp hoá chất Khả năng làm tăng độ tan của CD và - CDcũng đợc dùng để kiểm tra độ ô nhiễm đất vì khi tạo phức với CD, các chất nhiễmtrong đất trở nên hoà tan và dễ dàng xác định đợc hơn - CD có thể xúc tiến quátrình phân huỷ các hidrocacbon vốn ảnh hởng đến sinh trởng của vi sinh vật và làmgiảm các chất độc giúp tăng sinh khối các vi sinh vật trong xử lý ô nhiễm bằng ph-

ơng pháp sinh học [17]

* Trong công nghiệp mỹ phẩm

Lợi ích của - CD trong công nghiệp mỹ phẩm là làm ổn định và kiểm soát

h-ơng thơm, tăng độ tan, chuyển các chất dạng lỏng thành dạng rắn - CD đợc ứngdụng rộng rãi trong kem đánh răng, kem dỡng da, giấy vệ sinh

Tơng tác giữa - CD và các chất tạo hơng trong mỹ phẩm làm cản trở quá trìnhbay hơi nên giữ hơng thơm đợc lâu hơn (mặt khác làm giảm tác dụng kích ứng củachúng với da) - CD cũng đợc sử dụng trong một số mỹ phẩm để khử mùi cơ thểhoặc trong các sản phẩm chăm sóc tóc để giảm sự bay hơi của các mercaptan vốngây mùi khó chịu [15] Trong các sản phẩm kem đánh răng, - CD làm tăng độ hoàtan của triclosan (một chất kháng khuẩn) Độ nhũ hoá của các loại kem dỡng dacũng đợc tăng lên nhờ tác dụng của - CD

* Trong công nghiệp bao gói, dệt may

CD và - CD có thể đợc dùng trong công nghiệp dệt may để làm thơm vải, làmvải đỡ bắt bụi, bắt mùi hay mồ hôi - CD còn đợc dùng để nhuộm vải, làm màu vảibền hơn Trong công nghiệp bao gói, các phức bao - CD có chứa dầu chống vikhuẩn và các tác nhân bay hơi đợc phủ lên giấy gói các sản phẩm tơi nhằm bảo quản

đợc lâu hơn [18]

* Trong nông nghiệp và công nghiệp hoá học

Phức của - CD với nhiều hoá chất phục vụ nông nghiệp nh thuốc diệt cỏ,thuốc trừ sâu, trừ nấm làm tăng độ bền và độ tan của các sản phẩm trên Trongcông nghiệp hoá học, - CD đợc dùng rộng rãi để tách các isome, enantiome hayxúc tác các phản ứng Về mặt xúc tác, các CD có thể đợc biến đổi để có tác dụng xúctác bắt chớc theo cơ chế của enzim hoặc ảnh hởng đến hoạt tính xúc tác của enzimtheo hớng kìm hãm hay xúc tiến phản ứng

* Trong phân tích

- CD và các CD có khả năng phân biệt các isome, các nhóm chức năng, cácenantiome hay các homologue do đó đợc dùng rộng rãi trong phân tách các hỗn hợp[59] - CD cũng đợc dùng làm phối tử hoá học ở pha tĩnh hay pha động [10], trong

điện di mao quản, trong sắc ký lỏng cao áp (dùng làm pha tĩnh liên kết với chấtmang rắn), trong điện di gen, sắc ký khí, sắc ký điện động học, trao đổi ion, sắc ký

áp lực, sắc ký bản mỏng, tách qua màng, biosensor Hơn nữa, - CD còn đợc dùng

để tăng độ bền của chất phân tích, tăng khả năng phát hiện chất cần phân tích

Tóm lại, nhờ vào cấu trúc đặc biệt của mình, - CD nói riêng và các CD nóichung đã đóng góp một phần quan trọng trong nghiên cứu cũng nh trong các lĩnh vựccông nghiệp từ mỹ phẩm, thực phẩm đến dợc phẩm

1.1.5 các phơng pháp tinh sạch - CD

Cyclodextrin đợc sản xuất bằng quá trình chuyển hóa glucosyl nội phân tử nhờenzim cyclodextrin glucosyltranferaza từ nguyên liệu tinh bột Cyclodextringlucozyltransferaza (CGTaza) là enzim thuộc họ - amylaza, đợc xếp vào loại exo-enzim và không có khả năng đi qua các điểm phân nhánh trong phân tử tinh bột Sảnphẩm chính dới xúc tác của CGTaza trên tinh bột là - ,β- ,- CD và các dextrinphân nhánh phân tử lợng cao (gọi là dextrin giới hạn CGTaza) Trong khi các enzimamylaza chủ yếu là thuỷ phân các cầu nối glycozit trong phân tử tinh bột thì CGTazachủ yếu là xúc tác phản ứng chuyển glucozyl hoá với hoạt tính thuỷ phân tơng đốithấp Có bốn phản ứng đợc xúc tác bởi enzim này là:

* Phơng pháp tách sử dụng dung môi

Trên thực tế, trong phản ứng enzim, việc tạo thành phức của một CD nào đó vớimột chất khách thể làm thay đổi tỉ lệ : :  và hiệu suất tạo CD tăng lên đáng kể Tỉ

lệ : :  trong sản phẩm cuối cùng đợc chuyển tới một dạng sản phẩm chính của

CD với hiệu suất hơn 90% phụ thuộc vào khả năng lựa chọn của tác nhân tạo phức

Do vậy, công nghệ tách có thể sử dụng các dung môi khác nhau:

Cramer và Steinle đã quan sát thấy khi bổ sung toluen vào hỗn hợp phản ứng,hiệu suất chuyển hoá thành -CD tiếp tục tăng lên và lợng -CD sau khi đạt cực đạitrong thời gian ngắn đã giảm đi đáng kể Khi không bổ sung toluen thì sản phẩmchính là -CD Với enzim CDTaza sản xuất từ Baccilus macerans , Suzuki và cộng

sự đã đạt đợc hiệu suất tạo -CD là 51,2% khi có mặt của trichloethylene chỉ kèm rất

ít -CD Khi có mặt của 1-decadol, sự chuyển hoá thành -CD đạt năng suất 35,9%

và -CD là 3,1%

Tuy nhiên, phơng pháp tách CD sử dụng dung môi có nhợc điểm là sản phẩmthu đợc có độc tính cao, dung môi cần phải thu hồi và gây ô nhiễm môi trờng Mặtkhác, trong công nghiệp thực phẩm , cũng nh trong y học và mỹ phẩm thì yêu cầusản phẩm phải có độ tinh sạch cao và an toàn cho ngời sử dụng Do đó, sản phẩm sảnxuất từ phơng pháp này phải yêu cầu một công đoạn tiếp theo khá phức tạp và tốnkém

* Phơng pháp tách không sử dụng dung môi

ở Nhật Bản trong những năm đầu thập kỉ 70, Horikoshi và đồng nghiệp đã pháttriển quá trình sản xuất CD mà không sử dụng bất kì dung môi vô cơ nào Quy trìnhsản xuất không dung môi đã đợc chấp nhận tại Nhật Bản, CD đợc coi nh một phụ giathực phẩm và do đó, các nhà sản xuất ở Nhật Bản đều sử dụng quá trình không dungmôi

Một cải tiến trong quá trình sản xuất CD không dung môi là việc sử dụng máysiêu lọc để loại bỏ các CD và acrylic dextrin nhỏ khác trong phản ứng enzim Công

đoạn sử dụng máy siêu lọc tạo ra một hiệu suất cao hơn đáng kể, tạo điều kiện choquá trình tách các phần tinh bột không chuyển hoá khỏi các CD và việc kết tinh dễdàng hơn

Việc tách các CD đợc thực hiện bằng cách kết tinh phân đoạn dựa trên độ hoàtan trong nớc của các CD Quá trình tách sẽ thu đợc sản phẩm đầu tiên là -CD do

độ tan của -CD là nhỏ nhất, sau đó mới có thể tách -CD và cuối cùng là -CD Để tách riêng -CD ra khỏi hỗn hợp thì có hai phơng pháp chủ yếu đợc sửdụng Đó là: + Trao đổi ion

+ Sử dụng nấm men

Phơng pháp trao đổi ion có u điểm là có thể tách và thu hồi đợc đồng thời

-CD và glucoza với độ tinh khiết cao; nhng chi phí rất cao Do đó, phơng pháp này chỉdùng trong nghiên cứu

Phơng pháp sử dụng nấm men là bổ sung nấm men vào dịch sau thuỷ phân.Trong quá trình sinh trởng và phát triển của mình, nấm men sẽ tiêu thụ gần hết lợng

đờng đơn có trong dung dịch; do đó, ta sẽ tách và thu hồi đợc -CD một cách dễdàng

Hiện tại trên thế giới, quá trình tách và làm sạch -CD nói riêng và CD nóichung bằng các phơng pháp lý học, sinh học đang rất thịnh hành, đảm bảo độ tinhkhiết cao và an toàn cho ngời sử dụng

1.1.6 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng CD trên thế giới và ở Việt Nam

* Thực trạng của CD trên thế giới:

Từ khi đợc phát hiện, CD đợc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng ngày càng rộngrãi Điều đó thể hiện qua sự gia tăng nhanh con số các công bố nghiên cứu cũng nhcác sáng chế liên quan đến CD [20] Đến cuối năm 1999, đã có hơn 4000 sáng chế

và hiện nay, mỗi tháng có đến 30 sáng chế mới về sản xuất, ứng dụng CD và các dẫnxuất của nó [28]

ở đa số các nớc, CD và các dẫn xuất của nó đợc cho phép sử dụng (ở liều lợngnhất định) ở Mỹ, CD đợc phép sử dụng nh là một chất bảo vệ hơng liệu ở kẹo cao

su, kẹo cứng, bột ngũ cốc với liều lợng không quá 2%; ở các sản phẩm bơ bánhputding, bánh mì và đồ ống không quá 1%; các bánh snack, cracker không quá 0,5%

và bột xúp không quá 0,2% ở úc, CD đợc phép sử dụng làm chất loại cholesterol từtrứng, dầu ăn ở các nớc EU, Nhật, Hàn quốc, - CD đợc cho phép dùng làm phụ giasản xuất thực phẩm (không quá 1g/kg) Trong dợc phẩm và các ngành công nghiệpkhác, nhiều nớc cũng đã cho phép sử dụng CD và các dẫn xuất CD [26]

Hiện nay, CD đợc sản xuất rộng rãi ở nhiều nớc nh Mỹ, Nhật, Trung quốc Vàvới tiềm năng ứng dụng rộng lớn nh vậy, chắc chắn trong tơng lai nhu cầu về CD sẽngày càng gia tăng Nh vậy, vấn đề đặt ra là phải tăng về số lợng và giảm về giáthành sản phẩm CD Tuy nhiên, hiện nay việc sản xuất CD đang gặp một số trở ngại

về mặt công nghệ nh sau:

- Thứ nhất, đa số các enzim CGTaza thơng mại đang đợc sử dụng để sản xuất CD

đều hoạt động yếu trên hạt tinh bột Do đó, cần phải có giai đoạn dịch hoá tinh bộtvới - amylaza, khiến quá trình phức tạp hơn và dịch tinh bột đợc dịch hoá với -amylaza sẽ chứa maltodextrin là chất nhận trong phản ứng kết hợp xúc tác bởiCGTaza, làm giảm hiệu suất chuyển hoá tinh bột thành CD Tuy nhiên, vấn đề nàygần đây đã đợc giải quyết nhờ các enzim CGTaza bền nhiệt, có thể sử dụng để dịchhoá tinh bột

- Thứ hai, do bản chất của các CGTaza vốn bị ức chế bởi cơ chất và sản phẩm phảnứng, cũng nh song song với phản ứng tạo vòng, nó còn có thể xúc tác phản ứng phávòng nên hiệu suất của quá trình chuyển hoá CD từ tinh bột thờng thấp, khiến giáthành sản phẩm CD còn khá cao để có thể đợc sử dụng một cách rộng rãi

- Thứ ba, sản phẩm chuyển hoá từ tinh bột nhờ các CGTaza thờng là hỗn hợp của 3loại -, -, - CD, mà nếu muốn tách riêng ra từng loại, phải sử dụng các chất tạophức chọn lọc vốn ít nhiều gây độc hại và làm quá trình sản xuất phức tạp hơn (vìphải có công đoạn loại các chất này), đẩy giá thành sản phẩm lên cao hơn

Chính vì lý do giá thành mà ở Mỹ, trong khi thị trờng tiềm năng của CD có thểlên tới 32.000 tấn/năm nhng năm 1995, lợng tiêu thụ trên toàn thế giới chỉ có 5500tấn [26]

* Thực trạng CD ở Việt Nam

ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất CD còn rất mới mẻ Hầu hết các sảnphẩm đợc sản xuất từ nguyên liệu CD nh các gia vị hơng liệu (mù tạp, hơng liệudạng bột ) trong sản xuất đồ uống nh làm giảm độ đắng của nớc chanh, nớc cam ;trong sản xuất bánh làm mềm bột và giữ đợc hơng lâu hay trong sản xuất mỹ phẩm

để khử mùi hôi của cơ thể và lu đợc hơng lâu, đặc biệt là hơng liệu dạng bột hoàntoàn thông qua nhập từ nớc ngoài

Đã có một số các nghiên cứu về CD nhng chỉ là với lợng nhỏ vài gam sản phẩmtrong phòng thí nghiệm cha cha đợc ứng dụng trong thực tế sản xuất Còn cácnghiên cứu về CD để sản xuất hơng liệu dạng bột thì mới bắt đầu

Về tình hình nghiên cứu sản xuất CD thì vẫn cha có một công trình hoàn thiện

để có thể tiến hành sản xuất CD Lợng CD sử dụng trong nớc đều hoàn toàn thôngqua nhập khẩu từ nớc ngoài Vì vậy, xây dựng đợc một quy trình sản xuất CD phùhợp với điều kiện trong nớc rõ ràng là một hớng đầu t rất hợp lý và hiệu quả Trớchết, sản xuất CD trong nớc sẽ góp phần khai thác hiệu quả tiềm năng nguyên liệu(sắn) của nớc ta Thứ hai, là có thể tranh thủ đợc lực lợng lao động giá rẻ ở nớc ta.Sản phẩm thu đợc sẽ đáp ứng nhu cầu trong nớc mà không phải nhập khẩu từ nớcngoài nên giá thành sẽ hợp lý hơn Hơn nữa nó sẽ đa trình độ nghiên của và ứngdụng công nghệ sinh học của Việt Nam lên tầm cao hơn

1.2 Tinh bột SắN

1.2.1.Cấu tạo của tinh bột sắn

Tinh bột sắn có màu sáng trắng, có độ pH từ 4,5 đến 6,5 Hạt tinh bột sắn cókích thớc 5 - 40 m, chủ yếu là hình tròn, có bề mặt nhẵn

Cấu tạo bên trong của tinh bột chủ yếu do 2 loại polysaccarit hợp thành làamyloza và amylopectin Trong tinh bột sắn, hàm lợng amilopectin tơng đối cao,chiếm 78 - 80%, còn amyloza chiếm khoảng 20 - 22% Hai cấu tử này của tinh bộtkhác nhau về cấu tạo phân tử, tính chất lý, hoá học

H×nh 1 3 CÊu tróc ph©n tö amiloza

H×nh 1 4 CÊu tróc ph©n tö amylopectin

Tinh bột sắn có độ nở, khả năng hồ hoá và độ hoà tan cao Khoảng nhiệt độ hồhoá của tinh bột sắn là 58-70C Khi hồ hoá, độ nhớt dung dịch bột tăng rất nhanh và

có độ dính rất cao so với tinh bột từ các nguồn khác Ngoài ra, hồ tinh bột sắn có xuhớng thoái hoá thấp và độ bền gel cao [6]

Tinh bột sắn đợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm Có thể dùngtinh bột sắn để trực tiếp sản xuất miến, hạt trân châu… hoặc dùng làm nguyên liệuthông qua các tác nhân hoá học hoặc enzim để sản xuất các sản phẩm nh : tinh bộtbiến tính, dextrin, maltoza, glucoza, fructoza, cồn, mì chính, axit xitric… ở Việtnam, nguyên liệu tinh bột sắn có thể nói là rất dồi dào, phong phú và rẻ tiền Nớc ta

là nớc xuất khẩu sắn đứng thứ 2 trên thế giới (sau Thái lan) [7] Lợi thế đó tạo nênnhiều cơ hội để chế biến tinh bột, tinh bột biến tính và các sản phẩm từ tinh bột khác.1.3 Nấm men

1.3.1 Hình thái và đặc điểm chung của nấm men

Nấm men ( les levure, the yeast ) là loại vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không

di động và sinh sản chủ yếu bằng phơng pháp nảy chồi

Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng rất giàuprotein, vitamin và lipid Nấm men có khả năng lên men các loại đờng để tạo thànhrợu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng lại có khả năngtạo thành sinh khối tế bào, vì thế nấm men đợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệpthực phẩm để sản xuất rợu, bia, nớc giải khát lên men, sản xuất men bánh mỳ… [5] Chính những u điểm này mà nấm men đợc ứng dụng vào giai đoạn đồng hoá đ-ờng, giúp tăng hiệu suất thu hồi alpha cyclodextrin

1.3.2 Cấu tạo của tế bào nấm men

Tế bào nấm men có cấu tạo khá phức tạp, bao gồm:

- Vỏ tế bào

- Màng nguyên sinh chất

- Nguyên sinh chất

- Bầu mô (chồi).

1.3.3 Hoạt động của tế bào nấm men

* Giai đoạn phát triển tăng sinh khối

Nấm men là biểu hiện vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện Nếu đợc cung cấp đầy đủoxy thì nó phát triển ồ ạt, số lợng tế bào tăng nhanh, còn rợu không đợc trực tiếp tạothành hoặc tạo thành rất ít

Quá trình diễn ra theo phơng trình:

C6 H12 O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O + Q

Trong quá trình này, nấm men sủ dụng nguồn thức ăn từ môi trờng, sử dụngnguồn oxy đợc cung cấp để tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể

Quá trình sinh trởng của nấm men diễn ra trong 4 pha nh sau:

- Pha tiềm sinh : Nấm men thích nghi dần với điều kiện của môi trờng

- Pha logarit : Khi đã thích nghi đợc với điều kiện môi trờng, nấm men tăng trởng vớitốc độ rất nhanh Sau một khoảng thời gian nhất định từ 24- 32 giờ, lợng sinh khối

đạt giá trị cao nhất

- Pha cân bằng : Tại thời điểm này mật độ tế bào tăng hoặc giảm rất ít

- Pha suy vong : Lúc này, tế bào bắt đầu già và có hiện tợng thoái hoá Số tế bào chết

đi ngày càng nhiều hơn tế bào sống

Qua đó, ngời ta điều khiển việc cung cấp oxy cho môi trờng để thúc đẩy quátrình tăng sinh khối của nấm men

* Giai đoạn lên men

Khi không đủ oxy hoặc yếm khí, lợng sinh khối không tăng nhiều nh trớc nữa

mà chủ yếu diễn ra quá trình lên men rợu Trong đó, nấm men đóng vai trò tác nhântrực tiếp gây ra những biến đổi cơ bản của quá trình Đó là sự chuyển hoá đờng, chủyếu là glucoza và fructoza thành rợu

Mặc dù rợu là sản phẩm chính của quá trình lên men nhng ngoài rợu còn cómột số sản phẩm phụ khác do nấm men tổng hợp đợc cũng ảnh hởng chất lợng sảnphẩm tạo thành nh glyxerin, axit hữu cơ, vitamin, este…

Mỗi loài nấm men có khả năng đồng hoá và lên men một số loại đờng nhất

định Đối với nấm men dùng ở đây thì khả năng đồng hoá đờng glucoza, maltoza…

là đợc quan tâm chính

1.4 quá trình đồng hoá đờng

Tất cả các quá trình chuyển hoá liên quan đến quá trình tổng hợp và phân huỷtrong cơ thể vi sinh vật, cũng nh nấm men đợc gọi chung là quá trình trao đổi chất.

Sự trao đổi chất của cơ thể bao gồm hai quá trình chính:

Hàm lợng đờng ban đầu ảnh hởng trực tiếp đến hoạt động nấm men Nồng độ

đờng thích hợp cho đa số các loài nấm men là khoảng dới 220 g/l Nếu vợt quá giá trịtrên thì tế bào nấm men sẽ bị ức chế Tuy nhiên, vẫn có một số chủng nấm men cókhả năng lên men tốt ở hàm lợng đờng cao Nấm men sinh trởng dễ đàng hơn ở nồng

độ đờng thấp

* Lợng nấm men sử dụng

Bằng thực nghiệm các nhà khoa học đã chứng minh rằng vận tốc phát triểnphụ thuộc không chỉ vào nồng độ các chất dinh dỡng mà cả vào mật độ nấm mentrong môi trờng Khi nồng độ tế bào lớn thì vận tốc sinh sản giảm vì sự trao đổi chấtgiảm Do vậy, trong các thiết bị nuôi cấy men ở dạng công nghiệp thì nồng độ nấmmen không nên quá 60 – 70 g/l (tính nấm men có độ ẩm 75 %)

* Thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy chính là yếu tố rất quan trọng trong quá trình đồng hoá đ ờng Với một nồng độ đờng nhất định trong dịch thì khoảng thời gian thích hợp choquá trình đồng hoá chính là yếu tố rất cần thiết trong quy trình công nghệ Thời gianquyết định quá trình đồng hoá có hết đờng hay không của nấm men Nói cách khác,chính thời gian cũng quyết định khả năng đồng hoá

Tuy nhiên, thời gian nuôi cấy thích hợp không chỉ phụ thuộc vào nồng độ dịch

đờng ban đầu mà nó còn phụ thuộc vào cả nhiệt độ

* Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hởng lớn đến tốc độ sinh trởng và khả năng đồng hoá của nấmmen Nhiệt độ tối thích thay đổi tuỳ theo mỗi loài, chủng men và còn tuỳ thuộc vàotừng giai đoạn sinh trởng của nấm men

Do nhiệt độ có ảnh hởng lớn đến chất lợng sản phẩm., nên cần duy trì nhiệt độ

ổn định trong suốt thời kỳ nuôi cấy

* Oxy

Trong giai đoạn đầu của quá trình, tế bào nấm men rất cần oxy để sinh trởng

và phát triển số lợng tế bào Nếu lợng oxy cung cấp không đủ thì số tế bào sẽ bị hạnchế, ảnh hởng đến khả năng đồng hoá đờng

* Các yếu tố khác

Ngoài các yếu tố kể trên, nấm men còn chịu ảnh hởng của một vài yếu tố khác

có mặt trong quá trình đồng hoá nh:

- Độ pH cũng là một trong các yếu tố có gây ảnh hởng đến hoạt động của nấm men

Độ pH tối thích cho nấm men hoạt động là 4 – 6

- Chất khoáng cũng rất cần thiết cho nấm men nhất là trong giai đoạn sinh trởng tănglợng sinh khối Nấm men còn chịu ảnh hởng của các chất kích thích sinh trởng nhbiotin, vitamin…

- Các chất ức chế cũng gây ảnh hởng đến quá trình sinh trởng và phát triển của nấmmen

- Các sản phẩm phụ trung gian xuất hiện trong quá trình nếu đợc tích tụ dần có thể

ức chế hoạt động của nấm men Sự khuếch tán CO2 vào môi trờng cũng gây kìm hãm

sự trao đổi chất

Nh vậy, quá trình đồng hoá chịu ảnh hởng của nhiều yếu tố ở các mức độ nhất

định Muốn thu đợc alpha cyclodextrin với hiệu suất thu hồi cao và tinh khiết thì cầnchọn các điều kiện tốt nhất cho từng giai đoạn sinh trởng và phát triển của nấm men

* Enzim và nấm men

 Chế phẩm enzim Glucoamylaza (AMG) của hãng NOVO Đan Mạch Đây là chếphẩm dạng lỏng, màu nâu, có tỉ trọng xấp xỉ 1,2 g/ml chứa glucoamylaza sản xuất từ

chủng Aspergillus niger.

 Sumizyme L của Shin Nihon Chemical Co.,Ltd, Nhật Bản Đây là chế phẩmdạng bột, màu vàng nhạt, có chứa enzym -amylaza hoạt lực cao (100.000 u/g), sản

xuất từ chủng Aspergillus oryzae.

 Nấm men bánh mỳ của Mori Langa, Việt Nam Đây là chế phẩm nấm men khô,

màu vàng nhạt, sản xuất từ chủng Saccharomyces cerevisiae.

* Than hoạt tính

Than hoạt tính đợc sử dụng trong quá trình làm sạch và có nguồn gốc từ Nhật

Bản

2.1.2 Thiết bị

 Máy quang phổ UV- vis spectrophotometer 1601 của hãng Shimazu (Nhật)

 Máy đo pH: Thermor Orion_ metter_ Model 410 (Trung Quốc)

 Máy đo độ ẩm: Precisa HA60 (Thuỵ Sĩ)

 Khúc xạ kế cầm tay

 Micropipet (Đức)

 Nồi cách thuỷ GF1 mbH D3006 (Đức)

 Tủ lạnh

- Glucoza tinh khiết (>99%).

* Tiến hành

- Dựng đồ thị chuẩn glucoza

+ Pha dãy dung dịch glucoza chuẩn có nồng độ 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50 mM + Cho 1ml mỗi dung dịch chuẩn trên vào ống nghiệm khô sạch (mỗi nồng độ 2ống)

+ Thêm vào mỗi ống nghiệm 3ml thuốc thử DNS

+ Đun sôi mẫu 5 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng

+ Đo mật độ quang của mẫu ở bớc sóng 575 nm với đối chứng là nớc cất

+ Vẽ đờng chuẩn glucoza, với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ

- Xác định hàm lợng đờng khử trong mẫu

Mẫu dung dịch đem phân tích, nếu cần phải pha loãng sao cho mật độ quangnằm trong khoảng 0,2 - 0,8 Pha hỗn hợp phản ứng rồi đo mật độ quang nh phầndựng đồ thị chuẩn Từ kết quả đo đợc và căn cứ vào đờng chuẩn, xác định đợc hàm l-ợng glucoza trong mẫu

trong đó: a: lợng đờng khử trong mẫu đo (g)

b: tỷ lệ pha loãng mẫu

* Cách tiến hành

Dịch sau khi đờng hoá đợc bổ sung than hoạt tính với các tỉ lệ khác nhau đểxác định tỉ lệ than hợp lí nhất cho sản xuất Quá trình ủ đợc tiến hành ở 800C trongthời gian 30 phút sau đó dịch đợc lọc qua giấy lọc

2.2.4 Xác định mật độ tế bào bằng phơng pháp đo mật độ quang

Khi sinh trởng trên môi trờng lỏng các tế bào vi sinh vật có thể làm đục môi

tr-tế bào Phép đo độ đục đợc tiến hành trên máy đo quang phổ với bớc sóng 600 nm,

ánh sáng ở phạm vi này ít bị hấp thu bởi các thành phần của tế bào [1]

2.2.5 Xác định độ hấp thụ màu Abs

Sử dụng máy UV- 1601PC

Bằng máy đo độ ẩm Precisa HA60 (Thuỵ Sĩ)

2.2.9 Đánh giá cảm quan theo phép thử cho điểm Fisher

* Khái niệm

Phép thử cho điểm Fisher đợc sử dụng khi ta muốn so sánh nhiều mẫu với nhau

về nhiều tính chất cảm quan và ở nhiều mức độ khác nhau theo các thang điểm khácnhau Thông thờng, các thang đợc sử dụng ở đây là thang không liên tục