Phân lập và sàng lọc vi khuẩn biển định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan từ rong nâu việt nam

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng đường, sulfate và uronic acid theo tỷ lệ mol của fucoidan từ năm Bảng 1.2 Hoạt tính fucoidanases ở một số động vật không xương sống 21 Bảng 1.3 Sự đặc hi

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

Mã số sinh viên : 54130064

Khánh Hòa: 2016

Mã số sinh viên : 54130064

Khánh Hòa, tháng 07/2016

LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới ThS Văn Hồng Cầm và ThS NCS Cao Thị Thúy Hằng Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã vô cùng tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn toàn thể ban lãnh đạo, các cán bộ của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, đặc biệt là cán bộ phòng Hóa phân tích và phòng Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện hỗ trợ và giúp đỡ em để em có đủ điều kiện thực hiện đồ án

Em xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, phòng đào tạo Đại học và sau Đại học cùng các thầy cô Trường đại học Nha Trang đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm đồ án

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn luôn ở bên, quan tâm, chia sẻ những khó khăn, động viên, đốc thúc và là nguồn động lực to lớn để em hoàn thành đồ án này

Nguyễn Duy Hoài An

1.2.2.2 Nguồn thu từ động vật không xương sống biển 20

1.2.5 Các yếu tố dinh dưỡng của môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng

1.2.6 Một số phương pháp xác định hoạt tính enzyme fucoidanases 29

1.2.9 Tình hình nghiên cứu và sử dụng fucoidanase trên thế giới và ở Việt Nam 34

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.2.1 Phân lập vi khuẩn bằng phương pháp khuẩn lạc 38 2.2.2 Sàng lọc vi khuẩn định hướng sinh enzyme bằng đĩa thạch 38 2.2.3 Khảo sát hoạt tính dịch chiết enzyme thô tách chiết từ dịch lên men vi

2.2.5 Khảo sát các điều kiện lên men tối ưu cho vi khuẩn sinh enzyme có hoạt

3.2 Sàng lọc vi khuẩn định hướng sinh enzyme fucoidanase 46 3.3 Khảo sát hoạt tính dịch chiết enzyme thô từ dịch lên men vi khuẩn định hướng

3.5 Khảo sát điều kiện lên men tối ưu của chủng 16NT 215 52

DANH MỤC VIẾT TẮT

BSA Bovine serum albumin

DNA Deoxyribonucleic acid

PCR Polymerase chain reaction

rRNA Ribosome ribonucleic acid

C-PAGE Carbohydrate–polyacrylamide gel electrophoresis

HDL – C High Density Lipoprotein-Cholesterol

HGF Human Hepatocyte Growth Factor

HIV Human Immunodeficiency Virus

DVT Deep Vein thrombosis

PBS Phosphate Buffered Saline

ANOVA Analysis Of Variance

GC/MS Gas chromatography/mass spectrometry

ESI – MS Electrospray Ionisation Mass Spectrometry

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mô hình cấu trúc fucoidan từ Fucus vesiculosus của Pankter 12 Hình 1.2 Mô hình cấu trúc fucoidan từ Ascophyllum nodosum 12 Hình 1.3 Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum swartzii ở Việt Nam 13 Hình 1.4 Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum polycystum ở Việt Nam 13 Hình 1.5 Số lượng bài công bố về fucoidan và fucoidanases trên thế giới 34 Hình 2.6 Sơ đồ tóm tắt toàn bộ qui trình thực hiện 37 Hình 2.8 Sơ đồ tóm tắt qui trình tách chiết thu enzyme thô 40

Hình 2.9 Sơ đồ tóm tắt qui trình khảo sát điều kiện lên men tối ưu 43 Hình 3.10 Sàng lọc vi khuẩn định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan bằng

phương pháp đĩa thạch trên cơ chất fucoidan từ rong S mcclurei 47 Hình 3.11 Kết quả thử nghiệm hoạt tính dịch chiết enzyme thô chủng 16NT 215 49 Hình 3.12 Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% 50 Hình 3.16 Thử nghiệm đĩa thạch sự ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng

Hình 3.17 Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ pepton đến khả năng sinh

Hình 3.18 Thử nghiệm đĩa thạch sự ảnh hưởng của nồng độ pepton đến khả năng

Hình 3.19 Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ nuôi lắc đến khả năng sinh tổng

Hình 3.20 Thử nghiệm đĩa thạch sự ảnh hưởng của tốc độ nuôi lắc đến khả năng

Hình 3.22 Thử nghiệm đĩa thạch sự ảnh hưởng của thời gian nuôi lắc đến khả năng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng đường, sulfate và uronic acid theo tỷ lệ mol của fucoidan từ năm

Bảng 1.2 Hoạt tính fucoidanases ở một số động vật không xương sống 21 Bảng 1.3 Sự đặc hiệu đối với cơ chất của một số loại fucoidanases từ vi khuẩn biển 25 Bảng 1.4 pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của một số enzyme thủy phân fucoidan

MỞ ĐẦU Fucoidan từ rong Nâu Việt Nam ngày nay đã được biết đến rộng rãi như một loại thực phẩm chức năng với đặc tính sinh học đa dạng và thú vị của nó Fucoidan có những hoạt tính đáng quí như chống đông cục máu, kháng khuẩn, kháng virus (kể cả HIV) (Bui Huu Tai và cs., 2011), chống nghẽn tĩnh mạch, chống ung thư (Nguyễn Duy Nhứt và cs., 2008), chống viêm khớp, giảm mỡ máu đã được tiến hành lâm sàng trên người (Nguyễn Duy Nhứt và cs., 2008)

Nguồn tài nguyên biển phong phú trong bờ biển dài hơn 3000 km của nước ta là một tài sản vô cùng đáng giá Việt Nam là một nước có điều kiện thuận lợi cho rong biển phát triển, riêng thành phần loài rong biển của Việt Nam đến nay đã xác định lên đến 800 loài, gồm các ngành rong Nâu, rong Đỏ, rong Lục Trong đó, đa số các chi

trong ngành rong Nâu có sản lượng tự nhiên lớn là các chi Sargassum, Hormophysa,

Hydroclathrus (Lê Như Hậu và cs., 2009) Riêng tính sản lương rong Mơ – Sargassum

thì sản lượng hằng năm đã lên đến 20.000 tấn khô/năm (Lê Như Hậu và cs., 2009) Fucoidan trong rong Nâu chiếm từ 4 – 8% trọng lượng khô (Lê Như Hậu và cs., 2009)

Do đó, việc khai thác được nguồn polysaccharide đáng quí này là vô cùng to lớn và ý nghĩa

Fucoidan là tên được đặt riêng cho một sulfate polysaccharide chỉ có trong thành phần của ngành rong Nâu mà không có trong thành phần của các loài thực vật hay động vật khác Fucoidan có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính đa dạng của liên kết glycosidic và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer Dựa vào những lí do trên, người ta cần có một phương pháp hữu hiệu để cắt mạch fucoidan, một phần là để nghiên cứu về cấu trúc của chúng, về ý nghĩa của nhóm sulfate đặc trưng trong các hoạt tính sinh học Phần còn lại để phục vụ cho mục đích chữa trị của fucoidan vì các mạch nhỏ fucoidan sẽ được hấp thụ dễ dàng hơn cả phân tử lớn mà vẫn giữ được hoạt tính của mình vì còn nguyên gốc sulfate Hơn nữa, việc fucoidan có phân tử khối lớn sẽ dẫn đến tính nhớt của chúng trong dung dịch có thể hạn chế các hoạt tính sinh học của nó

Các phương pháp hóa học có thể dùng acid đặc, kiềm đặc hay nhiệt độ cao để cắt mạch fucoidan dẫn đến khả năng biến tính fucoidan và mất đi hoạt tính đáng quí vốn có (Cao Thị Thúy Hằng, 2011) Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp sinh học mà

cụ thể là sử dụng enzyme để cắt mạch sẽ trở nên hiệu quả hơn với mục đích sử dụng fucoidan của các nghiên cứu

Enzyme phân cắt fucoidan có thể được tìm thấy ở nhiều loài sinh vật biển bao gồm động vật không xương sống hay vi sinh vật biển Chúng có khả năng sử dụng fucoidan như một cơ chất để phục vụ cho mục đích sinh trưởng và phát triển của mình Đặc biệt đối với việc thu enzyme từ vi sinh vật sẽ có nhiều thuận lợi Vi sinh vật sinh sản phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng

tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá

dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Lượng enzyme có thể được sản xuất ra trong một thời gian ngắn

Vì những lí do trên, trong khuôn khổ đồ án tốt nghiệp này, được sự hỗ trợ của

Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Nha Trang, em thực hiện đề tài: “Phân lập và sàng lọc

vi khuẩn biển định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan từ rong Nâu Việt Nam”

Nội dung bao gồm:

 Phân lập vi khuẩn biển từ các nguồn sinh vật biển thuộc vùng biển Nha Trang

 Sàng lọc vi khuẩn biển sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan

 Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử

 Lựa chọn và khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để chủng vi khuẩn sinh enzyme có hoạt tính cao

1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về fucoidan

1.1.1 Khái niệm

Fucoidan lần đầu tiên được Kylin mô tả và đặt tên là fucoidin vào năm 1913 Tác giả đã tách chiết được fucoidin bằng phenylhydrazone vào năm 1915 từ loài rong

Nâu Laminaria digitata, cho thấy rằng methyl pentose có mặt trong dung dịch thuỷ

phân fucoidin (Black và cs., 1952) Năm 1937 Lunde, Heen và Öy kết tủa dịch chiết fucoidin bằng cồn, xác định được cấu trúc của chúng là: (R.R1.O.SO2.O.M)n, trong đó

R là fucose, R1 không biết là gì, M có thể là K, Na, Ca hoặc Mg, tổng sulfate khoảng 35.5 – 37.5% Percival và Ross vào năm 1950 đã chiết fucoidin bằng nước sôi trong 24

giờ, xác định được trong dịch thuỷ phân fucoidin từ Fucus vesiculosus, F spiralis,

Himanthalia lorea, L cloustoni, ngoài fucose còn có uronic acid, galactose, xylose,

tổng sulfate 32.4%, đó là polysulfatefucose, với liên kết 12 glycosidic và sulfate ở vị trí C – 4, cấu trúc này được khẳng định lại một lần nữa bởi O Neill (1954), Côte (1959) và nó tồn tại đến 40 năm sau (Mulloy, 2003)

Năm 1959, McNeely đổi tên fucoidin thành fucoidan trong khi phân loại polysacaride (Mulloy, 2003) Năm 1948, Vasseur tìm thấy methyl pentose sulfate cũng

có trong các loài động vật nhuyễn thể dưới biển, mặc dù vậy cho mãi đến năm 1987 không có nghiên cứu cấu trúc nào cho dạng fucan sulfate của động vật này Theo IUPAC định nghĩa fucan sulfate là polymer của fucose sulfate (polymer có thành phần đơn phân tử là đường thì khi tạo thành polymer hậu tố -ose được đổi thành -an), và thường chỉ dùng cho polysaccharide trong động vật, còn fucoidan được đặt tên riêng cho dạng polysaccharide sulfate tách chiết từ rong Nâu (Mulloy, 2003) trong đó fucose khoảng chừng 20 – 60% (Maria và cs., 2006), 18.6 – 32.8% (Maria và cs., 2001) các tác giả đã dùng tên này đặt cho các sản phẩm chiết từ rong Nâu của mình bên cạnh các tên khác như fucogalactan sulfate, fucoglucuronomannan sulfate, xylofucoglucuronan sulfate,… (Mulloy, 2003)

1.1.2 Cấu trúc

Những loại fucoidan được tách chiết từ các loại rong khác nhau thì có cấu trúc khác nhau Bởi vậy, mặc dù fucoidan đã được phân lập lần đầu tiên bởi Kylin gần 100

năm trước, nhưng cho đến nay mới chỉ có rất ít cấu trúc được xác lập Để xác định cấu trúc của fucoidan thì những thông số cơ bản sau cần được xác định (i) thành phần các gốc đường và nhóm sulfate (ii) vị trí nhóm sulfate trong các gốc đường (iii) vị trí liên kết giữa các gốc đường (iv) trật tự sắp xếp các gốc đường (Nguyễn Duy Nhứt, 2008)

Một số các loài rong Mơ thuộc chi Sargassum tại Việt Nam đã được nghiên cứu

về thành phần đường trung tính, lượng uronic acid và NaSO3cho thấy sự đa dạng về cấu trúc của fucoidan từ những loài rong khác nhau, được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Hàm lượng đường, sulfate và uronic acid theo tỷ lệ mol của fucoidan từ năm

loại rong mơ ở Khánh Hòa (Nguyễn Duy Nhứt, 2008)

Fucoidan từ rong Fucus vesiculosus được thương mại hóa tại thời điểm hiện

nay có thành phần gồm 44.1% fucose, 26.3% sulfate và 31.1% tro cùng một lượng ít aminoglucose (Bo và cs., 2008) Dựa trên kết quả của quá trình methyl hóa và xử lí bằng kiềm, Conchie và O’Neil đã tìm ra được thành phần chính của fucoidan này là đường α – 12 – fucose và một số các nhóm sulfate ở vị trí C - 4 của đơn vị fucose Bằng phương pháp khối phổ IR, Anno và cs đã phân lập được L – fucose 4–sulfate từ loại rong trên và báo cáo rằng nhóm sulfate là nhóm thế ở vị trị axial C – 4 của đơn vị

L – fucopyranose (Anno và cs., 1970) Mô hình cấu trúc của Conchie được chấp nhận trong vòng bốn mươi năm Vào năm 1993, dữ liệu GC/MS của quá trình methyl hóa

do Pankter và cs đã cho ra một mô hình cấu trúc mới, giả thiết rằng mạch chính của fucoidan là một polymer của fucose có liên kết α – 13 với nhóm sulfate thế ở vị trí C – 4 trong một vài gốc fucose, fucose thì được đính vào mạch để hình thành nên mạch nhánh và cứ mỗi 2 – 3 đơn vị fucose thì có một nhóm thế Cấu trúc được thể hiện ở hình 1.1

Thành phần mol đường trung tính Loài rong

SO3 -Na (%) w/w

Uro nic acid (%) w/w

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc fucoidan từ Fucus vesiculosus của Pankter

(Bo và cs., 2008) Một số các nghiên cứu khác đã được công bố, vào năm 2001, Maria và các cs

đã tìm ra cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Ascophyllum nodosum, mạch fucan có liên kết

α – 13, α – 14, mạch nhánh có liên kết α – 12 và nhóm sulfate ở vị trí C – 2, C –3

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc fucoidan từ Ascophyllum nodosum

(Maria và cs., 2001) Fucoidan có thể có mạch nhánh, trong phân tử có sự hiện diện của một số các gốc đường khác nhau và có thể có các gốc acetyl cũng như sulfate phân bố không theo một qui luật nào, kết quả của phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân cũng chỉ cho biết một phần thông tin về cấu trúc của chúng mà thôi (Maria và cs., 2006) Vì vậy, cho

đến nay việc mô tả hoàn chỉnh cấu trúc của fucoidan rong biển là việc vô cùng khó khăn (Silva và cs., 2005)

Fucoidan Việt Nam, ngoài thành phần sulfate fucose, còn có mặt nhiều thành phần đường đơn khác như mannanose, glucose, galactose, xylose , vì vậy chúng có cấu trúc phức tạo hơn nữa Một vài ví dụ về cấu trúc của fucoidan Việt Nam đã được

công bố, chẳng hạn như fucoidan từ rong Nâu Sargassum swartzii vào năm 2009

(Hình 1.3) (Nguyễn Duy Nhứt và cs., 2009)

Hình 1.3 Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum swartzii ở Việt Nam

Và cấu trúc của fucoidan từ rong Nâu Sargassum polycystum vào năm 2008

MS (Nguyễn Duy Nhứt, 2008)

1.1.3 Hoạt tính sinh học của fucoidan

Fucoidan có hoạt tính chống đông cục máu, kháng khuẩn, kháng virus (kể cả HIV), chống nghẽn tĩnh mạch, chống ung thư, chống viêm khớp, chống viêm nhiễm,

giảm mỡ máu, hạ cholesterol, ức chế miễn dịch có thể sử dụng cho ghép phủ tạng (Bo

và cs., 2008)… Fucoidan không gây độc cho người, đã được FDA cho phép sử dụng làm thực phẩm chức năng vào năm 2001 (Bo và cs., 2008)

Hoạt tính chống đông máu

Sự đông máu là một quá trình phức tạp qua đó tạo ra các cục máu đông Đông máu là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu Khi thành mạch máu bị tổn thương, máu được cầm nhờ chỗ tổn thương được che phủ bởi cục máu đông chứa tiểu cầu và sợi huyết Rối loạn đông máu có thể làm tăng nguy cơ chảy máu và/hoặc tạo cục máu đông và huyết tắc Những nơi thông thường nhất để hình thành cục máu đông

là chân (nghẽn tĩnh mạch sâu hay DVT) hoặc là phổi (tắc phế quản hay PE) (Qiu và Amarasekara, 2006)

Hoạt tính này có liên quan đến hàm lượng và vị trí gốc sulfate cũng như thành phần và khối lượng của phân tử đường (Qiu và Amarasekara, 2006) Đa số các hoạt động chống đông của fucoidan thông qua trung gian thrombin bằng cách ức chế cofactor heparin II (Qiu và Amarasekara, 2006)

Hoạt tính chống đông máu qua trung gian ức chế cofactor heparin II của fucans sulfate hóa quá độ tăng lên rõ rệt khi hàm lượng gốc sulfate được tăng lên (Nishino và

Nagumo, 1992) Qiu và cs báo cáo rằng fucoidan cho thấy hoạt tính chống đông cao

gấp bốn lần, tăng gấp đôi thời gian prothrombin của huyết tương người được citrate hóa so với fucoidan thuần khiết (Qiu và Amarasekara, 2006)

Hoạt tính kháng virus

So với các thuốc kháng virus hiện có, fucoidan dường như có ít độc tính hơn nên đang được các nhà khoa học đưa vào một số loại thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh (Bo và cs., 2008)

Fucoidan không trực tiếp bất hoạt hoạt động của virus mà ức chế sự hấp phụ virus để ngăn cản sự hình thành hợp bào (Hemmingson, 2006) Fucoidan được hấp thụ bằng đường uống có thể cho thấy hiệu quả bảo vệ rõ rệt qua việc ức chế sự nhân lên của virus và kích thích cả hệ miễn dịch tự nhiên và đặc hiệu Gốc sulfate cũng rất quan trọng trong hoạt tính chống virus Gốc sulfate ở vị trí C – 4 của gốc đường (1→3)–

fucopyranosyl cho thấy vai trò quan trọng trong việc chống lại virus Herpes của fucoidan (Mandal và cs., 2007)

Họat tính kháng khối u và điều hòa miễn dịch

Ung thư được xem là căn bệnh đáng quan tâm trong đời sống hiện nay Các phương pháp điều trị ung thư được biết đến ngày nay như xạ trị, phẫu trị và hóa trị Trong đó, các liều thuốc dành cho hóa trị ít nhiều đều gây ra những tác dụng phụ có hại đến người điều trị như bị nhờn thuốc, gây độc cho các tế bào lành dẫn đến buồn nôn, rụng tóc, … Do đó, việc tìm thấy một hợp chất thiên nhiên để ức chế các tế bào khối u thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu hơn cả

Fucoidan từ một số các loại rong như L japonica, L saccharina, L digitata, F

serratus, F distuchus được công bố là có một số các hiệu ứng tích cực trong việc

kháng lại tế bào ung thư như ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan QGY7703, ức chế sự tăng sinh và kích thích quá trình chết theo chu trình của dòng tế bào HS – Sultan lympho người (Usui và cs., 1980) (Song và cs., 2000) (Shi và cs., 2000)

Cơ chế của hoạt tính kháng khối u đến nay vẫn chưa được hiểu rõ Đối với tế

bào ung thư vú MDA – MB – 231, Liu và cs đã đặt giả thiết về việc fucoidan ức chế

sự bám dính của tế bào lên fibronectin bằng các phương thức khác nhau (Liu và cs., 2005)

Bên cạnh đó, fucoidan cũng có khả năng tác động lên hệ miễn dịch thông qua việc kích thích chức năng một số dòng tế bào như tế bào lympho T, tế bào B, đại thực bào và tế bào giết tự nhiên Thông qua nhiều con đường, fucoidan có khả năng ngăn chặn các tế bào ung thư thông qua việc tăng cường hoạt động điều hòa miễn dịch của

cơ thể (Liu và cs., 2005)

Hoạt tính chống oxi hóa

Rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác động chống oxy hóa rõ rệt của fucoidan

trong các thí nghiệm in vitro Đây là một chất chống oxy hóa tự nhiên rất tuyệt vời và

nó có khả năng giảm trừ những bệnh gây ra do các gốc tự do

Fucoidan từ L japonica có khả năng ngăn cản sự tăng lên của các gốc peroxide

(LPO) trong huyết thanh, gan và thận của chuột bị tiểu đường Chúng có tác động quét mạnh mẽ các gốc superoxide, còn đối với gốc hydroxyl thì tác động này dường như

yếu hơn (Zhang và cs., 2003) Bên cạnh đó, fucoidan từ F vesiculosus và fucans (heterofucans) từ Padina gymnospora có tác động ức chế sự hình thành gốc hydroxyl

và gốc superoxyl (Micheline và cs., 2007)

Việc sở hữu hoạt tính sinh học này của fucoidan cũng có thể liên quan đến lượng sulfate trong phân tử hay trọng lượng phân tử fucoidan, tỉ số lượng sulfate/lượng fucose là một chỉ thị hiệu quả cho những thí nghiệm về hoạt tính chống oxy hóa (Wang và cs., 2008)

Hoạt tính giảm lipid máu

Rối loạn lipid máu được xem là có các triệu chứng như tăng cholesterol huyết tương, tăng trigyceride trong máu và giảm lượng HDL-C Việc rối loạn lipid máu có thể dẫn đến hiện tượng lipid đóng mảng trong mạch máu do đó gây nên nhiều hậu quả như cao huyết áp, tắt nghẽn mạch máu

Fucoidan từ L japonica đã được cho thấy là làm giảm lượng cholesterol,

triglyceride và LDL-C, tăng lượng LDL-C trong huyết thanh của chuột có quá nhiều huyết thanh trong máu (hypercholesterolaemia) và chuột có quá nhiều lipid trong máu (hyperlipidaemia) (Bo và cs., 2008)

Fucoidan cũng như sialic acid, nó có khả năng làm tăng điện tích âm của bề mặt

tế bào do đó, các cholesterol trong máu sẽ kết tụ lại, vì vậy, lượng cholesterol trong huyết thanh sẽ giảm (Bo và cs., 2008)

Tính năng chống bổ thể

Hệ thống bổ thể là thành phần chính trong hoạt động miễn dịch và nó tham gia chủ yếu vào đáp ứng miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch thể loãng Nó có thể cho phép hệ thống miễn dịch tự nhiên liên kết với miễn dịch có điều kiện Một khi quá trình này xảy ra vượt mức kiểm soát thì sẽ gây hại cho vật chủ, như trường hợp thiếu máu hay sốc phản vệ và việc từ chối cấy ghép ngoại lai (Bo và cs., 2008)

Cấu trúc và đặc tính mang điệm âm của fucoidan cũng giống như heparin Heparin kích thích sự sản sinh ra nhân tố phát triển tế bào gan (HGF: hepatocyte growth factor), nhân tố này là chìa khóa để tái tạo nên mô Fucoidan và những oligosaccharides có nguồn gốc fucoidan cũng có khả năng tương tự kích thích sản xuất

HGF giống như heparin và oligosaccharides có nguồn gốc từ heparin Việc cảm ứng HGF từ heparin hay fucoidan đều xảy ra ở mức sơ cấp, tức là thông qua quá trình dịch

mã, với chung một cơ chế Fucoidan có thể trở nên hữu ích để bảo vệ mô và cơ quan khỏi các chấn thương và bệnh tật với chung một cơ chế với heparin (Fukuta và Nakamura, 2008)

Ngoài ra, fucoidan còn có một số các đặc tính khác trong điều trị Người ta đã

đề nghị sử dụng fucoidan để chữa trị bệnh thiếu máu cục bộ bằng phương pháp tạo mạch Fucoidan phân tử lớn sẽ bám dính vào yếu tố sinh trưởng như FGFs và từ đó bảo vệ chúng khỏi bị phân hủy Bên cạnh đó, fucoidan còn có thể góp phần trong công tác chữa trị trong việc đặt stent trị hẹp động mạch vành ở người Một nghiên cứu khác cho thấy những fucan có khối lượng phân tử thấp sẽ trở nên hiệu quả trong quá trình cấy ghép tim mạch allograft để chống lại ngăn ngừa tổn thương động mạch và nhu mô

để đáp ứng lại tổn thương do đồng dị miễn dịch (Alkhatib và cs., 2006)

Hoạt tính kháng viêm

Fucoidan trong 09 loại rong Nâu trong nghiên cứu của Bo Li, 2008 đã có thể ức chế sự tham gia của bạch cầu vào quá trình viêm của chuột Người ta nhận thấy rằng hàm lượng fucose và sulfate cũng như là các cấu trúc khác không ảnh hưởng đến hiệu quả của fucoidans trong mô hình này Fucoidan Mekabu có thể có tác dụng trong điều trị viêm phổi và có thể trở nên hữu ích trong việc điều trị viêm cấp tính (Bo và cs., 2008)

Hoạt tính bảo vệ dạ dày

Fucoidan từ Cladosiphon okamuranus Tokida là một cơ chất an toàn với khả

năng bảo vệ dạ dày Một loại thuốc chống loét dạ dày và ngăn cản sự bám dính của

Helicobacter pyoli có chứa fucoidan như một thành phần tích cực đã được cho ra đời

Loại thuốc này có thể chữa trị hiệu quá và ngăn cản sự loét dạ dày cũng như niêm mạc

dạ dày, đồng thời, nó cũng có thể ngăn chặn sự bám dính của Helicobacter pyoli lên dạ

dày (Itsuko và cs., 1995)

Ngoài ra, fucoidan còn một số hoạt tính như hoạt tính chống viêm gan

(fucoidan từ Laminaria sp., Sargassum fulvellum) cũng như hoạt tính chống lại bệnh

đường niệu và thận (fucoidan từ F vesiculosus, L japonica) đã được nghiên cứu (Bo

và cs., 2008)

1.2 Giới thiệu về fucoidanases

Theo Dulaux (1898), enzyme có tên là cơ chất hoặc sản phẩm quá trình xúc tác cắt mạch cộng thêm ase Như vậy, enzyme cắt mạch fucoidan có tên gọi theo Dulaux

là fucoidanase (King, 1969)

Năm 1972, King đã căn cứ trên kết quả nghiên cứu của (Natalie và Henry, 1967) đã đưa ra định nghĩa fucoidanase EC 3.2.1.44 là endo enzyme, xúc tác cắt đứt liên kết 12  – L – fucosidic trong phân tử fucoidan có nhóm sulfate ở vị trí C – 4 (King, 1969) Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu sau năm 1967 cho thấy fucoidan không chỉ

có liên kết 12, mà còn có 13, 14 glycosidic [phần 1.1.2: Cấu trúc]

Năm 2006, nhóm nghiên cứu enzyme của Viện hàn lâm Nga tại Vladivostok đã đặt tên fucoidanase cho enzyme thủy phân liên kết 13 fucosidic trong fucoidan (Kusaykin và cs., 2016)

Năm 2015, Silchenkoa và nhóm nghiên cứu của mình đã đặt tên fucodanase cho enzyme thủy phân fucoidan có liên kết 14 fucosidic (Silchenkoa và cs., 2015)

Như vậy, việc định nghĩa và tên gọi enzyme xúc tác thủy phân fucoidan đến nay cần có sự thay đổi để đồng nhất Fucoidanase có thể dùng để chỉ enzyme thủy phân bất kỳ liên kết đường nào trong fucoidan, trở về định nghĩa nguyên thủy ban đầu theo Dulaux

Hiện nay, fucoidanase không có hàng thương phẩm (Kim và Kim, 2008)

1.2.1 Khái niệm

Fucoidanases là enzyme có khả năng cắt mạch fucoidan mà không giải phóng

ra nhóm sulfate Do đó, polysaccharide này vẫn giữ được đặc tính sinh học của mình

nhờ nhóm sulfate Enzyme này có thể thu được từ những vi khuẩn như Vibrio sp (Furukawa và cs., 1992), Alteromonadaceae (Sakai và cs., 2004), Pseudoalteromonas

sp (Bakunina và cs., 2002) hoặc Flavobacteriaceae (Descamp và cs., 2005) trong các

động vật nhuyễn thể (Kusaykin và cs., 2003; Wu và cs., 2011) và từ nấm như

Dendryphiella arenaria (Wu và cs., 2011)

1.2.2 Nguồn thu fucoidanases

Fucoidanases có thể được thu từ các nguồn khác nhau, từ các vi khuẩn, vi nấm biển đến các động vật biển

1.2.2.1 Nguồn thu từ vi sinh vật

Vi sinh vật là một nguồn thu enzyme to lớn và hiệu quả Các nghiên cứu trước đây đã tìm ra một số loài vi sinh vật biển (vi nấm, vi khuẩn) có khả năng sinh fucoidanases Enzyme thu được từ mỗi loài khác nhau là khác nhau về các đặc tính lý hóa (pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, cơ chất đặc hiệu, liên kết đặc hiệu,…) Fucoidanases

có thể tồn tại ở ngoại bào hoặc nội bào tùy thuộc vào vi sinh vật

Có rất ít những công bố về fucoidanases thu được từ nấm biển Cho đến nay,

chỉ có hai loại fucoidanases từ Dendryphiella arenaria TM94 và Furasium sp LD8

được phân lập và mô tả cụ thể hoạt tính xúc tác Về pH tối ưu, pH của enzyme từ nấm biển cho thấy hoạt tính tốt nhất ở pH 6.0 và nhiệt độ khoảng 50 - 60˚C (Kusaykin và

cs., 2006) Khối lượng phân tử của fucoidanases từ D arenaria TM94 và Furasium sp

LD8 lần lượt là 180 kDa và 64kDa (Wu và cs., 2011; Wu và cs., 2011) Fucoidanase từ

D arenaria TM94 giữ được hoạt tính của mình trong khoảng pH từ 6.0 – 7.0, thời

gian mất đi một nửa hoạt tính là 1 giờ ở 56˚C Trong khi đó, fucoidanase từ Furasium

sp LD8 thì nhạy cảm với những thay đổi về nhiệt độ hơn, enzyme mất đi một nửa hoạt tính trong thời gian 1 giờ ở 50˚C, pH ở 6.0 (Wu và cs., 2011; Wu và cs., 2011)

Fucoidanases thu được từ vi sinh vật biển đa số có pH hoạt động tối ưu ở pH trung tính hoặc kiềm và chúng đa dạng ở dải nhiệt độ hoạt động (Kusaykin và cs.,

2016) Enzyme từ Vibrio sp N-5 hoạt động ở 50 - 60˚C, trong khi fucoidanase từ

“Fucobacter marina” SA-0082 (Furukawa và cs., 1992) (Takashi và cs., 2010) lại mất hoạt tính ở 30˚C Các chủng vi khuẩn cho thấy có sự sinh tổng hợp fucoidanases thường được phân lập từ các loại rong, trùng biển, hải sâm (Kusaykin và cs., 2016) Fucoidanases phân lập được đa số là fucoidanases nội bào Các enzyme thu được từ ba

chủng vi khuẩn Pseudoalteromonas citrea (KMM 3296, KMM 3297, KMM 3298) xúc tác thủy phân liên kết α – 13 – glycosydic trong fucoidan từ rong Fucus evanescens

và Laminaria cichorioides (Bakunina và cs., 2002) Trong khi đó Flavobacteriaceae xúc tác thủy phân liên kết 14 – O – glycosidic trong fucoidan từ rong Nâu Delvetia

canaliculata (Descamp và cs., 2005) Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234 cho ra

enzyme thể hiện là dạng endo- α – L – fucoidanase (Takashi và cs., 2010) Fucoidanase từ Fucoidanobacter marinus chủng SI-0098 cắt mạch polymer của fucoidan từ rong Nâu Kjellmaniella crassifolia (Urvantseva và cs., 2006) Ngoài ra,

cũng vẫn tồn tại fucoidanases ngoại bào thu được từ vi sinh vật biển, điển hình là

fucoidanases từ Alteromonas sp SN-1009 do nhà khoa học Nhật Bản Sakai phát hiện

năm 2004

Hiện chưa có công bố về fucoidanases phân lập từ vi sinh vật trên cạn

1.2.2.2 Nguồn thu từ động vật không xương sống biển

Fucoidanases có thể được thu từ nhiều ngành động vật không xương sống biển khác nhau, thể hiện ở bảng 2.2

Các enzymes thu được từ động vật không xương sống thường có pH tối ưu là

pH acid, trừ phân tử fucoidanase từ L sitkana có pH tối ưu là 8.5 Fucoidanases phân lập từ động vật thân mềm Haliotus sp., Mizuhopecten yessoensis (Patinopecten

yessoensis) và từ cầu gai biển Strongylocentreotus nudus có vùng pH tối ưu là từ 3.5 –

5.5 Fucoidanases từ các động vật không xương sống có nhiệt độ tối ưu trong khoảng

từ 38 – 45˚C và khối lượng phân tử trải dài từ 85 – 200 kDa (Kusaykin và cs., 2016)

Bảng 1.2 Hoạt tính fucoidanases ở một số động vật không xương sống

(Cao Thị Thúy Hằng, 2011)

tách chiết enzyme

Hoạt tính fucoidanases (UI/mg)Ngành ruột

Lớp san hô Anthoazoa

Actinia sp Bộ máy tiêu hóa 43

Cnidopulus japonicus Tất cả các cơ quan 19

Anthopleura orientalis Tất cả các cơ quan 27

Tialia fellina Tất cả các cơ quan 38 Ngành giun đốt ANNELIDA

Giun nhiều tơ Polichaeta

Tubulamus punctatus Tất cả các cơ quan 28

Chaetoperus cautus Tất cả các cơ quan 235

Eudistylial polymorpha Tất cả các cơ quan 117

Sipunculida phascolosoma Tất cả các cơ quan

80

NEMERTINI Nemertini

Collarenemertes bimaculata Proboscis 105

Động vật Chân khớp ARTHROPODA

Động vật giáp xác Crustacea

Pandalus hypsiuotus Gan tụy 0

Chiohoecetes opilio elongates Gan tụy 0 Pagurus beringanus Tất cả các cơ quan 32 Động vật thân mềm MOLLUSCA

Vỏ một tấm Monoplacophora

Onchidiopsis sp Gan tụy 86

Tritia tratercula Gan tụy 0

Plicifucus plicatus Gan tụy 7

Neptunea bulbacea Gan tụy 2

Neptunea lyrata Gan tụy 0

Astarte borealis Gan tụy 33

Lussiovolutopsius sp Gan tụy 18 Thân mềm hai mảnh

Cyclocardia rjabininae Gan tụy 41

Modiolus difficilus Sợi thủy tinh thể 14

Bộ máy tiêu hóa 0

Bộ máy tiêu hóa 31

Ophiura sarsi

Echinoidea

Strongylocentrotus pallidus

Asteroidea

Leptosterias arctica Distolasterias aligans

Bộ máy tiêu hóa

Bộ máy tiêu hóa

trúc không gian Từ những sự khác nhau đó, fucoidanases trở nên đa dạng về trung tâm hoạt động, cơ chế xúc tác Có thể nói rằng, sự khác nhau về cấu trúc trong phân tử fucoidanases đã dẫn đến những khác nhau về tính chất hóa lí của chúng

Khối lượng phân tử của fucoidanases từ các chủng vi khuẩn thường khoảng 60 đến 100 kDa (Furukawa và cs., 1992) Trong khi các fucoidanases từ nấm mốc và động vật không xương sống biển có khối lượng phân tử lớn hơn, thường từ 100 đến

200 kDa (Furukawa và cs., 1992; Wu và cs., 2011)

Về khối lượng phân tử, fucoidanase từ Fusarium sp LD8 có khối lượng là 64

kDa; khối lượng này gần tương tự như khối lượng của fucoidanases E1, E2, E3 từ

chủng Vibrio sp N-5 (lần lượt là 39 kDa, 68 kDa, và 68 kDa), trong khi khối lượng phân tử của fucoidanase tách từ gan tụy của Patinopecten yessoensis là từ 100–200 kDa và từ Dendryphiella arenaria TM94 là 180 kDa (Furukawa và cs., 1992; Wu và

cs., 2011)

Về sự ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme thì đối với từng nguồn thu fucoidanases khác nhau cũng sẽ cho fucoidanases có những điều kiện hoạt động tối ưu khác nhau Hoạt tính phân cắt của fucoidanases từ chủng LD8 là tối ưu ở pH 6.0, rất

gần với pH tối ưu cho hoạt động của fucoidanases từ Vibrio sp N-5 và Dendryphiella

arenaria TM94 Tại pH = 5.0 và 7.0 thì hoạt tính enzyme chỉ còn lại lần lượt là 68.2%

và 86.4% so với tại pH = 6.0 (Furukawa và cs., 1992; Wu và cs., 2011)

Tương tự như vậy so với sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme,

fucoidanases của các chủng LD8, Vibrio sp N-5 và Flavobacteriaceae SW5 có nhiệt

độ tối ưu lần lượt là ở 60˚C, 37˚C và nhiệt độ phòng (Furukawa và cs., 1992; Wu và cs., 2011)

1.2.4 Cơ chế tác động của fucoidanase

Những enzyme này có khả năng phân cắt các liên kết α –12, α –13, hoặc α–1 4 – glycosidic trong chuỗi polysaccharide của fucoidan Sự khác nhau quan trọng so với sự phân cắt hóa học là bảo tồn được các nhóm sulfate Việc nhóm sulfate của fucoidan không bị enzyme thủy phân chính là điểm quan trọng cho hoạt tính sinh học của nó (Qiu và Amarasekara, 2006)

Fucoidanases có thể được chia ra thành hai nhóm lớn là nhóm tác động exo- và nhóm tác động endo- Exo-fucoidanases có khả năng loại bỏ các phân tử fucose có hoặc không có nhóm sulfate từ đầu không khử của fucoidans Endo- fucoidanases có khả năng loại bỏ cầu nối glycosidic giữa một phân tử fucoidan và sản sinh ra các oligosaccharides với những mức độ polymer hóa khác nhau Trong endo-fucoidanases

có α – L – fucoisidase giải phóng L – fucose ra khỏi đoạn cuối cùng của một phân tử polysaccharide

Cơ chế chính xác của quá trình này vẫn chưa được tìm hiểu rõ (Holtkamp, 2009) Sự đặc hiệu đối với cơ chất của các loại fucoidanases được phân lập từ các nguồn khác nhau là khác nhau, ví dụ bảng 1.3

Bảng 1.3 Sự đặc hiệu đối với cơ chất của một số loại fucoidanases từ vi khuẩn biển

(Kusaykin và cs., 2016)

Hình thức tác động, liên kết

bị bẻ gãy

Tài liệu tham khảo

E1 E2 E3

F crassifolia

Fucose sulfate hoặc fucobiose sulfate

exo Furukawa và

cs (1992)

E1 F evanescens

saccharides sulfate có chứa liên kết α – 1 

Fucooligo-3, α – 1  4 liên kết với gốc fucose

Endo,

β – 1

 3

Sakai, Kimura, Kojima và

cs (2013)

1.2.5 Các yếu tố dinh dưỡng của môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng một phần nào đó liên quan đến hoạt tính enzyme Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme Đề tài này chỉ nghiên cứu đến các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối và hoạt tính enzyme trong điều kiện đó sao cho hoạt tính enzyme thu được là tốt nhất Để nghiên cứu sâu hơn về sự ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đến enzyme, cần phải có những thí nghiệm về động học enzyme sau khi đã tinh chế được enzyme

Yếu tố nguồn cacbon

Nguồn cacbon là một yếu tố thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, đặc biệt, vi sinh vật mục tiêu của đề tài lại sử dụng cơ chất để tổng hợp enzyme cho mình là polysaccharide Do đó, việc nghiên cứu nguồn cacbon là vô cùng quan trọng

Trong điều kiện bình thường, vi sinh vật chỉ tổng hợp ra một lượng enzyme vừa

đủ cho hoạt động sinh lý cơ thể của chúng (thường được gọi là sự tổng hợp enzyme

"bản thể") Nếu khi tăng hàm lượng một số chất hoặc thêm một số chất mới vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt là cơ chất của enzyme, cụ thể ở đây là fucoidan, thì sự tổng hợp enzyme tương ứng tăng lên một cách đáng kể, khác thường có khi còn tổng hợp enzyme mới: hiện tượng trên gọi là sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Chất gây nên

sự cảm ứng sinh tổng hợp gọi là chất cảm ứng Sự tổng hợp một lượng đáng kể enzyme gọi là siêu tổng hợp enzyme

Đối với mỗi loại vi sinh vật, nhu cầu sử dụng nguồn cacbon và nồng độ nguồn cacbon đó là khác nhau Kể cả đối với vi sinh vật sử dụng fucoidan làm cơ chất chính

và nguồn cacbon sơ cấp thì chúng cũng có thể sử dụng các loại đường khác như glucose, sucrose, lactose, fructose hoặc natri acetat làm nguồn cung cấp cacbon thứ cấp để sinh tổng hợp nên enzyme fucoidanase (Rosa và cs., 2010) Bên cạnh đó, việc

khảo sát nguồn cacbon cũng cho ta biết được rằng chủng vi khuẩn đó có cần fucoidan

để cảm ứng cho quá trình sinh enzyme fucoidanase của chúng hay không

Để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp

Điều này có nghĩa là, chúng ta cần phải xem xét giữa việc sử dụng nguồn cacbon là glucose, saccharose bình thường với việc sử dụng fucoidan trong nuôi cấy vi sinh vật thì biện pháp nào sẽ cho chúng ta kết quả tốt hơn

Đối với mỗi chủng vi khuẩn khác nhau thì nồng độ cơ chất tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp enzyme là khác nhau Ví dụ, nồng độ fucoidan tối ưu cho chủng

Pseudoalteromonas ganghwensis NITRA-134 được phân lập từ vùng biển Nha Trang

là 0.15% (Cao Thị Thúy Hằng, 2011), nhưng Vibrio sp N-5 lại có nồng độ fucoidan

tối ưu là 0.3% cho quá trình sinh tổng hợp enzyme của mình (Furukawa và cs., 1992) Tuy nhiên, do đặc tính của mỗi loại fucoidan khác nhau là khác nhau nên việc so sánh

chỉ mang ý nghĩa tương đối

Yếu tố nguồn nitơ

Nitơ đóng vai trò quan trọng trong việc kiến tạo nên cơ thể vi sinh vật như cấu tạo nên các nucleic acid, amino acid, thành tế bào,…, nhu cầu về amino acid đối với mỗi vi sinh vật khác nhau là khác nhau Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật

là NO3- và NH4+ Trong đó, NH4+ được vi sinh vật sử dụng trực tiếp còn NO3- được khử thành NH4+ rồi hấp thu Nguồn nitơ hay được sử dụng nhất trong nuôi cấy vi sinh vật

là pepton và cao nấm men

Với mỗi chủng vi sinh vật khác nhau nhu cầu về nguồn nitơ cũng khác nhau

Chủng Vibrio sp N-5 phát triển tốt nhất trên môi trường bổ sung ammonium nitrat với

tỉ lệ 0,2% (w/v) (Furukawa và cs., 1992) Trong khi đó, các chủng thuộc giống

Cytophaga, Alteromonas và Pseudoalteromonas lại phát triển mạnh trên môi trường

bổ sung nguồn nitơ hữu cơ là pepton 0,5% (w/v) và dịch chiết nấm men 0,2% (w/v) (Bakunina và cs., 2002)

Yếu tố pH

Enzyme là một phân tử lưỡng tính mà các nhóm acid hay base nằm trên bề mặt của chúng Các nhóm điện tích sẽ thay đổi nếu pH môi trường thay đổi Việc thay đổi tổng điện tích trong phân tử enzyme và sự phân bố chúng trên bề mặt phân tử sẽ ảnh hưởng đến khả năng phản ứng của trung tâm hoạt động

Cũng tương tự như các điều kiện khác, giá trị pH thích hợp cho sự sinh trưởng

và phát triển của mỗi chủng vi khuẩn là khác nhau (Bảng 2.4) Hơn nữa, giá trị pH thích hợp cho enzyme sinh ra từ mỗi chủng cũng rất đa dạng pH tối ưu cho sự phát

triển của chủng P ganghwensis NITRA-134 là 7.0 (Cao Thị Thúy Hằng, 2011) và chủng Vibrio sp N-5 từ 7.8 – 8.0 (Furukawa và cs., 1992)

Bảng 1.1 pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của một số enzyme thủy phân

fucoidan từ vi sinh vật (Kusaykin và cs., 2016)

Nguồn Enzyme Nhiệt độ tối

Dải pH chịu được

Khối lượng phân tử (kDa)

E1 E2 E3

38 - 45˚C

38 - 45˚C

38 - 45˚C

6.0 6.0 7.5

4.0 – 9.0 4.0 – 9.0 4.0 – 9.0

39.5 68.0 68.0

E1 Chưa biết Chưa biết 6.5 – 7.0 Chưa

1.2.6 Một số phương pháp xác định hoạt tính enzyme fucoidanases

Một trong những vấn đề chính của việc nghiên cứu về fucoidanases là sự thiếu hụt những phương pháp vừa nhạy bén, vừa đơn giản để xác định hoạt tính phân giải của enzyme này

Phương pháp xác định lượng đường khử

Hoạt tính enzyme theo thường lệ sẽ được xác định bằng cách đo lượng đường khử (mono- và oligosaccharides) sinh ra trong quá trình phân giải (Nelson, 1944) Nồng độ của đường khử tạo thành được xác định theo phương pháp Nelson-Somogyi Dưới tác dụng của enzyme thuỷ phân polysaccharide, các loại polysaccharide bị cắt mạch tạo ra oligosaccharide và các đường khử Vì vậy sự gia tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực enzyme Nhờ tính chất khử của nhóm (-CHO) của đường khi phản ứng với dung dịch đồng hóa trị 2 tạo thành kết tủa Cu2O Tủa Cu2O tan trong thuốc thử arsenomolybden, tạo thành phức chất màu xanh da trời và phức này hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm (Kusaykin và cs., 2016) Như vậy có thể xác định khả năng phân giải polysaccharide thông qua hàm lượng Cu2+ phản ứng

Tuy nhiên, đối với một số các thí nghiệm, dù cho kết quả điện di cho thấy enzyme có khả năng phân cắt fucoidan nhưng phản ứng Nelson lại cho kết quả gần như bằng không Điều này có thể lí giải do những đặc tính về thành phần hóa học của sản phẩm fucoidan sau khi được enzyme phân giải (Silchenkoa và cs., 2015)

Phương pháp điện di C-PAGE

Các phân tử protein có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp Phương pháp này cho phép phát hiện sản phẩm được thủy phân một cách nhạy bén, dù cho đây là phương pháp tốn kém về cả tiền bạc lẫn thời gian Hoạt động phân giải của enzyme sẽ được dừng lại sau một thời gian phản ứng bằng cách làm đông mẫu trước khi điện di (Kusaykin và cs., 2016)

Phương pháp đĩa thạch

Tất cả những phương pháp nêu trên đều không tiện lợi và tốn nhiều thời gian

Do đó, chúng không thể được sử dụng để sàng lọc một số lượng lớn vi sinh vật sinh fucoidanases Vậy nên, một phương pháp mới và tiện lợi hơn đã được ra đời nhằm phục vụ cho mục đích đó Phương pháp mới được dựa trên khả năng hình thành một muối màu trắng không tan trong nước giữa một chất tẩy rửa có điện tích dương là hexadecyltrimethylammonium (cetavlon) và fucoidan Fucoidan được thủy phân sẽ tích điện yếu và không tạo nên được sự kết tủa với cetavlon Vùng trong suốt không có màu dưới những khuẩn lạc cho thấy chúng có khả năng sản sinh fucoidanases (Silchenkoa và cs., 2015) Đáng lưu ý rằng, nồng độ fucoidan của môi trường kiểm tra hoạt tính ở 0.5% là tối ưu Fucoidan ở nồng độ thấp hơn (từ 0.1 – 0.4%) cho kết tủa rất yếu với cetavlon Việc nhuộm fucoidan với các loại thuốc nhuộm cùng là ion âm sẽ cho kết quả không khả quan vì cả fucoidan nguyên thủy lẫn fucoidan đã được thủy phân sẽ cho ra kết quả như nhau (Silchenkoa và cs., 2015)

1.2.7 Ứng dụng của fucoidanase

Ứng dụng điều chế oligosaccharides từ fucoidan

Vì các hoạt tính sinh học đáng được chú ý đến của fucoidan, polysaccharide này được xem như một hướng nghiên cứu mới cho các sản phẩm thực phẩm chức năng

hỗ trợ điều trị bệnh, nhất là bệnh ung thư Tuy nhiên, với khối lượng phân tử cao, fucoidan gây nhớt cho dung dịch dẫn đến sự khó khăn trong việc tách chiết cũng như ứng dụng chúng trong công tác chữa bệnh (Cao Thị Thúy Hằng, 2011) Khi được phân tách thành những fucooligosaccharide, chúng không bị mất đi gốc sulfate nên vẫn giữ được những hoạt tính quí của mình Việc điều chế bằng các tác nhân hóa học có thể dẫn đến sự biến đổi hóa lí của phân tử do các quá trình xử lí acid, base đặc hay nhiệt cao, từ đó, fucoidan có thể bị mất đi hoạt tính sinh học của mình Vì vậy, enzyme fucoidanases từ vi sinh vật được ứng dụng để điều chế ra các fucooligosaccharide, fucoidan phân tử thấp nhưng vẫn giữ nguyên hoạt tính sinh học của mình

Hơn nữa, quá trình phân cắt fucoidan bằng enzyme fucoidanases không cần thiết phải loại bỏ các tác nhân dư thừa cũng như độc hại như khi xử lí bằng các phương pháp hóa học Điều này cũng làm giảm chi phí và công sức cho quá trình sản xuất

Ứng dụng xác định cấu trúc của fucoidan

Như đã đề cập bên trên, việc xác định cấu trúc fucoidan là vô cùng cần thiết vì

từ đó chúng ta có thể tìm hiểu ra được cơ chế của các hoạt tính sinh học của chúng Các enzyme từ vi sinh vật có khả năng phân cắt các liên kết α – 12, α – 13, hoặc α – 1 4 – O – glycosidic Trong khi đó, mạch fucoidan từ rong Nâu hiện diện một nhóm các polysaccharide đồng thể và dị thể bao gồm thành phần chính là đường fucose được sulfate hóa tại vị trí số 2 và / hoặc số 4 (thỉnh thoảng tại vị trí số 3) (Cao Thị Thúy Hằng, 2011) Vì vậy, chúng ta có thể dựa trên cơ sở phân cắt fucoidan thành các phân tử nhỏ hơn, việc làm này sẽ đơn giản hơn so với việc khảo sát một phân tử fucoidan lớn và phức tạp

1.2.8 Một số phương pháp tinh sạch fucoidanase

Bước đầu tiên của việc thu enzyme nội bào là phá vỡ tế bào Như chúng ta đã biết, trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân, microsome, ty thể, lysosome ) của tế bào Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và dày Người ta còn thấy nhiều enzyme liên kết rất chặt chẽ với các cấu tử của tế bào Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme

và chuyển chúng vào dung dịch

Các phương pháp phá vỡ tế bào bao gồm nghiền cơ học (với chất trợ nghiền là bột thủy tinh hoặc cát thạch anh), shock nhiệt (bằng cách đưa vào điều kiện lạnh nóng xen kẽ, liên tục làm rách màng tế bào) hay dùng máy đồng hóa, … Sau khi tế bào được phá vỡ thì dịch enzyme sẽ được chiết ra khỏi tế bào bằng những dung môi khác nhau như dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính

Các thao thác tinh sạch tiếp theo sẽ tùy vào đặc tính của enzyme và điều kiện của phòng thí nghiệm Không có bất kì một qui trình xác định nào cho việc tinh sạch

và tinh chế enzyme Hơn nữa, ở những mức độ sử dụng khác nhau, nhu cầu về độ tinh sạch của enzyme cũng khác nhau

Enzyme là một protein dễ bị giảm hoạt tính và thậm chí là biến tính Các thao tác với enzyme đòi hỏi sự cẩn thận, nhanh chóng và chính xác Các bước trong qui trình cần được thực hiện dưới nhiệt độ thấp, thời gian ngắn, độ pH thích hợp để làm giảm một cách tối thiểu hoạt tính của enzyme

Kết tủa enzyme

Các tác nhân tủa được lựa chọn có thể là các dung môi hữu cơ như etanol, aceton hoặc là các muối trung tính như amonium sulfate Về nguyên lý của sự kết tủa giữa hai loại dung môi này có đôi phần khác nhau, nhìn chung, chúng là những phương pháp để ta có thể loại bỏ bớt các tạp chất trong dịch enzyme thô thu được ban đầu bằng cách tạo kết tủa để tách enzyme mục tiêu ra khỏi dung dịch

Kết tủa với dung môi hữu cơ

Nguyên lý: Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch Khi thêm dung môi hữu cơ vào

dung dịch đệm cùng enzyme thì lực hút giữa các phân tử protein và phân tử nước bao quanh chúng giảm Đến một nồng độ dung môi nào đó thì lực hút đó sẽ nhỏ hơn năng lượng liên kết giữa các phân tử protein, lúc này, các phân tử protein sẽ liên kết với nhau và tạo thành kết tủa Nồng độ và bản chất của dung môi dùng để làm tác nhân tủa

sẽ tùy thuộc vào bản chất của enzyme Các dung môi hữu cơ thường được sử dụng là aceton, etylic vì chúng có hằng số điện môi thấp cũng như giá thành rẻ, lại dễ dàng bay hơi để thu hồi enzyme Tuy nhiên, một số dung môi có khả năng gây bất hoạt enzyme

Vì vậy, các thao tác cần phải nhanh và chính xác

Cách tiến hành: Acetol 99.5% và etanol 96% được làm lạnh và bổ sung vào dịch chiết enzyme thô với các tỉ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 và 1:6 Sau 3 giờ, tiến hành ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 30 phút để thu hồi kết tủa Phần kết tủa được hòa tan trong đệm natri phosphat 0.02M, pH = 7.0 (Wu và cs., 2011)

Kết tủa với muối trung tính:

Nguyên lý: Các ion muối có tác dụng phá vỡ lớp vỏ hidrat bao quanh các phân

tử protein do sự hút các cực trái dấu của nước về phía chúng, kết quả là, các phân tử protein bị mất lớp vỏ nước và chúng liên hợp với nhau tạo thành các phân tử nước Tương tự như với phương pháp kết tủa với dung môi hữu cơ, nồng độ muối trung tính được sử dụng cho mỗi loại enzyme là khác nhau

Cách tiến hành: Tiến hành khảo sát khả năng kết tủa enzyme ở các nồng độ bão hòa từ 50% đến 90% Khuấy đều, giữ ở 4oC trong 3 giờ và ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 30 phút để thu hồi kết tủa Phần kết tủa được hòa tan trong đệm natri phosphate 0.02M, pH = 7.0 và được thẩm tách qua đêm để loại bỏ muối bằng dung dịch đệm như trên (Sakai và cs., 2004)

Sau khi tiến hành kết tủa thu được enzyme thô, người ta sẽ tiến hành các bước tinh chế enzyme để thu được enzyme sạch hơn như sắc kí lọc gel,… Tùy vào mỗi mục đích sử dụng mà người ta sẽ lựa chọn cho mình các phương pháp tinh chế enzyme khác nhau

1.2.9 Tình hình nghiên cứu và sử dụng fucoidanase trên thế giới và ở Việt Nam

Từ những năm 1970 thì số lượng các bài công bố về fucoidan bắt đầu tăng và

xu hướng này vẫn tiếp diễn cho đến nay Những lĩnh vực liên quan đến các enzyme phân hủy fucoidan (fucoidanases) được tập trung nghiên cứu sâu hơn Sự phát triển này có thể nhìn thấy qua biểu đồ hình 1.5

Hình 1.6 Số lượng bài công bố về fucoidan và fucoidanases trên thế giới (Holtkamp, 2009) (dữ liệu được thu thập bởi SciFinder® Scholar, American Chemical Society 2007) Tuy nhiên, chỉ có khoảng 70% những công bố trên được viết bằng tiếng Anh, những tài liệu còn lại được viết bằng tiếng Trung, tiếng Nhật hay tiếng Nga Điều này gây khó khăn cho việc tham khảo các thông tin liên quan đến lĩnh vực đề cập ở trên (Holtkamp, 2009)

- Một số nghiên cứu về fucoidanases ở nước ngoài

Kim và Kim, 2008 đã tiến hành phân lập được chủng vi khuẩn Sphingomonas

paucimobilis PF-1 (định danh bằng đoạn gen 16s rDNA) có khả năng phân giải

fucoidan từ bào tử rong Undaria pinnatifida của Hàn Quốc; enzyme thô có khối lượng

130 kDa được tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sulfate, sắc kí lớp mỏng và sắc kí điểm; khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu cho thấy enzyme phân lập được tối ưu ở pH 6.0 – 7.0, nhiệt độ 40 – 45oC cùng một số các nồng

độ ion kim loại khác kích thích hay ức chế hoạt động của enzyme (Kim và Kim, 2008)

Sakai, 2004 thực hiện phân lập và sàng lọc được chủng vi khuẩn thuộc họ Alteromonadaceae (định danh bằng đoạn gen 16s rDNA) có khả năng sinh enzyme

fucoidanases ngoại bào phân cắt fucoidan từ rong Nâu Kjellmaniella crassifolia; vi

khuẩn được định danh bằng đoạn gen 16S rDNA; enzyme thu được được tinh sạch và tinh chế và khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme, kết quả thu được enzyme hoạt động tối ưu ở pH 6.5 – 8.0, nhiệt độ tối ưu là 30 – 35oC cùng một số các nồng độ ion kim loại khác kích thích hay ức chế hoạt động của enzyme (Sakai và cs., 2004)

Một số nghiên cứu về fucoidanases ở trong nước

Cao Thị Thúy Hằng và cs., 2011 đã tiến hành phân lập, tuyển chọn được chủng

vi khuẩn Pseudoalteromonas ganghwensis NITRA-134 (định danh bằng đoạn gen 16s

rDNA) sinh fucoidanse có hoạt tính cao; vi khuẩn được định danh bằng đoạn gen 16s rDNA; enzyme thu được được tinh sạch và tinh chế bằng phương pháp kết tủa với

ethanol, sắc kí lọc gel; kết quả cho thấy chủng P ganghwensis NITRA-134 sinh

trưởng tốt nhất trong điều kiện môi trường có 0,15% fucoidan, 1% pepton, pH môi trường nuôi cấy là 7.0 – 7.5, tốc độ nuôi cấy 180 vòng/phút, thời gian 24 giờ; khảo sát hoạt động của enzyme cho thấy các điều kiện pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme lần lượt là 7.0 và 40oC bền trong vùng nhiệt độ 25 – 40oC và bền trong vùng

ưu ở pH = 6.5 và nhiệt độ 35oC (Nguyễn Thị Khánh Vy, 2012)

Trong các đề tài trên, các thí nghiệm dùng để khảo sát hoạt tính của enzyme là những phương pháp cổ điển như sử dụng phương pháp đo lượng đường khử với thuốc

thử Nelson, phương pháp điện di C – PAGE Đối với đồ án tốt nghiệp này, các thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme được sử dụng một phương pháp mới, nhanh chóng

và đơn giản hơn, đó là phương pháp đĩa thạch (Silchenkoa và cs., 2015)

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và thiết bị

2.1.1 Mẫu vật

Các mẫu động vật (ốc, sò, hải sâm) được tiến hành thu nhận ở khu vực xung quanh thành phố Nha Trang gồm: Hòn Một, Sông Lô, Hòn Tre, Bãi Tiên vào tháng 1 năm 2016 và đưa về phòng thí nghiệm Hóa phân tích ở Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang

2.1.2 Hóa chất

Fucoidan từ 02 loại rong Sargassum mcclurei và Sargassum polycystum được

Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang cung cấp

Các hóa chất còn lại xem phụ lục 3

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng trong đề tài bao gồm:

- Môi trường phân lập (1)

- Môi trường giữ giống bán rắn (2)

- Môi trường lên men (4)

- Môi trường nuôi cảm ứng 0.1% fucoidan (5)

- Môi trường kiểm tra hoạt tính 0.5% fucoidan (6)

Thành phần môi trường xem phụ lục 4

2.1.4 Thiết bị

Xem phụ lục 5

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Các bước thực hiện phương pháp nghiên cứu được thực hiện theo trình tự như

trong sơ đồ hình 2.6

Hình 2.7 Sơ đồ tóm tắt toàn bộ qui trình thực hiện

2.2.1 Phân lập vi khuẩn bằng phương pháp khuẩn lạc

Các mẫu thu về được xử lí trong vòng 24 giờ tính từ thời điểm thu mẫu Các mẫu được chụp hình, mã hóa rồi chia làm 02 phần (i) cắt nhỏ, cho vào ống falcon 50

ml, cho cồn tuyệt đối vào ngập mẫu, đánh dấu và gửi đi định danh (ii) phẫu thuật lấy phần gan tụy rồi huyền phù hóa trong nước biển vô trùng (tỉ lệ 1:1, w/v) (Cao Thị Thúy Hằng, 2011), pha loãng mầu bằng nước muối sinh lí (Phụ lục 1) đến nồng

độ 10-3

Cấy trang phân lập vi khuẩn: Mỗi mẫu pha loãng ở 03 nồng độ (10-1, 10-2, 10-3), mỗi nồng độ hút 0.1 ml dịch đồng nhất lên đĩa chứa môi trường phân lập dạng thạch rồi trải đều bằng que cấy trải, ủ ở 30oC trong vòng 24 giờ

Cấy ria làm thuần vi khuẩn: Chọn các khuẩn lạc rời, khác nhau về hình thái trên đĩa cấy trang và ria lên đĩa môi trường phân lập dạng thạch mới Thao tác được thực hiện 02 – 03 lần cho đến khi thu được vi khuẩn dòng thuần

Bảo quản vi khuẩn: Chủng vi khuẩn thuần được đưa vào giữ giống bảo quản trong 02 loại môi trường (i) môi trường giữ giống dạng bán rắn trong ống nghiệm dưới lớp dầu khoáng ở 4oC (Kim và Kim, 2008), (ii) canh trường biển DIFCO bổ sung 30% (v/v) glycerol ở 80oC (Cao Thị Thúy Hằng, 2011)

2.2.2 Sàng lọc vi khuẩn định hướng sinh enzyme bằng đĩa thạch

Dùng que cấy vòng cấy các chủng vi khuẩn thuần phân lập được ở mục 2.2.1 lên đĩa môi trường thạch kiểm tra hoạt tính 0.5% fucoidan theo hình tròn, ủ ở 30˚C trong vòng 03 ngày (Silchenkoa và cs., 2015) Ở đây, chúng tôi sử dụng 02 loại môi

trường có chứa 02 loại fucoidan từ hai loại rong Nâu khác nhau là rong S polycystum

và S mcclurei

Sau 03 ngày, khi vi khuẩn đã phát triển trên bề mặt thạch tiến hành dùng que cấy loại bỏ sinh khối và dùng nước cất để tráng 02 – 03 lần cho sạch phần sinh khối còn dư bám trên thạch Tiếp theo, đổ ngập cetavlon 1% vào đĩa thạch rồi để ở nhiệt độ phòng trong vòng 45 phút Đối với những chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh enzyme phân hủy fucoidan thì sẽ xuất hiện vòng trong ở ngay vị trí sinh khối của vi sinh vật, những phần thạch khác trong đĩa sẽ xuất hiện kết tủa trắng giữa fucoidan và cetavlon (Silchenkoa và cs., 2015)