Khảo sát điều kiện bất hoạt virus cúm a h7n9 trong quy trình sản xuất vắc xin cúm bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi

Đây là loại vi rút lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của vi rút cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng vi rút có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

- -

LÊ THỊ KIM MẬN

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN BẤT HOẠT VI RÚT CÚM A/H7N9 TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TRÊN TRỨNG GÀ CÓ PHÔI

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Giáo viên hướng dẫn:

1 ThS Dương Hữu Thái

2 ThS Nguyễn Thị Kim Cúc

NHA TRANG – 07/2016

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị Phòng Vắc xin Cúm - Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang đã tạo mọi điều kiện tốt nhất có thể cho tôi thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua.cảm ơn cha mẹ, bạn bè và toàn thể quí thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học

và Môi trường đã dạy dỗ và tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho tôi trong suốt thời gian vừa qua

Nha Trang, tháng 7 năm 2016

Sinh viên

Lê Thị Kim Mận

MỤC LỤC

Trang

LỜI CÁM ƠN i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về vi rút cúm A/H7N9 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học của vi rút cúm A/H7N9 3

1.1.2 Độc lực và sức đề kháng của vi rút cúm A/H7N9 5

1.1.3 Cấu trúc, chức năng của kháng nguyên HA (Haemagglutinin) 5

1.1.4 Cấu trúc, chức năng của kháng nguyên NA (Neuraminidase) 7

1.1.5 Các phương thức biến đổi kháng nguyên 8

1.1.6 Cơ chế xâm nhiễm vào tế bào vật chủ 10

1.1.7 Khả năng gây bệnh 11

1.2 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 ở người trên thế giới và Việt Nam 12

1.2.1 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 ở người trên thế giới 12

1.2.2 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 ở người tại Việt Nam 15

1.3 Nghiên cứu và sản xuất vắc xin H7N9 ở trong và ngoài nước 15

1.3.1 Tình hình nghiên cứu vắc xin H7N9 ở ngoài nước 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất vắc xin H7N9 ở trong nước 17

1.4 Công nghệ sản xuất vắc xin Cúm 18

1.4.1 Tổng quan về vắc xin cúm 18

1.4.2 Các loại vắc xin cúm 19

1.4.3 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm 22

1.5 Sản xuất vắc xin cúm quy mô lớn tại Viện vắc xin và sinh phẩm y tế (IVAC) 25

1.5.1 Điều kiện sản xuất: 25

1.5.2 Tóm tắt quy trình công nghệ 25

1.5.3 Phát triển quy trình công nghệ 27

1.5.4 Tiêu chuẩn của vắc xin 28

1.5.5 Tiêu chuẩn của vắc xin cúm 29

1.6 Các hóa chất thường dùng trong bất hoạt vắc xin cúm 29

1.6.1 Beta - propiolactone (BPL) 29

1.6.2 Formalin (Formaldehyde) 30

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 34

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 34

2.1.3 Dung dịch kháng nguyên vi rút 34

2.1.4 Các loại dung dịch, hóa chất 34

2.1.5 Thiết bị - dụng cụ 34

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Xác định các điều kiện tối ưu 36

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện tối ưu trong bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 38

2.2.3 Xây dựng quy trình bất hoạt 39

2.2.4 Một số phương pháp kiểm định (Test) 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Kết quả khảo sát các yếu tố nồng độ formalin, nhiệt độ và thời gian trong quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 của lô 1 47

3.1.1 Kết quả khảo sát hiệu giá HA 47

3.1.2 Kết quả khảo sát xác định liều gây nhiễm (EID50) 48

3.1.3 Kết quả khảo sát hiệu lực bất hoạt của lô 1 (RIV) 52

3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố nồng độ formalin, nhiệt độ và thời gian trong quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 của lô 2 54

3.2.1 Kết quả khảo sát hiệu giá HA của lô 2 54

3.2.2 Kết quả khảo sát xác định liều gây nhiễm của lô 2 (EID50) của các nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt trong các khoảng thời gian khác nhau của lô 2 55

3.2.3 Kết quả khảo sát hiệu lực bất hoạt của lô 2 (RIV) 58

3.3 Kết quả khảo sát các yếu tố nồng độ formalin, nhiệt độ và thời gian trong quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 của lô 3 60

3.3.1 Kết quả khảo sát hiệu giá HA của lô 3 60

3.3.2 Kết quả khảo sát xác định liều gây nhiễm của lô 3 (EID50) của các nhóm nồng

độ formalin, nhiệt độ bất hoạt trong các khoảng thời gian khác nhau của lô 3 61

3.3.3 Kết quả khảo sát hiệu lực bất hoạt của lô 3 (RIV) 64

3.4 Xây dựng quy trình bất hoạt 66

3.5 Thẩm định quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 mới xây dựng 67

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

4.1 KẾT LUẬN 71

4.2 KIẾN NGHỊ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EID50 Egg Infectious Dose 50

(Liều gây nhiễm 50 vi rút trên trứng gà) GMP Good manufacturing Practice

(Thực hành sản xuất tốt) FAO Food and Agriculture Organization

(Tổ chức Nông lương thế giới)

HA Haemagglutinin (Protein ngưng kết hồng cầu)

HAU Haemagglutination Unit (Đơn vị Haemagglutinin)

HI Haemagglutination Inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu)

HPAI Highly pathogenic avian influenza

(chủng vi rút cúm gia cầm độc lực cao)

IVAC Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế

NA Neuraminidase (enzyme bề mặt vi rút cúm)

NIBSC National Insitute for Biological Sandards and Control

(Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và kiểm định Sinh học, Vương quốc Anh)

OIE Office International Epizoot (Tổ chức Thú y thế giới)

PBS Phosphat Buffer Saline (dung dịch đệm photphat)

RIV Residual Infectious Viruses (vi rút sống tồn lưu)

TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới

TIV Trivalent - inactivated Influenza Vaccine

(Vắc xin cúm ba thành phần bất hoạt) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

WSL Working Seed Lot (Chủng làm việc)

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Lấy mẫu thử nghiệm với [formalin] = 0,01% 37

Bảng 2.2 Lấy mẫu thử nghiệm với [formalin] = 0,02% 37

Bảng 2.3 Lấy mẫu thử nghiệm với [formalin] = 0,04% 37

Bảng 2.4 Sơ đồ phản ứng ngưng kết hồng cầu 41

Bảng 2.5 Cách pha loãng mẫu thử nghiệm thành các độ pha khác nhau 42

Bảng 2.6 Kết quả EID50 của chủng giống được xác định bằng phương pháp Reed- Muench 43

Bảng 2.7 Cách tính EID50 của liều gây nhiễm 44

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát hiệu giá HA của các nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt trong các khoảng thời gian khác nhau của lô 1 47

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát xác định liều gây nhiễm (EID50) 49

của các nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt trong các khoảng thời gian khác nhau của lô 1 49

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hiệu lực bất hoạt của các nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt trong các khoảng thời gian khác nhau của lô 1 53

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hiệu giá HA của các nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt trong các khoảng thời gian khác nhau của lô 2 54

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát xác định liều gây nhiễm (EID50) 55

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát hiệu lực bất hoạt của các nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt trong các khoảng thời gian khác nhau của lô 2 58

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát hiệu giá HA của các nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt trong các khoảng thời gian khác nhau của lô 3 60

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát xác định liều gây nhiễm (EID50) 61

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát hiệu lực bất hoạt của các nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt trong các khoảng thời gian khác nhau của lô 3 64

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát HA, RIV và EID50 của 3 lô sản xuất ở các thời gian khác nhau trong quy trình bất hoạt 68

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp

ribonucleoprotein RNP (C) của vi rút cúm A 3

Hình 1.2 Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng nguyên” (antigenic drift) (A) và đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift) ở vi rút cúm A (B) 9

Hình 1.3 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của vi rút cúm A ở tế bào 11

Hình 1.4 Phân bố các trường hợp mắc bệnh do cúm A/H7N9 13

Hình 1.5 Số trường hợp mắc cúm A/H7N9 theo thời gian 14

Hình 1.6 Các thế hệ vắc xin cúm 20

Hình 1.7 Quy trình lõi sản xuất vắc xin cúm tại IVAC 26

Hình 1.8 Sơ đồ quy trình bất hoạt virus cúm A/H7N9 33

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35

Hình 2.2 Sơ đồ xác định các điều kiện tối ưu 36

Hình 2.3 Sơ đồ các bước tiến hành khảo sát những yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bất hoạt 38

Hình 3.1 Sự biến đổi Log EID50 ở formalin 0,01% trong các dải nhiệt độ và thời gian bất hoạt của lô 1 50

Hình 3.2 Sự biến đổi Log EID50 ở formalin 0,02% trong các dải nhiệt độ và thời gian bất hoạt của lô 1 50

Hình 3.3 Sự biến đổi Log EID50 ở formalin 0,04% trong các dải nhiệt độ và thời gian bất hoạt của lô 1 50

Hình 3.4 Sự biến đổi Log EID50 ở formalin 0,01% trong các dải nhiệt độ và thời gian bất hoạt của lô 2 56

Hình 3.5 Sự biến đổi Log EID50 ở formalin 0,02% trong các dải nhiệt độ và thời gian bất hoạt của lô 2 56

Hình 3.6 Sự biến đổi Log EID50 ở formalin 0,04% trong các dải nhiệt độ và thời gian bất hoạt của lô 2 56

Hình 3.7 56

Hình 3.7 Sự biến đổi Log EID50 ở formalin 0,01% trong các dải nhiệt độ và thời gian bất hoạt của lô 3 62

Hình 3.8 Sự biến đổi Log EID50 ở formalin 0,02% trong các dải nhiệt độ và thời gian bất hoạt của lô 3 62 Hình 3.9 Sự biến đổi Log EID50 ở formalin 0,04% trong các dải nhiệt độ và thời gian bất hoạt của lô 3 62 Hình 3.10 Quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 67 Hình 3.11 Hiệu lực bất hoạt vi rút cúm bằng formalin 0,02% ở 22-250C của lô

CT_A/H7N9/01 69 Hình 3.12 Hiệu lực bất hoạt vi rút cúm bằng formalin 0,02% ở 22-250C của lô

CT_A/H7N9/02 70 Hình 3.13 Hiệu lực bất hoạt vi rút cúm bằng formalin 0,02% ở 22-250C của lô

CT_A/H7N9/03 70

LỜI MỞ ĐẦU

Tháng 3/2013, vi rút cúm A/H7N9 xuất hiện gây bệnh trên người và lan ra nhiều địa phương tại Trung Quốc Từ đó đến nay, số ca mắc và tử vong ở người vẫn tiếp tục tăng lên, nhất là thời điểm mùa đông xuân (từ tháng 1 đến tháng 4) các năm 2013 đến

2015 Thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) cho thấy, đến tháng 3/2015 đã

có 568 trường hợp mắc cúm A/H7N9, trong đó có 212 người đã tử vong TCYTTG đã nhận định vi rút A/H7N9 là “một trong những vi-rút cúm gây nguy hiểm chết người đáng chú ý nhất” Nguồn gốc vi rút A/H7N9 được xác định từ gia cầm gây bệnh cho người, mặc dù cho đến nay chưa có bằng chứng vi rút có thể lây lan từ người sang người nhưng nguy cơ bùng phát dịch và khả năng lan tràn sang các quốc gia là rất lớn [33] Việt Nam là một nước tiếp giáp với Trung Quốc, có sự trao đổi thương mại, dịch

vụ và du lịch rất phát triển, có sự tương đồng về điều kiện địa lý và khí hậu Do vậy, Chính phủ, Bộ Y tế và các Bộ ngành liên quan đã đánh giá được nguy cơ xâm nhập vi rút cúm A/H7N9 vào nước ta là rất lớn Chính Phủ Việt Nam và Bộ Y tế đã chủ động chỉ đạo, lập kế hoạch và triển khai nhiều biện pháp nhằm phát hiện, ngăn chặn và phòng chống bệnh cúm này nếu có xuất hiện ở Việt Nam

Vắc xin là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để phòng ngừa, kiểm soát và đẩy lùi dịch bệnh nói chung và bệnh cúm nói riêng Tuy nhiên, việc sản xuất ra một lượng vắc xin đủ đáp ứng nhu cầu sử dụng trên toàn thế giới còn gặp nhiều khó khăn do năng lực sản xuất ở các quốc gia không đồng đều và những thách thức về công nghệ Mặc dù vắc xin cúm đã được sản xuất từ thập niên 60 nhưng chỉ tập trung ở các nước Châu Âu và Bắc Mỹ Với năng lực sản xuất vắc xin của thế giới hiện nay là 300 triệu liều/năm, nếu đại dịch cúm trên người xảy ra thì lượng vắc xin này chỉ có thể đáp ứng cho khoảng 10% dân số thế giới Trước tình hình đó, TCYTTG khuyến cáo tất cả các nước, đặc biệt các quốc gia Châu Á, chủ động nghiên cứu và sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 để có thể kịp thời cung ứng cho nhu cầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng khi xảy ra đại dịch Để giải quyết vấn đề này, các nhà sản xuất vắc xin tập trung đầu tư nghiên cứu nhiều dạng vắc xin cúm khác nhau: vắc xin cúm bất hoạt, vắc xin cúm giảm độc lực và vắc xin tái tổ hợp [4]

Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang (IVAC) đã nghiên cứu sản xuất thành công vắc xin cúm A/H7N9 bất hoạt trên trứng gà có phôi trên quy mô thí nghiệm Hiện

vi rút cúm nhằm đảm bảo tính ổn định và hiệu quả về kinh tế khi sản xuất vắc xin là vấn

đề được quan tâm đầu tư

Formalin là hóa chất được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới để bất hoạt vi sinh vật trong nhiều loại vắc xin cho người Tuy nhiên để xây dựng quy trình bất hoạt đối với mỗi loại vắc xin, sinh phẩm cần được xác định các thông số cụ thể như nồng độ formalin, thời gian và nhiệt độ bất hoạt để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của quy trình

Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tàì: “Khảo sát điều kiện bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 trong quy trình sản xuất vắc xin cúm bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi”

Mục tiêu của đề tài: Tìm ra điều kiện bất hoạt thích hợp nhất đối với vi rút cúm

A/H7N9 trên trứng gà có phôi để đem vào thử nghiệm và ứng dụng trên quy mô công nghiệp

Nội dung nghiên cứu:

- Xác định các điều kiện tối ưu để bất hoạt chủng vi rút cúm A/H7N9: nồng độ formalin, thời gian, nhiệt độ bất hoạt

- Thử nghiệm và áp dụng điều kiện bất hoạt thích hợp vào quy trình sản xuất vắc xin cúm trên quy mô 5000-10000 liều/mẻ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi rút cúm A/H7N9

1.1.1 Đặc điểm sinh học của vi rút cúm A/H7N9

Vi rút cúm A (còn gọi là vi rút cúm gia cầm, vi rút cúm gà) có tên khoa học là

Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại chung (Basic

Taxomomy) [25] Các hạt vi rút cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80-120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da [21,26,34]

- Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate [11]

- Hạt vi rút có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA

sợi đơn âm - negative single strand (Hình 1.1) [11]

Hình 1.1 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp

ribonucleoprotein RNP (C) của vi rút cúm A

(Nguồn: Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge)

Ghi chú:

- A: Các dạng hình thái khác nhau của vi rút cúm A dưới kính hiển vi điện tử

- B: Mô hình cấu tạo hạt vi rút cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên

HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzyme polymerase của vi rút)

- C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP

Vỏ vi rút có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của vi rút, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của vi rút Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân

bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ vi rút, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA

(matrix) và các dấu ấn khác của vi rút [13] Có sự phân bố không đồng đều giữa các

phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi rút ở tế bào cảm nhiễm [6,7] Vật chất di truyền (còn gọi là hệ gen) của vi rút cúm A là RNA sợi đơn âm ((-) ssRNA), gồm

8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ vi rút, mã hóa cho 11 protein tương ứng của vi rút, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2, phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein

là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1 - F2 [23] Đây là nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi kháng nguyên liên tục để trở thành chủng vi rút mới (Hình 1.1)

Về danh pháp, nhóm vi rút cúm A được phân chia thành nhiều phân type (subtype),

các phân type này được phân biệt bởi sự khác nhau ở các đặc tính kháng nguyên bề mặt (NA và HA), cho đáp ứng miễn dịch khác nhau giữa các chủng vi rút ở cơ thể bị nhiễm [6,7] Kháng nguyên HA có 16 loại HA (từ H1 đến H16) và 9 loại NA (từ N1 đến N9) nên có thể tạo ra hơn 254 biến chủng khác nhau (trừ chủng ban đầu), có khả năng gây bệnh cho người và động vật Tên gọi chủng cúm A/H7N9 dựa trên cấu trúc của hai loại kháng nguyên bề mặt này và là điểm khác biệt trong cấu trúc vi rút cúm A/H7N9 với các chủng vi rút cúm khác [8,12] Hiện nay, dữ liệu gen và hệ gen của vi rút cúm A có thể được tìm thấy trong Ngân hàng gen [22], tại mạng lưới chuyên gia cúm gia cầm của

Tố chức Nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức Thú y thế giới (OIE) [25,27], và tại trang web của Trung tâm dữ liệu các gen vi rút (Influenza Sequence Database, ISD: http://www.flu.lanl.gov/) TCYTTG đã quy định thống nhất danh pháp theo thứ tự kí hiệu: Tên serotype - Loài động vật bị nhiễm - Vùng địa lí phân lập - Số hiệu đăng kí chủng vi rút - Thời gian phân lập - Loại hình phân type [HA(H) và NA(N)] Đối với các

vi rút được phân lập trên người bệnh, thì không cần ghi loài mắc trong danh pháp, ví dụ:

A/Sanghai/2/2013(H7N9) [35]

1.1.2 Độc lực và sức đề kháng của vi rút cúm A/H7N9

 Độc lực gây bệnh của vi rút cúm A

Tính gây bệnh hay độc lực của vi rút cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI), và loại độc lực thấp (LPAI), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [23]

- HPAI (Highly pathogenic avian influenza): là loại vi rút cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 giờ sau nhiễm, loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng Vi rút loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [34]

- LPAI (Low pathogenic avian influenza): là loại vi rút khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ Đây là loại vi rút lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của vi rút cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng vi rút có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại vi rút HPAI nguy hiểm [34]

 Sức đề kháng

Vi rút cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân bất hoạt vật lí hay hóa học Các hạt vi rút tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9 Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả năng lây nhiễm của vi rút bị giảm mạnh [20] Lớp vỏ ngoài của vi rút bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol, β-propiolacton, sodium hypochloride, acid loãng và hydroxylamine Vi rút bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được vi rút nhưng không phá hủy được kháng nguyên của vi rút Tuy nhiên, vi rút cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 1000C và ở 600C/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (−700C) Trong phủ tạng gia cầm (400C), vi rút tồn tại 25 - 30 ngày, nhưng chỉ tồn tại 7 - 8 ngày ở nhiệt độ

cơ thể người (370C), trong nước, vi rút có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 300C [25,34]

1.1.3 Cấu trúc, chức năng của kháng nguyên HA (Haemagglutinin)

Kháng nguyên HA là một glycoprotein thuộc protein màng nhóm I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA

có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu HI

(hemgglutination inhibition) Phân tử protein HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 (gen HA)

có dạng hình trụ, dài khoảng 130 Angstron, cấu tạo gồm 3 đơn phân (monomer) được tạo

thành từ hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa) liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-) Các đơn phân được glycosyl hóa và gắn HA2 vào mặt ngoài capsid, phần

tự do HA1 chứa vị trí gắn với thụ thể thích hợp trên bề mặt màng tế bào đích [5]

Một vi rút có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt, đóng vai trò quan trọng trong nhận diện, phân loại vi rút và quá trình xâm nhiễm vào tế bào chủ, bắt đầu bằng sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng tế bào sau đó là hòa màng, giải phóng RNA và nhân lên trong tế bào cảm nhiễm Quá trình xâm nhập này phụ thuộc vào sự phù hợp giữa thụ thể của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của

vi rút cúm Khả năng gắn vào thụ thể của tế bào chủ cùa HA phụ thuộc vào hai yếu tố:

- Hai dạng phân tử SA (sialic acid) trên thụ thể của tế bào chủ: acetylneuraminic acid và N-glycolylneuraminic acid

N Hai kiểu liên kết với galactose: liên kết αN 2,6 Gal hay liên kết αN 2,3 Gal trên bề mặt của tế bào chủ [25]

Ở chim, phân tử HA của vi rút cúm A chủ yếu liên kết với phân tử SA α-2,3 Gal

có nhiều ở các tế bào biểu mô của ruột Ở người, HA liên kết với phân tử SA α-2,6 Gal nằm chủ yếu ở tế bào biểu mô khí quản Ở heo, các tế bào biểu mô của khí quản mang

cả hai loại SA và hai loại liên kết nêu trên nên heo có thể bị nhiễm cả hai loại vi rút cúm gây nhiễm cho chim và cho người Điều này làm tăng nguy cơ tái tổ hợp, tạo biến chủng

vi rút cúm mới có độc tính cao và lan truyền mạnh trong cộng đồng Trong lịch sử, 3 phân nhóm H1, H2 và H3 đã xảy ra đại dịch ở người Các phân nhóm H5, H7 và H9 cũng được cho là có khả năng gây bệnh trên người [5]

Trình tự mã hóa, thành phần chuỗi nối trên protein HA và vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể đích Đây là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA Protein HA còn kích thích được cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và tham gia vào phản ứng trung hòa vi rút HA quyết định tính kháng nguyên và độc lực của vi rút, là đích miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi rút và là cơ sở điều chế các vắc xin phòng cúm [5] Trong cấu trúc phân tử vi rút cúm A/H7N9, phân tử Haemagglutinin là loại phân

tử số 7 (H7) có biến đổi cấu trúc không gian khác biệt với các loại khác bao gồm khác biệt về một số cấu trúc hóa học và có ái tính với tế bào kết mạc của gia cầm và người,

trong khi chúng vẫn có ái tính với tế bào đường hô hấp trên Phân tử H1-H3 lại có ái tính mạnh với tế bào đường hô hấp trên của người, còn phân tử H5 có ái tính mạnh với

tế bào đường ruột của chim Tính năng bám dính và xâm nhập của H7 kém hơn so với H1-H3 do vậy khả năng gây bệnh cho người và động vật cũng thấp hơn và thi thoảng mới có tính sinh bệnh cao cho vật chủ Đây là sự khác biệt lớn nhất của vi rút cúm A/H7N9 [14,25]

1.1.4 Cấu trúc, chức năng của kháng nguyên NA (Neuraminidase)

Neuraminidase (NA) là một glycoprotein, có dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt của vi rút cúm Đầu tự do của phân tử NA chứa vùng hoạt động gồm 4 đơn phân và phần gốc là một vùng kị nước gắn vào màng vi rút Có khoảng 100 phân tử NA trên bề mặt một vi rút Phân tử NA mang bản chất enzyme, có khả năng phân cắt sialic acid ở liên kết glycoside nối nhóm keto của acid sialic với D-galactose hoặc D-galactosamine trong giai đoạn hòa màng, giúp cho vi rút xâm nhập vào trong bào tương tế bào [31] Phân tử

NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu Những tác động trên của NA làm gia tăng độc lực gây bệnh của vi rút Do đó NA là đích tác động

của thuốc kháng vi rút Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) có tác dụng ức chế enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt vi rút mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể Neuraminidase

mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân nhóm NA Có 9 phân nhóm NA từ N1 đến N9 được phát hiện chủ yếu ở vi rút cúm gia cầm, hai phân nhóm N1 và N2 được tìm thấy ở vi rút cúm người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử [5]

Phân tử NA còn là một kháng nguyên bề mặt có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch sinh ra kháng thể đặc hiệu kháng NA Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của vi rút là các đích chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch và điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm

Neuraminidase trong vi rút H7N9 là loại N9 có khả năng kép, do vậy Neuraminidase không những có khả năng lan tràn mạnh mà khả năng thâm nhập cũng rất mạnh Khi phân tử sinh học Hemagglutinin bị ức chế bởi thuốc thì ngay lập tức phân

tử sinh học Neuraminidase sẽ hoạt động thay thế và giúp vi rút xâm nhập vào tế bào, đây là điểm khác biệt thứ hai của vi rút này Tuy nhiên, cụ thể khả năng này trong phân

tử vi rút H7N9 đến đâu thì người ta chưa kiểm định được do biến thể này mới xuất hiện [14,25]

1.1.5 Các phương thức biến đổi kháng nguyên

 Hiện tượng lệch/trượt kháng nguyên (antigenic drift)

Lệch kháng nguyên (còn được gọi là trượt kháng nguyên) là sự biến đổi kháng nguyên HA và NA trong một phân nhóm Đây thực chất là các đột biến điểm ở các phân đoạn gen hoặc hệ gen của vi rút, dẫn đến sự biến đổi trình tự các amino acid cấu trúc nên phân tử HA và NA Hiện tượng lệch kháng nguyên xảy ra ở tất cả các nhóm vi rút cúm A do vi rút không có enzyme sửa chữa RNA trong quá trình phiên mã và sao chép Dẫn đến việc chèn thêm, làm mất đi hoặc thay thế một hay nhiều nucleotide Các đột biến điểm trong bộ ba mã hóa có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột biến Tần suất xảy ra đột biến điểm rất cao khoảng 1 đột biến trên 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA của vi rút cúm A) Như vậy, gần như mỗi hạt vi rút đều chứa đựng một đột biến điểm được tích lũy qua các thế hệ làm tăng khả năng xuất hiện một biến thể vi rút mới thay đổi độc lực gây bệnh hay mang đặc tính kháng nguyên mới [25,39]

 Hiện tượng trộn/trôi kháng nguyên (antigenic shift)

Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn được gọi là trôi kháng nguyên) là sự biến đổi hoàn toàn một hay cả hai protein bề mặt, xảy ra khi gen mã hóa cho phân nhóm này được thay thế bằng gen mã hóa cho một phân nhóm khác Đây là kết quả của quá trình

tổ hợp gen giữa hai chủng vi rút lây nhiễm đồng thời một tế bào Hiện tượng này chỉ gặp

ở vi rút cúm A vì chúng có thể gây bệnh cho nhiều loại vật chủ dẫn đến khả năng biến chủng rất cao Điều này tạo cơ hội cho quá trình tái tổ hợp bộ gen của các chủng vi rút khác nhau để tạo nên một chủng vi rút cúm mới nguy hiểm hơn Các đại dịch cúm từng xuất hiện ở Châu Á năm 1957 (H2N2), ở Hồng Kông năm 1967 (H3N2) là do các biến chủng vi rút cúm A được tạo ra theo cơ chế trôi kháng nguyên gây nên Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của vi rút cúm A được 2 chủng trao đổi cho nhau Kết quả là đã tạo ra thế hệ vi rút mới có các phân đoạn gen kết hợp giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh Khi xảy ra sự trôi kháng nguyên,

hệ miễn dịch của người thường không có khả năng bảo vệ, nếu chủng vi rút mới này có khả năng gây bệnh cao và lây trực tiếp từ người sang người thì nguy cơ một đại dịch sẽ xảy ra [14,25]

Hình 1.2 Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng nguyên” (antigenic drift) (A) và đột biến tái tổ hợp của hiện tượng

“trộn kháng nguyên” (antigenic shift) ở vi rút cúm A (B)

( Nguồn: Murphy BR, Webster RG (1996))

 Hiện tượng glycosyl hóa

Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate (oligosaccharide) vào amino acid asparagine (vị trí N) ở một số vị trí nhất định trong

chuỗi polypeptide HA, NA hay một số polypeptide khác của vi rút cúm Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = Asparagine; X= amino acid bất

kì, trừ proline; S/T = serine hoặc threonine) Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã của asparagine, tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho vi rút thoát khỏi tác động miễn dịch bảo vệ của cơ thể chủ và điều hoà sự nhân lên của vi rút [14,25,39]

Hiện tượng trượt kháng nguyên và glycosyl hóa xảy ra liên tục theo thời gian, còn

hiện tượng trộn kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng của vi rút cúm A, khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau Đây cũng chính là vấn

đề đáng lo ngại của vi rút cúm A/H5N1 hiện nay và vì về lý thuyết hoàn toàn có thể xảy

ra đối với vi rút cúm A/H7N9, vi rút này hoàn toàn có khả năng gây bệnh được cho người

dù chưa thích nghi để dễ dàng lây nhiễm ở người Vi rút cúm A/H7N9 hoàn toàn có thể tái tổ hợp gen HA hay NA, hoặc cả hai gen của các chủng vi rút cúm A khác để tạo ra một biến chủng vi rút mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong phòng chống [14,39]

1.1.6 Cơ chế xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [5]

Vi rút cúm A ký sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của vi rút xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm, có những nét đặc trưng như sau:

- Xâm nhiễm: Quá trình xâm nhiễm được mở đầu bằng sự kết hợp của HA với

thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào chủ sau đó hòa màng và giải phóng hệ gen của vi rút vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 1.3)

- Sao chép RNA: sự sao chép RNA của vi rút cúm chỉ xảy ra trong nhân của tế

bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các vi rút khác Trong nhân tế bào các RNA của

vi rút cúm tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen vi rút, từ đó tổng hợp nên RNA của vi rút mới nhờ RNA- polymerase Các sợi này không được adenine

hóa ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với NP tạo thành phức hợp RNP (ribonucleoprotein)

hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào Đồng thời, các RNA thông tin của

vi rút cũng được sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của vi rút và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của vi rút

- Tổng hợp protein HA và NA: Hệ gen của vi rút sử dụng bộ máy sinh học của tế

bào tổng hợp các protein của vi rút và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA Phức hợp protein – RNA của vi rút được vận chuyển vào trong nhân tế bào Các phân tử NA và

HA của vi rút sau khi tổng hợp được vận chuyển ra phía ngoài gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi tạo thành các gai nhú, quá trình này được gọi là hiện tượng “nảy chồi” của vi rút NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của vi rút Sau cùng các RNP của vi rút được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” vi rút gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt vi rút trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác

Hình 1.3 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của vi rút cúm A ở tế bào

(Nguồn: Lê Văn Bé (2015))

1.1.7 Khả năng gây bệnh

Vi rút cúm A/H7N9 là một phân nhóm trong nhóm vi rút cúm H7 có khả năng gây bệnh cho gia cầm (gồm H7N2, H7N3 và H7N7) Nhóm vi rút H7 từng được biết đến với khả năng gây bệnh cho người với những ca bệnh đã được xác nhận nhiễm vi rút cúm A/H7N3 ở Canada, Ý và Anh Nhiễm vi rút cúm A/H7N2 ở Mỹ và Anh hay nhiễm vi rút cúm A/H7N7 ở Mexico, Hà Lan và Mỹ Những trường hợp này hầu hết được xác định có tiếp xúc tới ổ dịch cúm gia cầm Biểu hiện bệnh thường diễn biến nhẹ với các triệu chứng như viêm kết mạc và viêm đường hô hấp trên Chỉ có 1 trường hợp tử vong được ghi nhận tại Hà Lan vì nhiễm vi rút cúm A/H7N7 đó là một bác sỹ thú y tiếp xúc trực tiếp với gia cầm mắc bệnh Tháng 3/2013, trường hợp mắc bệnh do vi rút cúm A/H7N9 ở người đầu tiên ở Trung Quốc được WHO xác nhận, đây cũng là lần đầu tiên

vi rút này được xác định có khả năng gây bệnh trên người

Vi rút cúm A/H7N9 gây bệnh chủ yếu với gia cầm nuôi trong nhà, được xếp vào hàng có khả năng gây bệnh yếu trong họ hàng nhà vi rút cúm A Trong một số trường hợp, vi rút này có khả năng gây bệnh trên người Chúng đặc biệt có ái tính với tế bào kết mạc ở mắt và tế bào đường hô hấp trên Người bệnh có biểu hiện bệnh bao gồm các triệu chứng viêm kết mạc, viêm đường hô hấp trên và viêm phổi Viêm kết mạc là hiện tượng ngứa mắt, cộm mắt, đỏ mắt, chảy nước mắt Triệu chứng viêm đường hô hấp trên cũng giống như các loại vi rút khác như sốt, đau mỏi cơ, ho, khó thở, khò khè, khàn tiếng, viêm phổi Hiện tại, chưa có bằng chứng chứng minh khả năng lây từ người sang

người hay từ động vật sang người như thế nào? Và cũng chưa xác định được mức độ gây bệnh của loại vi rút này là mạnh hay yếu vì chưa có thử nghiệm nào với loại vi rút biến thể mới nhất này Chỉ biết có một số trường hợp bệnh nhân mắc bệnh tại Trung Quốc đã tử vong do H7N9 Vi rút này có đặc điểm dễ nhạy cảm với điều trị, nhưng dễ kháng lại thuốc do có tính năng xâm nhập kép H7N9 dễ mẫn cảm với các thuốc điều trị bao gồm các thuốc ức chế neuraminidase như oseltamivir, zanamivir và peramivir Chúng rất dễ mẫn cảm với các chất kháng khuẩn như dung dịch natrihypochlorit 1%, cồn 700, glutaraldehyde, formalin và iot Loại vi rút này dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ 56 - 60ºC trong 60 phút Chúng có khả năng sinh tồn ở nước ao hồ và ở nước 220C khoảng

4 tuần, còn ở nước 00C, chúng có thể tồn tại và sinh bệnh tới 30 ngày sau Việc phòng chống cúm H7N9 tương tự với các loại cúm khác Vệ sinh và giết mổ gia cầm an toàn

là cách phòng bệnh tốt nhất Mặc dù, đây có thể là một loại cúm có tính sinh bệnh yếu nhưng chúng lại hoàn toàn có thể có tính sinh bệnh cao nhờ vào những điều kiện cụ thể của môi trường Do đó, luôn cần tính phòng ngừa lên trên hết [30,31]

1.2 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 ở người trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 ở người trên thế giới

Tháng 3/2013, chủng vi rút cúm A/H7N9 xuất hiện ở Thượng Hải (Trung Quốc), gây bệnh cho người và nhanh chóng lan tràn đến nhiều địa phương ở phía đông Trung Quốc Thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cho thấy, từ ngày 29/3/2013 đến ngày 4/4/2013, Trung Quốc đã phát hiện 11 trường hợp nhiễm cúm A/H7N9, trong đó có 5 trường hợp tử vong tại TP Thượng Hải (3/2), An Huy (1/0), Giang Tô (4/0) và Chiết Giang (3/2) Các trường hợp mắc đều có triệu chứng viêm đường hô hấp tiến tới viêm phổi và suy hô hấp Phòng xét nghiệm CDC Trung Quốc xác định các trường hợp trên dương tính với cúm A/H7N9 có gen từ nguồn gốc gia cầm Đây là những trường hợp đầu tiên nhiễm vi rút cúm A/H7N9 gây bệnh nặng trên người và chưa có bằng chứng bệnh lây từ người sang người Nguồn bệnh và phương thức lây truyền chưa rõ, WHO đang tích cực triển khai điều tra để xác định WHO chưa khuyến cáo hạn chế giao lưu qua lại giữa các quốc gia trên thế giới [31]

Đến ngày 30/5/2013 đã có 132 người mắc và 37 trường hợp tử vong do cúm A/H7N9 được xác nhận bao gồm 131 ca ở các tỉnh phía đông Trung Quốc và 1 ca ở Đài Loan Hầu hết các trường hợp được xác nhận dương tính với vi rút cúm A/H7N9 đều có biểu hiện viêm phổi trầm trọng và hội chứng viêm đường hô hấp cấp tính có thể dẫn đến

tử vong do suy hô hấp, nhiễm trùng hoặc biến chứng và cần chế độ điều trị, hồi sức tích

cực Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nhận định “vi rút cúm A/H7N9 là một trong những

vi rút cúm gây nguy hiểm chết người đáng chú ý nhất” Đến ngày 12/8/2013, WHO xác

nhận 135 ca mắc cúm A/H7N9, trong đó có 44 người đã tử vong Đây là lần đầu tiên chủng vi rút cúm A/H7N9 được xác nhận gây bệnh trên người Các báo cáo cho thấy vi rút cúm A phân nhóm H7 có thể gây bệnh và lan truyền trong đàn gia cầm nhưng thường xảy ra ở quy mô nhỏ, mức độ nhẹ và chỉ gặp đối với chủng H7N2, H7N3 và H7N7 Kết quả điều tra dịch tễ cho thấy bệnh cúm A/H7N9 xảy ra do lây lan từ gia cầm sang người, tất cả bệnh nhân đều có thời gian tiếp xúc với gia cầm hoặc sinh hoạt trong môi trường chăn nuôi, buôn bán gia cầm trước đó từ 7 đến 10 ngày Mặc dù chưa có bằng chứng bệnh cúm A/H7N9 lây lan từ người sang người nhưng các nhà khoa học đã cảnh báo nguy cơ bệnh có thể truyền từ người sang người, đây là vấn đề có thể dẫn đến bùng phát dịch và khả năng lan tràn sang các quốc gia là rất lớn trong đó có Việt Nam vì có nhiều điểm tương đồng về điều kiện khí hậu, tập quán và giao lưu thương mại lớn

Hình 1.4 Phân bố các trường hợp mắc bệnh do cúm A/H7N9

(Nguồn: Riedmann EM Human vaccines & immunotherapeutics ( 2013))

Phân bố bệnh cúm A/H7N9

Trong các năm tiếp theo, bệnh cúm A/H7N9 tiếp tục xuất hiện ở Trung Quốc tạo nên các chùm ca bệnh mới với đỉnh là mùa đông xuân các năm 2014 và 2015 Ngày 10/4/2015, Ủy ban Kế hoạch hóa gia đình và Y tế quốc gia Trung Quốc xác nhận thêm

20 trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 trên người, trong đó 04 trường hợp tử vong Các trường hợp này có thời gian khởi phát triệu chứng nhiễm bệnh khoảng từ ngày 14/02 đến 21/3/2015, đều là nam giới, tuổi từ 32 tuổi đến 80 tuổi và 90% trong số đó có tiền

sử tiếp xúc với gia cầm sống Tính đến ngày 14/4/2015, toàn thế giới ghi nhận tổng số

651 trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 trên người, trong đó 225 trường hợp tử vong (tỷ lệ 35%) Trong tổng số 651 người nhiễm bệnh do cúm A/H7N9 thì Trung Quốc 648 người (bao gồm cả Đài Loan 04, Hồng Kông 13), Malaysia 01 người, Canada 02 người [36,37]

Hình 1.5 Số trường hợp mắc cúm A/H7N9 theo thời gian

(Nguồn: WHO (2013))

Các chuyên gia thuộc Tổ chức y tế thế giới WHO ngày 01/5/2015 trong một cuộc

họp báo tại London, Anh đã đưa ra tuyên bố: “Biến thể mới của vi rút Cúm gia cầm

A/H7N9, bùng phát tại Trung Quốc trong thời gian vừa qua, là mối đe dọa nghiêm trọng đối với con người”, vi rút cúm A/H7N9 là chủng có nguy cơ gây tử vong cao, và có thể

là nguyên nhân dẫn đến một đại dịch Hiện nay, đã xác định con người có khả năng bị nhiễm vi rút cúm A/H7N9 từ gia cầm, nhưng chưa tìm thấy bẳng chứng cho thấy vi rút lây từ người sang người Tuy nhiên, vi rút cúm A/H7N9 có hai kiểu đột biến gene, điều

đó làm tăng khả năng lây lan từ người sang người, nếu khả năng này xảy ra, đây sẽ là

điều kiện gây đại dịch Cúm H7N9 ở người Trong khi đó, Peter Openshaw - Giám đốc Trung tâm nghiên cứu các bệnh về đường hô hấp thuộc Trường Cao đẳng Hoàng gia

London nói rằng: “Bệnh dịch này đang diễn biến khá phức tạp Nếu vi rút cúm A/H7N9

lây lan rộng rãi hơn, sự bùng phát dịch bệnh này sẽ trở nên hết sức nguy hiểm” Các

chuyên gia cũng ghi nhận rằng các bệnh nhân nhiễm cúm A/H7N9 ở mọi lứa tuổi khác nhau, điều đó cho thấy không lứa tuổi nào có thể miễn dịch với chủng cúm này [37]

1.2.2 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 ở người tại Việt Nam [5]

Theo Cục Y tế Dự phòng - Bộ Y tế, tính đến ngày 28/1/2015 chưa ghi nhận ca nào mắc cúm A/H7N9 tại Việt Nam Trung tâm kiểm soát bệnh truyền nhiễm Hoa Kỳ nhận định nguy cơ xâm nhập các trường hợp nhiễm cúm gia cầm vào Việt Nam ở mức trung bình, tuy nhiên nếu không kiểm soát chặt việc nhập lậu gia cầm thì nguy cơ là rất lớn

Căn cứ vào tình hình và đặc điểm dịch tễ của bệnh, nguy cơ dịch cúm A/H7N9 xâm nhập vào Việt Nam cũng như có khả năng bùng phát thành dịch tại cộng đồng là rất lớn nếu không chủ động triển khai các biện pháp phòng chống bệnh cúm A/H7N9

do nhiễm chủng vi rút này từ gia cầm Nguồn lây bệnh chưa được xác định rõ ràng, chưa xác định được các yếu tố dịch tễ liên quan giữa các trường hợp mắc bệnh Đặc tính của

vi rút cúm A là thường xuyên biến đổi thành chủng mới có thể lây truyền dễ dàng hơn

từ gia cầm sang người Lịch sử thế giới đã ghi nhận các dịch cúm A (H7) với nhiều trường hợp mắc, thậm chí là tử vong ở người

Hiện nay chưa có vắc xin phòng bệnh và thuốc điều trị đặc hiệu với bệnh cúm nói chung và bệnh cúm A/H7N9 nói riêng Để tăng cường phòng chống cúm, Bộ Y tế khuyến cáo người dân các biện pháp phòng bệnh không đặc hiệu như thường xuyên rửa tay với xà phòng; không sử dụng gia cầm, sản phẩm của gia cầm không rõ nguồn gốc Khi phát hiện có gia cầm ốm, chết, người dân phải báo ngay cho chính quyền địa phương

và đơn vị thú y trên địa bàn Người trở về nước từ các quốc gia hoặc khu vực có bệnh phải áp dụng các biện pháp phòng bệnh, khai báo tình trạng sức khỏe cho cơ quan y tế địa phương để được theo dõi sức khỏe

1.3 Nghiên cứu và sản xuất vắc xin H7N9 ở trong và ngoài nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu vắc xin H7N9 ở ngoài nước

Để chủ động kiểm soát và khống chế bệnh trước nguy cơ đại dịch, ngay sau khi xác định được nguyên nhân gây bệnh, WHO đã tiến hành phân lập chủng vi rút để phát

triển chủng dự tuyển sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 thông qua Hệ thống Ứng phó và Kiểm soát bệnh Cúm toàn cầu (GISRS) Đến nay đã có 3 chủng dự tuyển sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 được tạo ra bằng phương pháp di truyền ngược dòng đã được WHO chấp nhận và tiếp tục đánh giá đầy đủ về đặc tính và an toàn của chủng bao gồm chủng NIBRG-267 được sản xuất từ chủng A/Sanghai/2/2013, chủng NIBRG-268 từ chủng A/Anhui/1/2013 do Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm định Sinh học (NIBSC - Anh) thực hiện và chủng IDCDC-RG32A do Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh (CDC - Hoa Kỳ) tái tổ hợp từ chủng A/Sanghai/2/2013 Các chủng này được cung cấp miễn phí cho các nhà sản xuất vắc xin để nghiên cứu phát triển vắc xin dự tuyển cúm A/H7N9 Ngoài

ra, WHO cũng khuyến cáo các nhà sản xuất chuẩn bị các điều kiện về cơ sở vật chất, công nghệ, nguyên liệu v.v… để sẵn sàng sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 đáp ứng đủ số lượng và chất lượng dự phòng khi đại dịch xảy ra [31]

Vắc xin phòng bệnh cúm được xem là giải pháp quan trọng và hiệu quả nhất để kiểm soát sự lây lan Nhiều nhà khoa học trên khắp thế giới đã và đang đầu tư nghiên cứu phát triển vắc xin đặc hiệu phòng bệnh cúm A/H7N9 lây lan trên gia cầm Một số kết quả nghiên cứu đã cho thấy protein của kháng nguyên H7 có tính sinh miễn dịch kém ở người vì có rất ít nhóm đặc hiệu kháng nguyên (epitope) đặc hiệu với tế bào T trên cấu trúc phân tử HA và khả năng phản ứng chéo với các epitope của tế bào T của các chủng cúm lưu hành cũng rất hạn chế Do đó, việc phát triển một vắc xin đặc hiệu

và hiệu quả với vi rút cúm A/H7N9 là một vấn đề không dễ giải quyết Đến thời điểm hiện tại, ít nhất bốn cơ sở nghiên cứu công bố đã phát triển thành công vắc xin cúm A/H7N9 bao gồm Greffex, Protein sciences, Medicago và Novavax Cả bốn công ty này đều áp dụng công nghệ gen tiên tiến để nghiên cứu vắc xin dạng tiểu phần tinh khiết dự tuyển phòng cúm A/H7N9 Trong đó công ty Medicago và Novavax phát triển vắc xin dạng VLP cho kết quả bước đầu khả quan trong các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng [16,32]

Vắc xin VLP phòng cúm A/H7N9 do công ty Novavax phát triển chứa kháng nguyên HA từ chủng gốc A/Anhui/1/2013-H7N9, kháng nguyên NA từ chủng A/Anhui/1/2013-H7N9 và kháng nguyên M1 từ chủng A/Indonesia/05/2005-H5N1 Loại vắc xin này không những tạo được đáp ứng kháng thể kháng HA ở mức cao ≥ 1:64, kháng NA của vi rút cúm A/H7N9 mà còn tạo được đáp ứng miễn dịch chéo với các chủng vi rút cúm thuộc nhóm H7 như A/H3N2 Kết quả nghiên cứu trên chuột nhắt cho

thấy tất cả động vật được tiêm vắc xin đều tạo được đáp ứng kháng thể với vi rút cúm A/H7N9 trong khi tất cả chuột tiêm vắc xin cúm A/H5N1 và giả dược đều chết Ngoài

ra công nghệ sản xuất vắc xin VLP đơn giản và rút ngắn được thời gian với thực tế chỉ mất 26 ngày sản xuất vắc xin loại này Vắc xin này cũng không chứa vật chất di truyền cần thiết cho vi rút nhân lên và xâm nhập vào tế bào chủ Do vậy khi so sánh với các công nghệ sản xuất vắc xin cúm bất hoạt hoặc giảm độc lực cổ điển thì vắc xin này có thể sử dụng nhanh chóng tiện lợi và an toàn hơn khi dịch xảy ra Những nghiên cứu sâu hơn bao gồm cả thử nghiệm lâm sàng trên người vẫn đang tiếp tục được thực hiện [30]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất vắc xin H7N9 ở trong nước

Năm 2005, khi dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở gia cầm và gây bệnh cho người, các

cơ sở nghiên cứu và sản xuất trong nước đã tiến hành nghiên cứu, phát triển vắc xin cúm phòng đại dịch theo các công nghệ khác nhau Tất cả các vắc xin cúm do Việt

Nam nghiên cứu phát triển đến nay đều là vắc xin đơn giá (monovalent), toàn hạt vi

rút bất hoạt Tuy nhiên cho đến thời điểm này chưa có vắc xin cúm nào được cấp phép lưu hành

Năm 2008, IVAC được WHO và Bộ Y tế đầu tư công nghệ và kinh phí để xây dựng cơ sở thực nghiệm, phát triển vắc xin cúm đại dịch bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi Đây là dây chuyền sản xuất vắc xin cúm chuyên biệt, đạt tiêu chuẩn GMP – WHO có công suất 3 triệu liều/năm Tự chủ nguồn trứng gà nguyên liệu tin cậy

đủ tiêu chuẩn sản xuất vắc xin cho người được cung cấp tại chỗ từ cơ sở chăn nuôi gà kiểm soát, đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học Cho đến nay, IVAC đã phát triển thành công quy trình “lõi” sản xuất vắc xin cúm toàn hạt vi rút tinh khiết, bất hoạt bằng formalin để chủ động đáp ứng nhanh sản xuất vắc xin, ứng phó kịp thời với những biến thể của vi rút mới có thể gây dịch hoặc đại dịch Năm 2011, IVAC đã sản xuất thành công vắc xin cúm A/H1N1/09 và hoàn tất thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 trên người Năm 2013, IVAC phát triển sản xuất thành công vắc xin cúm A/H5N1, hoàn thành thử lâm sàng giai đoạn 1 trên người và đang tiếp tục các giai đoạn thử nghiệm tiếp theo hướng đến đăng ký lưu hành vào năm 2016 - 2017 Dây chuyền sản xuất vắc xin cúm nói trên đã được Bộ Y tế cấp chứng nhận GMP - WHO năm 2012

Ngoài ra, IVAC là thành viên trong mạng lưới các nhà sản xuất vắc xin cúm được WHO tài trợ và chuyển giao công nghệ nên đã liên lạc chặt chẽ với WHO để cập nhật thông tin và sẵn sàng các điều kiện để sản xuất vắc xin cúm khi có biến chủng vi rút

cúm mới có khả năng gây dịch hoặc đại dịch xuất hiện Tháng 5/2013, chỉ 2 tháng sau khi dịch cúm A/H7N9 xuất hiện tại Trung Quốc, IVAC chủ động đề xuất với Bộ Y tế nhiệm vụ nghiên cứu vắc xin A/H7N9 và được phép tiếp cận nhận chủng gốc do WHO cung cấp để nghiên cứu sản xuất vắc xin này Ngoài IVAC, trong nước chưa có cơ sở nào khác nghiên cứu sản xuất dự tuyển vắc xin Cúm A/H7N9 [2,3,4]

1.4 Công nghệ sản xuất vắc xin Cúm

1.4.1 Tổng quan về vắc xin cúm

Vắc xin cúm được sử dụng với mục đích làm giảm tỷ lệ mắc và chết do bệnh cúm bằng cách tạo ra đáp ứng kháng thể kháng lại vi rút gây nên bệnh cúm thông thường hàng năm (hay còn gọi là cúm mùa) hoặc những chủng vi rút mới được phân lập từ những vụ dịch cúm có khả năng phát triển thành đại dịch Miễn dịch hàng năm với các chủng vi rút cúm mùa cũng giúp hạn chế nguy cơ phát triển thành đại dịch do tính chất biến đổi gen của chủng vi rút cúm mùa thành chủng vi rút gây đại dịch Vắc xin cúm mùa cũng giúp tạo miễn dịch cơ bản chống lại vi rút cúm cho trẻ em, những đối tượng chưa từng bị nhiễm vi rút cúm

Năm 1931, kỹ thuật nuôi cấy vi rút trên trứng gà có phôi được phát triển Năm

1941, vắc xin cúm bất hoạt lần đầu tiên được sản xuất bằng kỹ thuật này và được phép

sử dụng cho quân đội Mỹ trong chiến tranh thế giới thứ 2 Ngày nay, nhờ áp dụng những tiến bộ của khoa học công nghệ, thế giới đang tiến tới mục tiêu sản xuất vắc xin cúm an toàn hơn và đại trà hơn

Có hai loại vắc xin cúm truyền thống là vắc xin bất hoạt và vắc xin sống giảm độc lực đang được sử dụng, các vắc xin này được sản xuất hàng năm bằng cách nuôi cấy

chủng vi rút trên trứng gà có phôi hoặc một số dòng tế bào như: MDCK, Vero và

PER.C6 Các dòng tế bào này có thể nuôi cấy trong môi trường không có huyết thanh

và đã được chấp nhận để sản xuất vắc xin cho người Vắc xin cúm chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi Năm 2003 khi dịch cúm A/H5N1

có nguy cơ thành đại dịch, quá trình nghiên cứu phát triển vắc xin cúm đại dịch được đầu tư trên các nền tảng công nghệ khác nhau như công nghệ nuôi cấy trên tế bào, công nghệ tái tổ hợp… Đồng thời nghiên cứu phát triển các tá chất sử dụng trong vắc xin nhằm tăng cường khả năng tạo đáp ứng miễn dịch tăng sản lượng vắc xin dự phòng cho đại dịch [24]

1.4.2 Các loại vắc xin cúm

1.4.2.1 Vắc xin sống giảm độc lực

Vắc xin sống giảm độc lực (LAIV) được nghiên cứu và phát triển trên 30 năm đây

là vắc xin dạng khí dung, miễn dịch bằng đường niêm mạc mũi Vắc xin này được sản xuất từ chủng nhược độc được tạo ra bằng cách tái tổ hợp gen sản xuất HA và NA của chủng vi rút cúm đang lưu hành với chủng vi rút dự tuyển sản xuất vắc xin Có 2 loại chủng dự tuyển sản xuất bao gồm :

- Chủng nhạy cảm nhiệt độ : chủng này phát triển kém ở nhiệt độ 37 – 390C nên khả năng nhân lên hạn chế ở đường hô hấp dưới, có khả năng phát triển ở đường

hô hấp trên do vậy có thể kích thích hệ thống miễn dịch nhày đường hô hấp và miễn dịch toàn thân

- Chủng thích ứng lạnh: có thể phát triển tốt ở nhiệt độ thấp (250C) do vậy thích hợp cho phát triển ở đường hô hấp trên

Vắc xin sống giảm độc lực được sử dụng ở Liên bang Xô Viết cũ trong nhiều năm

và cũng đã được cấp phép sử dụng tại Mỹ năm 2003

Ưu điểm của loại vắc xin này là quy trình tinh chế sau thu hoạch đơn giản, dễ thực hiện, có năng suất cao gấp 15 đến 20 lần so với vắc xin bất hoạt, không cần tiêm chích

và tạo đáp ứng miễn dịch màng nhày niêm mạc đường hô hấp, đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào Ngoài ra, khả năng kích thích hệ thống miễn dịch cũng mạnh hơn đối với vắc xin bất hoạt Do vậy hiện nay nhiều công ty đầu tư nghiên cứu phát triển vắc xin cúm đại dịch theo hướng này [9,19,24]

1.4.2.2 Vắc xin bất hoạt

Các loại vắc xin cúm mùa hiện nay trên thế giới là vắc xin bất hoạt 3 thành phần (kí hiệu TIV) gồm hai chủng cúm A là A/H1N1, A/ H3N2 và một chủng vi rút cúm B Mỗi liều vắc xin chứa 15g kháng nguyên mỗi chủng vi rút thành phần Hầu hết các loại vắc xin cúm mùa hiện nay trên thế giới được sản xuất theo công nghệ trên trứng gà có phôi Nhiều vắc xin đại dịch một thành phần cũng áp dụng công nghệ này để sản xuất

Từ 2007, vắc xin bất hoạt cũng được nghiên cứu sản xuất theo công nghệ nuôi cấy trên

tế bào và đã có một số vắc xin được cấp phép lưu hành Các loại tế bào sử dụng trong nuôi cấy bao gồm tế bào vero, MDCK, PER66 …v.v Có ba loại vắc xin bất hoạt là vắc

xin toàn hạt vi rút (whole virion), vắc xin dạng mảnh (split) và vắc xin tiểu phần

(subunit)

Hình 1.6 Các thế hệ vắc xin cúm

(Nguồn: Executive office of the President – US (2010))

Vắc xin toàn hạt vi rút là vắc xin thế hệ thứ nhất (1958) được sản xuất trên trứng

gà có phôi, vi rút được bất hoạt bằng formalin hoặc β-propiolactone Đây là loại vắc xin

an toàn, dung nạp tốt, hiệu quả bảo vệ 75 - 90%

Vắc xin dạng mảnh vi rút là vắc xin thế hệ thứ hai (1968), cũng được sản xuất như vắc xin toàn thân nhưng hạt vi rút được phá vỡ bằng các yếu tố hóa lý như sóng siêu âm, triton, tween 80…tạo thành các mảnh kháng nguyên bề mặt, nuclecapside

Vắc xin tiểu phần là vắc xin thế hệ thứ ba (1976) được sản xuất như vắc xin dạng mảnh nhưng quy trình tinh chế nghiêm ngặt hơn vì thành phần chính là các protein HA

và NA tinh chế, các thành phần khác của vi rút bị loại bỏ

Những nghiên cứu hiện nay tập trung nghiên cứu và sản xuất vắc xin DNA từ các mảnh gene của vi rút: gene HA, NA, NP, NS…Tuy nhiên vẫn chưa xác định được loại vắc xin nào hữu hiệu nhất để chống lại tất cả các vi rút cúm A [19,24]

1.4.2.3 Vắc xin cúm tái tổ hợp

Ngoài những công nghệ sản xuất thường gặp trên trứng gà có phôi và trên tế bào, hiện nay công nghệ tái tổ hợp đang được nghiên cứu, áp dụng trong sản xuất nhiều loại vắc xin như vắc xin HPV, HBV Trong công nghệ này, thành phần protein mang bản chất kháng nguyên vi rút được tổng hợp bằng công nghệ sinh học phân tử bằng cách gắn gen mã hóa tổng hợp protein HA của vi rút cúm lên tế bào đích và thu lại protein cần thiết mang bản chất kháng nguyên trong môi trường nuôi cấy để sản xuất vắc xin

Ưu điểm lớn nhất của loại vắc xin này là có thể rút ngắn thời gian sản xuất và tăng sản lượng sản xuất dựa trên công nghệ tái tổ hợp Tuy nhiên, cũng giống như việc chuyển

đổi công nghệ sản xuất từ nuôi cấy trên trứng gà có phôi sang công nghệ nuôi cấy trên

tế bào, sản xuất vắc xin cúm tái tổ hợp còn gặp những trở ngại do cần nguồn kinh phí đầu tư lớn Hệ thống các quy định, hướng dẫn, tiêu chuẩn cho cấp phép chưa đầy đủ Ngoài ra, kháng nguyên thu được có độ tinh khiết cao nên khả năng kích thích hệ thống miễn dịch thấp, nên cần phải tích hợp kháng nguyên vào cấu trúc VLP hoặc phối hợp với tá chất để tăng khả năng sinh miễn dịch Do vậy cần có sự đầu tư và lộ trình để thực hiện trong tương lai [24]

1.4.2.4 Vắc xin đa năng (universal)

Vi rút cúm là tác nhân gây bệnh đặc biệt, Hàng năm, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt tạo ra chủng vi rút mới có khả năng chống lại sự bảo vệ của cơ thể đã sử dụng vắc xin đối với chủng chưa biến đổi, do vậy vắc xin đặc hiệu với mỗi chủng gây bệnh cũng cần được thay đổi hàng năm, đồng thời cần có dự báo để sẵn sàng chủng sản xuất vắc xin cho năm tiếp theo Những nghiên cứu gần đây cho thấy, có những thành phần mang tính kháng nguyên của hạt vi rút cúm không thay đổi giữa các chủng cúm làm cơ sở cho nghiên cứu vắc xin đa năng kháng được tất cả các chủng vi rút cúm

Hầu hết các loại vi rút gây bệnh mà hiện nay đã sản xuất được vắc xin bảo vệ bền vững là những tác nhân gây bệnh trên người và người cũng là vật chủ duy nhất Các vi rút này có thể phát triển trong cơ thể người nhưng không gây bệnh hoặc gây bệnh có triệu chứng lâm sàng ở các mức độ khác nhau Vi rút cúm có khả năng biến đổi kháng nguyên bề mặt nên với trình độ công nghệ hiện nay chưa tạo ra được vắc xin gây miễn dịch bền vững và có tác dụng với các chủng vi rút khác nhau Do vậy, vắc xin cúm đa năng là một thách thức lớn trong việc tìm kiếm những cấu trúc kháng nguyên có tính chất bền vững, không thay đổi giữa các chủng đồng thời có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch và kết hợp với kháng thể đặc hiệu

Cấu trúc haemaglutinin bề mặt vi rút cúm đóng vai trò kháng nguyên và kết hợp với kháng thể đặc hiệu Cấu trúc phân tử HA gồm hai phần, phần đỉnh có tác dụng gắn với kháng thể và là điểm bám vào tế bào đích Phần gốc gắn lên bề mặt của vi rút Để

né tránh bị trung hòa bởi kháng thể, vi rút cúm đột biến để tạo ra cấu trúc mới ở vùng đỉnh của cấu trúc HA trong khi cấu trúc phần gốc thường ổn định và bền vững Những nghiên cứu gần đây cho thấy có thể tạo ra được kháng thể đặc hiệu gắn với phần gốc của HA, đây là cơ sở cho việc đầu tư nghiên cứu loại vắc xin đa năng kháng lại vi rút cúm nói chung Tuy nhiên để phát triển được loại vắc xin này cũng còn nhiều vấn đề

phải giải quyết như chế tạo loại kháng nguyên này như thế nào trong khi chưa có vắc xin nào được tạo ra theo hướng đó và sau khi vắc xin được tạo ra vi rút có thể đột biến

để thay đổi cấu trúc phần này làm mất tác dụng của vắc xin hay không…Do vậy, mặc

dù trên lý thuyết vắc xin đa năng là một hướng phát triển nhiều triển vọng nhưng vẫn còn nhiều vấn đề cần được đầu tư nghiên cứu [24]

1.4.3 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm

1.4.3.1 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi

Công nghệ sản xuất vắc xin cúm là một yếu tố quan trọng để các nhà sản xuất lựa chọn và áp dụng Hiện tại, đa số các nhà sản xuất lựa chọn công nghệ sản xuất trên trứng

gà có phôi vì đây là công nghệ truyền thống an toàn, tin cậy được thế giới áp dụng từ những năm 1950 và phổ biến hiện nay với khoảng 90% sản lượng vắc xin cúm toàn cầu đang được lưu hành được sản xuất theo công nghệ này và được sử dụng an toàn

Ưu điểm của công nghệ này là một phương pháp sản xuất chuẩn thức được sử dụng rộng rãi trên 60 năm và mỗi năm hàng trăm triệu liều vắc xin cúm đã được sản xuất, sử dụng an toàn trên thế giới, chủng vi rút sản xuất vắc xin được tối ưu hóa để phát triển tốt trên trứng gà, các phương pháp phân tích phù hợp cần thiết đã được thiết lập, đã được chứng minh, đánh giá và có chứng cứ thuyết phục, quy định trong cấp phép sử dụng đã được áp dụng Ngoài ra công nghệ này cũng phù hợp với các cơ sở sản xuất quy mô vừa

và nhỏ, dễ đầu tư công nghệ do vốn đầu tư ban đầu để xây dựng nhà máy sản xuất ở qui

mô này thấp, giá thành vắc xin tương đối rẻ Với những ưu điểm này, hàng tỷ liều vắc xin cúm sản xuất theo công nghệ trên trứng gà có phôi đã được sản xuất và sử dụng trên toàn thế giới, từ các công ty đa quốc gia như GSK, Novartis, Sanofi Aventis, Merck… đến các nhà sản xuất tại các quốc gia đang phát triển ở Châu Á, Châu Phi và Nam Mỹ Trứng gà có phôi 9 - 12 ngày tuổi cung cấp từ các đàn gà có kiểm soát được sử dụng để cấy vi rút Sau khi gây nhiễm vi rút, ủ trứng ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp Sau 72h chuyển trứng vào buồng lạnh (40C) để qua đêm Ngày hôm sau thu hoạch dịch niệu nang rồi tiến hành các công đoạn tinh chế kháng nguyên và bất hoạt Phương pháp và mức độ tinh chế tùy thuộc vào dạng vắc xin toàn hạt vi rút, tiểu phần hay kháng nguyên

bề mặt Vắc xin toàn vi rút chỉ đòi hỏi một lần siêu ly tâm phân đoạn sucrose trong khi vắc xin tiểu phần đòi hỏi phải có quá trình phá vỡ các hạt vi rút bằng các chất tẩy rửa (triton X100, sodium lauryl sulfate, tween 80 ) và qua 2 lần siêu ly tâm phân đoạn

sucrose Vắc xin kháng nguyên bề mặt đòi hỏi nhiều bước tinh chế hơn thay vì ly tâm phân đoạn sucrose lần thứ 2

Tuy nhiên công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi vẫn còn những hạn chế như: khó mở rộng quy mô sản xuất, phụ thuộc vào nguồn sản xuất trứng nguyên liệu, lượng chất thải rắn trong qui trình sản xuất lớn, cẩn phải có hệ thống xử lý thích hợp… Ngoài ra, công nghệ này cũng có một vài nhược điểm do đây là 1 dây chuyền riêng biệt chỉ dùng cho việc sản xuất vắc xin cúm Nếu nhu cầu vắc xin cúm đột ngột giảm xuống không tận dụng được cơ sở vật chất sẵn có để sản xuất loại vắc xin khác vì thế phải tính toán chi tiết khi đầu tư mở rộng sản xuất Nguồn cung cấp trứng sẽ hạn chế đặc biệt khi dịch xảy ra trên gà Chất thải rắn trong qui trình sản xuất chiếm 80% lượng nguyên liệu cung cấp nên cần phải có hệ thống xử lý thích hợp

Hiệu suất vắc xin sản xuất trên trứng: Mỗi một chủng vi rút có những đặc tính phát triển trên trứng khác nhau cho hiệu suất khác nhau Đối với chủng cúm đại dịch A/H1N1/09, cũng là một thành phần trong vắc xin cúm mùa nhiều năm nay, thì sản lượng ổn định và không thay đổi so với vắc xin cúm mùa Tuy nhiên, trong thực tế chủng vi rút cúm A/H5N1 làm vắc xin được tạo ra từ kỹ thuật di truyền đảo ngược hiện nay chỉ tạo được năng suất khoảng 30- 40% so với các chủng vắc xin cúm mùa và điều này hoàn toàn có thể đúng với các chủng sản xuất vắc xin cúm đại dịch khác trong đó

có vắc xin cúm A/H7N9 Đây cũng là thách thức chung cho cả vắc xin sản xuất trên tế bào và cần được khắc phục trong tương lai gần [9,15,38]

Những chủng vi rút dùng trong sản xuất vắc xin cúm đã được tối ưu hóa để phát triển trên trứng Vấn đề giấy phép cũng như những phân tích cần thiết đã được thiết lập

và đã được TCYTTG chấp thuận Vốn đầu tư ban đầu không lớn để xây dựng nhà máy sản xuất ở qui mô vừa và nhỏ, giá thành vắc xin tương đối rẻ

Tuy nhiên công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi vẫn còn những hạn chế như: khó mở rộng quy mô sản xuất, phụ thuộc vào nguồn sản xuất trứng nguyên liệu, lượng chất thải rắn trong qui trình sản xuất lớn, cẩn phải có hệ thống xử lý thích hợp…

1.4.3.2 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên tế bào

Đây là công nghệ sản xuất vắc xin tiên tiến được các nhà nghiên cứu và sản xuất đầu tư phát triển với độ tinh khiết và tính an toàn cao đồng thời dễ kiểm soát các tác nhân ngoại lai hơn so với công nghệ sản xuất trên trứng gà Công nghệ này đã được áp

dụng thành công trong sản xuất nhiều loại vắc xin vi rút như vắc xin dại, vắc xin bại liệt, vắc xin viêm gan vv và hiện nay đã có một số sản phẩm vắc xin cúm mùa đa chủng được sản xuất theo công nghệ này được cấp phép sử dụng ở châu Âu và Mỹ Ưu điểm của công nghệ này là dễ phát triển quy mô sản xuất và tiết kiệm được công lao động Tuy nhiên việc thiết lập cơ sở sản xuất đòi hỏi sự đầu tư lớn về tiền bạc và thời gian cho nên đến nay hầu hết các nhà sản xuất chỉ mới đang trong giai đoạn nghiên cứu phát triển trên quy mô nhỏ Giá thành cao và rào cản sở hữu trí tuệ cũng làm cho công nghệ này vẫn chỉ là xu thế phát triển trong tương lai

Hiện nay có một số dòng tế bào đang được dựng trong nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm: MDCK (tế bào thận chó Madin-Darby); Vero (tế bào thận khỉ xanh châu Phi);

PER.C6 (tế bào võng mạc người) Các dòng tế bào khác như tế bào nguyên bào sợi phôi

gà, tế bào Vivalis có nguồn gốc từ gà (Nantes, Pháp) đang được nghiên cứu gần đây cũng cho thấy có nhiều hứa hẹn trong tương lai [24,38]

 Ưu điểm của công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên tế bào [3][10]

Nuôi cấy vi rút cúm trên tế bào sẽ khắc phục được một số nhược điểm của phương pháp sản xuất trên trứng gà có phôi Những thuận lợi của phương pháp này so với phương pháp sản xuất trên trứng gà có phôi bao gồm:

- Không cần phải dùng đến lượng trứng gà lớn Nguồn cung cấp nguyên liệu bảo đảm và có thể dự trữ

- Quy trình này có thể tăng quy mô lên nhanh chóng do sử dụng được công nghệ trong nhà máy sản xuất các vắc xin khác trên tế bào

- Nâng cao khả năng vô trùng trong quá trình sản xuất Tránh được nguy cơ trứng có phôi nhiễm retro vi rút

- Vắc xin không có thành phần trứng nên tránh được nguy cơ dị ứng cho

những người có tiền sử dị ứng với protein của trứng

 Nhược điểm của công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên tế bào

- Chi phí sản xuất vắc xin cúm trên tế bào cao hơn so với phương pháp truyền thống Các quy trình kiểm định phức tạp hơn như phải phát hiện DNA của tế bào chủ Những kỹ thuật này đòi hỏi phương tiện và phải chuẩn thức

- Tốn thời gian và chi phí để phát triển đủ lượng tế bào cho sản xuất từ ngân hàng tế bào gốc

Các tế bào dùng để sản xuất vắc xin thường yêu cầu phải có hồ sơ mô tả toàn bộ đặc tính của tế bào và hồ sơ về ngân hàng tế bào gốc của nhà sản xuất, mà chúng thường được cấp sở hữu trí tuệ nên đòi hỏi phải xin giấy phép [3,10,29]

1.4.3.3 Một số các phương pháp sản xuất vắc xin cúm khác

- Nuôi cấy trên nguyên bào sợi phôi gà: Sản xuất vắc xin theo công nghệ này

có thể là phương pháp nhanh nhất để mở rộng quy mô sản xuất vắc xin cúm Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những bất lợi như đòi hỏi phải có trứng sạch SPF, huyết thanh

bào thai bê và năng lực sản xuất có hạn vì rất ít nhà sản xuất đầu tư phương pháp này

- Vắc xin DNA: Vắc xin chứa DNA của HA và NA được tiêm trong da dưới dạng

đạn bọc DNA (hãng PowderMed, Oxford Anh) Vì DNA có thể được sản xuất nhanh chóng nên vắc xin này đang thu hút sự quan tâm của các nhà chuyên môn Tuy nhiên quy trình công nghệ phức tạp và quyền sở hữu trí tuệ gây khó khăn cho việc triển khai

rộng rãi loại vắc xin này

- Vắc xin HA theo kiểu vector và tái tổ hợp: Kháng nguyên HA được sản

xuất bởi hệ thống vi rút baculo (hãng Protein Sciences Corporation, Mỹ) hoặc trong

thực vật cấy DNA của vi rút (hãng Microbix, Mỹ) Ưu điểm của dạng vắc xin này là năng suất kháng nguyên cao và sản xuất nhanh Tuy nhiên khả năng đáp ứng miễn dịch bị hạn chế [24]

1.5 Sản xuất vắc xin cúm quy mô lớn tại Viện vắc xin và sinh phẩm y tế (IVAC)

1.5.1. Điều kiện sản xuất

Nhà máy đạt chuẩn GMP-WHO để sản xuất vắc xin cúm với công suất 1 - 3 triệu liều vắc xin/năm được trang bị đầy đủ các trang thiết bị hiện đại nhất thế giới như : Lò

ấp trứng, máy gặt trứng, máy hút dịch, máy li tâm 2000 vòng/ phút, máy siêu ly tâm

35000 vòng/phút, hệ thống lọc trong, bơm hút…

1.5.2. Tóm tắt quy trình công nghệ

Trên cơ sở dây chuyền sản xuất vắc xin cúm theo công nghệ nuôi cấy trên trứng

gà có phôi đã đưa vào vận hành và thẩm định, vận dụng kết quả đạt được trong nghiên cứu sản xuất trên quy mô thí nghiệm Quy trình sản xuất chung cho các vắc xin cúm đại dịch, bao gồm vắc xin cúm A/H7N9 được áp dụng như sau:

- SRID, Ovalbumin, RIV Vắc xin thành phẩm - Protein, Formalin,

endotoxin

- SRID, Ovalbumin

 Thuyết minh quy trình: Quy trình sản xuất theo dạng bán tự động gồm các bước chính:

- Trứng (0 ngày tuổi) từ trại chăn nuôi gà Suối Dầu sẽ được chuyển đến phòng chọn trứng để loại những quả không đạt tiêu chuẩn chất lượng

- Trứng đạt tiêu chuẩn được xếp khay, tiến hành ấp trong 11 ngày

- Soi trứng (loại bỏ các trứng yếu, chết)

- Gây nhiễm bằng máy gây nhiễm

- Dịch thu được chuyển sang máy siêu ly tâm 35000 vòng/ phút

- Bất hoạt dịch vi rút sau siêu ly tâm bằng formaldehyde

- Ly giải

- Lọc vô trùng để thu sản phẩm cuối cùng

1.5.3. Phát triển quy trình công nghệ

 Cơ sở đánh giá tính ổn định của quy trình: Quy trình có nhiều giai đoạn, mỗi

giai đoạn ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm của quy trình Do đó để đánh giá tính ổn định của quy trình chúng ta cần liên tục thẩm định các công đoạn trong quy trình sản xuất, những công đoạn ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất tạo ra sản phẩm sẽ được nghiên

cứu và khảo sát để tìm kiếm điều kiện tối ưu nhất áp dụng vào sản xuất

- Xác định các thông số tối ưu trong sản xuất đối với chủng A/H7N9: Đậm độ vi rút gây nhiễm, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy, lọc và tách hạt vi rút, thông số kỹ thuật bất hoạt bằng formalin

- Xác định các thông số sản xuất chính vắc xin cúm A/H7N9 ở quy mô 10000 –

20000 liều/ lô

- Trên cơ sở quy trình lõi sản xuất vắc xin cúm theo công nghệ nuôi cấy trên trứng

gà có phôi đã được thẩm định, các thông số kỹ thuật chi tiết của từng giai đoạn được thiết lập và đánh giá để thiết lập quy trình phù hợp với đặc tính của chủng cúm A/H7N9

như xác định liều gây nhiễm tối ưu, các điều kiện nhiệt độ và thời gian nhân lên của vi rút, điều kiện và khả năng bất hoạt bằng formalin

1.5.4. Tiêu chuẩn của vắc xin

Hai tiêu chuẩn quan trọng nhất của vắc xin là an toàn và hiệu lực:

 An toàn

Một vắc xin lý tưởng khi sử dụng sẽ không gây bệnh, không gây độc và không gây phản ứng nghiêm trọng Sau khi sản xuất vắc xin phải được cơ quan kiểm định nhà nước kiểm tra chặt chẽ về mặt vô trùng, thuần khiết và không độc

- Vô trùng: Vắc xin không được nhiễm các vi sinh vật khác

- Thuần khiết: Ngoài kháng nguyên đưa vào để kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch chống vi sinh vật gây bệnh, không được lẫn các thành phần kháng nguyên khác

có thể gây ra các phản ứng phụ bất lợi

- Không độc: Liều sử dụng phải thấp hơn rất nhiều so với liều gây độc

Tuy nhiên, không có vắc xin nào đạt được độ an toàn tuyệt đối Về nguyên tắc, vắc xin phải đảm bảo đủ độ an toàn Song trên thực tế không thể đạt được mức độ an toàn tuyệt đối Tất cả các vắc xin đều có thể gây ra phản ứng phụ ở một số người

 Hiệu lực

Vắc xin có hiệu lực lớn là vắc xin gây được miễn dịch ở mức độ cao và tồn tại trong một thời gian dài Hiệu lực gây miễn dịch của vắc xin trước hết được đánh giá trên động vật thí nghiệm, sau đó trên thực địa

- Trên động vật thí nghiệm:

Cách thứ nhất, đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch thông qua việc xác định hiệu giá kháng thể hoặc xác định mức độ dương tính của phản ứng da Cách đánh giá này chưa cho biết hiệu lực bảo vệ, mới chỉ cho biết mức độ đáp ứng miễn dịch của cơ thể động vật đối với loại vắc xin thử nghiệm Cách thứ hai, xác định tỷ lệ động vật đã được tiêm chủng sống sót sau khi thử thách bằng vi sinh vật gây bệnh

- Trên thực địa:

Dù đã được cơ quan kiểm định nhà nước kiểm tra và đã được đánh giá trên động vật, trước khi đưa ra tiêm chủng rộng rãi, vắc xin đều phải được thử nghiệm trên thực địa: Vắc xin được tiêm chủng cho một cộng đồng, theo dõi thống kê tất cả các phản ứng phụ và đánh giá khả năng bảo vệ khi mùa dịch tới

Ngoài 2 tiêu chuẩn trên, để chọn một vắc xin tiêm chủng, người ta còn quan tâm

đến giá thành và tính thuận lợi trong việc tiến hành tiêm chủng

1.5.5. Tiêu chuẩn của vắc xin cúm

Cũng như các loại vắc xin khác, vắc xin cúm cũng cần đảm bảo được hai tiêu chuẩn trên Đối với giai đoạn bất hoạt thì tiêu chuẩn an toàn cần được đảm bảo hàng đầu Trong đó các chỉ tiêu, tiêu chuẩn như sau:

1.6 Các hóa chất thường dùng trong bất hoạt vắc xin cúm

Yêu cầu khi sản xuất vắc xin là phải an toàn cho người sử dụng Do đó các vi sinh vật sử dụng để chế tạo vắc xin phải không còn khả năng gây bệnh nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên, nghĩa là có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể

Vi sinh vật có thể được bất hoạt bằng các tác nhân hóa học: formalin, beta propiolactone… hay tác nhân lý học (tia cực tím, nhiệt độ…)

1.6.1 Beta - propiolactone (BPL) [25,28]

Beta - propiolactone (C3H4O2) là hợp chất hữu cơ thuộc họ lactone, ở trạng thái lỏng không màu có mùi hăng, vị ngọt BPL hòa tan trong nước và có thể trộn lẫn với rượu, axeton, ete, và hầu hết các dung môi phân cực và chất béo BPL có khả năng tự thủy phân thành acid hydracrylic trong nước, nhưng ổn định khi bảo quản ở 50C trong

lọ thủy tinh BPL có cấu trúc vòng bốn cạnh nên có thể thực hiện phản ứng nở vòng ở

cả hai vị trí alkyl và acyl làm cho nó dễ dàng phản ứng với protein (chủ yếu là methionine, cysteine) và acid nucleic (phần lớn là guanine)

 Ưu điểm của BPL

- Bất hoạt vi rút nhanh, hiệu quả

- BPL có thể bị phân hủy ngay sau vài giờ sử dụng nên ít nguy hiểm

 Nhược điểm

- BPL ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe con người

- BPL tan trong nước nên rất khó thao tác và nguy hiểm khi sử dụng

- Giá thành cao

Hiện nay BPL cũng đang được sử dụng để bất hoạt vi rút cúm tại Viện Vắcxin

Hà lan (NVI)

1.6.2 Formalin (Formaldehyde)

Formalin là tên thương phẩm của formaldehyde, một aldehyde đơn giản nhất có công thức phân tử H2CO, có thể tồn tại dưới dạng C3H6O3 (trioxane) và dạng polymer paraformaldehyde Trong nước, formalin ở dạng H2C(OH)2 Formalin là sản phẩm trung gian khi đốt methane hay các hợp chất chứa carbon khác Trong không khí, formalin được tạo ra do phản ứng của oxy với methane hay các hydrocarbon dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời

Ở nhiệt độ phòng, formalin ở dạng khí, dễ hoà tan trong nước với nồng độ khoảng 37%, bền vững với methanol 10 - 15% Trong nước, đa phần formaldehyde được chuyển thành dạng hydrate hoá CH2(OH)2 hay methanediol [17,40]

1.6.2.1 Cơ chế bất hoạt vi rút của formalin [17,18]

Formalin đã được sử dụng để bất hoạt vi sinh vật trong nhiều năm qua Cơ chế tác động của formalin đối với các vi sinh vật như sau:

- Formalin có phản ứng rất mạnh, có thể kết hợp với acid nucleic và protein

và làm bất hoạt chúng, còn có thể làm bất hoạt thông qua việc liên kết chéo

(crosslinking) và alkyl hóa (alkylating) nhóm -NH2, -SH của protein và vòng

nitrogen trong các base purin

- Formalin phản ứng với các nhóm amino tự do của phân tử protein độc (chủ yếu là nhóm lysine và các phân tử hai đầu chứa nhóm NH2) Ngoài ra, formalin còn phản ứng với các nhóm protein khác như là: nhóm imidazole của histidine, nhóm hydroxyle của tyrosine và nhóm indole của trypthophane …Tuy nhiên, không phải phản ứng xảy ra ở tất cả các nhóm, phản ứng còn phụ thuộc vào các yếu tố tác động bên ngoài như pH môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng…

- Phản ứng giữa formalin với amine chính hay amine thứ cấp:

Amine chính: R-NH2 + OCH2 R-NH-CH2OH R-N=CH2 +H2O

Amine thứ cấp: RR’-NH + OCH2 RR’-N-CH2OH

- Phản ứng amino acid với formalin:

R-CH-NH3+ + OCH2 R-CH-NH-CH2OH R-CH-N=CH2 + H2O

Phản ứng làm thay đổi các mối liên kết trong phân tử protein dẫn đến bất hoạt chúng

1.6.2.2 Ưu và nhược điểm của formalin

- Thời gian phân giải chậm nên quá trình bất hoạt kéo dài

- Hàm lượng formalin cao ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe con người

Tuy nhiên, khi phát triển công nghệ sản xuất quy mô công nghiệp cần phải xem xét các yếu tố:

- Thời gian bất hoạt

- Hiệu giá HA trước và sau bất hoạt

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả bất hoạt vi rút của formalin bao gồm: