Sàng lọc và xác định đặc tính sinh học của lectin từ động vật thân mềm thuộc vùng biển nha trang, khánh hòa

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BSA : Albumin huyết thanh bò TBS : Tris Bufer Saline PBS : Phosphate buffered saline đệm phosphate chứa NaCl Cmin : nồng độ nhỏ nhất của đường mM hoặc glycoprote

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Công nghệ sinh học

SÀNG LỌC VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA LECTIN TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM THUỘC VÙNG BIỂN NHA TRANG, KHÁNH HÒA

Cán bộ hướng dẫn : TS LÊ ĐÌNH HÙNG

ThS LÊ NHÃ UYÊN Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NGỌC KIỀU

Mã số sinh viên : 54130650

Khánh Hòa, tháng 7 năm 2016

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Công nghệ sinh học

SÀNG LỌC VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA LECTIN TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM THUỘC VÙNG BIỂN NHA TRANG, KHÁNH HÒA

Cán bộ hướng dẫn : TS LÊ ĐÌNH HÙNG

ThS LÊ NHÃ UYÊN Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NGỌC KIỀU

Mã số sinh viên : 54130650

Khánh Hòa, tháng 7 năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Đình Hùng (Trưởng phòng Công nghệ sinh học biển – Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ

Nha Trang) và Ths Lê Nhã Uyên (Giảng viên Viện Công nghệ Sinh học và Môi

trường – Trường Đại học Nha Trang), những người đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn

tôi trong suốt quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp đại học

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nha

Trang, cảm ơn PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa – Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và

Môi trường, cùng toàn thể các thầy cô giáo đã tận tình chỉ dạy và cho tôi nhiều kiến

thức quý báu trong suốt bốn năm học qua

Tôi chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công

nghệ Nha Trang, các anh chị phòng Công nghệ sinh học biển, đặc biệt là anh Đinh Thành Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi

thực hiện đồ án này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã luôn

quan tâm, động viên, cổ vũ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện đồ án

Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 7 năm 2016

Sinh viên

Trần Thị Ngọc Kiều

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu 3

1.2 Tổng quan về ngành động vật thân mềm (Mollusca) 4

1.2.1 Đặc điểm chung của ngành (Mollusca) 4

1.2.2 Phân loại động vật thân mềm 5

1.2.3 Ốc nón đỏ Tectus conus (Gmelin, 1791) 13

1.3 Tổng quan về lectin 14

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu lectin 14

1.3.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới 17

1.3.2.1 Lectin trong giới thực vật 17

1.3.2.3 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật 18

1.3.2.4 Sự định khu của lectin trong tế bào và cơ thể sinh vật 18

1.3.3 Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới và Việt Nam 19

1.3.3.1 Lectin từ nguồn biển 19

1.3.3.2 Lectin từ động vật thân mềm biển 20

1.3.3.3 Một vài nghiên cứu khác về lectin 21

1.3.4 Cấu tạo của phân tử lectin 22

1.3.5 Một số tính chất hóa lí và sinh học của lectin 26

1.3.5.1 Tính tan và kết tủa 26

1.3.5.2 Khả năng tương tác với đường của lectin 26

1.3.5.3 Khả năng gây ngưng kết tế bào 27

1.3.5.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố tới hoạt độ của lectin 28

1.3.6 Phương pháp thu nhận lectin 29

1.3.6.1 Các kỹ thuật chiết xuất lectin 29

1.3.6.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin 30

1.3.7 Ứng dụng của lectin 32

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 34

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 34

2.2.1 Vật liệu 34

2.2.2 Hóa chất 34

2.3 Phương pháp nghiên cứu 35

2.3.1 Quy trình sàng lọc lectin từ động vật thân mềm biển 35

2.3.2 Quy trình tách chiết lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 36

2.3.3 Xác định điều kiện chiết và kết tủa thích hợp để thu nhận lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 37

2.3.4 Xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH tới hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ ốc nón đỏ 42

2.3.5 Xác định các đặc tính sinh học của lectin từ ốc nón đỏ 44

2.3.5.1 Khả năng liên kết carbohydrate 44

2.3.5.2 Khả năng kháng khuẩn 46

2.3.6 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry 47

2.3.7 Phương pháp xử lí hồng cầu thỏ 48

2.3.8 Phương pháp xác định hoạt độ lectin 49

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 50

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Kết quả sàng lọc lectin từ động vật thân mềm biển thu được tại vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa 51

3.2 Kết quả xác định điều kiện chiết và kết tủa lectin từ ốc nón đỏ (Tectus conus) 52 3.2.1 Ảnh hưởng của dung môi chiết 52

3.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi chiết 53

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết 55

3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ ammonium sulfate đến HĐR, HĐTS, MAC và hiệu suất thu hồi lectin 57

3.2.5 Quy trình thu nhận lectin thô 59

3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ ốc nón đỏ 62

3.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ ốc nón đỏ 63

3.5 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 64

3.6 Khả năng kháng khuẩn của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

1 Kết luận 68

2 Kiến nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 79

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BSA : Albumin huyết thanh bò

TBS : Tris Bufer Saline

PBS : Phosphate buffered saline (đệm phosphate chứa NaCl)

Cmin : nồng độ nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein

(µg/ml) mà tại đó hiện tượng NKHC do lectin gây ra bị

ức chế hoàn toàn

HA : hoạt độ ngưng kết hồng cầu

HI : giá trị nồng độ pha loãng mà tại đó hoạt độ NKHC vẫn

còn bị ức chế, sau khi lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein

HU : Hemagglutinin unit (đơn vị ngưng kết)

HĐR : hoạt độ riêng

HĐTS : hoạt độ tổng số

HSTH : hiệu suất thu hồi

NKHC : ngưng kết hồng cầu

OD : mật độ quang học

MAC : nồng độ protein nhỏ nhất gây NKHC

ĐVTM : động vật thân mềm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Khảo sát khả năng liên kết của lectin với một số loại đường và

glycoprotein 44

Bảng 2.2 Các vi khuẩn gây bệnh được sử dụng trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lectin từ ốc nón đỏ 47

Bảng 3.1 Các mẫu ĐVTM biển được điều tra lectin (Đơn vị: HU/ml)………… 51

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dung môi chiết tới HĐR, HĐTS và MAC của lectin 52

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ chiết tới HĐR, HĐTS và MAC của lectin 54

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐTS, HĐR, MAC của lectin 55

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ tủa ammonium sulfate tới MAC, HĐR, HĐTS và hiệu suất thu hồi của lectin 57

Bảng 3.6 Kết quả quá trình thu dịch chiết lectin 60

Bảng 3.7 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 65

Bảng 3.8 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh 66

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Cấu tạo cơ thể song kinh có vỏ 6

Hình 1.2 Cấu tạo cơ thể song kinh không vỏ 7

Hình 1.3 Đại diện lớp vỏ một tấm 8

Hình 1.4 Cấu tạo cơ thể lớp chân xẻng 9

Hình 1.5 Đại diện lớp chân bụng 10

Hình 1.6 Đại diện lớp hai mảnh vỏ 11

Hình 1.7 Đại diện lớp chân đầu 12

Hình 1.8 Ốc nón đỏ Tectus conus 13

Hình 1.9 Cấu trúc không gian 3 chiều của lectin 23

Hình 2.1 Quy trình sàng lọc lectin 35

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình thu nhận lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 36

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi chiết 38

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu:dung môi chiết 39

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết tối ưu 40

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ tủa thích hợp 41

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới 42

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH 43

Hình 2.9 Lectin liên kết với hồng cầu (A), lectin liên kết với đường (B) 45

Hình 2.10 Đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry 48

Hình 3.1 Ảnh hưởng của dung môi chiết tới HĐTS và HĐR của lectin 53

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi chiết tới HĐTS và HĐR của lectin 54

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐR, HĐTS của lectin 56

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ tủa ammonium sulfate tới HĐR, HĐTS 58

Hình 3.5 Quy trình công nghệ thu nhận chế phẩm lectin thô từ ốc nón đỏ Tectus conus 61

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NKHC của lectin từ 62

Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ NKHC của lectin 64

MỞ ĐẦU

Sự đa dạng sinh học của biển đã và đang thu hút được sự quan tâm của nhiều ngành khoa học khác nhau, trong đó có ngành công nghệ sinh học Vi sinh vật biển, thực vật biển, động vật biển nói chung và động vật thân mềm biển nói riêng đang là đối tượng nghiên cứu mới Các hợp chất thứ cấp phân lập từ sinh vật biển cho các hoạt tính sinh học rất đa dạng như: hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus… Một số hợp chất còn cho kết quả khá khả quan trong việc ức chế các loài virus chưa có thuốc điều trị hiện nay như virus Herpes (type 1 và 2), HIV trong điều kiện invitro [42], [51]

Lectin là một trong những hợp chất được phát hiện cách đây hơn một thế kỷ

và hiện nay vẫn đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu bởi hoạt tính và các chức năng đặc biệt của nó Bản chất của lectin là protein có khả năng gây ngưng kết các

tế bào hồng cầu người và động vật, một số tế bào lạ và đặc hiệu với một số loại đường Tuy không có nguồn gốc miễn dịch nhưng các nhà khoa học đã chứng minh rằng chúng có vai trò trong miễn dịch của thực vật, có khả năng gây ngưng kết với các tế bào dị thường và ác tính, vi khuẩn, virus và kháng nguyên lạ

Hơn nữa, lectin là hợp chất phân bố rộng trong tự nhiên (có ở cả thực vật, động vật và vi sinh vật), đặc biệt là ở động vật biển Vì vậy, nguồn nguyên liệu để chiết xuất lectin rất đa dạng và phong phú [63]

Cho đến nay, hàng nghìn công trình nghiên cứu về lectin đã được công bố Lectin có nguồn gốc động vật được phát hiện khá sớm như lectin từ huyết thanh

sam Mỹ (Limulus polyphenus, 1903) và tôm hùm Mỹ (Homarus amricanus, 1907)

[62] Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu này được bắt đầu từ năm 1980 tại trường Đại học Tổng hợp Hà Nội và sau đó được mở rộng

Việt Nam có chiều dài bờ biển trên 3260 km, với một hệ sinh vật phong phú, đây là điều kiện thuận lợi cho việc đẩy mạnh các nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc từ động vật biển mà đặc biệt là động vật thân mềm

Do đó, việc đa dạng hóa nguồn nguyên liệu thu nhận lectin là việc cần thiết để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn nhằm định hướng ứng dụng trong y dược cũng như các lĩnh vực khác

Xuất phát từ những lí do trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Sàng lọc và xác định đặc tính sinh học của lectin từ động vật thân mềm biển thuộc vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa.”

 Mục tiêu của đề tài

Sàng lọc nguồn lectin từ động vật thân mềm biển thuộc vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng Nhằm đa dạng hóa nguồn nguyên liệu thu nhận và định hướng sử dụng lectin ứng dụng trong y dược cũng như các lĩnh vực khác

 Nội dung nghiên cứu

- Sàng lọc lectin từ động vật thân mềm biển thu thập được từ vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu

- Xác định sự ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính ngưng kết của dịch chiết có chứa lectin thu nhận được từ đối tượng tuyển chọn

- Khảo sát đặc tính sinh học của dịch chiết lectin từ đối tượng tuyển chọn: + Ngưng kết với hồng cầu thỏ được xử lí bằng các phương pháp khác nhau + Khả năng liên kết với các loại đường và glycoprotein

+ Hoạt tính kháng khuẩn

 Ý nghĩa khoa học

- Thu nhận thêm thông tin khoa học về lectin động vật thân mềm biển thu thập tại vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa

 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Xây dựng được quy trình chiết, tách lectin thô từ động vật thân mềm và xác định được những tính chất hóa lý đặc trưng của lectin này, từ đó có thể thu nhận lectin ở quy mô lớn để đưa vào ứng dụng thực tế

- Từ nguồn lectin đã được nghiên cứu đặc tính có thể đề xuất ra các hướng ứng dụng khác nhau

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu

Vị trí địa lý thủy văn của Nha Trang, Khánh Hòa

Khánh Hòa là một tỉnh ven biển miền Trung và nằm trong khu vực nhiệt đới

gió mùa, trong khoảng 11o41’53’’ – 12o52’10’’ vĩ độ Bắc và 18o40’42’’ –

109o30’00’’ kinh Đông Độ dài bờ biển xấp xỉ 200 km Khánh Hòa có khoảng 200

hòn đảo với tổng diện tích khoảng 600 km2 Các vịnh và đầm phá phân bố liên tục

và dọc theo đường bờ biển của Khánh Hòa: Vũng Rô – Đại Lãnh, Vũng Bến Gói –

Vịnh Vân Phong, Vịnh Bình Cang, Đầm Nha Phu và Đầm Thủy Triều – Vịnh Cam

Ranh Hệ thống vịnh góp phần vào đặc trưng về địa mạo, trầm tích cũng như các

yếu tố thủy động lực làm cho Khánh Hòa phức tạp, đa dạng và phong phú về nguồn

lợi sinh vật [3], [12] Khí hậu Khánh Hòa mang tính gió mùa của Nam Trung Bộ

Mùa mưa chính bắt đầu từ tháng 9 đến tháng 11 với lượng mưa đạt từ 250 – 350

mm, từ tháng 5 đến tháng 6 là thời kỳ mưa tiểu mãn (lượng mưa đạt từ 60 – 120

mm) Mùa khô kéo dài từ tháng 3 đến tháng 8 Chế độ gió mùa đã ảnh hưởng lớn

đến chế độ dòng chảy ở đây Gió mùa Tây-Nam từ tháng 6 đến tháng 9 và gió mùa

Đông Bắc từ tháng 11 đến tháng 3 [12]

Vịnh Nha Trang là một vịnh nhỏ nằm sâu trong nội địa, xung quanh được bao

bọc bởi các đảo vừa và nhỏ, đảo lớn nhất là đảo Hòn Tre Vịnh Nha Trang rộng

khoảng 124 km2, giới hạn tọa độ địa lý 12o09’ – 12o22’ Bắc và 109o12 – 109o22’

Đông Phía lục địa giới hạn bởi đường bờ, dài khoảng 28 km từ mũi Hòn Khô đến

mũi Cù Linh Phần biển ngoài khơi giới hạn bởi đường đẳng sâu 50m và có hàng

trục đảo lớn nhỏ tạo thành vành đai che chắn bên ngoài Ở phía nam vịnh, địa hình

đáy dốc hơn phía Bắc Giữa vịnh có một rãnh sâu (kênh ngầm) chạy theo hướng

Tây Bắc – Đông Nam Phần cửa vịnh phía đông có dải san hô ngầm “Grandbanc”,

án ngữ như một kè chắn sóng tự nhiên bảo vệ cho bãi tắm dọc thành phố Nha Trang

Vịnh Nha Trang có nhiệt độ nước trung bình 26oC (dao động 24 – 29oC), ấm

áp quanh năm Nhiệt độ cao nhất vào 6, 7 và 8 Lạnh nhất vào tháng 9 và 1

Tốc độ gió trung bình là 2,6 m/s (dao động 2 – 5 m/s), chưa vượt quá giới hạn bất lợi cho hoạt động con người Hệ thống thủy văn động lực mang tính hỗn hợp Sóng cao trung bình 0,4 m, độ cao sóng cực đại là 4,0 - 4,5m, chu kỳ trung bình 5,5 – 6,0s Do địa hình tương đối dốc, nên sóng tác động mạnh, đặc biệt là vào thời gian

từ tháng 9 cho đến tháng 4 năm sau Vùng cửa vịnh Nha Trang có hiện tượng nước trồi với tốc độ trồi dưới nước sâu lên đạt giá trị 10-3cm/s Hiện tượng này đã tạo ra những đặc trưng hải dương học, sinh thái học hết sức đặc biệt và thú vị, có giá trị khoa học và thực tiễn lớn [9]

1.2 Tổng quan về ngành động vật thân mềm (Mollusca)

Việt Nam là nước nằm trong vùng nhiệt đới Phía Đông và Nam đều giáp biển,

có nhiều vũng, vịnh, cửa sông đổ ra biển, nền đáy đa dạng… tạo nên khu hệ động vật phong phú về thành phần loài Động vật thân mềm là một trong các loài đem lại lợi ích kinh tế cao Do đó việc nghiên cứu động vật Thân mềm được tiến hành sâu rộng từ thế kỉ XX, nhất là sau khi viện Hải Dương học Nha Trang được thành lập (năm 1922) Năm 1996, Nguyễn Chính nghiên cứu, tổng kết và giới thiệu 88 loài Thân mềm có giá trị kinh tế ở biển Việt Nam [5]

1.2.1 Đặc điểm chung của ngành (Mollusca) [2]

Năm 1798 nhà Động vật học người Pháp Cuvier sử dụng tên Mollusca (tiếng

La-tinh là Mollis có nghĩa là mềm) lần đầu tiên để mô tả Mực Ống (squid) và Mực Nang (cuttlefish), loài động vật vỏ thoái hóa và có vỏ trong hoặc không có vỏ Sau

đó các nhà khoa học mới phát hiện sự liên quan thực sự giữa nhóm này với các loài

Mollusca khác như ốc, hai mảnh vỏ

Mollusca là một nhóm có tính thích ứng rất cao Tính thích ứng thể hiện qua

số lượng loài và sự đa dạng về môi trường sống, Mollusca là một trong ba nhóm có

tính thích ứng cao nhất trong giới động vật Đã có hơn 160.000 loài được mô tả, trong đó có khoảng 130.000 loài còn sống đến nay và khoảng 35.000 loài ở dạng hóa thạch

Mollusca phân bố ở hầu như tất cả các môi trường sống Ở biển chúng phân

bố từ vực sâu của đại dương đến vùng triều Chúng có thể sống trong nước ngọt

cũng như trên cạn Vì vậy, trong suốt quá trình tiến hóa chúng trở nên thích ứng và

sống tốt trong mọi sinh cảnh Ngành Mollusca được chia làm 2 phân ngành gồm 7

lớp với mức độ quan trọng khác nhau Lớp quan trọng nhất trong các loài Động vật thân mềm là chân bụng, bao gồm hơn 80% loài Động vật thân mềm còn sống đến nay Lớp chân đầu hiện nay vẫn còn nhiều loài sống sót, những bằng chứng hóa thạch cho thấy trước đây chúng phong phú hơn hiện nay và có lẽ chúng là nhóm động vật chiếm ưu thế ở kỷ Ordovic (500 triệu năm trước)

Đặc điểm chung của ngành Mollusca

- Cơ thể đối xứng hai bên (trừ Gastropoda), không phân đốt và thường có đầu

- Xoang cơ thể thường rất nhỏ là vùng bao quanh tim (xoang bao tim)

- Hệ thống tiêu hóa phức tạp, thường có cơ quan nghiền thức ăn là lưỡi sừng

ngoại trừ Bivalvia (không có lưỡi sừng)

- Hệ thống tuần hoàn hở, gồm tim, mạch máu và xoang máu

- Trao đổi khí xảy ra ở mang, phổi, màng áo hoặc bề mặt cơ thể

- Các cơ quan cảm giác gồm: xúc giác, khứu giác, vị giác, thính giác và thị giác

(một số loài) Mắt của Cephalopoda phát triển

1.2.2 Phân loại động vật thân mềm [2]

Phân loại ĐVTM chủ yếu dựa vào sơ đồ cấu tạo cơ thể, sự thích ứng với các lối sống khác nhau ĐVTM được chia làm 2 phân ngành, 7 lớp

 Phân ngành song kinh (Amphyneura): gồm 2 lớp

- Lớp song kinh có vỏ (Loricata)

- Lớp song kinh không vỏ (Aplacophora)

Đặc điểm phân ngành Song kinh

- Sống bám, gần bờ

- Đầu và nội quan nhập thành 1 khối, khác khối chân

- Tính chất nguyên thuỷ: Nhiều đặc điểm phân đốt (8 mảnh vỏ lưng), thần kinh dạng dây

- Phân tính, phát triển qua giai đoạn ấu trùng con quay

- Trên 1100 loài đã biết, gồm 2 lớp: Loricata và Aplacophora

Hình 1.1 Cấu tạo cơ thể song kinh có vỏ [2]

Cơ thể song kinh có vỏ nhìn từ mặt bụng (A) và cấu tạo trong (B – Nhìn bên; C – Nhìn từ lưng sau khi gỡ tấm vỏ và mô bì vạt áo; D – Hệ thần kinh nhìn từ lưng, từ

Pechenik) 1 Đầu; 2 Miệng; 3 Chân; 4,5 Tuyến tiêu hóa; 6 Ruột; 7 Ống bài tiết;

8 Lỗ sinh dục; 9 Lỗ thận; 10 Rãnh mang; 11 Hậu môn; 12 Tâm thất; 13 Tâm nhĩ; 14 Tấm vỏ; 15 Vạt áo; 16 Tuyến sinh dục; 17 Dạ dày; 18 Mạch lưng; 19 Lưỡi bào; 20 Vòng não; 21 Gờ vạt áo; 22 Khoang áo; 23 Mang; 24 Tuyến nước bọt; 25 Khoang miệng; 26 Cơ xiên 27 Thận; 28 Khoang bao tim; 29 Ống dẫn trứng; 30 Cơ co lưng; 31 Vách; 32 Hạch miệng; 33 Hạch dưới lưỡi bào; 34 Dây thần kinh bên – tạng; 35 Dây thần kinh chân

Hình 1.2 Cấu tạo cơ thể song kinh không vỏ [2]

Hình thái ngoài và cấu tạo trong của song kinh không vỏ

(A,B từ Dogel; C,D theo Pruvot; E,G từ Pechenik)

A - Chetoderma nitidulum; B - Neomenia carinata; C - Trưởng thành;

D 2 giai đoạn ấu trùng; E,G Sơ đồ phần phía trước cơ thể Limifossor

talpoideus

1 Mang; 2 Miệng; 3 Rãnh bụng; 4 Gai; 5 Tấm vỏ; 6 Tiền đình; 7 Tuyến;

8 Não; 9 Dây thần kinh bên; 10 Ruột giữa; 11 Dây thần kinh chân; 12 Lưỡi bào; 13 Hố chân; 14 Tuyến nước bọt; 15 Tầng cuticun; 16 Dạ dày; 17 Mạch lưng; 18 Tuyến sinh dục; 19 Tuyến tiêu hóa; 20 Sụn nâng lưỡi; 21 Thực quản; 22 Giáp miệng

 Phân ngành vỏ liền (Conchifera)

- Cơ thể được bọc trong 1 vỏ liền hoặc phân 2 mảnh

- Thân nhô cao về phía lưng; thần kinh dạng hạch phân tán

- 5 lớp: Vỏ 1 tấm; Chân bụng; Chân xẻng; Chân rìu (Vỏ 2 mảnh) và Chân đầu

Lớp vỏ một tấm (Monoplacophora)

Trước 1952 lớp này chỉ biết dưới dạng hóa thạch Năm 1952 gặp đại diện đang

sống đầu tiên Neopilina galatheae ở ven Thái Bình Dương gần bờ Mehico, chỗ sâu

5000m Từ đó đến nay đã phát hiện được 19 loài đang sống, tất cả đều ở đáy biển

sâu trên 2000m Trong số các loài đang sống, lớn nhất là Neopilina galatheae, dài 37mm và bé nhất là Micropilina arntzi dài dưới 1mm

Trưởng thành có hình vỏ nón, có vết bám của cơ sắp xếp phân đốt ở mặt trong Thân ẩn dưới vỏ Chân hình đĩa Đầu ở trước chân không phân rõ với phần thân Hai bên chân là rãnh áo có 3, 5 hoặc 6 đôi mang lá đối Tận cùng có nhú hậu môn

Cạnh lỗ miệng có 2 tua miệng hình thùy ở hai bên Không có mắt Giữa tua miệng và bờ trước của chân có cơ quan chia nhánh có lẽ giữ nhiệm vụ khứu giác

Hình 1.3 Đại diện lớp vỏ một tấm [2]

Hình dạng ngoài và cấu tạo trong của Neopilina galatheae

(theo Lemche và Vingstrand)

Lớp chân xẻng (Scaphopoda)

Có khoảng 300 loài, sống chui rúc trong bùn biển Cơ thể đối xứng hai bên Vỏ dạng ống chứa thân

Hình 1.4 Cấu tạo cơ thể lớp chân xẻng [2]

Sơ đồ cắt dọc cơ thể (A) và các giai đoạn phát triển của Dentalium (B-E)

(A từ Dogel; B-E từ Barnes)

1 Lỗ đỉnh vỏ và lỗ khoang áo; 2 Tuyến sinh dục; 3 Gan; 4 Thận; 5 Bao tim; 6 Hạch não; 7 Vỏ; 8 Vạt áo; 9 Tua bắt mồi; 10 Miệng; 11 Chân; 12 Hạch chân;

13 Bình nang; 14 Khoang áo; 15 Hậu môn; 16 Dạ dày; 17 Màng bơi; 18 Vỏ và vạt áo

Lớp chân bụng (Gastropoda)

- Hầu hết mất đối xứng; đầu có xúc tu cảm giác, mắt

- Có 1 mảnh vỏ xoắn hình chóp

- Thân được phủ lớp áo – Xoang áo thông ngoài & chứa các hệ cơ quan - Phức hệ

cơ quan áo

- Hầu có lưỡi gai; thần kinh dạng hạch phân tán (các đôi: Phủ tạng)

Não-Chân-Mang-Áo Đa số đơn tính, thụ tinh trong Nhóm có phổi phát triển trực tiếp, họ ốc vặn đẻ con

- Đã biết 90.000 loài (có 15.000 loài hoá thạch), chia 3 phân lớp: mang trước, mang sau, có phổi

- Đại diện:

- Prosobranchia: Bào ngư (Haliotis sp.), ốc xà cừ, ốc nước lợ, ốc nhồi (Pila

polita), ốc rạ (Cypangopaludina lecythoides), ốc vặn (Angulyagra polyjonata)…

- Pulmonata: Ốc tai (Lymnaea auricularia; L viridis), ốc đĩa (Gyraulus chinensis,

Polypylis hemisphoerula), ốc sên (Achatina fulica)…

Hình 1.5 Đại diện lớp chân bụng

A – Ốc nón; B - Ốc bàn tay quéo

Lớp 2 mảnh vỏ (Bivalvia)

- Còn đối xứng 2 bên

- Đầu tiêu giảm, thân dẹp bên, chân phát triển

- Vỏ 2 mảnh - tiết xà cừ (ngọc trai), đính mặt lưng (dây chằng và khớp)

- Mang: Dãy, sợi, phiến, vách

- Phân tính

- Đại diện: Sò (Acra granosa), hầu sông (Ostrea vivularis); hến (Corbicula sp.), ngao (Meretrix sp.), trai sông (Sinanodonta elliptica), trai ngọc (Pincdata

martensi); hà biển (Teredo mani)

Hình 1.6 Đại diện lớp hai mảnh vỏ

Lớp Chân đầu (Cephalopoda)

Có khoảng 6.000 loài hiện sống và 7.000 loài hoá thạch Phần lớn chân đầu bơi giỏi, sống ở biển Cơ thể có đối xứng hai bên Về đặc điểm cấu tạo có nhiều biến đổi so với sơ đồ cấu trúc chung của thân mềm như chân biến đổi thành cơ quan bắt mồi và phễu thoát nước

Vỏ chuyển vào trong cơ thể hay tiêu giảm Nhiều loài chân đầu là thức ăn ngon và phổ biến ở nhiều nước

- Thích ứng điều kiện vận động tích cực, biến đổi

- Chân có tua ở phần đầu (để bắt mồi), lõm tạo phễu

- Vỏ tiêu giảm (mực), mất hẳn (Duốc bể, Bạch tuộc), còn ở ốc Anh Vũ

- Não có bao sụn Giác quan phát triển (mắt)

- Tuần hoàn kín Tim: 1 tâm thất, 2 thất nhĩ

- Phân tính Thụ tinh trong xoang áo Phát triển thẳng

- Đại diện: Ốc Anh Vũ (Nautlus pompilus); mực thẻ (Logigo edulis), mực ống (L beka), mực nang (Sepia sabaculenta); bạch tuộc (Octopus vulgaris)

Hình 1.7 Đại diện lớp chân đầu [93]

A - Ốc Anh Vũ; B – Mực

1.2.3 Ốc nón đỏ Tectus conus (Gmelin, 1791) [45]

Là loài có hoạt tính sinh học cao được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Trong đề tài này, đây là loài cho hoạt tính lectin cao nhất

Ốc nón đỏ Tectus conus còn có tên gọi khác Trochus conus (Gmelin, 1791)

Tectus conus là một loài ốc biển thuộc ngành thân mềm sống ở rạn san hô với

phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Thái Bình Dương, từ phía bắc đến phía nam Nhật Bản

và phía nam Indonesia

Chi (Genus): Tectus

Loài (Species): T conus

Đặc điểm:

Loài ốc này có vỏ hình chóp, có một lớp xà cừ dày, trên vòng xoắn có vòng nhô cao, từ vòng xoắn thứ hai đến đỉnh vỏ, gờ này có dạng hình ống có lỗ ở đầu Ở

đế vỏ có những đường xoắn ốc xếp đều nhau từ trong miệng ốc chạy ra đến mép vỏ.

Kích thước: chiều dài vỏ tối đa 8cm, phổ biến là 6cm

Môi trường sống: gần rạn san hô, từ vùng triều thấp đến độ sâu 5m

Là loài ốc ăn được, vỏ xà cừ được sử dụng làm vật liệu trong sơn, cúc áo, mỹ phẩm, đồ gỗ và một số ngành công nghiệp khác Chúng đã được người dân các nước ở Úc, Đông Nam Á và vùng Thái Bình Dương khai thác cho mục đích thương mại từ lâu Ở Khánh Hòa, sự hiện diện của loài ốc này rất phong phú

1.3 Tổng quan về lectin

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu lectin

Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứng đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng

tỏ nguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng cho các mục đích y tế Năm 1884 Warden và Waddel đã giải thích nguyên lý

gây độc của các hạt cam thảo dây Aprus precatoriu [91], đến năm 1887 Dixson đã xác định được một dịch lỏng có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus

precatorius là một protein [55] Những protein như vậy được đề cập dưới tên gọi là

hemagglutinin hay agglutinin thực vật, vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết

từ thực vật Các nhà khoa học sau này đều cho rằng những mô tả đầu tiên và đầy đủ nhất về hemagglutinin là từ luận văn tiến sĩ của Peter Hermann Stillmark thực hiện tại trường Dorpat (nay là trường Tartu, Estonia) vào năm 1888 Chất hemagglutinin

được Stillmark tách chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis và được đặt tên

là ricin, một độc tố mà sau đó được xác định là có bản chất protein [71]

Kể từ đó quá trình nghiên cứu lectin được chia làm 3 giai đoạn chính:

Giai đoạn đầu từ cuối thế kỷ XIX đến nửa đầu thế kỷ XX: đây là giai đoạn mang tính điều tra cơ bản về lectin trong sinh giới Ngoài công trình nghiên cứu của

Stillmark vào năm 1888 thì cũng tại trường đại học Tartu, vào năm 1891, H Hellin

tìm thấy một hemagglutinin độc ở cây đậu Abrus precatorius, gọi là abrin Sự phát

hiện ra ricin, crotin, abrin đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học Đáng chú ý

là nghiên cứu của Paul Erlich ở Viện nghiên cứu hoàng gia Experieinental Therapy, ông đã sử dụng chúng làm kháng nguyên mô hình cho các nghiên cứu miễn dịch, từ

đó ông xây dựng một số nguyên lý cơ bản về miễn dịch học vào những năm 1890 [63]

Cùng với các hemagglutinin thực vật, các hemagglutinin động vật cũng dần được khám phá Những công trình nghiên cứu lectin động vật đầu tiên chủ yếu trong ngành động vật không xương sống Năm 1898, Edfstand cho rằng các tế bào

mô của một số loài động vật không xương sống có chứa các chất có hoạt tính tương

tự như ricin, gây ngưng kết hồng cầu của một số loài động vật như lợn, bò

Nouguchi phát hiện chất gây ngưng kết ở sam Mỹ (Limulus polyphenus, 1903) và tôm hùm Mỹ (Homarus amricanus, 1907) [62]

Trong suốt những năm sau đó, các hợp chất có tính chất đặc biệt có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu người và một số loài động vật được phát hiện ngày một nhiều trong giới sinh vật từ virus đến con người

Trong những năm 1950 đến năm 1970: năm 1954, Boyd và Shapleigh đã sử dụng thuật ngữ “Lectin” (thuật ngữ Lectin bắt nguồn từ chữ “Lectus”, dạng quá khứ của động từ “Legre”, trong tiếng Latin có nghĩa là “lựa chọn”) để chỉ nhóm các

“chất gây ngưng kết” thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệu nhóm máu [48], đây

có thể được coi là khái niệm đầu tiên về lectin Trong hai thập kỷ này, bên cạnh các công trình mang tính điều tra về sự hiện diện của lectin trong sinh giới, phần lớn các nhà khoa học đã tập trung vào việc tinh chế lectin để nghiên cứu cấu trúc và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến hoạt tính của lectin, trên cơ sở đó tìm cách sử dụng lectin nhằm phục vụ cho đời sống con người

Từ năm 1970 đến nay: giai đoạn này, tiến độ nghiên cứu lectin được đẩy nhanh Nhiều kết quả thú vị đã được công bố như việc tìm thấy lectin ở nấm nhầy

và ở cơ thể người [71]

Năm 1980, Goldstein và các cộng sự đã đưa ra định nghĩa “Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” [62] Khái

niệm này đồng nhất với định nghĩa về Lectin mà Houston và Dooley đã đưa ra năm

1982 : “Lectin là protein tương tác đặc hiệu đường, đặc tính cơ bản của nó là khả

năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” [71]

Năm 1991, Balzarini J đã phát hiện ra lectin của một số loài thuộc họ Thủy

tiên (Amaryllidaceae) và họ Lan (Orchidaceae) có tác dụng kìm hãm sự phát triển

của virus HIV [46]

Năm 1995, Peuman và Van Dame đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúc

liên quan đến tính chất của lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ít

nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” [82]

Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiện hoạt tính sinh học, Peuman và

cộng sự đã chia lectin thành 3 loại:

- Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm

liên kết đường, do đó không có đặc tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa các

hợp chất liên kết đường Thuộc về loại này là một số protein của các cây họ Lan

(Orchidaceae)

- Hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với đường, do đó có khả

năng gây ngưng kết tế bào và gây kết tủa, do tương tác với nhiều hợp chất cộng

đường Đó chính là các lectin quen thuộc đã được nghiên cứu nhiều nhất và dễ được

phát hiện bởi khả năng gây ngưng kết tế bào của chúng và thường được gọi là

hemagglutinin

- Chimerolectin là những phân tử trong đó có ít nhất một vị trí liên kết với

đường và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh

học) Thuộc về loại này là protein kìm hãm riboxom type 2 (RIP, Type 2) có trong

hạt Thầu dầu (Ricinus communis L.) hoặc hạt cây Cam thảo dây (Abrus precatorius L.)

Song song với các hướng nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học vẫn đi sâu

vào tìm hiểu cấu trúc cũng như tính chất của các lectin để sử dụng chúng một cách

thiết thực và có hiệu quả hơn Hiện nay các nhà khoa học cũng đã biết khá nhiều về

bản chất của lectin Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất về lectin

như sau: “Lectin là glycoprotein hoặc protein không có nguồn gốc miễn dịch, có

khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate được liên kết Lectin gắn kết với những tế bào có glycoprotein hoặc glycolipid bề mặt Sự hiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tử lectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sử dụng rất rộng rãi để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật khác nhau” [82]

1.3.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới

1.3.2.1 Lectin trong giới thực vật

Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu khá rộng trong các cơ quan như thân, lá và hạt Allen và Brillantine (1969), đã tiến hành điều tra ở 2663 loài thực vật và kết quả cho thấy có 800 loài chứa lectin, trong đó

các cây họ Đậu (Fabaceae) chiếm trên 600 loài [41] Ngoài các cây họ Đậu có số lượng loài lớn nhất có chứa lectin, một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae),

họ Trinh nữ (Minosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae)

cũng có chứa lectin [46]

Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin Lectin từ

họ Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài cây khác như Chay (Artocarpus

tonkinensis), Sake chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa lectin có hoạt tính

NKHC rất cao [53]

Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của lectin ở nhiều loài của thực vật bậc thấp như ở một số loài nấm (Fungi), địa y (Lichenes) và rong (Algae) Đến nay đã có hàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin từ rong biển ở nhiều quốc gia khác nhau như: Tây Ban Nha, Nhật Bản, Việt Nam, Mỹ, Ấn Độ… [49, 66, 78, 89]

Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật vẫn chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu khoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực vật [22]

1.3.2.2 Lectin trong giới động vật

Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm Lectin trong

giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam Mỹ (Limulus polyphemus,

1903) Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động vật ngành Ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra Ở Việt Nam, khi khảo sát 30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa xuất hiện 10 loài chứa lectin [69]

Trong khi đó, ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được điều tra cơ bản Một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia), lớp Bò sát (Reptila), lớp chim (Aves) và lớp thú (Mammalia) cũng có chứa lectin

Ngoài ra, còn có một số dạng lecin khác từ huyết tương cá chình (Aguilla rastiata) hay trứng cá vược (Perca piuviatitis)….Một số kết quả nghiên cứu khác ở mô người

như mô cơ và các cơ quan của cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệ miễn dịch cũng chứa lectin Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin Đó cũng là bằng chứng về tính phổ biến của lectin trong sinh giới [86]

1.3.2.3 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật

Lectin đầu tiên từ virus được phát hiện vào năm 1942, khi Hirst và cộng sự đã tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà Sau này, một số công trình khoa học của Briody (1948), Bruet (1951) và Stone (1949) cũng đã phát hiện lectin ở một số loài virus khác [41]

Trên đối tượng vi khuẩn E coli, Ofek (1987) đã cho biết: trên bề mặt của tế

bào vi khuẩn này có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào Hoạt tính này mất

đi khi có mặt một số loại đường như galactose và dẫn xuất amin của nó Đó chính là lectin bề mặt màng tế bào vi khuẩn [80]

1.3.2.4 Sự định khu của lectin trong tế bào và cơ thể sinh vật

Nghiên cứu sự xuất hiện của lectin đã cho thấy, trong một cơ thể, lectin có thể

có ở bộ phận, cơ quan này nhưng lại không có ở bộ phận, cơ quan khác Hàm lượng lectin cũng biến đổi trong quá trình sinh trưởng và phát triển của sinh vật

Với các cơ thể thực vật, sự định khu của lectin khá rộng: ở lá, hoa, thân và đặc biệt là hạt Hầu hết các loài thực vật hạt kín, hạt là nơi chứa nhiều lectin nhất

Trong cơ thể động vật, lectin có trong huyết thanh ở một số mô và cơ quan, đặc biệt là mô cơ Ngoài ra, còn có ở giao tử hoặc tế bào trứng

Ở mức độ tế bào, sự định khu của lectin cũng đã được phát hiện Một số công trình đã khẳng định lectin có trong nguyên sinh chất và một số bào quan của tế bào Gần đây cũng đã chứng minh sự tồn tại của lectin ở trong nhân tế bào ở một số loài bò sát và động vật có vú [36]

1.3.3 Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới và Việt Nam

1.3.3.1 Lectin từ nguồn biển

Tài nguyên sinh vật biển như tảo lam, rong biển, động vật không xương sống

và cá có khả năng sản xuất một loạt các phân tử có hoạt tính sinh học mạnh bao gồm các hợp chất tự nhiên như acid béo, polysaccharides, polyete, peptide, protein

và enzyme Đến nay, có nhiều nghiên cứu tập trung vào sản phẩm biển và tính năng dược lí đa dạng của chúng để phát triển các loại thuốc mới bao gồm kháng sinh, chống virus, chống suy giảm miễn dịch (HIV), chống ung thư và phương pháp điều trị bệnh Alzheimer Trong việc phát hiện các loại thuốc từ tài nguyên biển, lectin là một trong những ứng cử viên đầy triển vọng cho các liệu pháp điều trị tích cực bởi các cấu trúc carbohydrate như proteoglycans, glycoprotein và glycolipid có liên quan đến các loại tế bào nhất định và các chức năng sinh lý, bệnh lý của chúng bao gồm các tương tác vật chủ - tác nhân gây bệnh, truyền tín hiệu giữa các tế bào Ví

dụ như Griffithsin (GRFT), một lectin được phân lập từ rong đỏ Griffithsia sp., cho

thấy hoạt tính chống HIV mạnh có hiệu quả tối đa với nồng độ 50% của 0,043-0,63

mM (EC50) qua thụ thể liên kết gp120, là glycoprotein gắn trên màng virus HIV

[90] Cyanovirin (CN-V) phân lập từ tảo lam Nostoc ellipsosporum đã được báo cáo

là lectin mạnh với hoạt tính chống HIV [80]

Lectin là nhóm các protein có khả năng liên kết đường ngoại trừ kháng thể và enzyme Nó nhận diện cấu trúc carbohydrate riêng biệt, xác định các tế bào khác nhau thông qua cổng liên kết đường Vì vậy, chúng có thể xác định các dạng tế bào

và giai đoạn phát triển tế bào bao gồm cả tế bào gốc phôi (ES) và tế bào gốc đa

năng (iPS) thông qua các ứng dụng sinh hóa, đo dòng tế bào, kĩ thuật phân tử, vì các

tế bào thường biểu thị các glycoprotein trên bề mặt [75] Lectin được phân phối

rộng rãi trong sinh giới từ vi sinh vật, thực vật, động vật và có liên quan đến nhiều

quá trình tế bào phụ thuộc vào sự nhận diện của các carbohydrate phức tạp Dựa

vào sự tương đồng về cấu trúc của miền nhận carbohydrate (CRD) và đặc điểm của

chúng, lectin động vật được phân loại thành nhiều loại: C-lectin (CTL), galectins,

I-lectin, pentraxins, P-I-lectin, tachylectins, …[61]

1.3.3.2 Lectin từ động vật thân mềm biển

 Tình hình nghiên cứu lectin từ động vật thân mềm biển trên thế giới

Thành phần dịch thể của động vật không xương sống có chứa lectin Sự hiện

diện của agglutinins tự nhiên hoặc lectin đã được ghi nhận ở loài chân bụng và hai

mảnh vỏ Trong chân bụng, lectin được tìm thấy ở Helix aspersa [82, 64],

L stagnalis [82] và B glabrata [46] Trong P corneus, agglutinins tự nhiên và

agglutinins do vi khuẩn cảm ứng sinh ra đã được tinh chế bởi sắc ký ái lực trên

Sephadex gel G 150 [81] Agglutinin tự nhiên là một glycoprotein có trọng lượng

phân tử 130 kDa và chứa acid N-acetylmuramic, điển hình của Prokaryote, không

có acid sialic như Eukaryote [81]

Trong loài hai mảnh vỏ, lectin đã được tìm thấy trong Crassostrea virginica,

Mytilus edulis và C Gigas Hiện nay, các lectin có thể gây ngưng kết hồng cầu

ngựa, hồng cầu người và tế bào vi khuẩn như vi khuẩn Vibrio anguilarum [81]

 Tình hình nghiên cứu lectin từ động vật thân mềm biển ở Việt Nam

Việc nghiên cứu lectin ở Việt Nam đã được triển khai có quy mô bắt đầu từ

sự hợp tác quốc tế về khoa học giữa các trường Đại học Tổng hợp Paris IV (Cộng

hoà Pháp) với trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội (ĐHQG HN) từ năm

1980 Quá trình nghiên cứu lectin của các nhà khoa học Việt Nam bước đầu đã có

những kết quả rất khả quan

Cao Phương Dung và cộng sự (1991) đã thực hiện bước đầu điều tra lectin

Nhuyễn thể vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa và nghiên cứu một vài tính chất của

lectin Tai nghé, Tai tượng, Điệp ngọc [8]

Nguyễn Diệu Thuý và cộng sự (1995) đã công bố có khoảng 31% loài nhuyễn thể Việt Nam có hoạt tính lectin [29] Tại vùng biển Thừa Thiên Huế, tác giả Cao Đăng Nguyên và Nguyễn Quốc Khang (1998) đã công bố 75% loài nhuyễn thể chứa lectin [28]

Tiếp theo, Nguyễn Quốc Khang đã tinh sạch và nghiên cứu tính chất của lectin sam biển [27], sau đó cùng với Cao Đăng Nguyên và cộng sự đã nghiên cứu

tách chiết lectin động vật như loài Trìa mỡ (Meretrix meretrix), cá nheo (Parasilurus asotus), cá chình hoa và cá chình Nhật (Anguilia bengalesnis, Anguila

mamorata) [24]

Năm 2008, tác giả Cao Đăng Nguyên và cộng sự đã tách chiết và nghiên cứu tính chất của lectin trong một vài loài ở lớp chân bụng sống ở nước ngọt tại Thừa Thiên Huế [23]

Từ các công trình nghiên cứu khảo sát lectin từ động vật thân mềm biển cho kết quả rằng hơn 50% tổng số loài được điều tra đều có khả năng gây ngưng kết với

ít nhất một loại hồng cầu từ động vật như thỏ, cừu, gà, ngựa và 3 nhóm máu A, B,

O của người Một số tính chất hóa sinh như liên kết carbohydrate, hoạt tính kháng khuẩn, khoảng pH hoạt động, nhiệt độ hay khả năng ứng dụng lectin vào y học cũng đang được nghiên cứu

1.3.3.3 Một vài nghiên cứu khác về lectin

Hướng nghiên cứu ứng dụng của các loại lectin đang được các nhà khoa học Việt Nam chú ý trong những năm gần đây, chủ yếu tập trung vào các lectin ứng dụng trong y học, hỗ trợ điều trị các căn bệnh khác nhau và cũng đã có một số kết quả đáng quan tâm Chẳng hạn như năm 1989, Nguyễn Quốc Khang sử dụng lectin trong chẩn đoán thai sớm, 7 năm sau được ứng dụng rộng rãi [21] Đỗ Ngọc Liên và

Nguyễn Lệ Phi (1992) sử dụng lectin mít tố nữ (Artocarpus champeden) để tinh chế

IgAi trong huyết thanh của người bằng sắc ký ái lực [16] Năm 1994, Đỗ Ngọc liên

sử dụng lectin hạt Chay để chẩn đoán miễn dịch ký sinh trùng Schistosoma

mamsoni [15] Năm 1999, Cao Đăng Nguyên và Bùi Thái Hằng khi nghiên cứu

lectin Trìa mỡ (Meretrix meretrix) thấy rằng lectin này phản ứng với nhiều protein

có nguồn gốc khác nhau, đặc biệt vói các protein có ý nghĩa trong y học như: α- foetoprotein, a-interferon và IgG [25] Năm 2003, các tác giả Đỗ ngọc Liên và Trần Thị Phương Liên đã nghiên cứu đáp ứng miễn dịch kháng thể IgA1 và IgG trong huyết thanh bệnh nhân ưng thư gan và bệnh bạch cầu cấp (ung thư máu) bằng phương pháp ELISA-LECTIN [15] Năm 2006, tác giả Nguyễn Hạnh Phúc cho thấy

vai trò của lectin sam (Tachypteus tridentatus) sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh

học [33] Năm 2008, tác giả Trần Thị Phương Liên đã sử dụng lectin để xác định kháng thể và kháng nguyên của một số bệnh ung thư thường gặp [20]

Từ năm 2008 đến nay, các công trình nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã khảo sát được hơn 80 loài rong biển khác nhau, thuộc 3 dòng: rong đỏ, rong nâu và rong xanh Kết quả cho thấy, hầu hết các loài rong biển đều có khả năng gây ngưng kết với ít nhất một loại hồng cầu từ động vật như thỏ, cừu, gà, ngựa và 3 nhóm máu người A, B, O Một số tính chất hóa sinh như liên kết carbohydrate, khoảng pH hoạt động, nhiệt độ hay khả năng ứng dụng của lectin này cũng đang được nghiên cứu [22]

1.3.4 Cấu tạo của phân tử lectin

 Cấu trúc và phân loại

Năm 1988, khi Drickamer xem xét những gì đã được biết đến trong những cấu trúc chính của lectin động vật, có thể kết luận rằng hầu hết lectin thuộc về một trong 2 nhóm chính: C-type (phụ thuộc Ca2+) và S-type (phụ thuộc lưu huỳnh hoặc liên kết beta - galactoside) Cả 2 loại đều có một miền bảo tồn khoảng 120 amino acid , mặc dù C-type và S-type hoàn toàn không liên quan đến nhau Các trường hợp ngoại lệ được biết đến vào thời điểm đó là một nhóm không đồng nhất được gọi là “N-type”

Ngày nay, với sự gia tăng số lượng các cấu trúc lectin được mô tả, phân loại này thay đổi và bao gồm một số nhóm mới Lectin động vật hiện nay ít nhất có 25 loại khác nhau về nếp gấp bao gồm C-type, I-type (nếp gấp Ig), P-type, β-sandwich (thạch cuộn, có mặt trong gallectins), calnexin/calreticulin, ERGIC-53 (endoplasmatic reticulum-Golgi intermediate compartment-53—L-type), G-domain thuộc họ LNS (laminin, agrin), β-trefoil, domain giàu cysteinethuộc receptor

mannose đại thực bào C-type, fibrinogen-like domain (ficolins), intelectins và tachylectin-5 [75, 83]

Hình 1.9 Cấu trúc không gian 3 chiều của lectin [84]

(A) arcein từ Phaseolus vulgaris L (pdb: 1ioa) [64];

(B) amaranthin từ Amaranthus caudatus (pdb: 1jly) [88];

(C) ricin từ Ricinus communis (pdb: 3rti) [79];

(D) jacalin từ Artocarpus integer (pdb: 1m26) [68];

(E) galectin-3 từ Homo sapiens (pdb: 2xg3) [52];

(F) calreticulin từ Mus musculus (pdb: 3o0w) [72];

(G) Homo sapiens L-type (pdb: 4gkx) [92];

(H) Homo sapiens C-type (pdb: 1pwb) [87]

Những màu sắc vàng và trắng đại diện cho cấu trúc bậc 2 của lectin, xoắn α màu trắng và phiến β màu vàng Ngoài ra, màu xanh đại diện cho ion Ca2+, carbohydrate được đại diện bởi những quả bóng và que

 Cấu tạo phân tử

Lectin có bản chất là protein, trong đó phần lớn là các glycoprotein, có rất ít lectin mà chỉ gồm một thành phần cấu tạo protein, điển hình là ConA

(Concanavalin A) chiết từ Canavalia ensiformis và lectin mầm lúa mì WGA (wheat

germ agglutinin)

Thành phần carbohydrate của lectin bao gồm các đường mannose, glucose, galactose Ngoài ra, còn có axit sialic (là dẫn xuất N-acyl của axit neuramic) thường nằm ở phần cuối oligosaccaride của các glycoprotein hoà tan

Thành phần protein gồm một hay nhiều chuỗi polypeptide kết hợp lại nhờ liên kết cộng hoá trị Lectin của mỗi loài chứa thành phần axit amin khác nhau, nhưng phổ biến nhất là axit aspartic, serin, arginin và threonin Các axit amin này chiếm tới 30% thành phần phân tử lectin Trong khi đó, các axit amin chứa lưu huỳnh như cystein, methionin chỉ chiếm một tỉ lệ thấp, hoặc hầu như không có trong thành phần lectin

Trong phân tử lectin còn có các ion kim loại, thường gặp nhất là Mn2+ và Ca2+

các ion này không trực tiếp tham gia vào liên kết lectin–glucid, nhưng lại rất cần cho sự tương tác giữa lectin và các gốc đường, vì chúng ảnh hưởng đến cấu hình không gian của phân tử lectin và trung tâm liên kết glucid [53]

Bất cứ một dạng lectin nào dù có cấu trúc bậc 1 hay cấu trúc không gian phức tạp đều chứa trung tâm hoạt động Đó là trung tâm liên kết carbohydrate Chính trung tâm này quyết định hoạt tính của lectin Nếu như ở enzyme, trung tâm hoạt động của chúng là các gốc acid amin hoặc phần phi protein thì ở hầu hết các lectin, trung tâm hoạt động của chúng là do một số acid amin như tyrosin, serin,threonin, tryptophan…có khả năng liên kết mạnh với các gốc đường tạo nên [84] Các dạng lectin khác nhau thì có thành phần acid amin trong trung tâm hoạt động là khác nhau Cho đến nay, vấn đề về trung tâm hoạt động của lectin vẫn còn rất phức tạp

Về cơ chế hoạt động của lectin, các nhà khoa học đều thống nhất như sau:

“Các trung tâm hoạt động của các phân tử lectin đều có khả năng liên kết các gốc đường trong các thụ thể tiếp nhận (receptor) trên bề mặt màng tế bào Các liên kết

sẽ được hình thành giữa các receptor trên bề mặt màng tế bào với các trung tâm hoạt động của lectin Nhờ các liên kết này mà lectin đã kết dính các tế bào, tạo nên hiện tượng ngưng kết tế bào Các dạng lectin khác nhau, khả năng liên kết với các receptor trên bề mặt tế bào cũng khác nhau Giống như enzyme, trung tâm hoạt động của lectin chỉ hoạt động khi nó nằm trong một cấu trúc hoàn chỉnh của phân

tử Bất kì một tác nhân nào phá vỡ cấu trúc phân tử lectin đều sẽ làm giảm hoặc mất khả năng hoạt động của trung tâm này Chính vì vậy, hoạt độ của lectin phụ thuộc chặt chẽ vào một số tác nhân lý hóa của môi trường [84]

 Khối lượng phân tử của lectin

Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện di trên gel polyacrylamide, phương pháp siêu li tâm và phương pháp quang phổ khối ion hóa phun điện tử (electron spray ionization – mass spectrometry) khối lượng phân tử của khá nhiều dạng lectin đã được xác định Kết luận có thể dẫn ra ở đây là khối lượng phân tử của các loại lectin có nguồn gốc khác nhau thì khối lượng có thể giống hoặc khác nhau và dao động trên một dải rất rộng từ vài nghìn Dalton (lectin

của rễ cây tầm ma Urtica dioica: 8.500 Da) [69] cho tới vài trăm nghìn Dalton (lectin của sam biển châu Á: Tachypleus tridentatus 700.000 Da)

Do phân tử lectin có thể được cấu tạo từ nhiều tiểu đơn vị, nên khối lượng phân tử của chúng phụ thuộc rất nhiều vào cấu trúc không gian Các yếu tố này làm thay đổi cấu trúc không gian của lectin như: pH, dung dịch urê nồng độ cao, guanidin clorit đều có thể ảnh hưởng đến khối lượng phân tử lectin

Cho đến nay, khoa học không tìm thấy mối liên quan nào giữa khối lượng phân tử và hoạt tính của letin Khối lượng phân tử của lectin không mang tính đặc trưng và không phụ thuộc vào mức độ tiến hoá của loài hay cá thể [27]

1.3.5 Một số tính chất hóa lí và sinh học của lectin

1.3.5.1 Tính tan và kết tủa

Lectin có khả năng hoà tan trong nước, đặc biệt lectin rất dễ tan trong dung môi là muối loãng, vì vậy trong quy trình tinh chế, các nhà khoa học thường sử dụng các dung dich đệm chứa muối ở nồng độ sinh lý làm dung môi chiết xuất Do bản chất là protein nên lectin dễ kết tủa với: aceton, alcohol ở nhiệt độ thấp một số muối trung tính nồng độ cao (đặc biệt là ammonium sulfate) và muối kim loại nặng

1.3.5.2 Khả năng tương tác với đường của lectin

Khả năng tương tác với đường của lectin là một trong những tính chất điển hình của lectin Lectin có thể liên kết với cả phân tử đường đơn lẫn cả gốc đường nằm trên bề mặt tế bào Các loại đường như là: glucose và glucosamin, galactose và galactosamin, fucose, manose tương tác với nhiều loại lectin

Có rất nhiều giả thuyết về bản chất sự tương tác giữa lectin với gốc đường, tuy nhiên các nhà khoa học đều thống nhất là: sự bền vững của phức hợp lectin - đường được duy trì nhờ các liên kết phân cực (liên kết hidro giữa các nhóm -OH của đường với các đầu phân cực của các gốc axit amin trên phân tử lectin) và liên kết không phân cực hay liên kết không gian (liên kết bằng lực Van der - Walls)

Phương pháp xác định sự tương tác giữa đường và lectin đang được sử dụng hiện nay là xác định hoạt độ NKHC của lectin khi có mặt một loại đường nào đó Trường hợp hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn chứng tỏ đường đã kìm hãm hoạt tính của lectin Ngược lại, hoạt độ lectin vẫn ổn định chứng tỏ đường không ức chế

Có thể nói rằng cơ chế của sự tương tác giữa đường và lectin còn khá phức tạp Mặc dù vậy, đặc tính này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu sử dụng lectin Với các loại lectin tương tác đặc hiệu với một glycoprotein nào đó thì

có thể sử dụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc màng tế bào có mặt glycoprotein đó Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein để xác định kháng nguyên trên bề mặt màng tế bào hồng cầu Gần đây, dựa vào các loại đường ức chế đặc hiệu hoat độ lectin mà người ta đã sử dụng chúng để tinh chế nhiều loại lectin bằng sắc kí ái lực, hơn nữa người ta cũng sử dụng cột ái lực letin để tinh chế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein có chức năng sinh học [55, 65]

1.3.5.3 Khả năng gây ngưng kết tế bào

Ngưng kết tế bào là đặc tính sinh học điển hình của lectin, các nhà khoa học dùng đặc tính này để phát hiện sự có mặt của lectin ở các đối tượng nghiên cứu Đặc tính này còn giúp phân biệt lectin với những hợp chất sinh học khác cũng có khả năng tương tác với đường như là glycosidase, glycotranferase

Để có thể gây ngưng kết tế bào, lectin phải tạo ra nhiều cầu nối giữa các tế bào

bị gắn kết Tuy nhiên khả năng ngưng kết không chỉ phụ thuộc đơn thuần vào số lượng lectin, mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: đặc tính phân tử của lectin, đặc tính màng (số trung tâm liên kết đường, kích thước phân tử, số lượng thụ thể, tính chất và tình trạng trao đổi chất của màng)… Ngoài ra, một số yếu tố như nồng

độ tế bào, các yếu tố môi trường như: pH, nhiệt độ, chất kích thích, chất kìm hãm, ion kim loại cũng là những nhân tố tác động lên khả năng ngưng kết tế bào của lectin

Số lượng lectin có khả năng gây NKHC duy nhất một nhóm máu rất ít vì chúng đồng thời có thể gây ngưng kết với nhiều loại hồng cầu như: thỏ, gà, cừu, dê hay ngựa… Theo nghiên cứu, trong hơn 800 dạng lectin được nghiên cứu thì chỉ có

90 loại lectin đặc hiệu nhóm máu, 711 loại lectin không đặc hiệu nhóm máu [40, 70] Các lectin đặc hiệu nhóm máu này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng

Theo Sharon (2003), lectin không chỉ gây ngưng kết tế bào hồng cầu người

và động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tế bào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi… [86]

1.3.5.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố tới hoạt độ của lectin

 Ảnh hưởng của pH

Các nghiên cứu về điểm đẳng điện của lectin cho thấy: tại điểm đẳng điện (pHi) thì hoạt độ của lectin là bé nhất Tại đó, lectin dễ bị kết tủa pH ngoài điểm đẳng điện, lectin ở trạng thái phân li tích điện, dễ hòa tan và có hoạt độ Mỗi dạng lectin thường có pH thích hợp với hoạt độ của nó, đó là giá trị pH mà ở đó hoạt độ lectin mạnh nhất hoặc duy trì ở trạng thái ổn định Ở pH vùng acid và kiềm mạnh, hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn Thường thì lectin từ thực vật bậc cao, lectin

từ động vật có khoảng pH hẹp Đối với lectin từ thực vật bậc thấp có khoảng pH thích hợp rất rộng, ví dụ như lectin từ tỏi Allium sativum có khoảng pH thích hợp từ

3 đến 10 [38], lectin từ rong biển hầu hết có khoảng pH từ 3 đến 9, đặc biệt có ở

một số loại rong như Boodlea composite, Dictyosphaeria versluysii hay Valonia

Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striatum và Eucheuma denticulatum [35, 67,

73]

 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Do bản chất là protein, lectin cũng chịu ảnh hưởng của nhiệt độ tác động lên cấu trúc không gian bậc bốn, làm ảnh hưởng đến ái lực liên kết với đường của các trung tâm hoạt động và làm thay đổi hoạt tính của lectin

Đa số lectin bị mất hoạt tính ở nhiệt độ cao, do tác dụng của nhiệt độ làm đứt gãy liên kết hoá trị của phân tử lectin khiến cấu trúc không gian của chúng không thể phục hồi lại (bị biến tính không thuận nghịch), ở nhiệt độ thấp hoạt tính lectin giảm, khi tăng dần nhiệt độ thì hoạt tính lectin cũng cũng tăng dần đến một giá trị cực đại ở nhiệt độ tối thích Khoảng nhiệt độ tối thích còn tùy thuộc vào từng loại lectin

 Ảnh hưởng của một số yếu tố khác

- Ảnh hưởng của enzyme

Enzyme có khả năng làm biến đổi tính chất của màng tế bào và làm thay đổi khả năng ngưng kết tế bào của lectin Một số enzyme như trypsin, papain có tác dụng làm tăng hoạt tính của lectin Khi hồng cầu được xử lý bằng các enzyme này, một số protein trên bề mặt hồng cầu sẽ bị thuỷ phân làm bộc lộ rõ các thụ thể có bản chất là glycoprotein giúp cho lectin gắn vào màng tế bào hồng cầu dễ dàng hơn, do vậy sẽ làm tăng hoạt tính ngưng kết tế bào hồng cầu của lectin Ngược lại một số enzyme lại làm giảm hoặc mất hoạt tính của lectin, khi tiến hành xử lý hồng cầu bằng galactose oxidase hoặc một số enzyme glycosidase các enzyme này sẽ phân huỷ các gốc đường đặc hiệu với lectin, do đó làm giảm hoạt tính ngưng kết

- Ảnh hưởng của các ion kim loại

Một vài ion kim loại cũng ảnh hưởng đến tính chất của lectin Trong nhiều thí nghiệm, một số loại ion kim loại sẽ làm giảm hoặc tăng hoạt tính của lectin Tác động của chúng khá là phức tạp không tuân theo quy luật nào [53]

1.3.6 Phương pháp thu nhận lectin

1.3.6.1 Các kỹ thuật chiết xuất lectin

Lectin có bản chất là protein hay glycoprotein dễ tan trong nước nên việc chiết xuất lectin ra khỏi mô động vật, thực vật hay vi sinh vật có thể thực hiện dễ dàng bằng cách dùng các dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làm dung môi chiết xuất Tùy theo tính chất của mỗi loại lectin người ta có thể sử dụng các dung môi chiết xuất khác nhau như dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,85%, dung dịch đệm PBS, đệm Tris-HCl, ethanol…

 Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính

Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số muối trung tính ở nồng độ cao và có thể được hòa tan trở lại Các muối thường được dùng để kết tủa protein là muối cation hóa trị 1, anion đa hóa trị như: (NH4)2SO4, Na2SO4….Các protein khác nhau được kết tủa ở nồng độ muối bão hòa khác nhau Người ta sử dụng phương pháp này trong các quy trình chiết xuất lectin để cô đặc dung dịch protein cần tách

 Kết tủa phân đoạn bằng dung môi

Một số dung môi hữu cơ có thể dễ dàng hòa tan trong nước như : acetone, polyethylene glycol, ethanol…làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng có thể kết tủa nhanh chóng Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này là rất

dễ gây biến tính protein, vì vậy việc sử dụng dung môi để kết tủa lectin cần phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp

 Thẩm tách

Phương pháp thẩm tách được tiến hành dựa trên nguyên lý sử dụng màng bán thấm với đặc tính cho qua những phần tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phần tử lớn hơn kích thước màng bán thấm Trong phương pháp này, màng bán thấm ở dạng túi chứa chất cần thẩm tách đặt trong môi trường có pH nhất định, các phân tử nhỏ trong túi sẽ khuếch tán ra môi trường ngoài nhờ tác động của máy khuấy từ Thẩm tách thường dùng để loại muối và những chất có phân tử nhỏ ra khỏi dung dịch chứa lectin cần thẩm tách

1.3.6.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin

 Sắc kí lọc gel [53]:

Đây là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein nhờ phân tách các

kích thước phân tử khác nhau Chất giá thường được sử dụng là gel Sephadex Sephadex có bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lưới xốp Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất

có kích thước khác nhau của các loại protein Có nhiều loại Sephadex, trong đó mỗi loại có kích thước lỗ khác nhau Tuỳ từng loại protein có kích thước khác nhau mà

sử dụng các gel có kích thước khác nhau để tinh chế Để tinh chế lectin người ta thường sử dụng loại gel Sephadex G-75, Sephadex G-100

Phương pháp sác ký lọc gel còn là phương pháp được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất cần tách

 Sắc kí trao đổi ion [53]:

Lectin có bản chất là protein nên phân tử của nó tích điện khác nhau tuỳ

thuộc vào thành phần axit amin mang trong phân tử đó Tuỳ thuộc vào môi trường

pH khác nhau mà lectin mang điện tích âm hay dương Lợi dụng tính chất này người ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dương như DEAE-sephadex, DEAE-cellulose, DEAE-trisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi anion Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện âm như CM-sephadex, CM-cellulose, CM-trisacryl…được

sử dụng làm chất trao đổi cation Mỗi chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao đổi Người ta có thể sử dụng 2 loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định

 Sắc kí ái lực [53]:

Nguyên tắc của phương pháp sắc kí ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là ligand được gắn vào một chất mang tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký Chất mang được sử dụng nhiều nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl… Quá trình thực hiện sắc kí ái lực được tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột ái lực với lectin, giai đoạn 2 hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực

- Giai đoạn 1: Thiết kế cột ái lực lectin: việc lựa chọn chất kết hợp có ái lực đặc hiệu với protein cần tách có ý nghĩa rất quan trọng Vì vậy, cần phải dựa vào tính chất của protein cần tách, đặc tính lý hóa của chất kết hợp và đặc biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa protein và chất kết hợp Trong các thí nghiệm tinh chế lectin người ta thường lựa chọn các chất đường, glycoprotein hoặc chất cộng hợp đường có ái lực hóa học với một lectin nhất định

- Giai đoạn 2: hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất không có ái lực với cột: Các protein có ái lực với cột cần được tạo điều kiện tốt cho quá trình hấp phụ (pH, nhiệt độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ở giai đoạn này, các protein không có ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột

- Giai đoạn 3: giải hay phản hấp phụ lectin ra khỏi cột, cần phải dùng một dung dịch giải hấp phụ có ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi cột