ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY DÀI HẠN PHÁT HIỆN CÁC BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Ở BỆNH NHÂN ĐA U TỦY XƯƠNG TẠI VIỆN HUYẾT HỌCTRUYỀN MÁU TW

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY DÀI HẠN PHÁT HIỆN CÁC BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Ở BỆNH NHÂN ĐA U TỦY XƯƠNG TẠI VIỆN HUYẾT HỌCTRUYỀN MÁU TW  Xây dựng được quy trình nuôi cấy dài hạn cho bệnh nhân ĐUTX nghiên cứu tại NIHBT  Bước đầu khảo sát các bất thường di truyền ở bệnh nhân ĐUTX.

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung thực vàchưa hề được sử dụng trong bất kỳ công bố nào

Em xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận đã được cảm ơn vàcác thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Lê Thị Bích Liên

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đã cho phép và tạo điều kiện cho em được hoàn thành Khóa luận Tốt nghiệp này

Tiếp theo cho em được gửi lời chân thành cảm ơn đến TS Nguyễn Hữu Đức, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, ThS Trần Công Hoàng, Phó trưởng khoa Di truyền và Sinh học phân tử, và TS Dương Quốc Chính, Trưởng Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương Các Thầy đã tận tình hướng dẫn, dạy dỗ, giúp đỡ, chỉ bảo và truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm vô cùng quý báu trong suốt thời gian em thực hiện Khóa luận Tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn với tình cảm chân thành đến tập thể cán bộ Khoa Di truyền

và Sinh học phân tử, đặc biệt là ThS.Vũ Thị Bích Hường, CN Nguyễn Thị Hồng Vân và

CN Kim Thị Ngọc Vân Các anh chị đã luôn nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ, thông cảm và tạo điều kiện cho em được học tập, thực hành các kỹ năng thí nghiệm

Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể các thầy cô giáo đã truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng bổ ích và quý báu trong suốt bốn năm em học tập tại trường

Cuối cùng cho em được gửi lời cảm ơn đến tất cả người thân trong gia đình, bạn bè

đã luôn dành tình cảm, ủng hộ, tạo điều kiện tốt nhất để em học tập và hoàn thành tốt công việc trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

LỜI CAM ĐOAN 2

LỜI CẢM ƠN 3

MỤC LỤC 4

DANH MỤC HÌNH 6

DANH MỤC BẢNG 8

PHẦN I MỞ ĐẦU 9

1.1 Đặt vấn đề 9

1.2 Mục đích và yêu cầu 10

1.2.1 Mục đích 10

1.2.2 Yêu cầu 10

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

2.1 Khái quát về bệnh lý Đa u tủy xương (Multiple Myeloma - MM) 11

2.2 Các bất thường di truyền trong ĐUTX 11

2.3 Tương tác với vi môi trường tủy xương 13

2.4 Tiên lượng 13

2.5 Nhiễm sắc thể 14

2.5.1 Khái niệm 14

2.5.2 Hình thái và kích thước 15

2.5.3 Cấu trúc nhiễm sắc thể 15

2.5.3.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể 15

a Tâm động (Centromere) 16

b Thể mút (Telomere) 17

2.5.3.2 Cấu trúc siêu hiển vi của nhiễm sắc thể 17

2.6 Kỹ thuật di truyền nuôi cấy dài hạn tế bào trong bệnh lý ĐUTX 18

2.7 Phân tích kết quả 20

2.7.1 Phân loại NST 20

2.7.1.1 Chiều dài NST: 21

2.7.1.2 Sự phân bố của các băng sáng tối trên NST 22

2.7.1 Phân tích kết quả xét nghiệm công thức NST (bằng Karyotype) 22

2.7.2 Các bất thường NST và ký hiệu: 22

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

3.2 Vật liệu nghiên cứu 25

3.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 27

3.4.1 Phương pháp nuôi cấy dài ngày tế bào 27

3.4.2 Kỹ thuật thu hoạch 27

3.4.3 Nhuộm NST với Giemsa 28

3.4.4 Phân tích kết quả 29

DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Tương bào tăng sinh trong tủy xương 12

Hình 2.2 Nhiễm sắc thể 16

Hình 2.3 Cấu trúc nhiễm sắc thể 17

Hình 2.4 Các kiểu hình nhiễm sắc thể 18

Hình 2.6 Bộ NST người nhuộm băng G 21

Hình 2.7 46, XX (A); 46, XY (B) 21

Hình 2.8 Các nhóm NST 22

Hình 2.9 Sự phân bố các băng trên NST 23

Hình 2.10 t(8;21) (q22;q22) trong thể M2 ( theo Heim và Mitelman, 1987) 25

DANH MỤC BẢNG

PHẦN I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Đa u tủy xương (Multiple Myeloma - MM) là một bệnh tăng sinh ác tính dòngplasmo (Plasma cells), thuộc tuỷ xương với sự có mặt của tổn thương xương, tăng tươngbào non, xuất hiện protein đơn dòng trong huyết tương và nước tiểu, đau xương, tăngcanxi máu và thiếu máu Tỷ lệ ĐUTX chiếm khoảng 1% trong các bệnh ung thư và hơn10% trong ung thư máu, được cho là một bệnh có tiên lượng xấu và hiện nay chưa có khảnăng chữa khỏi Tuy nhiên, do đặc tính kém tăng sinh và dẫn đến chết theo chương trìnhcủa các tế bào plasmo ác tính khi tách ra khỏi vi môi trường tủy xương nên việc phân tíchcông thức nhiễm sắc thể tủy xương thường cho kết quả bình thường (âm tính giả) Chính

vì vậy, cần phải nuôi cấy dài ngày với sự bổ sung các interleukin 4, interleukin 6 nhằmđảm bảo các tế bào plasmo ác tính có thể phân chia và thu được các cụm nhiễm sắc thể(NST) của dòng tế bào này Việc phát hiện các bất thường di truyền là rất quan trọngtrong việc tiên lượng và xếp loại nhóm nguy cơ đối với bệnh nhân MM Một số nghiêncứu cập nhật cho với với nhóm nguy cơ trung bình và nhóm nguy cơ chuẩn thì thời giansống thêm trung bình lần lượt là 4-5 năm và 8-10 năm còn với nhóm nguy cơ cao, thờigian sống thêm trung bình chỉ khoảng 2 đến 3 năm dù được sử dụng những phác đồ điềutrị liều cao với các thuốc mới nhất Thêm vào đó, việc phát hiện chính xác các tổn thương

di truyền và đánh giá chúng không chỉ giúp tư vấn cho bệnh nhân mà còn hỗ trợ bác sỹlâm sàng lựa chọn thuốc và phác đồ điều trị phù hợp

Do đó, để góp phần nâng cao chất lượng tiên lượng bệnh phục vụ cho việc điều trị,

em đã được hướng dẫn thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy dài hạn nhằm phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể ở bệnh nhân đa u tuỷ xương tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương (NIHBT)”

1.2 Mục đích và yêu cầu

 Xây dựng quy trình nuôi cấy dài hạn để áp dụng thường quy cho bệnh nhân

đa u tuỷ xương tại NIHBT

 Thử nghiệm quy trình trên các mẫu nghiên cứu thu thập tại NIHBT

 Xác định tỷ lệ bệnh nhân có bất thường NST

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát về bệnh lý Đa u tủy xương (Multiple Myeloma - MM)

Đa u tủy xương là bệnh lý ác tính dòng tương bào (Plasma cells) đặc trưng bởi sựtăng sinh và tích lũy bất thường các tế bào dòng tương bào trong tủy xương, thuộc tuỷxương với sự có mặt của tổn thương xương, tăng tương bào non, xuất hiện protein đơndòng trong huyết tương và nước tiểu, đau xương, tăng canxi máu và thiếu máu Đa u tủyxương là một thể tủy của ung thư tương bào (plasma cell – neoplasma)

Bệnh MM chiếm 1% trong các bệnh ung thư nói chung, chiếm 13% bệnh máu áctính ở người da trắng và 3% bệnh máu ác tính ở người da đen (Longo D.L, 1998)

Tương bào là dạng tế bào trưởng thành của lympho dòng B Nguồn gốc của tế bàolympho B là từ tế bào gốc vạn năng tại tủy xương trải qua giai đoạn biệt hóa từ tiềnlympho B, lympho B chín, lympho B trưởng thành và cuối cùng biệt hóa thành tương bào

có khả năng tổng hợp và chế tiết các globulin miễn dịch (Ig) dưới sự kích thích của khángnguyên gây ra những rối loạn đặc trưng Ngược với các tương bào bình thường, tế bàoplasmo ác tính trong MM không được biệt hoá hoàn chỉnh và có những receptor với IL-6,khi kết hợp với IL-6 sẽ tạo thành yếu tố thuận lợi cho sự phát triển, kéo dài đời sống của

tế bào plasmo ác tính và dẫn đến lấn át các dòng tế bào sinh máu bình thường, đồng thờiphá hủy xương gây tăng canxi, acid uric máu và gây rối loạn do tăng tiết Ig bệnh lý

Hình 2.1 Tương bào tăng sinh trong tủy xương

( http://emedicine.medscape.com )

2.2 Các bất thường di truyền trong ĐUTX

Trong bệnh ĐUTX, các bất thường di truyền được chia thành 2 nhóm: nhóm đa bộichiếm tỷ lệ 55 – 60% và nhóm không đa bội chiếm khoảng 40 – 45% Gần một nửa cácbệnh nhân MM thuộc nhóm đa bội có 48 – 75 NST do xuất hiện nhiều trisomie nhiễm sắcthể 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 và 21 (Fonseca R và cộng sự, 2009) Các bất thường khác nhưmất 17p hoặc đột biến p53, đột biến RAS, chuyển đoạn MYC có tần suất tương đươngnhau ở cả hai nhóm đa bội và không đa bội Trong bệnh ĐUTX, nhóm bất thường không

đa bội chủ yếu là các đột biến của các đột biến của gene mã hóa Ig Dạng đột biến haygặp là chuyển đoạn nhiễm sắc thể xảy ra ở vùng chuyển đổi Ig trên nhiễm sắc thể 14q32

Đa số các đột biến gene đều do những sai sót xảy ra ở một trong ba quá trình biếnđổi gene đặc hiệu của tế bào B: quá trình tái tổ hợp ba đoạn gene VDJ, quá trình tái tổ hợpchuyển đổi Ig hoặc đột biến soma quá mức Những bất thường di truyền không phải đabội thường liên quan đến tiên lượng không tốt gồm các chuyển đoạn liên quan đến IgH,nhân đoạn 1q, mất đoạn 1p và mất đoạn nhiễm sắc thể 13 Các gen liên quan đến cácchuyển đoạn IgH là MMSET và FGFR3 ở 4p16, cyclin D3 ở 6p21, cyclin D1 ở 11q13, c-MAF ở 16q23, MAFA ở 8q24 và MAFB ở 20q11 Trong các nghiên cứu trung tâm, tầnsuất của các chuyển đoạn gene IgH trong ĐUTX khoảng 55% - 70% (Avet-Loiseau H vàcộng sự, 2002) Cho đến nay, các nghiên cứu đã phát hiện ra 7 dạng đột biến gene chuỗinặng IgH, gặp trong khoảng 40% các trường hợp ĐUTX Trong giai đoạn sớm của bệnhthường gặp bốn dạng bất thường di truyền: các chuyển đoạn gene IgH chủ yếu do nhữngsai sót xảy ra trong quá trình tái tổ hợp chuyển đổi hoăc đột biến soma quá mức của các tếbào B tại trung tâm mầm và được gọi là các chuyển đoạn IgH nguyên phát, đa bội với cáctrisomie, mất đoạn nhiễm sắc thể 13, và rối loạn điều khiển gene cyclin D

Các bất thường di truyền như đột biến N-RAS, K-RAS và FGFR3 trong những trườnghợp có chuyển đoạn t(4;14), các chuyển đoạn gene MYC, bất hoạt hoặc mất gen p53 lànhững sự kiện xảy ra trong quá trình tiến triển của bệnh, và được gọi là chuyển đoạn IgHthứ phát Ngoài ra, một số các đột biến và chuyển đoạn liên quan đến hoạt động củađường truyền tín hiệu tế bào NF-κB (NFκB pathway) chống lại sự chết theo chương trìnhB (NFκB (NFκB pathway) chống lại sự chết theo chương trìnhB pathway) chống lại sự chết theo chương trìnhcũng đóng một vai trò quan trọng trong sự phát sinh bệnh lý ĐUTX

Bảng 1.1 Một số bất thường di truyền trong ĐUTX

Vi môi trường tủy xương gồm có các tế bào của hệ thống tạo máu, các tế bào khôngthuộc hệ thống tạo máu, thành phần ngoài tế bào và dịch lỏng Trong bệnh ĐUTX, sự cânbằng giữa các thành phần tế bào, thành phần ngoài tế bào và thành phần dịch lỏng trongtủy xương bị phá vỡ Các bất thường di truyền dẫn đến sự thể hiện quá mức các phân tửkết dính trên bề mặt các tế bào đa u tủy đồng thời làm cho các tế bào này nhạy cảm hơnđối với các chất kích thích tăng trưởng Hiện tượng kết dính và tương tác giữa tế bàoplasma ác tính với các phân tử bám dính và tế bào đệm tủy xương, khởi động và tăng quátrình sao chép gene dẫn đến sinh tổng hợp nhiều loại cytokine và các yếu tố tăng trưởngnhư : IL-6, IGF-1, VEGF, TNF-a, SDF-1a, TGF-b, bFGF, MIP-1a, SCF, HGF, IL-1b, IL-

3, IL-10, IL-15, và IL-21, Ang-1 và Matrix Metalloproteinases (MMP-2 và MMP-9) Cáccytokine và các yếu tố tăng trưởng có khả năng thúc đẩy quá trình tăng sinh mạch máu,quá trình tồn tại, phân chia và tăng sinh cũng như phát triển khả năng kháng thuốc của các

tế bào ĐUTX Một số cytokine như IL-1, IL-5, TNFα, TNF-β có khả năng làm tăng hoạtđộng huỷ cốt bào đồng thời ức chế tạo cốt bào gây nên tình trạng tiêu xương, huỷ xương

và gãy xương bệnh lý

2.4 Tiên lượng

Theo Durie - Salmon dựa trên sự kết hợp các yếu tố liên quan đến khối lượng u làmột cách đánh giá tiên lượng bệnh, tuy nhiên nhược điểm của phân loại giai đoạn theo hệthống này là sự phụ thuộc vào nhiều chỉ số, vốn phụ thuộc lẫn nhau, cũng như khó khănkhi xác định chính xác số lượng xương bị tổn thương Thời gian sống trung bình khoảng

60 tháng với BN giai đoạn IA; 14,5 tháng với những BN giai đoạn IIIB (có sự kết hợp vớigiai đoạn suy thận)

Tiên lượng của BN ĐUTX phụ thuộc vào tuổi, mức độ hoạt động của BN, bấtthường, NST.

Nhiễm sắc thể Nguy cơ cao Nguy cơ trung

là cặp nhiễm sắc thể tương đồng (homologous pair), trong đó một chiếc là của mẹ và mộtchiếc là của bố, mỗi chiếc mang cùng một số gen phân bố theo cùng thứ tự Mỗi NSTgồm 2 nhiễm sắc tử (chromatid), trong các giao tử NST đơn bội ở dạng một nhiễm sắc tử

Số lượng nhiễm sắc thể trong mỗi tế bào bình thường luôn là bội số của 2 và được gọi

là lưỡng bội (2n)

V Kích thước NST của các tế bào mô trên cùng một loài có sự khác nhau, nhưng chúngđặc trưng cho các tế bòa và cá thể.

2.5.3 Cấu trúc nhiễm sắc thể

2.5.3.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể

Ở tế bào dinh dưỡng mỗi nhiễm sắc thể có một cặp giống nhau về hình dạng, kíchthước gọi là các nhiễm sắc thể tương đồng (homologous) Bộ nhiễm sắc thể có cặp gọi làlưỡng bội (2n) và đơn bội (n) khi mỗi nhiễm sắc thể chỉ có một chiếc Ngoài ra còn có 1cặp NST giới tính (sex chromosome)

Vai ngắn hơn gọi là vai p và vai dài hơn gọi là vai q Người ta thành lập chỉ số tâm động(centrmere index – Ic) để xác định vị trí của tâm động và kiểu hình NST.

Ic = p+ q p

Dựa vào vị trí của tâm động có thể phân biệt hình thái các nhiễm sắc thể:

- Tâm giữa (metacentric): tâm động ở chính giữa chia 2 vai bằng nhau

- Tâm cận giữa (submetacentric): tâm động ở gần chính giữa

- Tâm đầu (acrocentric): tâm động ở rất gần điểm tận cùng nhiễm sắc, 2 vaikhông bằng nhau

- Tâm mút (telocentric): tâm động nằm ngay điểm tận cùng nhiễm sắc thể

Cấu trúc và thành phần đặc thù của thể mút gồm các đoạn lặp nucleotit, khác nhau ởtùy loại nhưng thường thể hiện theo phương thức 5’ – T1-4A0-1G1-8 – 3’ (Nguyễn Như Hiền,2005) Ví dụ ở người trong tế bào dinh dưỡng lành (không bị ung thư) thể mút thườngchứa 500 – 3000 đoạn lặp lại TTAGGG.

Thể mút có ba chức năng chính:

(1) Ngăn cản các NST trong bộ không dính kết

(2) Ngăn cản enzyme deoxiribonuclease không phân giải đầu tận cùng của phân

tử AND

(3) Sự tái bản AND ở đầu cuối của phân tử tái bản được thuận lợi

2.5.3.2 Cấu trúc siêu hiển vi của nhiễm sắc thể

Trong nhiễm sắc thể chứa phân tử AND mạch kép, có đường kính 2nm AND liênkết với protein tạo sợi nhiễm sắc (chromonema) có cấu trúc xoắn nhiều cấp Sợi nhiễmsắc có đường kính 11nm, là chuỗi hạt cườm gọi là sợi nucleosome (nucleosome fiber).Mỗi hạt cườm là một nucleosome có đường kính 11nm gồm lõi cấu tạo bởi 8 phân tửhiston (2H2A, 2H2B, 2H3, và 2H4), sợi AND xoắn kép cuốn quan lõi histon chứa khoảng

146 cặp nucleotide với 1 34 vòng Giữa hai nucleosome kế tiếp nhau là một đoạn ADN và

1 phân tử histon Các nucleosome nối nhau qua sợi xoắn kép AND dài khoảng 60nucleotid

Chuỗi nucleosome tạo thành sợi cơ bản có chiều ngang 11 nm Sợi cơ bản cuộnxoắn bậc 2 tạo thành sợi nhiễm sắc có đường kính khoảng 30 nm gọi là sợi solenoid(solenoid fiber)

Sợi nhiễm sắc lại xếp cuộn lần nữa tạo nên sợi có cấp độ đường kính khoảng 300 nmchứa các vòng bên (looped domains) Các sợi có đường kính 300 nm xoắn tiếp lại thànhcromatit có đường kính khoảng 700 nm NST tại kỳ giữa của phân bào ở trạng thái kép có

2 cromatit nên đường kính có thể đạt đến 1400nm Với cấu trúc cuộn xoắn, chiều dài NST

có thể thu ngắn từ 15000 – 20000 lần Sự thu gọn cấu trúc không gian của NST thuận lợicho sự phân li và tổ hợp các nhNST trong quá trình phân bào, đảm bào sự duy trì ổnđịnh cấu trúc qua các thế hệ tế bào và cơ thể Ngoài protein histon, trong NST còn cónhiều protein axit điều hòa hoạt động của gen

Hình 2.5 Cấu trúc siêu hiển vi của nhiễm sắc thể

( https://candidscience.files.wordpress.com )

2.6 Kỹ thuật di truyền nuôi cấy dài hạn tế bào trong bệnh lý ĐUTX

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào và phân tích công thức nhiễm sắc thể được ứng dụng đầutiên để phân tích các biến đổi di truyền trong bệnh ĐUTX Việc phát hiện bộ nhiễm sắcthể bất thường không những phản ánh sự tăng sinh cao mà còn cho thấy sự phát triểnkhông phụ thuộc vào các tế bào đệm tủy xương của các tế bào plamo ác tính Tuy nhiên,

do đặc tính kém tăng sinh và dẫn đến chết theo chương trình của tương bào ác tính khitách ra khỏi vi môi trường tủy xương nên việc phân tích công thức nhiễm sắc thể tủyxương thường cho kết quả bình thường (âm tính giả) Khi sử dụng kỹ thuật nuôi cấy dàihạn có bổ sung các cytokine như IL-6, IL-4 và GM-CSF thì tỷ lệ phát hiện bất thườngnhiễm sắc thể được cải thiện và có thể lên đến 40%

Để tiến hành kỹ thuật này, cần các tế bào đang ở kỳ giữa của quá trình phân bào vì ở

kỳ giữa trong quá trình phân chia của tế bào, NST có số lượng và hình dạng co xoắn, côđặc, co ngắn tối đa, thời điểm quan sát hình dạng đặc trưng nhất

Với mẫu bệnh phẩm dùng heparin để chống đông, sử dụng môi trường nuôi cấy giàuchất dinh dưỡng, gồm nhiều acid amin, các yếu tố vi lượng, huyết thanh bê (FBS), khi tếbào nhân lên rồi thực hiện kỹ thuật chuẩn bị tiêu bản NST Nguyên lý của kỹ thuật này là

tế bào plasmo từ tuỷ xương sẽ phân chia dưới sự kích thích của IL-4 và IL-6 Sự phânchia tế bào dưới sự kích thích của các interleukin sẽ xảy ra mạnh nhất sau 120 tiếng trongđiều kiện nuôi cấy 37°C Môi trường nuôi cấy được xử lý với colcemid để ức chế phânbào, giữ tế bào ở trung kỳ và tế bào được thu hoạch bằng cách sử dụng phương pháp xử lýnhược trương và cố định lên tiêu bản NST

Tiến hành nhuộm NST để phân tích NST Các NST khi được nhuộm Giemsa sẽ bắtmàu nhuộm, phương pháp nhuộm Giemsa cổ điển cho phép phân tích NST bằng kíchthước và chỉ số tâm động Tuy nhiên, có những NST có kích thước và chỉ số tâm gầngiống nhau thì người ta sử dụng kỹ thuật nhuộm băng G để nhận dạng cá NST và pháthiện các bất thường NST Kỹ thuật nhuộm bằng G được sử dụng để nhuộm NST ở kỳgiữa được xử lý bằng enzyme phân giải protein và được nhuộm với Giemsa Băng tối làđoạn ADN giàu A, T, băng sang là những đoạn giàu G, C Phương pháp cho hình ảnhNST có các băng đậm nhạt, số lượng, thứ tự và đặc điểm các băng đặc thù cho từng NST