Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược của một số phân đoạn dịch chiết từ quả Bí Đao (Benincasa hispida Cogn.)

Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết quả Bí đao Benincasa hispida Cogn.. Đánh giá được khả năng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch chiết lên mô hình c

Lời cảm ơn

Trong quá trình tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt ngiệp, tôi đã nhận được những lời chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của cô giáo: Tiến sĩ Trần Thị Phương Liên

Bên cạnh đó, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, Trung tâm chuyển giao công nghệ, các Phòng, Ban trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo các điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình làm việc Cùng với đó là sự hỗ trợ nhất định từ gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!

Xuân Hòa, ngày 26 tháng 11 năm 2011

Học viên

Nguyễn Mạnh Cường

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮ DÙNG TRONG LUẬN VĂN

ĐTD Đái tháo đường

HDL –c High density lipoprotein cholesterol (Cholesterol tỉ

trọng cao) VLDL –c Very low dentisy lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng

thấp liên kết cholesterol) LDL –c Low dentisy lipoprotein cholesterol (Lipoprotein

liên kết cholesterol) STZ Streptozotocin

TC Total cholesterol (Cholesterol toàn phần)

Hiện trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh đái tháo đường Dự báo đến năm 2030, con số này sẽ tăng lên 366 triệu người

Thống kê của Hội Người giáo dục bệnh ĐTĐ Việt Nam cho thấy, nếu như năm 2002, tỷ lệ người mắc ĐTĐ chiếm 2,7% dân số thì hiện con số này đã lên trên 7,2%, trong đó khu vực các đô thị, thành phố lớn tập trung nhiều người mắc nhất

ĐTĐ không chỉ có tính chất là một bệnh mạn tính, ĐTĐ còn kèm theo nhiều biến chứng nguy hiểm như các bệnh về thận dẫn đến suy thận, bệnh về mắt dẫn đến mù lòa, tổn thương hệ thần kinh và đặc biệt là các biến chứng về mạch máu (xơ vữa động mạch) có thể dẫn đến tử vong như bệnh mạch vành, nhồi máu não, xuất huyết não…[17], [45], [23], [7] , [16].

Y học ngày nay đã có nhiều loại thuốc chữa bệnh ĐTĐ có hiệu quả như insulin, sulfonylurea, biguanid, Tuy nhiên, hầu hết các loại thuốc này đều có tác dụng phụ và chi phí điều trị đắt đỏ [10], [30], [2], [22].

Những kinh nghiệm cổ truyền và cả những công bố khoa học hiện đại cho thấy bí đao là món ăn bài thuốc hữu hiệu trong phòng chống các bệnh liên quan đến oxy hoá, trong đó có thừa cân béo phì và các bệnh tim mạch khác

Với những lí do trên, nhằm góp phần tìm kiếm và nghiên cứu thuốc điều trị đái tháo đường từ thành phần hóa học cơ bản của quả Bí

đao (Benincasa hispida Cogn.) trên chuột nhắt gây bệnh ĐTĐ bằng

streptozotocin (STZ), chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu

“Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược của một số phân đoạn dịch chiết

từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)”

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá hoạt tính sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết

từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất tự nhiên có trong quả

Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)

3.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau

3.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch

chiết quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) trên mô hình chuột ĐTĐ mô

phỏng type 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

5 Phương pháp nghiên cứu

6 Đóng góp mới của đề tài

Đánh giá được khả năng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch chiết lên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 thông qua chỉ số glucose huyết, các chỉ số lipit máu trên chuột sau 21 ngày điều trị

NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về một số hợp chất tự nhiên ở thực vật

1.1.1 Flavonoid thực vật

Trong số các polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng vì chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và có nhiều hoạt tính sinh - dược học có giá trị [9]

1.1.1.1 Cấu tạo hoá học và phân loại

1.1.1.2 Hoạt tính sinh học của flavonoid

* Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant)

1.1.2.2 Vai trò của hợp chất phenolic trong thực vật

Hợp chất phenolic được hình thành từ những sản phẩm của quá trình đường phân và con đường pentose qua acid cynamic hay theo con đường acetate malonate qua Acetyl- CoA Nhóm hợp chất này có một số chức năng trong đời sống thực vật [8], [60]

1.1.3 Tannin thực vật

1.1.3.1 Cấu trúc hoá học và phân loại

Tannin được cấu tạo dựa trên acid gallic và acid tanic Tannin có 2 nhóm chính: tannin thuỷ phân và tannin ngưng tụ

- Tannin thuỷ phân

- Tannin ngưng tụ

1.1.3.2 Tác dụng sinh học

1.1.4 Alkaloid.

1.1.4.1 Khái quát về Alkaloid

Alkaloid có tính kiềm yếu, do các mạch cacbon chứa nitơ quyết định Chúng có thể liên kết với kim loại nặng tạo phức và phản ứng với một số thuốc thử đặc trưng như: Bouchardat (kết tủa màu nâu sẫm), Vans-Mayer (kết tủa trắng ánh vàng) hay Dragendroff (màu da cam, nâu đỏ)

1.1.4.2 Tác dụng sinh học.

Alkaloid được hình thành từ các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như trao đổi protein Ở trong cây, alkaloid được coi như là chất dự trữ cho tổng hợp protein, các chất bảo vệ cây, tham gia vào sự chuyển hoá hydro ở các mức độ khác nhau [8], [30]

thể BMI (Body Mass Index) để đánh giá tình trạng dư thừa hay thiếu hụt

mỡ của mỗi người

Bảng 1.1 Phân loại BMI của người trưởng thành châu Âu và châu

Á [2].

1.2.1 Thực trạng béo phì trên thế giới và Việt Nam

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) hiện nay số người béo phì đã lên tới 1,7 tỉ người [3], không chỉ gặp nhiều ở các quốc gia phát triển mà còn gặp cả ở các quốc gia đang phát triển

Tại Việt Nam, theo tiêu chuẩn cho người châu Á, số người thừa cân béo phì cũng tăng theo thời gian Năm 1991 theo điều tra của Lê Huy Liệu và cộng sự thì tỉ lệ thừa cân mắc bệnh béo phì nói chung tại

Hà Nội là 1,1% Đến năm 2000 con số này đã là 2,62% tăng gần 2,5 lần trong vòng 10 năm (điều tra của Lê Văn Hải) [3].

1.2.3 Tác hại và nguy cơ của bệnh béo phì

Người béo phì có nguy cơ bệnh tật cao hơn so với người thường

do nhiễm độc mỡ máu, tiêu biểu như:

* Bệnh tim mạch

* Rối loạn lipid máu

* Tiểu đường

* Đột qụy

* Ngoài ra béo phì còn làm gia tăng nguy cơ của nhiều bệnh khác

1.2.4 Nguyên nhân và giải pháp phòng, điều trị béo phì

Nguyên nhân chính dẫn đến thừa cân béo phì là do khẩu phần và thói quen dinh dưỡng không hợp lý, hoạt động thể lực kém dẫn đến

năng lượng hấp thụ vào cơ thể vượt quá mức cần thiết và tích lũy dưới dạng mỡ

Thuốc chống béo phì được chia làm hai nhóm lớn

* Nhóm có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương

* Nhóm tác dụng lên hệ tiêu hóa

Thuốc điều trị béo phì phổ biến hiện nay là Metformin thuộc nhóm hai với tác dụng chủ yếu là ức chế phân giải glycogen thành glucose ở gan, làm tăng tính nhạy cảm của insulin ngoại vi, tác động hạ glucose trong khoảng 2 - 4 mmol/l, giảm HbA1C đến 2%

1.2.5 Rối loạn trao đổi lipid máu

Để đánh giá lượng mỡ trong máu người ta làm xét nghiệm với các chỉ số:

* Cholesterol toàn phần (2,9 – 5,2 mmol/l);

* Triglycerid (0,8 – 2,3 mmol/l);

* HDL-c (0,90 – 1,50 mmol/l);

* LDL-c (0,5 – 3,4 mmol/l)

1.3 Bệnh đái tháo đường (Diabetes mellitus).

1.3.1 Khái niệm và phân loại

Danh từ đái tháo đường (Diabetes mellitus) có nguồn gốc từ tiếng

Hy Lạp (Diabetes: nước chảy trong ống syphon) và tiếng Latinh (mellitus: ngọt) [65] Khoảng 1550 năm trước công nguyên các thầy thuốc Hy Lạp đã mô tả bệnh này với các triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, nước tiểu có đường và sút cân nhanh [4] PGS TS Tạ Văn Bình định nghĩa đái tháo đường là một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng đường máu, do hậu quả của việc mất hoàn toàn insulin

hoặc là do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin Bệnh ĐTĐ được xác định dựa vào những tiêu chí trong bảng 1.2 [4]

Bảng 1.2 Các tiêu chí để chuẩn đoán ĐTĐ theo WHO

Dựa vào những hiểu biết về nguyên nhân phát sinh bệnh, ủy ban chuyên gia về chuẩn đoán và phân loại ĐTĐ của WHO chia ĐTĐ thành các loại như sau: ĐTĐ type 1; ĐTĐ type 2

1.3.2 Thực trạng đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam

Cùng với các bệnh không lây nhiễm khác, bệnh ĐTĐ đang phát triển với tốc độ nhanh chóng cùng sự phát triển của nền kinh tế xã hội Năm 1994, toàn thế giới có 98,9 triệu người mắc ĐTĐ Năm 1995 đã tăng lên 135 triệu người chiếm 4% dân số thế giới, cuối năm 2002 có khoảng 177 triệu người [2] Dự đoán đến năm 2010 có khoảng 222 triệu

và năm 2025 có khảng 300 triệu bệnh nhân chiếm 5,4% dân số thế giới [2]

Việt Nam hiện nay ĐTĐ đang gia tăng rất nhanh Hiện nay, có khoảng hai triệu người mắc bệnh ĐTĐ nhưng có tới 65% số đó không biết mình đã mắc bệnh Theo PGS TS Tạ Văn Bình: ĐTĐ type 2 ở lứa tuổi thanh thiếu niên ngày một tăng nhanh, đây là một vấn đề rất đáng lưu tâm [2]

1.3.3 Tác hại và biến chứng

ĐTĐ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và khả năng làm việc của người lao động, nhưng hơn cả là nguy cơ biến chứng của bệnh nhân thường rất cao [4]

1.3.5 Chuyển hóa glucose và sự điều hòa glucose huyết

1.4 Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường

Béo phì và ĐTĐ là hai bệnh không truyền nhiễm nhưng nguy hiểm nhất của thế kỉ 21 Hai căn bệnh này có mối liên quan chặt chẽ với nhau thể hiện ở chỗ tỉ lệ người béo phì luôn tăng tương đương với số bệnh nhân bị

Tại Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu của Trần Đức Thọ và cộng

sự năm 1996 thì người có BMI > 25 có nguy cơ mắc ĐTD týp 2 cao gấp 3,74 lần so với người bình thường Nghiên cứu của Thái Hồng Quang, tỷ

lệ ĐTD ở người có béo phì độ 1 cao hơn 4 lần và béo phì độ 2 là 30 lần

so với người bình thường

1.5 Phương pháp gây đái tháo đường thực nghiệm STZ

1.6 Vài nét chung về cây Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)

1.6.1 Giới thiệu

Bí đao hay bí phấn hoặc bí trắng, danh pháp khoa học: Benincasa

hispida Cogn; họ bầu bí (Cucurbitaceae)

1.6.2 Nguồn gốc

Bí đao có nguồn gốc ở Ấn Độ, được trồng rộng rãi ở hầu khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á và miền đông của châu Đại dương Ở nước ta, quả Bí đao cũng được trồng khắp nơi [69]

1.6.3 Phân loại, mô tả

Cây thảo một năm, mọc leo dài tới 5m, có nhiều lông dài

1.6.4 Thành phần hóa học

Bí đao tươi có tỷ lệ % các chất như sau: nước 67,9, protid 0,1, lipid 0,1, cellulos 0,7, dẫn xuất không protein 30,5, khoáng toàn phần 0,1 Trong các loại kháng có calcium 26mg, phosphor 23mg, sắt 0,3mg Còn có các vitamin caroten 0,01mg, vitamin B1 0,01mg, vitamin B2 0,02mg, vitamin PP 0,03mg và vitamin C 16mg \

1.6.5 Một số tác dụng Sinh - Dược và công dụng của cây Bí đao [69], [70]

Bí đao là loại rau xanh thường dùng trong các bữa ăn của nhân dân

ta, cũng như dưa chuột Có thể dùng quả Bí đao ăn luộc hoặc nấu canh tôm, canh cua, làm nộm, xào thịt gà, thịt lợn Bí đao còn dùng làm mứt; mứt bí thường dùng trong dịp Tết Nguyên đán Ăn Bí đao thông tiểu, tiêu phù, giải khát, mát tim, trừ phiền nhiệt, bớt mụn nhọt

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

+ Cây Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)

+ Bộ phận sử dụng: quả bí đao

+ Địa điểm thu mẫu: Xuân hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc

+ Mẫu thực vật do Bộ môn Thực vật học - Trường ĐH Sư phạm

Hà nội 2 giám định

2.1.2 Mẫu động vật

Chuột nhắt trắng (Mus musculus) chủng Swiss 4 tuần tuổi (14-17g)

do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng 22- 25°C với chu kỳ sáng 12h và tối 12h

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm

2.1.3.1 Hóa chất

2.1.3.2.Các dụng cụ thí nghiệm:

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu

Từ 3000g quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) sấy khô được

ngâm chiết với ethanol 90% ở nhiệt độ phòng 22oC trong vòng 45 ngày (quá trình được lặp lại 3 lần) Gộp các dịch chiết lại, lọc qua giấy lọc 3 lần và cất lại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không thu được cao tổng số ethanol được hòa tan trong nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, chloroform, ethylacetate cất dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn dịch chiết tương ứng

2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của quả bí đao

(Benincasa hispida Cogn.)

2.2.2.1 Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên

Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính [21] Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau:

Bảng 2.1 Bảng các phản ứng định tính đặc trưng

2.2.2.2 Định lượng pholyphenol tổng số theo phương pháp Ciocalteau

Folin-Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong

mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic [65].

Các bước tiến hành như sau:

* Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất

* Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic

* Định lượng phenolic

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn quả Bí đao

(Benincasa hispida Cogn.) lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh

máu của chuột béo phì thực nghiệm

2.2.3.1 Thử độc tính cấp, xác định LD50

Xác định LD50 của dịch chiết quả Bí đao bằng đường uống theo phương pháp Lorke [51] Chuột nhịn đói trước 16h thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N = 10 và cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg (thể tích và khối lượng tối đa cho phép) Theo dõi biểu hiện và số chuột chết

trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết quả Bí đao (Benincasa

hispida Cogn.)

2.2.3.2 Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm sóc bình thường trong 3 - 4 ngày để thích ứng với môi trường mới sau

đó chúng tôi tiến hành phân chuột thành 2 nhóm với hai chế độ dinh dưỡng như sau:

Nhóm 1 – Nhóm đối chứng

Nhóm 2 - Nhóm nuôi béo

Bảng 2.2 Thành phần thức ăn giàu lipid [64], [66]

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các

phân đoạn dịch chiết quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) trên mô

hình chuột ĐTĐ type 2

Để tìm hiểu tác dụng của dịch chiết cây quả Bí đao lên đường huyết, trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan [66]

2.2.4.1 Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2

Để có mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2, chuột nuôi với chế độ

ăn giàu chất béo và cholesterol sau 8 tuần, được tiêm màng bụng liều đơn STZ (110mg/kg pha trong đệm citrate 0,01M, pH = 4,3)

Đo đường huyết tại các thời điểm 0 giờ (trước khi tiêm STZ), 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (sau khi tiêm STZ) (3 lần, mỗi lần cách nhau 1 tiếng và lấy trung bình) Chuột nào có đường huyết cao (≥18 mmol/l) và

ổn định được lựa chọn để cho uống cao các phân đoạn dịch chiết trong

vòng 21 ngày Đường huyết trong các trường hợp trên đều được đo sau khi cho chuột nhịn qua đêm (12 giờ), chỉ cho uống nước

2.2.4.2 Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết

Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống cao các phân đoạn dịch chiết như bảng 2.3 Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 5, thứ 10, thứ 15, thứ 21 khi điều trị

Bảng 2.3 Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các

phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)

2.2.5 Một số kĩ thuật phân tích hóa sinh

2.2.5.1 Phương pháp định lượng glucose huyết

Xác định nồng độ glucose huyết trên máy đo đường huyết với que thử tự động One Touch Ultra

2.2.5.2 Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh

Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c) được xác định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động (Phòng hóa sinh – Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô)

2.2.5.2.1 Định lượng cholesterol toàn phần

với các phép thử t-test cho các mẫu độc lập và phân tích Anova một, hai nhân tố với mức ý nghĩa

p < 0,05 [21]

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Quy trình tách chiết các phân đoạn từ quả Bí đao

Để tìm hiểu thành phần hóa học của quả Bí đao, chúng tôi tiến hành chiết như đã mô tả ở phần phương pháp thu được cao ethanol Phân

bố đều cao ethanol trong nước cất, sau đó chiết phân lớp lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, chloroform và ethylacetat

Hình 3.1 Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ quả

Bí đao [13]

Với quy trình chiết rút như trên, chúng tôi thu được hiệu suất chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ 3000 gam bột mịn quả Bí đao như bảng 3.1

Bảng 3.1 Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ quả Bí đao

Từ bảng 3.1 và hình 3.1 chúng ta thấy rằng hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phân đoạn cao ethanol (15%) so với khối lượng nguyên liệu khô ban đầu là 50 g, tiếp đến là cao phân đoạn n- hexan (4.94%), cao phân đoạn ethylacetate là (3.42%), cao phân đoạn nước (3.14%) và thấp nhất là ở cao phân đoạn chloroform (2.81%) Kết quả này cho thấy trong quả bí đao có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên

3.2 Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết quả Bí đao

Nhằm góp phần đánh giá thành phần các hợp chất tự nhiên cơ bản

có trong cao các phân đoạn từ dịch chiết quả Bí đao, chúng tôi tiến hành các phản ứng định tính, định lượng

3.2.1 Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong quả Bí đao

Sử dụng các thuốc thử đặc trưng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên, chúng tôi thu được kết quả trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết quả Bí đao Kết quả định tính cho thấy thành phần các hợp chất trong quả Bí đao khá phong phú, có đầy đủ các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến như: flavonoid, tannin, alkaloid và glycoside Trong đó, ở phân đoạn cao ethanol, EtOAc và phân đoạn cao cồn tổng số hầu hết các phản ứng với các nhóm chất đều là dương tính; phân đoạn cao chloroform có chứa tương đối đầy đủ các chất trừ các phản ứng Diazo, Mayer, Bouchardat - trong đó các chất thấy với hàm lượng nhiều là polyphenol, glycoside; các chất còn lại có nhưng với hàm lượng ít; Trong phân đoạn nước chứa nhiều các chất như polyphenol, glycoside; không thấy xuất hiện catechin cũng như phản ứng với Diazo và Bouchardat Từ bảng 3.2 ta thấy ở phân đoạn cao cồn tổng số và phân đoạn cao ethylacetate chứa rất nhiều polyphenol và mức phản ứng mạnh và rất mạnh, chứng tỏ là hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư Kết quả định tính này giúp chúng tôi có những định hướng để tiếp tục nghiên cứu ở mức độ cao hơn

3.2.2 Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết

Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin - Ciocalteau

3.2.2.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic

Đường chuẩn acid gallic được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành trên

máy ERMA ở bước sóng 765nm Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2

Bảng 3.3 Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic

3.2.2.2 Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Bảng 3.4 Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết

từ quả Bí đao

Bảng định lượng 3.4 cho thấy rằng, hàm lượng polyphenol tổng số trong cao phân đoạn EtOH là cao nhất (8.742%), sau đó đến phân đoạn cao EtOAc (3.146); trong khi đó phân đoạn n- hexan và chloroform có hàm lượng polyphenol gần tương đương nhau (chiếm 2.242% và 2.322% tương ứng) Đối với phân đoạn nước hàm lượng polyphenol thấp nhất (1.032%)

Kết quả đó chỉ ra rằng, thành phần hóa học trong quả Bí đao có chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong cao ethanol và cao ethylacetate

3.3 Kết quả xác định liều độc cấp

Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ quả Bí đao trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke [50] Chuột cho nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 5 con

và được cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết quả Bí đao

Bảng 3.5 Kết quả thử độc tính cấp theo đường uống

Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết Đến liều cao nhất 8000mg/kg thể

trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chưa tính được LD50, nghĩa là

có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao hoàn toàn không độc dù ở liều rất cao theo đường uống

3.4 Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng ban

đầu là 14 - 17g) được chia làm 8 lô

Lô 1: cho ăn chế độ bình thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ

Trung ương)

Lô 2 - 8: cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao như bảng 2.2

Sau 8 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân trọng lượng chuột Kết quả sự thay đổi trọng lượng của chuột thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.3

Bảng 3.6 Trọng lượng trung bình của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dưỡng khác nhau

Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 8 tuần

Bảng 3.6 và hình 3.3 đã cho thấy rằng chuột được nuôi theo chế độ

ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao có khả năng tăng về trọng lượng lớn hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thường và sự sai khác này là có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0.05 Cụ thể là:

Tại thời điểm ban đấu sự khác nhau về trọng lượng không có ý ngĩa thống kê (p> 0.05)

Sau 8 tuần nuôi, chuột nuôi với thức ăn thường trọng lượng cơ thể chỉ tăng thêm 24,68 g ứng với 158,82% so với ban đầu, trong khi chuột nuôi với thức ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao trọng lượng cơ

thể tăng thêm 47,55 g ứng với 311,60% so với ban đầu Như vậy, chuột

ăn thức ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao đã tăng trọng hơn so với chuột ăn thức ăn thường là 22,87g hay gấp 1.93 lần Đây là một kết quả khả quan, phù hợp với thực nghiệm nuôi béo chuột của TS Phùng Thanh Hương (sau 8 tuần, trọng lượng HFD gấp 1.6 lần ND) [12]

Để đánh giá ảnh hưởng của chế độ nuôi béo đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cùng của thời gian nuôi béo sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số hoá sinh Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.4 sau đây Bảng 3.7 So sánh một số chỉ số hóa sinh máu giữa chuột nuôi thường và nuôi béo phì thực nghiệm

Hình 3.4 Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột TNo

Kết quả ở bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy các lô chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipit cao đều có rối loạn một số chỉ số lipit máu so với các lô chuột ăn thức ăn bình thường Cụ thể:

Hàm lượng LDL –c trong máu chuột ăn thức ăn béo là 1.25 mmol/l, tăng 86.18% so với nhóm nuôi thường (0.67mmol/l) với P < 0.05 Trái lại, HDL –c lại có sụt giảm mạnh, giảm tới 47.15% so với chuột nuôi thường (1.23mmol/l), với P < 0.05

Hàm lượng glucose của chuột trong nhóm ăn thức ăn béo là 7.51 mmol/l, tăng 15% so với chuột thường (6.52mmol/l) Hàm lượng cholesterol toàn phần / triglycerid / LDL-c/ Glucose trong huyết thanh

của nhóm chuột nuôi béo tương ứng tăng gấp 1.25 / 1.37 / 1.85 / 1.15 lần

so với nhóm chuột nuôi bằng thức ăn thường

3.5 Tác dụng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao trên mô hình chuột ĐTĐ type 2

3.5.1 Kết quả tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm

Với nguyên tắc kết hợp giữa chế độ ăn béo trong thời gian dài và tiêm màng bụng STZ (pha trong đệm Citrat 0,01M, pH 4,5) với liều đơn

110 mg/kg thể trọng, chúng tôi đã thành công trong việc gây ĐTĐ type 2 thực nghiệm Kết quả được trình bày trong bảng 3.8 và có so sánh với các lô chuột chỉ ăn thường tiêm STZ, chuột thường và chuột béo chỉ tiêm đệm (Citrat 0,01M, pH 4,5)

Bảng 3.8 Nồng độ glucose huyết của các lô chuột trước và sau khi tiêm STZ

Nhận xét:

- Giữa chuột béo và chuột thường có tăng nhẹ về mức glucose huyết (trước khi tiêm) Cụ thể mức glucose ở chuột nuôi chế độ ăn béo trong thời gian 8 tuần có mức glucose huyết tăng 19.34% so với chuột thường Điều này chứng tỏ, những rối loạn về chuyển hóa lipid rất dễ dẫn đến rối loạn chuyển hóa glucid Các quá trình chuyển hóa trong cơ thể luôn có mối quan hệ biện chứng chặt chẽ

- Đã có sự khác nhau nồng độ glucose huyết của chuột thường tiêm STZ so với nồng độ glucose huyết của chuột thường tiêm đệm với

độ tin cậy > 95% (tương ứng là 6.80 mmol/l và 8.04mmol/l, p < 0.001)

- Có sự khác nhau không nhiều về nồng độ glucose huyết lúc đói giữa chuột thường tiêm đệm và chuột béo phì tiêm đệm (tương ứng là

6.80mmol/l và 7.35mmol/l, trị số p < 0.4), sự chênh lệnh này có thể có

do sự khác nhau ngay từ đầu về đường huyết giữa chuột nuôi thường và chuột nuôi béo phì (do chế độ nuôi chi phối - như trên đã trình bày)

- Ở lô béo phì tiêm STZ, nồng độ glucose huyết tăng một cách rõ rệt so với các lô thường và so với trước khi tiêm Nồng độ glucose huyết của các con chuột béo sau tiêm STZ 72 giờ là 21.22mmol/l Kết quả thu được phù hợp với nghiên cứu của GS.TSKH Đỗ Ngọc Liên và cộng sự (2006), Phùng Thanh Hương, Trần Thị Chi Mai và nhiều nghiên cứu khác [11], [18], khi tiến hành gây ĐTĐ bằng STZ trên mô hình chuột béo, đều có glucose huyết tăng cao trên 18mmol/l Điều này chứng tỏ: hiện tượng - cơ chế béo phì, rối loạn trao đổi lipid khi bị nhiễm chất độc vào cơ thể (chuột béo phì nhiễm chất độc STZ từ xạ khuẩn Streptomyces achromogens) sẽ chuyển sang trạng thái ĐTĐ type 2 bền vững, khó phục hồi (Lenzen, S 2008) [48].

Hình.3.5 Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột thí nghiệm trước và sau khi tiêm 72 giờ

Hiện nay, có rất nhiều mô hình ĐTĐ mô phỏng type 2, như mô hình ĐTĐ di truyền, chuột thường ĐTĐ, nhưng mô hình chuột béo phì ĐTĐ vẫn được ưa chuộng nhất bởi vì nó nhiều đặc điểm bệnh lý giống với ĐTĐ type 2 ở người [48], [67] Tuy nhiên, khả năng gây ĐTĐ type

2 ở chuột tuỳ thuộc nhiều yếu tố như dòng chuột lựa chọn, thời gian

và chế độ nuôi béo, liều tiêm STZ Nhiều công trình khác nhau công

bố về hiệu quả mô hình này [10], [16], [45], [48], [49], [55], [58], [61], [67].

Qua tham khảo và thử nghiệm chúng tôi thấy rằng: đối với dòng chuột chủng Swiss, để có thể gây ĐTĐ với hiệu suất cao cần có thời gian nuôi béo dài hơn thông thường từ 4- 6 tuần, kết hợp với tiêm STZ liều thấp Căn cứ vào liều STZ gây ĐTĐ type 2 ở chuột cống của Reed và cộng sự (thường 50mg/kg thể trọng), chúng tôi thấy rằng ở chuột nhắt trắng cần tiêm liều cao hơn thông thường từ

90 – 120mg/kg thể trọng Kế thừa những nghiên cứu trước đây [11], [10], [13]…, chúng tôi quyết định chọn tiêm liều 110mg/kg thể trọng Với liều tiêm như vậy, chúng tôi đã đạt được hiệu suất gây ĐTĐ là 87% chuột có đường huyết ≥ 18mmol/l

Lô chuột thường tiêm STZ với liều như trên, nồng độ glucose huyết lúc đói có tăng nhẹ sau khi tiêm (nồng độ glucose lúc đói trước và sau 72 giờ tiêm tương ứng 6.56 và 8.04 mmol/l) Điều này có thể do chuột ăn chuẩn có thể tự điều chỉnh nồng độ glucose máu nhờ tăng lượng Insulin tiết ra để điều hòa lượng glucose trong máu

Đối với lô chuột béo phì tiêm STZ nồng độ glucose sau 72 giờ tiêm tăng một cách rõ rệt (từ 7.51mmol/l trước khi tiêm lên 21.22 mmol/l sau khi tiêm 72 giờ)

3.5.2 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao đến nồng

độ glucose huyết lúc đói của chuột ĐTĐ

Với các mô hình thí nghiệm như trong phần phương pháp nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả thể hiện trong bảng 3.9 và hình 3.6 sau: Bảng 3.9 Kết quả nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột sau 21 ngày điều trị

Biểu đồ 3.6 Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột trước và sau 21 ngày điều trị

Phân đoạn chloroform và cao phân đoạn ethylacetate có tác dụng giảm mạnh ở các ngày điều trị (5, 10, 15) và giảm mạnh nhất, rõ nhất sau ngày 21 điều trị, lần lượt là (7.7 mmol/l và 8.4 mmol/l) tương ứng với (giảm 64.5% và 62.3% (p < 0.05)) Phân đoạn cao cồn tổng số cũng có tác dụng giảm mạnh ở các ngày điều trị (5, 10, 15) và giảm mạnh nhất ở ngày điều trị thứ 21 (9.3 mmol/l tương đương giảm 58.1%, (p < 0.01)), tác dụng giảm đường huyết của phân đoạn này tương đối đồng đều qua các ngày điều trị Tiếp theo là cao phân đoạn cao nước, với mức giảm tối

đa là ở ngày thứ 21 điều trị (10.1 mmol/l, tương ứng giảm 60.7%) Thuốc metformin là loại thuốc hiệu quả trong hạ glucose huyết của bệnh ĐTĐ với mức giảm sau 21 ngày điều trị xuống còn 9.1 mmol/l ứng với giảm 55.9% (p < 0.01) với liều 500mg/kg thể trọng

3.6 Tác dụng đến chuyển hóa lipid của quả Bí đao trên mô hình chuột ĐTĐ type 2

Để đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cùng của thời gian điều trị, sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi chọn 2 lô chuột

có chỉ số đường huyết thấp, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ

số hoá sinh Kết quả được trình bày trong bảng 3.12 và hình 3.9 sau đây

Bảng 3.10 So sánh một số chỉ số lipid máu ở chuột ĐTĐ trước và sau điều trị bằng cao phân đoạn CHCl3 và cao phân đoạn EtOAc Hình 3.7 So sánh một số chỉ số lipid máu ở chuột ĐTĐ trước và

sau điều trị bằng bằng cao phân đoạn CHCl3 và

cao phân đoạn EtOAc

Qua bảng 3.10 và hình 3.7 cho thấy ở chuột béo phì đã có những biểu hiện về rối loạn lipid máu với 2 chỉ số quan trọng là Cholesterol và Trigrixerit tuy nhiên sau 21 ngày điều trị bằng phân đoạn CHCl3 và phân đoạn cao EtOAc thì chỉ số Cholesterol toàn phần giảm tương ứng 14.18%

và 16.67%, chỉ số triglixerit giảm tương ứng 26.31% và 28.8%; chỉ số LDL-c giảm mạnh nhất: giảm 39.19% khi điều trị bằng phân đoạn CHCl3

và giảm 42.4% khi điều trị bằng phân đoạn cao EtOAc (các số liệu trên

đều có ý nghĩa thống kê với p < 0.05)

Kết quả trên bước đầu cho thấy dịch chiết các phân đoạn CHCl3

và EtOAc có tác dụng giảm Cholesterol toàn phần, triglixerit và LDL -c Mặt khác chỉ số HDL – c lại có xu hướng tăng mạnh: tăng 151% khi điều trị bằng phân đoạn CHCl3 và tăng 154% khi điều trị bằng phân đoạn cao EtOAc; chỉ số HDL-c tăng mạnh là một dấu hiệu khả quan vì HDL được mệnh danh là “lipoprotein tốt”, hoạt động chính của

nó là vận chuyển cholesterol dư thừa từ tế bào ngoại vi về gan để đào thải qua đường mật, điều này cũng một phần giải thích được vì sao lượng cholesterol toàn phần và triglyxerit giảm

2 Chuột được nuôi theo chế độ ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao trong 8 tuần đã bị mắc bệnh béo phì với sự tăng khối lượng là 311,60% hàm lượng cholesterol toàn phần tăng 25.48%, triglycerid tăng 37% và LDL-c tăng 86.57%, Glucose 15.18%, tuy nhiên hàm lượng HDL – c lại giảm 47.15% Sự tăng, giảm này hoàn toàn có ý nghĩa thống kê toán học với p < 0.05

3 Chuột béo phì sau khi tiêm STZ liều thấp 110mg/kg thể trọng bị mắc bệnh ĐTĐ type 2 với nồng độ glucose huyết sau 72 giờ tiêm được duy trì ở mức cao, ổn định (>17.15mmol/l) và phần lớn những con chuột càng béo có khả năng bị ĐTĐ càng cao

4 Một số phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao có khả năng hạ đường huyết trên mô hình chuột ĐTĐ: Hàm lượng glucose huyết của lô chuột uống lô chuột uống cao n-Hexan giảm 52.1%; lô chuột uống phân đoạn cao cồn tổng số giảm 58.1%; cao phân đoạn nước giảm 60.7%; lô chuột uống cao phân đoạn ethylacetate nồng độ glucose huyết giảm tới 62.3% và giảm mạnh nhất là lô chuột uống cao chloroform giảm 64.5%

so với lô bình thường

5 Với liều uống 2000mg/kg thể trọng chuột ĐTĐ của cao phân đoạn CHCl3 và cao phân đoạn EtOAc, sau 21 ngày điều trị chỉ số Cholesterol toàn phần giảm tương ứng 14.18% và 16.67%, chỉ số triglixerit giảm tương ứng 26.31% và 28.8%; chỉ số LDL-c giảm mạnh nhất: giảm 339.19% khi điều trị bằng phân đoạn cao chloroform và giảm 42.4% khi điều trị bằng phân đoạn cao EtOAc

Mặt khác chỉ số HDL – c lại có xu hướng tăng mạnh: tăng 151% khi điều trị bằng phân đoạn cao chloroform và tăng 154% khi điều trị bằng phân đoạn cao EtOAc (p<0.05)

KIẾN NGHỊ

1 Tiếp tục đi sâu tìm hiểu cơ chế giảm trọng lượng, giảm lipid máu, hạ glucose huyết hay tăng dung nạp glucose của các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao với thời gian điều trị lâu hơn

2 Tiếp tục nghiên cứu thành phần và xác định cấu trúc hóa học của một số chất trong phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao có tác dụng chống béo phì và hạ glucose huyết

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn trao đổi chất với biểu hiện chung nhất là chứng tăng đường huyết Căn bệnh này đang trở thành mối nguy hại đối với toàn cầu bởi trung bình 10 giây có một người tử vong vì ĐTĐ

Hiện trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh đái tháo đường

Dự báo đến năm 2030, con số này sẽ tăng lên 366 triệu người Mỗi năm, thế giới có khoảng 3,2 triệu người chết vì bệnh Đái tháo đường, tương đương số người chết hàng năm vì bệnh HIV/AIDS Đáng chú ý là bệnh có xu hướng gia tăng mạnh tại các quốc gia đang phát triển ở châu Phi, châu Mỹ La Tinh và châu Á, đặc biệt ở độ tuổi lao động

Riêng châu Á, số liệu công bố tại hội nghị ĐTĐ quốc tế tổ chức vào tháng 12 năm 1997 tại Singapo công bố: năm 1995 có khoảng 62 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, cuối năm 2002 con số này là 89 triệu người Theo đánh giá của Hiệp hội ĐTĐ quốc

tế (IDF) năm 2005 số người mắc bệnh ĐTĐ tại châu Á tăng lên 1.7 lần WHO đã cảnh báo có thể xuất hiện “đại dịch ĐTĐ” ở châu Á vào thế kỷ 21 [24], [2], [3]

Tính đến nay, Việt Nam có gần 5 triệu người mắc bệnh đái tháo đường Với

tỷ lệ tăng từ 8-20% mỗi năm, Việt Nam nằm trong nhóm nước có tỷ lệ bệnh đái tháo đường tăng nhanh nhất trên thế giới Thống kê của Hội Người giáo dục bệnh ĐTĐ Việt Nam cho thấy, nếu như năm 2002, tỷ lệ người mắc ĐTĐ chiếm 2,7% dân

số thì hiện con số này đã lên trên 7,2%, trong đó khu vực các đô thị, thành phố lớn tập trung nhiều người mắc nhất Đối tượng mắc ĐTĐ thường ở độ tuổi từ 30 - 65, nhưng hiện đã có những bệnh nhân bị ĐTĐ mới chỉ 9 - 10 tuổi, điều này phản ánh

sự trẻ hóa về bệnh này ở nước ta

ĐTĐ không chỉ có tính chất là một bệnh mạn tính, ĐTĐ còn kèm theo nhiều biến chứng nguy hiểm như các bệnh về thận dẫn đến suy thận, bệnh về mắt dẫn đến

mù lòa, tổn thương hệ thần kinh và đặc biệt là các biến chứng về mạch máu (xơ vữa động mạch) có thể dẫn đến tử vong như bệnh mạch vành, nhồi máu não, xuất huyết não…[17], [45], [23], [7], [16]

Ngày 21 tháng 12 năm 2006, Hội Đồng Liên Hiệp Quốc đã thông qua một nghị quyết thống nhất chung, tuyên bố ĐTĐ là một vấn đề sức khỏe cộng đồng quốc tế

Đây là lần đầu tiên một bệnh không truyền nhiễm lại được xem là một vấn đề sức khỏe cộng đồng quốc tế và ĐTĐ là bệnh thứ hai chỉ sau AIDS đạt đến tầm quan trọng như vậy Trong những năm sắp đến, ĐTĐ là mối đe dọa sức khỏe cộng đồng đang tăng lên ở các nước phát triển và đang phát triển Y học ngày nay đã có nhiều loại thuốc chữa bệnh ĐTĐ có hiệu quả như insulin, sulfonylurea, biguanid, Tuy nhiên, hầu hết các loại thuốc này đều có tác dụng phụ và chi phí điều trị đắt đỏ [10], [30], [2], [22]

Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ người mắc bệnh làm cho ĐTĐ trở thành một vấn đề lớn cho sức khỏe vì bệnh có tỷ lệ mắc, chết trầm trọng trong quá trình trị liệu lâu dài, đặc biệt là ĐTĐ type 2 một trong những bệnh phổ biến nhất trong bệnh ĐTĐ ĐTĐ có thể mang nhiều biến chứng nguy hiểm như: biến chứng võng mạc, suy thận, biến chứng mạch máu lớn, tổn thương bàn chân dẫn đến cụt Vì vậy đại

đa số người bệnh đều có nhu cầu chữa bệnh một cách an toàn Mỗi năm nước Mỹ

đã phải chi hàng tỉ đô la cho điều trị ĐTĐ bằng các thuốc do tổ chức an toàn thực phẩm và dược phẩm Mỹ phê chuẩn (Food and Drug Aministration - FDA) như: Metformin, Orlistat, Sibutramin, Ephedrin, Fenfluramin Song hầu hết các thuốc này đều có nguồn gốc tổng hợp, thường có tác dụng phụ và đắt tiền Trước tình hình đó ủy ban chuyên gia của (WHO) đã khuyến nghị nên sử dụng các thuốc

có nguồn gốc thảo dược sẵn có, giá thành rẻ và ít độc tính [4], [2]

Trong lịch sử Y học từ 1550 năm trước công nguyên, con người đã biết dùng cây cỏ để chữa ĐTĐ Nhiều loại thảo dược đó chứng tỏ có tác dụng rất tốt trong

việc điều trị ĐTĐ như: mướp đắng, sinh địa, hoàng kỳ, huyền sâm, cỏ ngọt, chè xanh, khoai lang,…Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của các loài cây thuốc có giá trị của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lý, hiệu quả có tầm quan trọng đặc biệt

Quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) là loài thực vật thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) Bí đao gốc ở Ấn Độ, được trồng rộng rãi ở khắp các vùng nhiệt

đới và á nhiệt đới của châu á và miền Ðông của châu Ðại Dương Ở nước ta, quả Bí đao cũng được trồng khắp nơi để lấy quả

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng chống oxy hoá của bí đao trên tế bào mô gan, não, thận Đây là cơ sở của những tác dụng dược lý của bí đao đã được công bố, đó là: kháng viêm, kháng dị ứng, hạ đường huyết, phòng chống Alzheimer, béo phì, u xơ, ung thư Nhóm nghiên cứu của Chetan Nandecha và cộng sự đã khẳng định cao chiết hạt bí đao có hoạt tính ức chế 5α-reductase, giúp C Nandecha phòng chống phì đại tiền liệt tuyến trên mô hình thực nghiệm

Nghiên cứu mới nhất của nhóm tác giả Ấn Độ (T Jayasree, 2011) cho thấy cao chiết nước bí đao làm tăng thể tích nước tiểu, tăng bài tiết ion natri và clor, nhưng lại giảm bài tiết kali Kết quả này càng khẳng định vai trò của bí đao với bệnh nhân phù thũng, cao huyết áp

Những kinh nghiệm cổ truyền và cả những công bố khoa học hiện đại cho thấy bí đao là món ăn bài thuốc hữu hiệu trong phòng chống các bệnh liên quan đến oxy hoá, trong đó có thừa cân béo phì và các bệnh tim mạch khác

Với những lí do trên, nhằm góp phần tìm kiếm và nghiên cứu thuốc điều trị

đái tháo đường từ thành phần hóa học cơ bản của quả Bí đao (Benincasa hispida

Cogn.) trên chuột nhắt gây bệnh ĐTĐ bằng streptozotocin (STZ), chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược của một số

phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)”

Nghiên cứu được thực hiện với những mục tiêu sau:

- Tìm hiểu thành phần hóa học cơ bản của quả Bí đao

- Tìm hiểu tác dụng hạ đường huyết của một số phân đoạn dịch chiết quả Bí đao trên mô hình chuột gây ĐTĐ thực nghiệm bằng STZ

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá hoạt tính sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết từ quả Bí

đao (Benincasa hispida Cogn.)

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất tự nhiên có trong quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)

3.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau 3.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết quả

Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) trên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2

4 Đối tượng nghiên cứu

4.1 Mẫu thực vật

- Quả bí đao (Benincasa hispida Cogn.)

- Địa điểm thu mẫu: Phúc Yên – Vĩnh Phúc

4.2 Mẫu động vật và vi sinh vật

- Chuột nhắt trắng là chủng Swiss 4 tuần tuổi (18- 20 g), do Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Phương pháp hoá lý và hoá học

5.2 Sử dụng các phương pháp hoá sinh

5.3 Tạo mô hình chuột BP, tạo mô hình chuột ĐTĐ typ II

5.5 Sử dụng phương pháp nghiên cứu hình thái giải phẫu

6 Đóng góp mới của đề tài

Đánh giá được khả năng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch chiết lên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 thông qua chỉ số glucose huyết, các chỉ số lipit máu trên chuột sau 21 ngày điều trị

NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về một số hợp chất tự nhiên ở thực vật

1.1.1 Flavonoid thực vật

Trong số các polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng vì chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và có nhiều hoạt tính sinh - dược học có giá trị [9]

1.1.1.1 Cấu tạo hoá học và phân loại

Về cấu tạo hóa học, khung cacbon của flavonoid là C6 - C3 - C6, gồm 15 nguyên tử cacbon, hai vòng benzene A và B nối với nhau qua dị vòng C, trong đó A kết hợp với C tạo khung chroman

9

10 8

4'

3' 2'

B

Flavan (2-phenyl chroman) Tùy theo mức độ oxy hoá của vòng pyran, sự có mặt hay không có mặt của nối đôi giữa C2 và C3 và nhóm cacbonyl ở C4 mà có thể phân biệt flavonoid thành các nhóm phụ sau: flavon, flavonol, flavanon, chalcon và auron, antoxyanidin, leucoantoxyanidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid, neoflavonoid

Flavonoid tồn tại ở hai dạng: dạng tự do gọi là aglycon và dạng liên kết với đường gọi là glycoside Các glycoside khi bị thuỷ phân bằng acid hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đường và aglycon tương ứng Có 2 dạng glycoside là O-glycoside và C-glycoside Đối với O-glycoside phân tử đường liên kết với flavonoid thông qua nhóm hydroxyl như rutin; đối với C-glycoside, flavonoid liên kết với đường thông qua nguyên tử cacbon như saponin

1.1.1.2 Hoạt tính sinh học của flavonoid

- Tác dụng chống oxy hoá (antioxydant): flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hoá dây chuyền sinh ra bởi gốc tự do hoạt động Những flavonoid có các nhóm hydroxyl sắp xếp ở vị trí octo dễ dàng bị oxy hoá dưới tác dụng của các enzyme polyphenoloxydase và peroxydase tạo thành dạng semiquinon hoặc quinon

có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý để tiêu diệt chúng

- Flavonoid có khả năng điều hòa hoạt độ enzyme do khả năng liên kết với nhóm amin trong phân tử protein, làm thay đổi cấu hình không gian của enzyme do

đó tạo hiệu ứng điều hòa dị lập thể

- Flavonoid có tính kháng khuẩn, kháng virus, tăng khả năng đề kháng của

cơ thể do kích thích lympho bào, tăng sản xuất interferon, ức chế hiện tượng thoát bọng (digramilation)

- Flavonoid có hoạt tính của vitamin PP, làm tăng tính bền và đàn hồi của thành mạch, giảm sức thấm của mao mạch

- Flavonoid có tác dụng chống ung thư do kìm hãm các enzyme oxy hoá khử, quá trình đường phân và hô hấp, kìm hãm phân bào, phá vỡ cân bằng trong các quá trình trao đổi chất của tế bào ung thư [6]

- Tác dụng giảm béo phì và lipid máu

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật cho thấy khi chuột béo phì được điều trị bằng dịch chiết giàu flavonoid từ lá Bằng lăng (Lagerstroemia specciosa L.) thì có trọng lượng giảm đáng kể (~ 10% ) Thí nghiệm tương tự với flavonoid từ lá Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) đối với chuột cống trắng uống cholesterol cũng cho thấy có tác dụng làm giảm các chỉ số cholesterol, triglycerid, LDL-c đồng thời tăng HDL-c [34] Naringin (C17H32O4) và hesperidin (C28H34O15)

là những flavonoid có hàm lượng cao trên họ cam chanh (Rutaceae) đã được nhiều nhà nghiên cứu chiết xuất và thử tác dụng trên mô hình chuột béo phì cho kết quả tốt trong việc làm hạ các chỉ số lipid máu [33], [38]

- Tác dụng hạ glucose huyết

O

O

OH OH

OH OH

O

O

O OH

O H

O O

O

OH

OH

OH

Một số flavonoid được tách chiết từ nguyên liệu thực vật đã được chứng minh là có tác dụng điều hòa glucose huyết như: quercetin có trong Đỗ trọng (Eucommia ulmoides Oliver.) [59], Hesperidin và Naringin có trong các cây thuộc

họ Rutaceae, Genistein và Daidzein có trong Đậu nành (Glycine max L.) [12], Myricetin có trong cây Vông vang (Abelmoschus moschatus) [12]

1.1.2 Hợp chất phenolic

1.1.2.1 Phân loại

Hợp chất phenolic là nhóm các chất khác nhau rất phổ biến trong thực vật Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có vòng thơm (benzen) mang một, hai

hay ba nhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào vòng benzen Dựa vào thành phần và cấu trúc, người ta chia hợp chất phenolic thành 3 nhóm:

- Nhóm hợp chất phenolic đơn giản: trong phân tử chỉ có một vòng benzen

và một vài nhóm hydroxyl Tuỳ thuộc vào số lượng nhóm hydroxyl mà chúng được gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquinon, ), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquinol, )

- Nhóm hợp chất phenolic phức tạp: trong thành phần cấu trúc phân tử của

chúng ngoài vòng thơm benzen (C6) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh Đại diện nhóm này có acid cynamic, acid cumaric

- Nhóm hợp chất phenolic đa vòng: là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất

phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng Nhóm này có flavonoid, tannin và coumarin

1.1.2.2 Vai trò của hợp chất phenolic trong thực vật

Hợp chất phenolic được hình thành từ những sản phẩm của quá trình đường phân và con đường pentose qua acid cynamic hay theo con đường acetate malonate qua Acetyl- CoA Nhóm hợp chất này có một số chức năng trong đời sống thực vật [8], [60]

- Các hợp chất phenolic tham gia vào quá trình hô hấp như là một chất vận chuyển hydro

- Các polyphenol có thể hình thành liên kết hydro với các protein và enzyme làm thay đổi hoạt động của các enzyme này tương tự như hiệu ứng điều hòa dị lập thể

- Tác dụng mạnh lên quá trình sinh trưởng, nó đóng vai trò là chất hoạt hoá IAA- oxydase và tham gia vào quá trình sinh tổng hợp enzyme này Hợp chất phenol tác dụng như chất điều hoà các chất điều khiển sinh trưởng ở thực vật

- Hợp chất phenol có tính chất kháng khuẩn

1.1.3 Tannin thực vật

1.1.3.1 Cấu trúc hoá học và phân loại

Tannin là hợp chất phenol có trọng lượng phân tử cao, có chứa các nhóm

chức hydroxyl và các nhóm chức khác (như cacboxyl), có khả năng tạo phức với protein và các phân tử lớn khác trong điều kiện môi trường đặc biệt [8], [30]

O O

H

OH

OH

OH OH

O O

H

OH OH

- Tannin ngưng tụ: là các oligomer hay polymer của các đơn vị flavonoid (flavan 3-ol) nối với các dây nối C - C không bị cắt khi thuỷ phân như catechin, epicatechin hoặc các chất tương tự Tannin ngưng tụ có thể có từ 2 tới 50 hay hơn các đơn vị flavonoid

Tannin thường là hợp chất vô định hình hoặc tinh thể, không màu, có tính quang học, vị chát Tannin tan trong nước tạo dung dịch keo và độ hoà tan thay đổi tuỳ thuộc vào mức độ polymer hoá Chúng tan tốt trong ethanol, acetone

- Tannin có tác dụng ức chế và diệt khuẩn, tác dụng cầm máu do làm se hệ mao mạch hay tác dụng làm giảm đau tại chỗ do làm giảm tác dụng ở đầu dây thần kinh trung ương Tannin còn chữa ngộ độc kim loại nặng và alkaloid do tạo tủa với chúng

1.1.4 Alkaloid

1.1.4.1 Khái quát về Alkaloid

Alkaloid là hợp chất chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng và có tính kiềm, thường gặp ở thực vật và động vật [8], [30] Đa số các alkaloid trong thành phần có chứa oxy

ở thể rắn (cafein), không có oxy thường ở thể lỏng dễ bay hơi (nicotin) Alkaloid thường không có màu, không mùi và vị đắng Một số alkaloid có màu vàng như berberin, palmitin Các alkaloid ở dạng base thường không tan trong nước [40]

N

N N

O H

O H

Alkaloid có tính kiềm yếu, do các mạch cacbon chứa nitơ quyết định Chúng

có thể liên kết với kim loại nặng tạo phức và phản ứng với một số thuốc thử đặc trưng như: Bouchardat (kết tủa màu nâu sẫm), Vans-Mayer (kết tủa trắng ánh vàng) hay Dragendroff (màu da cam, nâu đỏ)

1.1.4.2 Tác dụng sinh học

Alkaloid được hình thành từ các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như trao đổi protein Ở trong cây, alkaloid được coi như là chất dự trữ cho tổng hợp protein, các chất bảo vệ cây, tham gia vào sự chuyển hoá hydro ở các mức độ khác nhau, [8], [30]

Alkaloid được sử dụng nhiều trong công nghiệp dược, có rất nhiều thuốc chữa bệnh được sử dụng trong y học là các alkaloid tự nhiên hoặc nhân tạo, ví dụ như: atrophin, morphin, cocain,

1.1.5 Hợp chất coumarin

Coumarin là dẫn chất của α- purone có cấu trúc C6- C3 dị vòng chứa oxy Coumarin kết tinh không màu hoặc màu vàng nhạt, vị đắng, cay, có mùi thơm [30] Tính chất hóa học đặc trưng là dễ dàng kết hợp với đường glucose tạo thành glycosid dễ tan trong nước

Hiện nay chúng ta biết đến 1500 hợp chất coumarin khác nhau khi nghiên cứu 800 loài thực vật Ta cũng dễ dàng tìm thấy coumarin trong tất cả các bộ phận khác nhau của cây như: áo hạt, quả, hoa, rễ, lá, thân…Coumarin cũng có vai trò là một nhóm chất phòng thủ hóa học hữu hiệu chống lại vi khuẩn và tác nhân có hại của môi trường Tuy nhiên cho tới nay con đường tổng hợp coumarin vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ [38]

Coumarin Coumarin sử dụng trong đời sống hàng ngày như làm nước hoa, hương liệu, làm chất chống đông máu và chất diệt loài gặm nhấm Trong y học dẫn xuất của coumarin có tác dụng chống co thắt, giãn nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch, ngăn cản đột qụy [38] Một số coumarin khác có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, trừ giun sán và giảm đau

1.1.6 Terpen thực vật

Terpen là nhóm hydrocacbon thực vật lớn và đa dạng nhất, được hình thành

từ quá trình polyme hoá các tiểu đơn vị isopren 5-carbon (C5H8), có công thức cấu tạo chung là (C5H8)n Trong thực vật terpen được tổng hợp thông qua con đường trao đổi chất acetate/mevalonate hoặc con đường glyceraldehyde 3-phosphate/pyruvate Hầu hết các terpen đều thuộc nhóm hydrocarbon, tuy nhiên chúng có thể bị khử hoặc bị oxy hóa để hình thành các hợp chất terpenoid khác nhau như alcohol, ketone, acid và aldehyd Vì vậy, một số tác giả sử dụng thuật ngữ

“terpenes” để chỉ chung một nhóm lớn các hợp chất bao gồm cả terpen và