Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan

Trịnh Hồng Thái Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường của các bệnh nhân ung thư gan thông qua các điểm protein trên

Trang 1

Lê Lan Phương

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: PGS TS Trịnh Hồng Thái

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thư so với

mô gan bình thường của các bệnh nhân ung thư gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều Nhận dạng được một số protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thư gan) đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tương bệnh nhân ung thư gan Đưa ra kết quả và bà luận: tách triết Protein từ mô gan; phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều; nhận dạng Protein bằng phương pháp Maldi-Tof MS; thẩm tách miễn dịch-Western Blot hai chiều; đặc điểm, vai trò của các protein biểu hiện khác biệt

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Bệnh ung thư; Ung thư gan; Bệnh nhân;

Miễn dịch

Content

Ung thư gan hiện là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới và Việt Nam, đây là bệnh ung thư có tỷ lệ tử vong cao, hơn nữa, tỷ lệ mắc bệnh đang có xu hướng tăng lên Hiện nay, các phương pháp xét nghiệm lâm sàng như: sinh thiết gan, chụp cắt lớp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ảnh và xác định các chỉ thị sinh học như anpha fetoprotein là các “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán ung thư gan Tuy nhiên, các xét nghiệm này chỉ phát hiện được bệnh vào giai đoạn muộn làm giảm khả năng sống sót của bệnh nhân ung thư gan Nhu cầu đặt ra là phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học mới giúp chẩn đoán, phát hiện ung thư gan ở giai đoạn sớm

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm kiếm các chỉ thị ung thư gan sử dụng công cụ proteomics Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein nội bào có liên quan đến quá trình hình thành khối u, kích thích đáp ứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thể và nhiều kháng nguyên ung thư đã được xác định trong cơ thể bệnh nhân ung thư Vì thế, các tự kháng thể có thể được dùng để chẩn

Trang 2

đoán lâm sàng ung thư và dùng trong phân tích proteomics để nhận dạng các kháng nguyên liên quan đến khối u có khả năng liên quan đến sự chuyển dạng ác tính của tế bào Đây là hướng nghiên cứu mới nhằm tìm kiếm các chỉ thị sinh học ung thư liên quan đến đáp ứng miễn dịch

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan” nhằm mục đích: (a)

Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường của bệnh nhân ung thư gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều (b) Nhận dạng được một số protein khác biệt đặc trưng giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường (c) Xác định được protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thư gan) đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tương bệnh nhân ung thư gan

Đề tài được thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ GAN

Ung thư gan gồm hai dạng là ung thư gan nguyên phát và ung thư gan thứ phát (di căn) Ung thư gan nguyên phát là ung thư xuất phát từ các loại tế bào gan, chiếm trên 80% ung thư gan nguyên phát, vì vậy, trong phạm vi luận văn này, chúng tôi chỉ đề cập tới ung thư gan nguyên phát với dạng phổ biến nhất là ung thư tế bào biểu mô gan (Hepatocellular Carcinoma-HCC) thường gọi là ung thư gan

1.1.1 Phân loại ung thư gan nguyên phát

Dựa vào phân loại mô bệnh học và loại tế bào phát sinh ung thư, ung thư gan nguyên phát được phân thành các loại chính như sau:

- Ung thư tế bào biểu mô gan là dạng ung thư biểu mô hay gặp nhất trong ung thư

Trang 3

- Ung thư tế bào mạch là loại ung thư rất hiếm gặp, nó bắt nguồn từ mạch máu trong gan do gan tiếp xúc với các hóa chất công nghiệp

1.1.2 Nguyên nhân dẫn tới ung thư gan

Mặc dù vẫn còn nhiều tranh cãi về cơ chế chính xác dẫn đến ung thư gan, song các nghiên cứu đều chỉ ra rằng tác nhân gây ung thư là đa nhân tố và quá trình tiến triển thành ung thư rất phức tạp, phải trải qua nhiều bước Các yếu tố nguy cơ chính có thể tiến triển thành HCC bao gồm: các tác nhân gây bệnh như nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis

B virus - HBV), virus viêm gan C (Hepatitis C virus - HCV) dẫn tới viêm gan mạn tính;

xơ gan; các loại hóa chất như: rượu, aflatoxin B1, vinyl chlorid, asen hoặc các rối loạn trao đổi chất như nhiễm sắt ở mô, bệnh thiếu hụt α1 - antitrypsin Tuy rằng, các yếu tố nguy cơ có thể tác động đến tế bào gan theo các con đường khác nhau nhưng cuối cùng đều làm biến đổi di truyền và dẫn đến hình thành tế bào ung thư Ngoài ra, các yếu tố khác như tuổi, giới tính và chủng tộc cũng góp phần làm tăng nguy cơ bị ung thư gan

1.1.3 Các giai đoạn của ung thư gan

Căn cứ theo Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng Quốc tế bệnh ung thư (năm 1993), ung

thư gan được phân loại thông qua các chẩn đoán lâm sàng, sử dụng kỹ thuật hình ảnh để xác định kích cỡ khối u nguyên phát và tình trạng bị xâm lấn các mạch máu Ngoài cách phân giai đoạn theo kích thước u, hạch lympho, di căn (Tumor Node Metastasis - TNM), ung thư gan còn được phân loại thành 4 giai đoạn, gồm: giai đoạn I (T1, N0, M0), II (T2,

N0, M0), IIIA (T3, N0, M0)/B (T4, N0, M0)/C (T bất kỳ, N 1, M0) và giai đoạn IV (T bất kỳ,

N bất kỳ, M1)

1.1.4 Các phương pháp chẩn đoán ung thư gan

Hiện nay, phát hiện HCC chủ yếu dựa vào việc xét nghiệm máu để định lượng alpha fetoprotein (AFP) trong huyết thanh Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trưng cho ung thư gan vì nồng độ AFP có thể cũng tăng trong một số trường hợp khác Xét nghiệm AFP cũng không nhạy bởi có khoảng 15% - 30% bệnh nhân ung thư gan mà hàm lượng AFP vẫn không tăng, nhất là đối với các khối u gan nhỏ hơn 3cm Hàm lượng AFP cao có thể nghĩ đến ung thư gan nhưng không thể là yếu tố quyết định chắc chắn Vì thế, để chẩn đoán ung thư gan cần kết hợp xét nghiệm định lượng AFP và chẩn đoán hình ảnh bằng siêu

âm, chụp cắt lớp vi tính hay chụp cộng hưởng từ để có thể thấy được hình dạng, kích thước

và kết cấu của khối u, nhưng để chẩn đoán chính xác u lành tính hay ác tính thì nhất thiết

Trang 4

phải sinh thiết gan Tuy nhiên, sinh thiết gan dễ gây biến chứng Do đó, cần tìm kiếm các chỉ thị sinh học có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn để hỗ trợ cho AFP giúp chẩn đoán sớm ung thư gan

1.2 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ

Chỉ thị sinh học là các phân tử được tìm thấy trong máu, các loại dịch của cơ thể hoặc trong mô đặc trưng cho một quá trình sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý Chỉ thị sinh học có thể được dùng để xem xét đáp ứng của cơ thể đối với một phác đồ điều trị bệnh hoặc một trạng thái nhất định Các chỉ thị ung thư là những đại phân tử xuất hiện ở một bệnh ung thư, có nồng độ thay đổi theo chiều hướng tăng lên liên quan đến sự phát sinh và tăng trưởng của những khối u ác tính Chỉ thị ung thư là những chất do các tế bào hoặc mô ung thư tổng hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc được tạo ra từ các phản ứng của cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch

Đối với ung thư gan, chỉ thị ung thư được ứng dụng theo hai hướng chính sau: (a) Sàng lọc các nhóm nguy cơ cao để xác định được ung thư khi kích thước khối u còn nhỏ (< 3cm) để có liệu pháp điều trị hiệu quả (b) Xác nhận chẩn đoán ung thư ở những bệnh nhân

có khối u lớn đã được phát hiện nhờ chụp X quang

1.3 MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƯ

Khi nghiên cứu ung thư thực nghiệm, có nhiều bằng chứng thể hiện có sự kiểm

soát của hệ thống miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên ung thư, đồng thời, các nghiên cứu cũng chứng minh được sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu trong ung thư

Khi tế bào bình thường chuyển dạng ác tính thành tế bào ung thư, trong khối u xuất hiện các protein biểu hiện bất thường, bị đột biến hoặc biến đổi sau dịch mã, đây chính là các kháng nguyên liên quan đến ung thư

Hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung theo hướng nghiên cứu tìm kiếm các protein kháng nguyên liên quan đến khối u, các protein này kích thích sinh ra kháng thể trong huyết thanh, đây cũng là các dạng chỉ thị ung thư tiềm năng

Theo hướng nghiên cứu trên, trong đề tài này, chúng tôi đã kết hợp phân tích proteomics mô gan của bệnh nhân ung thư gan và thực hiện phản ứng miễn dịch Western blot hai chiều nhằm tìm ra các protein có biểu hiện khác biệt, đặc biệt là các protein kháng nguyên phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tương của bệnh nhân ung

Trang 5

thư gan, đây là các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học giúp chẩn đoán sớm ung thư gan

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Mẫu nghiên cứu là mô gan tại vị trí có khối u của bệnh nhân HCC và huyết tương của chính bệnh nhân đó Mẫu đối chứng là mô gan cách ít nhất 5cm trên cùng lá gan tại

vị trí không có khối u

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các trạng thiết bị, hóa chất, dụng cụ của Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc Phương pháp nghiên cứu được mô tả trong các hình dưới đây:

Hình 1 Quy trình chiết protein từ mô gan

Trang 6

Hình 2 Quy trình phân tích proteomics mô gan

Hình 3 Quy trình thẩm tách miễn dịch Western blot hai chiều

Trang 7

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN

Sử dụng dung dịch PBS pH7,4 và đệm phá tế bào (Lysis) chúng tôi thu được 5 phân đoạn dịch chiết protein của mô gan Hình ảnh điện di cho thấy các phân đoạn này có

độ sạch khác nhau, song đều chứa nhiều protein thể hiện qua số lượng băng protein trên mỗi giếng nhiều, trải dọc theo giếng điện di

Các phân đoạn dịch chiết chưa sạch sẽ được tủa để loại các thành phần phi protein, các phân đoạn dịch chiết được trộn lại với nhau thành dịch chiết protein mô gan và tiến hành điện di hai chiều

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

A Dịch chiết mô gan bình thường B Dịch chiết mô gan ung thư

Hình 4 Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thường và mô

gan ung thư trên gel polyacrylamide 10% có SDS

(Giếng 1: Dịch chiết PBS1; Giếng 2: Dịch chiết PBS2; Giếng 3: Dịch chiết Lysis1;

Giếng 4: Dịch chiết Lysis2; Giếng 5: Dịch chiết Lysis3)

3.2 PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU

3.2.1 Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều

Trước tiên, protein mô gan được phân tách theo pI trên thanh strip dài 17cm, pH 3-10 và điện di chiều 2 để phân tách theo khối lượng phân tử trên bản gel polyacrylamide 10% có SDS

Hình ảnh bản gel 2DE mô gan bình thường và mô gan ung thư cho thấy, các protein

đã được phân tách tương ứng với các spot trên bản gel Tuy hệ protein mô gan rất phức tạp, song hàm lượng của các protien trong gan khá đồng đều, do đó, các protein được phân tách

Trang 8

khá tốt trên bản gel 2-DE Số lượng các spot lớn, kích thước khá đồng đều, song phần lớn các spot tập trung ở vùng giữa cuả mỗi bản gel Do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành diện di, phân tách protein trong khoảng pH hẹp hơn

A - Mô gan bình thường B - Mô gan ung thư

Hình 5 Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều

Chiều 1: Điện di đẳng điện sử dụng thanh IPG strip dài 17cm, pH 3 - 10 (A1 và B1); IPG strip dài 7cm, pH 4 - 7 (A2 và B2); Chiều 2: Điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 10% Bước đầu sử dụng phần mềm chuyên dụng phân tích hình ảnh bản gel điện di hai

chiều - Phoretix, chúng tôi đã xác định được tổng số spot được phân tách trên các bản gel

8261 272 spot 171 spot 75 spot 136 spot

Trang 9

3.2.2 Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều

Tiếp tục sử dụng phần mềm phoretix để phân tích sự biểu hiện của các spot protein trên bản gel điện di Phần mềm này giúp xác định các spot tương ứng trên các cặp bản gel của từng bệnh nhân, đưa ra giá trị cường độ khối trung bình của các spot (các spot tương ứng có giá trị này chênh lệch từ 1 đến 1,5 lần mới được tính là khác biệt) Ngoài ra, phần mềm còn đưa ra hình ảnh ba chiều (3-D) của các spot, trong đó: độ lớn của spot được thể hiện bằng bề rộng của đáy spot trên hình 3-D; độ đậm của spot được thể hiện bằng chiều cao của spot tính từ đáy lên đỉnh; độ sắc nét của spot nhuộm màu coomasie được thể hiện bằng độ nhọn của spot ấy trên hình ảnh 3-D Đây là tiêu chí để đánh giá biểu hiện khác biệt của các spot trên các cặp bản gel gồm: spot tăng hoặc giảm ở bản gel mô ung thư so với bản gel mô BT; Spot chỉ xuất hiện rõ rệt ở một trong hai bản gel

Khi phân tích độc lập từng cặp bản gel, chúng tôi đã xác định được các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường trên từng cặp bản gel 2-DE phân tách protein trong khoảng pH 3 - 10, dài 17cm (bảng 6) và phân tách

protein trong khoảng pH 4 - 7, dài 7cm (bảng 7)

Trang 10

Bảng 2 Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình

thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10

Bảng 3 Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình

thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7

Ghi chú: Spot protein biểu hiện tăng (↑); spot protein biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mẫu ung thư

so với bản gel mô bình thường; spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mẫu ung thư (+); xuất

hiện mờ nhạt hoặc không thấy trên bản gel mẫu mô ung thư (-)

Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư so với bản gel mô gan bình thường của cả 6 bệnh nhân HCC, chúng tôi nhận thấy có 52 spot khác biệt rõ ràng, xuất hiện trên các bản gel mô gan ung thư so với mô gan bình thường, bao gồm: 6 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thư; 5 spot chỉ thấy xuất hiện

rõ rệt ở bản gel mô đối chứng; 23 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thư; 18 spot biểu hiện giảm ở bản gel mô ung thư

Khi so sánh hình ảnh các bản gel điện di thu được trong nghiên cứu này với hình ảnh bản gel mô gan người trong cơ sở dữ liệu SWISS-2D-PAGE, chúng tôi nhận dạng

Trang 11

được 13 protein tương ứng với 13 spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư

so với bản gel mô gan bình thường (bảng 8)

Bảng 4 Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thư so với

mô gan bình thường được xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL

STT Protein

Yếu tố nhận dạng protein

Cường độ khối trung bình Biểu

hiện

ĐC HCC

1 Alpha-1-antitrypsin (Alpha-1-protease

2 Protein disulfide-isomerase (PDIA1) P07237 0,738 0,078 ↓

3 Cellular tumor antigen p53 (p53) P04637 0,114 − −

4 Beta-actin, cytoplasmic 1 (ACTB) P60709 0,003 4,599 +

11 UMP-CMP kinase (KYC) P30085 0,306 0,014 ↓

12 Superoxide dismutase [Cu-Zn] (SODC) P00441 4,524 1,467 ↓

13 Glutamate dehydrogenase 1, mitochondrial

Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; -, protein không biểu hiện ở

mẫu bệnh; +, protein không biểu hiện ở mẫu mô bình thường; ĐC, bản gel mô gan bình thường; HCC, bản gel mô gan ung thư

Định dạng
Số trang	23
Dung lượng	1,19 MB