Nghiên cứu công nghệ sản xuất dấm bằng phương pháp lên men chìm sử dụng phụ phẩm trong sản xuất rượu gạo

và đặc biệt là các chất thơm; thường được tận dụng làm thức ăn chăn nuôi, men bánh mỳ, men gia súc,… Nghiên cứu tận thu nguồn phụ phẩm trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm nói chung

ĐỖ THỊ KIM LOAN

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT DẤM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM SỬ DỤNG PHỤ

PHẨM TRONG SẢN XUẤT RƯỢU GẠO

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học thực phẩm

Mã số: 62.54.02.05

Hà Nội - 2016

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Nguyễn Thị Việt Anh

2 PGS.TS Lê Đức Mạnh

Phản biện 1 PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú

Phản biện 2 TS Nguyễn Quang Hào

Phản biện 3 TS Phạm Hương Sơn

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp Viện họp tại Viện Công nghiệp thực phẩm

Vào hồi …… giờ, ngày …… tháng …… năm……

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia

Thư viện Viện Công nghiệp thực phẩm

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Dấm là một loại gia vị truyền thống dùng trong chế biến các món ăn ở nhiều nước trên thế giới Ngày nay, dấm được sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau và được sử dụng rất phổ biến trong công nghiệp thực phẩm với mức tiêu thụ ước tính trên toàn thế giới lên tới 3,2 tỉ lít dấm chứa 5% acid acetic mỗi năm Trong đó, dấm gạo là loại phổ thông, có hương vị đặc trưng, phù hợp với khẩu vị của nhiều quốc gia, dân tộc trên thế giới, đặc biệt với văn hóa ẩm thực của người Phương Đông Ở Việt Nam, dấm chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp lên men bề mặt và một phần được pha chế từ acid acetic tinh khiết nên hiệu suất lên men không cao và tiềm ẩn nhiều nguy cơ mất an toàn thực phẩm

Bên cạnh nguồn nguyên liệu quả, hạt ngũ cốc, dấm còn được sản xuất từ một số loại phụ phẩm như: rượu vang chua, hành đỏ thứ phẩm, mật ong thứ phẩm,… Trong đó, nguồn dịch bã thải sau quá trình chưng cất rượu gạo còn sót một số thành phần có giá trị như: ethanol, đường, tinh bột, acid amin, vitamin, chất khoáng,… và đặc biệt là các chất thơm; thường được tận dụng làm thức ăn chăn nuôi, men bánh mỳ, men gia súc,… Nghiên cứu tận thu nguồn phụ phẩm trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm nói chung và tận dụng dịch bã rượu từ qui trình sản xuất rượu gạo nói riêng để lên men dấm

có ý nghĩa thực tiễn, vừa đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường về dấm, vừa giảm giá thành sản phẩm và góp phần giảm thiểu

ô nhiễm môi trường

Đề tài luận án: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất dấm bằng phương pháp lên men chìm sử dụng phụ phẩm trong sản xuất rượu gạo” nhằm khai thác, tận dụng nguồn phụ phẩm dịch bã rượu

tạo ra sản phẩm dấm an toàn, đáp ứng yêu cầu của người tiêu dùng,

góp phần nâng cao giá trị, giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường từ các qui trình sản xuất rượu gạo lên men

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn acetic có khả năng sinh tổng hợp acid cao và phù hợp với môi trường lên men sử dụng dịch bã rượu

- Cải biến vi khuẩn acetic bằng kỹ thuật tạo đột biến ngẫu nhiên, nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp acid acetic, ứng dụng trong lên men dấm nồng độ cao

- Xây dựng qui trình lên men dấm nồng độ acid acetic cao từ môi trường bổ sung dịch bã rượu bởi chủng vi khuẩn acetic đột biến, theo phương pháp chìm, qui mô phòng thí nghiệm Sản phẩm dấm lên men tạo thành có sự kế thừa và phát triển nguồn chất thơm tự nhiên

từ dịch bã rượu, đạt chất lượng tốt, đảm bảo vệ sinh an toàn và đáp ứng thị hiếu của người tiêu dùng

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

3.1 Ý nghĩa khoa học

Luận án đã đưa ra cơ sở khoa học về việc sử dụng phụ phẩm trong sản xuất rượu gạo, kết hợp với kỹ thuật sinh học trong việc cải biến chủng vi khuẩn acetic có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao, ứng dụng trong sản xuất dấm an toàn, đáp ứng yêu cầu của người tiêu dùng Cụ thể như sau:

- Đã phân tích, đánh giá thành phần của dịch bã rượu tạo cơ sở cho việc tận dụng làm nguyên liệu cho sản xuất dấm

- Đã tuyển chọn được chủng vi sinh vật có khả năng lên men dấm từ môi trường bổ sung dịch bã rượu và cải biến được chủng vi khuẩn acetic mới có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao bằng phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên

- Xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất dấm từ dịch bã rượu đạt nồng độ acid acetic và hiệu suất lên men cao theo phương pháp lên men chìm bởi chủng vi khuẩn acetic đột biến

4 Những điểm mới của luận án

- Từ nguồn mẫu thu thập ở Việt Nam và Nhật Bản đã phân lập, tuyển chọn, định tên được 04 chủng vi khuẩn acetic có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao, đạt trên 8%w/w Bằng kỹ thuật đột biến sử dụng

hóa chất NTG và tia UV đã cải biến được chủng K saccharivorans

A2 NV120.3 có khả năng lên men acid acetic đạt trên 10%w/w

- Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về công nghệ sản xuất dấm theo phương pháp lên men chìm sử dụng phụ phẩm của sản xuất rượu gạo từ khâu phân lập, tuyển chọn, định tên chủng, cải biến nâng cao hoạt tính lên men tạo acid acetic của chủng giống đến điều kiện lên men, thu nhận sản phẩm, phân tích thành phần hương thơm

và chất lượng của sản phẩm dấm tạo thành

5 Kết cấu của luận án

Luận án gồm 140 trang, 4 chương, 38 bảng số liệu, 39 hình và đồ thị, 95 tài liệu tham khảo và 5 công trình có liên quan tới luận án đã được công bố

đó, dấm gạo là loại dấm phổ thông, có hương vị đặc trưng và phù hợp với khẩu vị của người tiêu dùng ở nhiều quốc gia, đặc biệt với văn hóa ẩm thực của người Châu Á

Quá trình lên men trong sản xuất dấm được thực hiện theo các phương pháp: lên men bề mặt, dòng chảy nhỏ giọt và lên men chìm Trong đó, phương pháp lên men chìm là một giải pháp công nghệ tiên tiến với nhiều ưu điểm nổi trội, được áp dụng phổ biến trong sản xuất dấm ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là trong sản xuất dấm nồng độ acid acetic cao Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay, sản xuất dấm theo phương pháp lên men chìm còn nhiều hạn chế, mới đề cập đến trong một số nghiên cứu sơ bộ và sản xuất thử nghiệm qui mô nhỏ Duy có nhà máy 100% vốn nước ngoài của hãng Ajinomoto sản xuất dấm gạo lên men theo phương pháp chìm, qui mô công nghiệp trên hệ thống dây chuyền thiết bị của Nhật

Bên cạnh nguồn nguyên liệu quả và hạt ngũ cốc, sản xuất dấm từ nguồn phụ phẩm không phải là vấn đề mới, được một số tác giả trên thế giới đề cập đến như: dấm hành đỏ ở Nhật, dấm dừa ở Thái Lan, dấm mật ong ở Tây Ban Nha,… Tuy nhiên, việc tận dụng phụ phẩm dịch bã rượu để lên men dấm chưa có nghiên cứu nào công bố Đặc biệt, dấm lên men sử dụng dịch bã rượu không những tận dụng được các thành phần dinh dưỡng có giá trị mà còn có khả năng kế thừa và phát triển nguồn chất thơm tự nhiên của dịch bã rượu

Các nghiên cứu về phân lập, tuyển chọn vi khuẩn acetic (AAB) trên thế giới nhằm lựa chọn các chủng có đặc tính công nghệ tốt như: khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao, chịu được nồng độ ethanol, chịu được acid acetic, chịu nhiệt và lên men ở nhiệt độ cao ứng dụng

có hiệu quả trong sản xuất dấm Ở Việt Nam, vấn đề này đã được một số tác giả nghiên cứu nhưng số lượng còn hạn chế Việc đánh giá, tuyển chọn các chủng AAB đáp ứng được tiêu chí công nghệ của qui trình sản xuất dấm ít được quan tâm Đặc biệt, việc tuyển chọn chủng AAB phù hợp với quá trình lên men dấm sử dụng phụ phẩm dịch bã rượu chưa có nghiên cứu trong và ngoài nước nào công bố Bên cạnh việc phân lập, tuyển chọn AAB có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao và phù hợp với quá trình lên men dấm trong điều kiện khắc nghiệt, ứng dụng vi sinh vật đột biến theo phương pháp truyền thống trong chế biến thực phẩm là hướng nghiên cứu mới, đã đạt được những thành công nhất định Với mục đích chọn lọc nhanh các dòng đột biến có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao và phù hợp lên men dấm trên môi trường sử dụng dịch bã rượu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu cải biến chủng AAB bằng kỹ thuật đột biến sử dụng hóa chất NTG, tia UV và kết hợp với tạo áp lực môi trường acid acetic Trên cơ sở đó, xây dựng qui trình công nghệ lên men dấm từ nguồn nguyên liệu dịch bã rượu bởi chủng vi khuẩn acetic đột biến, thu được sản phẩm dấm an toàn và có nồng độ acid cao

Vì vậy, “Nghiên cứu công nghệ sản xuất dấm bằng phương pháp lên men chìm sử dụng phụ phẩm trong sản xuất rượu gạo”

với mục tiêu phân lập, tuyển chọn, định tên, cải biến vi khuẩn acetic, lên men dấm nồng độ cao trên môi trường sử dụng phụ phẩm dịch bã rượu theo phương pháp chìm là nghiên cứu cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

+ Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn acetic: dịch dấm các loại, dấm bỗng,

dịch thải nhà máy rượu, quả chín lên men, thu thập từ một số địa phương trong nước và từ Nhật Bản

+ Dịch bã rượu và mẫu dấm đối chứng: dịch bã rượu thu nhận từ qui

trình sản xuất rượu gạo lên men qui mô công nghiệp với công suất 1.500 kg/mẻ, tại Viện Công nghiệp Thực phẩm Một số mẫu dấm nếp hoa vàng, dấm Tâm Đức loại chai thủy tinh, dấm gạo lên men Ajinomoto loại chai PET trên thị trường được sử dụng để so sánh

+ Hóa chất: các hóa chất môi trường, hóa chất phân tích và hóa chất

sinh học phân tử đạt tiêu chuẩn sử dụng, có nguồn gốc từ Việt Nam, Trung Quốc, Pháp, Mỹ

+ Thiết bị: các thiết bị thí nghiệm thông thường, máy quang phổ

UV-VIS T80, máy cất đạm Vapodest 10s-Gerhardt, hệ thống HPLC AGILENT 1200 series, hệ thống GC-MS Shimadzu, GC-6890 Plus- hãng Agilent, máy đọc trình tự gen, hệ thống thiết bị lên men Minifor 1 lít của hãng Lambda- Thụy Sỹ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử

- Phân lập AAB trên môi trường GYC: glucose 1%, cao nấm men 1%, ethanol 3%, CaCO3 2% và agar 1,5% theo phương pháp pha loãng thông thường

- Sàng lọc AAB trên môi trường YEC (hoặc YEB): cao nấm men 1%, ethanol 4%, CaCO3 2% (hoặc Bromecresol green 0,002%) và agar 1,5% theo kiểu cấy chấm điểm và đục lỗ

- Tuyển chọn AAB có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao trên môi trường cơ bản YGEA (1% cao nấm men, 1% glucose, 6%

ethanol và 0,6% acid acetic) và trên môi trường lên men sử dụng 20% dịch bã rượu, bổ sung cao nấm men 1%, saccarose 1%, bổ sung ethanol đạt 6%Vol và acid acetic đạt 0,6%

- Định tên AAB dựa vào trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA

- Phương pháp tạo đột biến AAB bằng hóa chất NTG và NTG kết hợp với tia UV

- Phương pháp xác định một số đặc tính cơ bản của AAB

- Xác định hàm lượng acid tổng số bằng chuẩn độ acid-bazơ

- Xác định tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng acid

- Xác định hàm lượng nitơ tổng số theo AOAC 2001.11

- Xác định hàm lượng aldehyde theo TCVN 1051-71

2.2.5 Phương pháp phân tích cảm quan

Theo phép thử cho điểm thị hiếu với thang đo 9 điểm

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu thành phần dịch bã thải từ qui trình sản xuất rượu gạo

3.1.1 Phân tích một số thành phần cơ bản của dịch bã rượu

Đã xác định được một số thành phần dinh dưỡng có giá trị như: tinh bột 1,78±0,14%; protein thô 3,52±0,43%; ethanol 0,26±0,08%; đường có khả năng lên men 3,27±0,62 g/l bao gồm: saccarose 1,36 ± 0,74 g/l; glucose 1,09 ± 0,14 g/l; maltose 0,58 ± 0,15 g/l; maltotriose 0,25± 0,12 g/l;… Bên cạnh đó, một số chỉ tiêu liên quan đến vấn đề

vệ sinh và an toàn thực phẩm của dịch bã rượu cũng được xác định: hàm lượng aldehyde 30,8± 2,7 mg/l; thành phần methanol không tìm thấy; tổng số vi sinh vật hiếu khí 7,4×104 CFU/ml, tổng số nấm men-nấm mốc 1,6×104 CFU/ml

3.1.2 Phân tích thành phần hợp chất bay hơi của dịch bã

Kết quả phân tích GC-MS cho thấy, thành phần hợp chất bay hơi của dịch bã rượu bao gồm: acid acetic, ethyl acetate, benzeneethanol, ethyl lactate, 2-3-Butanediol, 1-ethoxy-Propane, 2-methyl-Propanoic acid, ethyl succinate, caffeine, propanoic acid, ….; chúng có vai trò quan trọng trong tạo hương thơm của dịch bã rượu Lên men dấm sử dụng phụ phẩm từ qui trình sản xuất rượu gạo không những tận dụng được các thành phần dinh dưỡng có giá trị mà còn có khả năng kế thừa và phát triển nguồn chất thơm tự nhiên từ quá trình lên men rượu gạo

3.2 Phân lập và tuyển chọn AAB cho lên men dấm từ môi trường sử dụng dịch bã rượu

3.2.3 Tuyển chọn AAB sinh tổng hợp acid acetic cao

Từ 12 chủng AAB sàng lọc, đã tuyển chọn được 04 chủng AAB

có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao trên môi trường YGEA theo kiểu lên men lắc, bổ sung dần ethanol đến 9%Vol.; cụ thể như

sau: chủng A2 đạt 8,34±0,05 %w/w acid acetic; chủng A4 đạt

8,12±0,06 % w/w acid acetic; chủng M3 đạt 8,00±0,07 %w/w acid acetic; chủng M5 đạt 8,38±0,03 % w/w acid acetic

3.2.4 Định tên chủng AAB có khả năng sinh tổng hợp acid cao

Đã định tên đến cấp độ loài 04 chủng AAB có khả năng sinh tổng

hợp acid acetic cao: K saccharivorans A2, K saccharivorans A4, K

europaeus M3 và A pomorum M5

3.2.5 Một số đặc điểm của các chủng AAB đã tuyển chọn

- Đã xác định một số đặc điểm hình thái tế bào và khuẩn lạc, đặc tính

sinh lí, sinh hóa của 04 chủng đã tuyển chọn: K saccharivorans A2,

K saccharivorans A4, K europaeus M3 và A pomorum M5

- Đã đánh giá khả năng chịu nồng độ ethanol và acid acetic của 04

chủng AAB: chủng K saccharivorans A2 có dấu hiệu phát triển yếu

trên môi trường chứa 12% (Vol.) ethanol và môi trường chứa 10%

(w/w) acid acetic; K europaeus M3 có khả năng chịu ethanol đến 12% (Vol.) nhưng không chịu được acid đến 8% (w/w); chủng K

saccharivorans A4 và A pomorum M5 chỉ chịu được nồng độ

ethanol đến 10%(Vol.), nồng độ acid acetic đến 8%(w/w)

- Kết quả đánh giá khả năng chịu nhiệt và sinh tổng hợp acid acetic ở các nhiệt độ khác nhau cho thấy: 04 chủng AAB đều phát triển tốt và sinh tổng hợp acid acetic cao nhất ở 30°C; ở nhiệt độ trên 35°C, khả

năng lên men acid acetic của chủng K saccharivorans A4 thấp hơn

03 chùng còn lại; ở nhiệt độ 40°C-45°C, các chủng phát triến yếu hoặc không phát triển được

3.2.6 Lựa chọn chủng vi khuẩn acetic phù hợp với quá trình lên men dấm gạo trên môi trường sử dụng dịch bã rượu

- Từ 04 chủng AAB, đã tuyển chọn được chủng K saccharivorans

A2 có khả năng sinh acid acetic cao và phù hợp với quá trình lên men dấm trên môi trường sử dụng dịch bã rượu: đạt 5,64±0,25% (w/w) acid acetic và hiệu suất lên men 84, 42±3,77% ở 30°C

- Đã xác định được điều kiện thích hợp nhất cho quá trình lên men

dấm sử dụng dịch bã rượu bởi chủng K saccharivorans A2: nồng độ

ethanol ban đầu đạt 6 % (Vol.), nồng độ acid đầu đạt 6 g/l (theo acid acetic), nồng độ cao nấm men bổ sung 0,75g/l, nhiệt độ 30oC, thời gian lên men 7 ngày, lắc 150v/ph trong bình tam giác 1000ml, dấm

có hàm lượng acid acetic 5,90±0,12 %(w/w)

- Đã cải thiện qui trình lên men dấm từ tận dụng dịch bã rượu trên thiết bị Minifor của Lambda theo phương pháp bổ sung dần ethanol

đến 9% Vol bởi chủng K saccharivorans A2; với điều kiện ban đầu

đã lựa chọn, quá trình lên men dấm đạt nồng độ acid acetic trung bình 8,11±0,23% (w/w) với hiệu suất lên men 82,19±2,28% và thời gian lên men 5 ngày (hình 3.11)

- Thành phần một số hợp chất bay hơi chính liên quan đến chất lượng hương thơm của dấm gạo lên men sử dụng dịch bã rượu bởi

chủng K saccharivorans A2 đã được xác định, bao gồm:

phenylethyl alcohol, hexadecanoic acid ethyl ester, butanoic acid ethyl ester, phenylethyl acetate,…

Hình 3.11 Sự biến đổi nồng độ ethanol và acid acetic trong quá trình lên

men dấm

3.3 Cải biến AAB bằng kỹ thuật đột biến ngẫu nhiên

3.3.1.Khảo sát ảnh hưởng của NTG, UV đến tỉ lệ tế bào chết

Kết quả khảo sát đã xác định được các mốc thời gian cho xử lí tạo đột biến bởi NTG là 40, 60, 80, 100, 120, 140 phút; xử lí tạo đột biến kết hợp NTG và UV là 60, 80, 100, 120 phút với tỉ lệ tế bào chết cao

3.3.2 Đánh giá khả năng sinh acid của các dòng đột biến

- Sau quá trình xử lí đột biến bằng hóa chất NTG, đã sàng lọc và lựa

chọn được dòng đột biến K saccharivorans A2 N140.7 có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao hơn chủng gốc K saccharivorans A2

17% trên môi trường YGEA

- Kết quả xử lí đột biến tích lũy bởi NTG và tia UV đối với chủng K

saccharivorans A2 N140.7 đã sàng lọc được dòng đột biến K saccharivorans A2 NV120.3 có khả năng lên men acid acetic cao

trên môi trường YGEA, tăng 16 % so với K saccharivorans A2 N140.7 và tăng 26% so với chủng K saccharivorans A2

3.3.3 Một số đặc tính của chủng đột biến

6,00

4,25

2,80 3,30

1,80 2,30

1,00 1,50

0,60 1,10

0,40 0,90

0,30

0,80 0,25 0,00 0,60

2,10 3,48 4,92 5,97 6,78 7,267,26 7,77 8,10

8,28

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00

Nồng độ acid (% acid acetic)