Nghiên cứu phân lập và khả năng lên men của một số chủng vi sinh trong môi trường có bổ sung tảo xoắn

Phân lập chủng vỉ sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina spp....30 3.1.1.. Phân lập chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men tạo đồ uổng tr

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2

HÀ ÁNH NGỌC

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢ NĂNG LÊN MEN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẶT

TRONG MỒI TRƯỜNG CÓ BỔ SUNG

TẢO XOẮN (SPIRULINA sppO

Chuyên ngành: Sinh thái học

Mã số: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC sĩ SINH HỌC Người hướng dẫn

khoa học: PGS TS Đỉnh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2016

được những lời chi bảo, hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị em và các bạn Với lòng kinh trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lỏng biết ơn tới:

PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung - Người đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận vãn.

Tôi xỉn chân thành cảm ơn cán bộ phòng Vi sinh trường ĐHSP Hà Nội 2 Bên cạnh đổ, Ban giảm hiệu, Phòng sau đại học, các Phòng, Ban trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo các điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình làm việc.

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã giúp đỡ tôi trong quá trình chụp ảnh mẫu để hoàn thành nghiên cứu của mình.

Cảm ơn cán bộ Sở khoa học công nghệ - Tỉnh Vĩnh Phúc đã giúp đỡ tôi phân tích mẫu hoàn thành luận văn của mình.

Cùng với đó là sự biết ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, bạn bè

đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.

Hà Nội, tháng 08 năm 2016

Học viên

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung Luận văn này không có sự trùng lặp với các đề tài khác

Hà Nội, tháng 08 năm 2016

Học viên

Hà Ánh Ngọc

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiền cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vỉ nghiền cứu 3

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

6 Đóng góp mói của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.1 Sơ lược về tảo xoan (Spỉruỉỉna spp.) 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học của tảo xoan (Spỉruỉỉna spp.) 4

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng và công dụng của tảo xoắn (Spirutína spp.) 6

1.1.4 Tình hình nghiên cứu của tảo xoan (Spirulina spp.) hiện nay 8

1.2 Vỉ sinh vật và quá trình lên men tạo đồ uống có bỗ sung tảo xoắn (Spiruỉina spp.) 11

1.2.1 Vi khuẩn lactic 11

Cơ chế của quá trình lên men lactic 12

1.2.2 Vỉ khuẩn acetic 13

1.2.3 Nấm men 13

1.2.4 Đặc điểm sinh lỷ, sinh hóa của nhóm vi sinh vật lên men tạo đồ uổng có bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 15

1.3 ứng dụng ịSpỉrulỉna spp.) trong thực phẩm, xử lý môi trường, y học và mỹ phẩm 20

1.3.1 ửng dụng trong thực phẩm 20

1.3.2 ứng dụng trong xử lý môi trường 21

1.3.3 ứng dụng trong y học 22

1.3.4 ứng dụng trong mỹ phẩm 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.2 H óa chất, dụng cụ thỉ nghiệm 23

2.1.3 Các loại môi trường 23

2.2 Phưong pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp vỉ sinh 24

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 26

2.2.2.8 Xác định độ cồn [43] 28

2.2.3 Ph ương pháp thong kê và xử lỷ kết quả [18] 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phân lập chủng vỉ sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 30

3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men tạo đồ uổng trong môi trường bổ sung tảo xoan (Spirulina spp.) 30

3.1.2 Phân lập chủng vi khuẩn acetic có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulỉna spp.) 32

3.1.3 Phân lập chủng nẩm men có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường có bổ sung tảo xoắn tảo xoan (Spirulina spp.) 33

3.2 Tuỵển chọn chủng vỉ sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường có bỗ sung tảo xoắn (Spỉrulỉna spp.) 35

3.2.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spỉrulỉna spp.) 35

3.2.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn acetic có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường bồ sung tảo xoắn (Spỉrulỉna spp.) 39

3.2.3 Tuyển chọn chủng nam men cỏ khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường có bồ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 44

hả năng chịu cồn của các chủng nấm men 45

tạo đồ uổng trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 47

3.3 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men chế tạo đồ uống trong môi trường bỗ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 48

3.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trình lên men chế tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 48

3.3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ hữu cơ tới quá trình lên men chế tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoan (Spỉrulỉna spp.) 50

3.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng KH 2 P0 4 tới quá trình lên men chế tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulỉna spp.) 52

3.3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng MgS0 4 7H 2 0 tới quá trình lên men chế tạo đồ uống có bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 54

3.4 Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến quá trình lên men chế tạo đồ uổng trong môi trường có bổ sung tảo xoắn (Spimlina spp.) 56

3.4.1 Ảnh hưởng củapH ban đầu 56

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men 58

3.5 ứng dụng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 60

3.5.1 Lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoan (Spirulina spp.) 61

3.5.2 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 62

3.5.3 Đánh giá cảm quan sản phẩm 66

KẾT LUẬN 69

1 Kết luận 69

• 2 Kiến nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

Hình 3.1 Ảnh chụp tế bào vi khuẩn lactic trên kính hiển vi quang học X 1000 lần 31

Hình 3.2 Ảnh chụp tế bào vi khuẩn lactic trên kính hiển vi điện tử X 10000 lần 32

Hình 3.3 Te bào vi khuẩn acetic trên kính hiển vi quang học X 1000 lần 33

Hình 3.4 Te bào nấm men trên kính hiển vi quang học X 1000 lần 34

Hình 3.5 Ảnh chụp té bào nấm men trên kính hiển vi điện tử X 10000 lần 34

Hình 3.6 Chuyển hoá ethanol thảnh acid acetic của các mẫu vi khuẩn acetic 40

Hình 3.7 Hoạt tính catalase của vi khuẩn acetic 41

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào ở các mức pH khác nhau trong môi trường lên men của các nhóm vi sinh vật tuyển chọn 58

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn số lượng té bào ở các mức nhiệt độ khác nhau trong môi trường lên men của các nhóm vi sinh vật đã tuyển chọn 60

Hình 3.10 Ba mẫu lên men tạo nước giải khát có bổ sung tảo xoắn cSpirulinaspp.) 62

Hình 3.11 Kết quả kiểm tra vi sinh đánh giá sản phẩm nước giải khát 63

Hình 3.12 Kết quả đánh giá sản phẩm nước giải khát trước khi lên men 64

Hình 3.13 Ket quả đánh giá sản phẩm nước giải khát sau khi lên men 65

Hình 3.14 Kiểm tra tổng số lợi khuẩn có trong nước giải khát lên men 66

Hình 3.15 Quy trình lên men tạo sản phẩm nước giải khát có bổ sung tảo xoắn (,Spirulinaspp.) 68

Bảng 1.1 Thành phần của tảo xoắn (Spiruỉina spp.) 6

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái và kích thước của vi khuẩn acetictrong các mẫu phân lập 32

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái và kích thước của nấm mentrong các mẫu phân lập 33

Bảng 3.4 Độ pH, hàm lượng axit của chủng vi khuẩn lactic 35

Bảng 3.6 Ket quả thử nghiệm hoạt tính catalase của các chủng vi khuẩn lactic 36

Bảng 3.7 Khả năng sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn lactic 37

Bảng 3.8 Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn lactic 37

Bảng 3.9 Ket quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn 39

Bảng 3.10 Đặc điểm sinh hóa của 6 chủng vi khuẩn acetic 43

Bảng 3.11 Hàm lượng khí C02 giải phóng sau 7 ngày lên men của nấmmen 44

Bảng 3.12 Khả năng lên men ở các nồng độ cồn khác nhaucủa 9chủngnấm men 45

Bảng 3.13 Khả năng két lắng khác nhau của nấm men 46

Bảng 3.14 Khả năng lên men các loại đường 48

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của hàm lượng đường sacarose đến quá trình lên men của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 49

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ hữu cơ đến quá trình lên men củacác chủng vi sinh vật tuyển chọn 51

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2P04đến quá trình lên men của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 53

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của hàm lượng MgS04.7H20 đến quá trình lên men của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 55 Bảng 3.19 Ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men củacác chủng vi sinh vật tuyển

chọn

sinh vật tuyển chọn 59Bảng 3.21 Đánh giá chất lượng sản phẩm nước giải khátbằng phương pháp

cảm quan 67

BẢNG CHỮ CÁI VIÉT TẮT TRONG LUẬN VĂN

1 TCN : Trước công nguyên

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Cùng với sự phát triển ngày càng cao của xã hội thì nghành công nghiệp sảnxuất nước giải khát cũng phát triển mạnh mẽ Với xu hướng của thời đại các sản phẩmnước nước giải khát lên men được làm từ các nguồn nguyên liệu giá trị dinh dưỡng caongày càng được ưa chuộng Hiện nay trên thị trường xuất hiện nhiều loại

nước giải khát với nhiều hương vị khác nhau (nho, mận, táo, ) Tuy nhiên, trênthực té thì hầu như không có các sản phẩm nước giải khát làm từ tảo xoắn

Tảo xoắn là một loại vi tảo dạng sợi xoắn màu xanh lục Tảo xoắn (Spiruỉinaspp.) đã được nghiên cứu từ nhiều năm nay Chúng có những đặc tính ưu việt và giá trịdinh dưỡng cao Các nhả khoa học trên thế giới đã coi tảo (Spỉrulina spp.) là sinh vật cóích cho loài người Tổ chức Y tế thế giới (WHO/OMS) công nhận tảo cSpiruỉina spp.)

là thực phẩm bảo vệ sức khỏe tốt nhất của loài người trong thế kỉ 21 Cơ quan quản líthực phẩm và dược phẩm Hoa Kì (FDA) công nhận nó là một trong những nguồnprotein tốt nhất [17, 36, 39]

Trên thế giới, sản phẩm từ tảo xoắn đã được biết đến ở dạng là: thực phẩm,dược phẩm và mỹ phẩm Năm 1960, Spirulina spp mới bắt đầu được biết đến, loại tảonày do tiến sĩ Clement người Pháp tình cờ phát hiện khi đến hồ Sat ở Trung Phi Năm

1963 Viện dầu hoả Pháp đã bắt đầu quan tâm đến báo cáo về loại bánh tảo Dihe Đượcbiết đó là tảo Spiruỉina platensỉs, họ đã tiến hành nghiên cứu loại tảo này trong phòngthí nghiệm rồi xây dựng quy trình sản xuất thử Từ năm 1970 Công ty Soda - Texcocovừa sản xuất soda vừa sản xuất tảo trên diện tích khoảng 12 ha với sản lượng mỗi ngày

là trên 1 tấn tảo khô Năm 1973, Tổ chức Lương nông quốc tế và Tổ chức Y tế thế giới

đã chính thức công nhận Spỉrulỉna spp là nguồn dinh dưỡng và dược liệu quý, đặc biệtữong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa Tại Ấn Độ, một nghiên cứu năm 1995 đãchứng tỏ với liều lg Spiruỉina/ngày, có tác dụng trị ung thư ở những bệnh nhân ung thư

do thói quen nhai trầu thuốc Ở Nhật Hiroshi Nakamura cùng Christopher Hill thuộcLiên đoàn vi tảo quốc tế cùng một số nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu Spirulina spp từnăm 1968 Hiện nay ữong các

Ở Việt Nam, sản phẩm từ tảo xoắn chủ yếu đuợc biết đến duới dạng duợc phẩm

đề tài nghiên cứu chống HIV/AIDS của Nhật, có đề tài sử dụng Spỉrulina spp [14],

[33],

Trong những năm 1985 -1995 đã có nghiên cứu thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học cấpnhả nuớc nhu nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Hữu Thuớc và cộng sự với đề tài “Côngnghiệp nuôi trồng và và xử lý tảo Spirulina” Tuy nhiên, sản phẩm này chỉ mới pháttriển ở những năm gần đây và chua có đề tài nghiên cứu quá trình lên men trong môitruờng có bổ sung tảo xoắn Vì vậy, việc nghiên cứu quá trình lên men dịch tảo xoắn từ

đó ứng dụng vào ché biến nuớc giải khát tảo xoắn, sẽ góp phần làm phong phú các sảnphẩm nuớc uống trên thị truờng và tận dụng các ích lợi từ nguồn duợc liệu này đến

nguời tiêu dùng, chính vì vậy tôi tiến hành: “Nghiên cứu phân lập và khả năng lên

men của một số chủng vi sinh vật trong môi trường có bổ sung tảo xoắn (Spirulina

spp.)”

2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn đuợc chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uốngtrong môi truờng có bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.)

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Phân lập chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men tạo đồ uống trongmôi truờng có bổ sung tảo xoắn (Spiruỉina spp.)

3.2 Tuyển chọn đuợc chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men tạo đồuống trong môi truờng có bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.)

3.3 Ảnh huởng của môi truờng dinh duỡng tới quá trình lên men tạo đồ uốngtrong môi truờng có bổ sung tảo xoắn (Spiruỉina spp.)

3.4 Ảnh huởng của điều kiện lên men tạo đồ uống trong môi truờng có bổ sungtảo xoắn (Spirulỉna spp.)

3.5 ứng dụng để lên men tạo đồ uống trong môi truờng có bổ sung tảo xoắn

{Spirulina spp.)

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu: chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic, nấm mentuyển chọn từ môi trường lên men có bổ sung tảo xoắn (Spỉrulỉna spp.)

4.2 Phạm vi nghiên cứu: chủng vi khuẩn và nấm men có khả năng lên men tạonước giải khát trong môi trường bổ sung tảo xoắn (iSpiruỉina spp.)

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

5.1 Ý nghĩa khoa học

ứng dụng cơ sở khoa học của quá trình lên men lactic, lên men acetic, lên menrượu để lên men tạo đồ uống trong môi trường có bổ sung tảo xoắn (Spiruỉina spp.)

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo đồ uống giải khát trong môi trường có bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.)

6 Đóng góp mới của đề tài

Phân lập được 15 chủng vi khuẩn lactic, 10 chủng vi khuẩn acetic và 9 chủngnấm men Tuyển chọn sơ bộ được 9 chủng vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus: L2 , L 5 , L]], L 4 , L Ọ , L Ị , L 7 , L] 2 , L J 4 , 6 chủng vi khuẩn thuộc giống Acetobacter: G], G2 , G 3 , G 6 ,

G 7 , Gịị và 3 chủng nấm men Saccharomyces cerevỉsỉae:NỊ, N4 , N 7 Lựa chọn được 3

chủng gồm: vi khuẩn Lactobacillus L2 , vi khuẩn Acetobacter G] nấm men Saccharomyces cerevỉsỉae Nj lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn {Spirulina spp.) Tìm được môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men thích hợp cho

quá trình lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn {Spirulina spp.) đạttiêu chuẩn về an toàn thực phẩm: hàm lượng đường Sacarose 100 (g/1), tảo xoắn

(Spirulina spp.) 9 (g/1), KH2PO4 l(g/l), MgS04.7H20 0,6(g/l), pH =

4,5, nhiệt độ 30°c Xây dựng quy trình lên men tạo sản phẩm nước giải khát quy môphòng thí nghiệm

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về tảo xoắn (Spiruỉina spp.)

1.1.1 Sơ lược về tảo xoắn (Spirulina spp.)

Tảo lam hay còn gọi là vi khuẩn lam theo tiếng Hi Lạp thì cyanos-blue là mộtngành vi khuẩn mà có khả năng hấp thu năng lượng qua quá trình quang hợp Tảo xoắn

(Spiruỉina spp.) là vi khuẩn lam dạng sợi thuộc ngành vi khuẩn lam hay tảo lam Tảo

xoắn (Spiruỉina spp.) là một loài vi tảo có dạng xoắn hình lò so, màu xanh lam với kíchthước chỉ khoảng 0,25 mm Chúng sống trong môi trường giàu bicarbonate (HCO3") và

độ kiềm cao (pH 8,5-9,5) Chúng có những đặc tính ưu việt và giá trị dinh dưỡng cao

Do hình thái “lò so xoắn” dễ nhận biết qua kính hiển vi, người ta cũng thường gọi tảonày là “tảo xoắn” Tảo (Spỉrulỉna spp.) vẫn tiếp tục được nghiên cứu sử dụng như thức

ăn -vị thuốc trong tương lai do khả năng phát triển cực kỳ nhanh của một vi sinh vậtđơn bào Tảo (Spiruỉinaspp.) xuất hiện cách đây hơn 3 tỷ năm Nó là vi khuẩn lam cốđịnh có lịch sử lâu đời hơn tảo nhân thật hoặc thực vật bậc cao tới 1 tỷ năm Hơn 1 ngànnăm trước tổ tiên của những người Aztect ở Mexico đã biết thu hái (Spỉrulina spp.) từcác hồ kiềm tính, phơi dưới ánh nắng mặt ữời và dùng làm thực phẩm Tên gọi

(Spỉrulỉna spp.) do nhà tảo học Deurben (người Đức) đặt năm 1927, dựa trên hình thái

của tảo là dạng sợi xoắn ốc (spiralis) [23],

1.1.2 Đặc điểm sinh học của tảo xoắn (Spirulina spp.)

1.1.2.1 Phân loại

Tảo (Spirulina spp.) phân bố rất rộng rãi trong các môi trường khác nhau và và

có thể phát triển trong các môi trường các loại tảo khác không thể sinh sống Một vàiloài thuộc chi Spirulina tiêu biến như Spỉrulỉna platensỉs, Spirulỉna maxima, Spirulina

geilleri F.geiỉỉer Ngành tảo lam sắp liền sau ngành vi khuẩn và tách riêng với các nhóm

tảo khác là vì: Chưa có nhân rõ rệt,không có sự sinh sản hữu tính, có chứa sắc tố, tảnđơn sơ, đơn bào hoặc hình sợi

1.1.2.2 Đặc điểm sinh lỷ

Tảo xoắn (Spirulina spp.) là một loại vi tảo dạng sợi xoắn màu xanh lục, chỉ cóthể quan sát thấy hình xoắn sợi do nhiều tế bào đơn cấu tạo thành dưới kính hiển vi

Hình 1.1 Hình dạng tảo (Spirulina spp.) dưới kính hiển vỉ [8]

Giống như các thực vật khác, Spirulỉna spp cần có chất dinh dưỡng để phát triểnnhư nước, cacbon, nitơ, photpho, kali, lưu huỳnh, sắt và các chất khoáng khác Khi cóánh sáng mặt trời quá trình quang hợp xảy ra và loài vi tảo này chuyển hóa các chấtdinh dưỡng kể trên thành chất nuôi tế bào, đồng thời thải ra khí oxy Các tế bào sản sinhmột cách đơn giản là tự phân và một số loài có khả năng tăng gấp đôi số tế bào trongvòng vài giờ đồng hồ trong điều kiện phòng thí nghiệm [8], [30] Trong hồ tự nhiên vàdưới nước biển, tảo phát triển nhanh chóng và sau đó chết theo từng mùa Việc chấtdinh dưỡng sẵn có trong hồ tự nhiên hoặc tại các hệ thống thủy sinh thái thường là nhân

tố chủ yếu hạn chế sự tăng trưởng Mưa làm trôi chất dinh dưỡng của đất xuống hồ ao,sông ngòi tạo điều kiện cho tảo mùa phát triển Ở đại dương, chỉ có những đụn giàuchất dinh dưỡng do các luồng nước chính tạo ra gặp vùng đất rộng có thể làm hìnhthành các vùng tăng trưởng thường xuyên cho quần lạc thực vật phù du này là cơ sở củamạng lưới thực phẩm và hỗ trợ cho mọi sự sống dưới nước thuộc hình thái cao hơn Tạicác hồ cấy vi tảo người ta không cần đất màu Tuy nhiên do vi tảo phát triển với tốc độlớn như vậy, nên phải cung cấp chất dinh dưỡng nhanh hơn so với cây trồng trên cạn.Phải bơm xuống nước đủ lượng C02 và phải luôn luôn cung cấp chất dinh dưỡng có khảnăng hòa tan khác để các hồ luôn luôn có vi tảo được thu hoạch [8], [23]

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng và công dụng của tảo xoắn (Spiruỉina spp.)

1.1.3.1 Giá trị dinh dưỡng của tảo xoan (Spirulina spp.)

Spirulina còn có tên thương mại là Arthrospỉra platensỉs mà được nuôi trồng

trên thế giới như một nguồn thực phẩm, chúng rất giàu chất dinh dưỡng Hiện nay đượcphổ biến như là thực phẩm bổ dưỡng tại us và Europe

Protein: 55%-70%

Giàu các vitamin: vitamin A, Bi, B2, B3, B6, B12, vitamin c, vitamin D, vitamin

E, folate, vitamin K, biotin, axit pantothenic, beta carotene - tiền chat của vitamin A,inositol

Giàu các chất khoáng: Canxi, mangan, sắt, chromium, photpho, magie, selen.Giàu các sắc tố: phycoxyanin, chlorophyll,carotenoid và xanthophyll và các sắc

tố khác

Các hợp chất hữu cơ: Axit gama linoleic, glycolipid, các pholysaccharide

Các axit amin: Isoleucine, phenylalanine, leucine, threonine, lysine, trytophan,methionine, valine, alanine, glycine, arginine, histidine, axit aspartic, pro line, cystine,serine, axit glutamic, tyrosine.

Đặc biệt chúng chứa nhiều axit amin không thay thế mà động vật không thể tựtổng họp được Yì vậy Spỉrulina spp được nuôi trồng rất phổ biến trên thế giới, được sửdụng vào nhiều vào mục đích khác nhau: Y - Dược, mỹ phẩm, thực phẩm, nông nghiệpthủy sản và được coi là thức ăn của con người trong tương lai [20, 26]

Nguồn tảo mà tôi sử dụng là bột tảo do công ty Dược Hậu Giang cung cấp và

đã được phân tích thành phần dinh dưỡng như sau:

1.1.3.2 Câng dụng của tảo xoắn (Spiruỉina spp.)

> Proteỉn chất lượng cao

Tảo xoắn (Spiruỉina spp.) là một loại tảo đơn bào nhỏ dạng xoắn ốc, chứaprotein cân bằng hoàn chỉnh và nhiều chất dinh dưỡng có giá trị Spirulina spp chứakhoảng 70% protein dễ tiêu, lượng protein cao hơn bất kỳ lượng thực phẩm nào khác.Ngoài ra thành phần của tảo (Spỉrulina spp.) còn chứa 18/22 axit amin, tất cả những axitamin cần thiết này tạo thành một nguồn thực vật hoàn chỉnh về protein Hơn nữa,protein trong Spiruỉina spp dễ tiêu hóa hơn so với các nguồn thịt Thực vậy, protein thịt

bò được ước lượng chỉ dễ tiêu 20%, toong khi protein Spiruỉina spp là 95% Tảo

(Spirulina spp.) không những là thực phẩm tuyệt vời giúp cơ thể dễ dàng hấp thụ

protein chất lượng cao mà còn chứa các men hỗ trợ quá trình tiêu hóa [14], [26], [27],

> Chat giàu dinh dưỡng tự nhiên

Nguồn dinh dưỡng thực phẩm tự nhiên hoàn chỉnh được tìm thấp toong thựcphẩm này cho ta những điều lợi ích vô tận về sức khỏe, Spirulỉna spp có lượng beta-

Bảng 1.1 Thành phần của tảo xoắn (Spirulina spp.)

Thành phần Số lượng (% chất khô) Thành phần Số lượng (% chất khô)

calotene cao -tiềm chất của vitamin A gấp 25 lần cà rốt, đây là chất chống oxy hóamạnh, bảo vệ cơ thể khỏi những tổn hại cơ bản không giống vitamin A tổng hợp vàgiàu gan cá, beta-calotene hoàn toàn không độc hại, thậm chí khi sử dụng với số lượnglớn Tảo (Spirulina spp.) giàu vitamin A được chuyển hóa cần thiết cho mắt, làn da,răng, móng, xương và một hệ thống miễn dịch tốt bảo vệ cơ thể Spirulina spp là mộtnguồn cung cấp vitamin B tuyệt vời cụ thể là vitamin BI2, quan trọng với người ănchay gấp 2-6 lần gan bò sống thực phẩm dinh dưỡng này cũng chứa vitamin E là nguồnsắt cao và chứa 14 chất khoáng tự nhiên và nhiều vi lượng [17],

> Siêu thực phẩm cho người ăn kiêng

Tảo (Spiruỉina spp.) là một toong những thực phẩm giàu chất dinh dưỡng nhất

và chứ ít chất béo Nhiều người nhận thấy rằng sử dụng Spiruỉina spp trước bữa ăn sẽlàm giảm lượng thức ăn của họ sẽ làm giảm nhu cầu thèm ăn của họ, cách này thích hợpcho người ăn kiêng Đối với những người suy dinh dưỡng, cần tăng trọng cách tốt nhất

là bổ sung Spirulỉna spp sau mỗi bữa ăn Chất dinh dưỡng sẽ được tích lũy lại, giúpngười suy dinh dưỡng mau chóng hồi phục Loại siêu thực phẩm này có thể là mộtthành phần giá trị của bất kỳ của chương trình tăng cân hoặc giảm cân sức khỏe nào

Spiruỉina spp cũng là nguồn cung cấp cacbonhydrate phức hợp tuyệt vời, nó chứa

glycogen dễ được cơ thể hấp thụ và biến đổi nhanh chóng thành năng lượng chúng tacần mỗi ngày [8], [17], [40]

y Hỗ trợ miễn nhiễm tự nhiên

Tảo (Spỉrulina spp.) chứa đựng nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự miễnnhiễm tối ưu như GLA, beta-carotene và các carotenoid khác Lượng giàu chứa GLAgấp 3 lần so với dầu cây anh thảo Nghiên cứu đã tìm ra GLA giúp làm giảm bệnhhuyết áp cao và giảm lượng cholesterol trong máu, làm dễ chịu các trường hợp viêmkhớp, các cơn đau tiền kinh nguyệt và các bệnh khác về da [8], [17] Tảo (Spirulinaspp.) được nghiên cứu rộng rãi nhằm công bố đặc tính tăng cường miễn nhiễm, cácnghiên cứu cho thấy (Spiruỉina spp.) có thể làm tăng mức độ kháng thể và hoạt động đạithực bào, cả hai đều quan trọng đối với một hệ thống miễn nhiễm mạnh mẽ, nó cũnggiúp cân bằng hoạt động hệ thống miễn nhiễm của bạn [8], [17], [41]

> Lọc và giải độc

Còn một lý do khiếp cho Spiruỉina spp quan trọng chúng chứ diệp lục gấp nhiềulần so với cỏ linh lăng hoặc lúa mì Chất diệp lục là sắc tố giúp thực vật có màu xanh vàrất trong sạch, với nhiệm vụ là làm sạch hệ thống kim loại nặng và các độc tố kháctrong cơ thể có hại cho sức khỏe [40, 41, 42],

1.1.4 Tình hình nghiên cứu của tảo xoắn ịSpirulina spp.) hiện nay

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trước những năm 1960, việc cấy toong Spirulina spp làm thực phẩm chưa cómột khát niệm thực sự Năm 1960, Spirulina spp mới biết đến, loại tảo này do tiến sĩClement người Pháp tình cờ phát hiện khi đến hồ Sat ở Trung Phi Năm 1963, Viện dầuhỏa Pháp đã bắt đầu quan tâm đen báo cáo về loại bánh tảo Dihe [14], Được biết đó làtảo (Spiruỉina spp.), họ đã tiến hành nghiên cứu loại tảo này trong phòng thí nghiệm rồixây dựng quy trình sản xuất thử Tuy nhiên điều kiện tự nhiên của nước

Pháp không thuận lợi cho việc nuôi trồng loại tảo này Durand, Giám đốc công ty sảnxuất soda ở hồ Texcoco - Mêhicô đã ứng dụng quy trình của viện dầu hoả Pháp tiếnhành nuôi tảo (Spirulina spp.) trên một phần diện tích của hệ thống bay hơi nhờ nănglượng mặt ười của hồ Texcoco Từ năm 1970, Công ty Soda - Texcoco vừa sản xuấtsoda vừa sản xuất tảo trên diện tích khoảng 12 ha với sản lượng mỗi ngày là trên 1 tấntảo khô [8], [31] Năm 1973, Tổ chức Lương nông quốc tế và Tổ chức Y tế thế giới đãchính thức công nhận Spiruỉina spp là nguồn dinh dưỡng và dược liệu quý, đặc biệttrong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa Đáng lưu ý trước hét là công trìnhnghiên cứu phòng chống ung thư gây ra bởi tia phóng xạ hạt nhân cho các nạn nhân của

sự cố Nhà máy Điện hạt nhân Chemobul đã thu được kết quả rất tốt khi điều trị bằng

Spiruỉina spp nguyên chất Khi uống Spiruỉina spp., lượng chất phóng xạ đã được đào

thải khỏi đường tiểu của người bị nhiễm xạ rất cao Kết quả này đã được biểu dương tạihội nghị quốc té về tảo năm 1998 ở cộng hòa Czech Tại Ấn Độ, một nghiên cứu năm

1995 đã chứng tỏ với liều lg Spirulina/ngày, có tác dụng trị ung thư ở những bệnh nhânung thư do thói quen nhai trầu thuốc [8, 17]

Ở Nhật Hiroshi Nakamura cùng Christopher Hill thuộc Liên đoàn vi tảo quốc tếcùng một số nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu Spỉrulina spp từ năm 1968 Hiện naytrong các đề tài nghiên cứu chống HIV/AIDS của Nhật, có đề tài sử dụng Spirulina spp

Sản lượng Spirulina spp trên thế giới khoảng 1000 tấn khô/năm Những nước đi đầusản xuất đại trà loại tảo này là Mehico, Mỹ, Đài Loan, Ấn Độ Trại tảo lớn nhất là ởHawaii có khoảng 25 ha và mới đây là Trung Quốc có khoảng 16 ha Nhu cầu Spỉrulỉnaspp trên the giới là rất lớn, tuy nhiên sản xuất chưa nhiều, nên giá bán những chế phẩm

Spirulina spp rất đắt Gần đây việc phát hiện và đưa vào sử dụng một số chất có hoạt

tính sinh học ở Spirulina spp đã góp phần không nhỏ thúc đẩy quá trình nghiên cứu,sản xuất cũng như ứng dụng có hiệu quả sinh khối tảo này [8], [17]

1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tảo (Spirulỉna spp.) được giáo sư Ripley D.Fox- nhà nghiên cứu về tảo và cácchế phẩm của tảo tại “Hiệp hội chống suy dinh dưỡng bằng các sản phẩm từ tảo” tạiPháp đưa vào Việt Nam năm 1985 Trong những năm 1985 -1995 đã có những nghiêncứu thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học cấp nhà nước như nghiên cứu của GS.TS.Nguyễn Hữu Thước và cộng sự -Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học vàCông nghệ Việt Nam với đề tài “Công nghiệp nuôi trồng và và sử lý tảo Spirulina Đồtài cấp thành phố của Bác sĩ Nguyễn Thị Kim Hưng -TP Hồ Chí Minh và cộng sự với

đề tài “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng thức ăn có tảo Spirulina trong dinh dưỡng điềutrị” [17], [32],

Cho đén nay, nhiều cơ sở nuôi trồng, sản xuất và ché biến các sản phẩm từ tảo

Spirulỉna đã được thành lập Đó là các cơ sở như Vĩnh Hảo - Bình Thuận, Châu Cát,

Lòng Sông - Thuận Hải, Suối Nghệ - Đồng Nai, Đắc Min - Đắc Lắc Nguồn C02 từ lònung vôi sau khi đã lọc bụi và các hầm khí bioga cũng đã được nghiên cứu tận dụng đểphát triển nuôi trồng tảo và cũng đã thu được một số két quả khả quan Ngoài các sảnphẩm Spỉrulỉna nhập từ Thái Lan, Trung Quốc với nhiều tên gọi khác nhau, bán hàngtheo phương thức phân phối đa cấp với tỉ lệ chiết khấu cao gây thiệt thòi cho người tiêudùng Các sản phẩm được chế biến từ tảo Spiruỉina tại Việt Nam cũng đã xuất hiện ngàycàng nhiều và đa dạng Trước đây đã từng có bột dinh dưỡng Enalac, Sonalac có 5% tảo[7] Nay đã có 5 sản phẩm Spir@ của Công ty DETECH - Viện Khoa học và Côngnghệ Việt Nam được Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế cấp phép lưu hành trên thịtrường Đó là các sản phẩm:

l.Spir@ B - Tảo bồi bổ: Tảo xoắn Spiruỉina dùng cho người suy dinh dưỡng,

người mới ốm dậy cần bồi bổ phục hồi sức khoẻ.

2.Spir@ HA - Tảo điều hoà huyết áp: Tảo xoắn Spỉrulỉna két hợp tinh chất hoahòe, hoa cúc dùng cho người bị tăng huyết áp, giảm stress và tăng cường trí nhớ chongười già

3.Spir@ CĐ - Tảo phòng chống độc: Tảo xoắn Spirulỉna kết hợp tinh chất caohạt nho dùng để tăng sức đề kháng, chống độc, khử gốc tự do

4.Dia-Spir@ - Tảo phòng chống tiểu đường: Tảo xoắn Spiruỉina két hợpvitamin, khoáng chất dùng cho người bị bệnh đái tháo đường týp 1 và týp 2

5.Spir@ Cid - Tảo phòng chống ung thư: Tinh nghệ nguyên chất kết hợp với tảoxoắn Spỉrulina, cao hạt nho dùng hỗ trợ cho việc phòng và chữa các bệnh ung thư [17],[32],

Tất cả các sản phẩm trên có thể không phải là “thần dược” Nhưng với xu thếhòa nhập cùng thế giới, nhất là sau khi đã tham gia vào WTO chúng ta cũng không thểphủ nhận những tác dụng của thực phẩm chức năng mà thế giới đã thừa nhận Do vậyngười tiêu dùng, nhất là người bệnh và những người có điều kiện về kinh tế nên tìmhiểu và nên sử dụng ngày càng nhiều hơn các loại thực phẩm chức năng như là tảo(Spiruỉina spp.) vì sức khoẻ của chính mình

1.2 Vi sinh vật và quá trình lên men tạo đồ uống có bồ sung tảo xoắn (Spirulina

Những vi khuẩn gây lên men sinh axit lactic được gọi là vi khuẩn lactic Vikhuẩn lactic được đặc trưng bởi khả năng sinh axit lactic rất mạnh từ các loại đườngkhác nhau, đặc biệt là đường lactozo và đường saccarozo Hầu hết các vi sinh vật sinhaxít lactic đều thuộc về họ Lactobacillaceae và được xếp bốn chi: Streptococcus,

Pediococcus, Lactobacỉllus và Leuconostoc Chúng có dạng hình cầu hoặc hình que,

Gram dương, không bào tử, không di động Tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một

số giống toong họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử Vi khuẩn lactic không khửnitrate, phản ứng catalase âm tính, kị khí tuỳ ý, một vài loài kị khí sống trong hệ tiêuhoá của con người [10], [34], [38]

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng cao Để sinh trưởngbình thường, ngoài nguồn cacbon, chúng cần nitơ, một phần dưới dạng các axit amin,một số vitamin, các chất sinh trưởng và các chất khoáng Chúng không thể phát triểnđược trong môi trường có thành phần đơn giản như glucozo và NH4+ như một số loàikhác Vì thế người ta phải cho vào môi trường một số chất giàu dinh dưỡng: cao nấmmen, cao thịt, các loại đường để chúng có thể lên men

Vi khuẩn lactic có thể tồn tại trong môi trường khô, có thể chịu được hàm lượngcồn từ 10 - 15% và có thể chịu được nồng độ C02 cao Chúng được tìm thấy khắp nơitrong tự nhiên, dưới da, trong hệ tiêu hoá Lactobacillus có vai trò quan trọng nhấttrong lên men lactic, là vi khuẩn kị khí Gram dương, có dạng hình que dài, không sinhbào tử, tế bào thường xếp đôi hoặc thành chuỗi, không di động Chúng là nhóm chínhcủa vi khuẩn axit lactic, hầu hết các chủng của chúng biến đổi đường lactozo và nhữngđường khác thành axit lactic Chúng là vi khuẩn rất phổ biến và thường là lành tính Ởngười, chúng có mặt ở âm đạo và ở ruột Nhiều loài có ở thực vật đang phân rã Sự sảnxuất axit lactic làm ngăn cản sự phát triển của một vài loài vi khuẩn có hại khác [2],[10], [38]

Cơ chế của quá trình lên men lactic

Lên men lactic là một quá trình trao chuyển hóa sinh học kị khí làm biến đổi cáchợp chất đường thành acid lactic (chủ yếu) và một số sản phẩm khác Các sản phẩmnhư acid lactic, ethanol, C02 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men còn các phân

tử ATP được giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng

của vi sinh vật Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên menngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác [1].

Có hai kiểu lên men lactic:

Lên men lactic đồng hình hầu như chỉ cho ra sản phẩm là acid lactic

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic còn

có các sản phẩm khác như acid acetic, ethanol, C02

Ngoài ra, trong dịch lên men còn xuất hiện nhiều hợp chất hóa học mới là sảnphẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men Một số hợp chất dễ bay hơi

có vai trò quan trọng góp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho các sản phẩm lênmen lactic Lượng sản phẩm phụ thu được hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật,môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh [4]

1.2.2 Vi khuẩn acetic

Vi khuẩn aceticlà tác nhân chính của quá trình lên men acetic Giống vi khuẩnacetic, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể dễ dàng tìm thấy các vi khuẩn này từkhông khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, giấm, rượu, bia, hoa quả Ngày nayngười ta đã biết tới hơn 20 loài vi k h u ẩ n có khả năng lên men acetic thuộc các nhómkhác nhau [22], về hình dạng té bào vi khuẩn acetic là những trực khuẩn hình que hayhình elip, hình chỉ, hình cầu hoặc có hình bán nguyệt, kích thước té bào thay đổi tùyloài (0.3-0.6 X 1.0-8.0|xm) Các té bào đứng riêng rẽ hoặc xép thành chuỗi, có hoặckhông có tiêm mao, sống và phát triển trong điều kiện hiếu khí bắt buộc hóa dị dưỡnghữu cơ, không sinh bào tử Ở môi trường dịch thể vi khuẩn acetic có sự hình thànhmàng trên mặt thoáng, màng tạo thành có độ dày mỏng khác nhau và đặc điểm của cácloại màng cũng khác nhau tùy loại [11]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩnacetic rất phong phú Nguồn cacbon có thể được cung cấp từ các hợp chất đường, rượuetylic và các acid hữu cơ Vi khuẩn acetic có thể sử dụng các muối amon làm nguồncung cấp nitơ và phân giải pepton Một số acid amin như acid pantothenic và các chấtkhoáng K, Mg, Ca, Fe, p, s cũng có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng vàphát triển Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây là nguồndinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Một số loài vi khuẩn còn tổng hợp

được vitamin Bi, vitamin B2, oxy hoá sorbit thành đường sorbose (dùng trong côngnghiệp sản xuất vitamin C), hay như Acetobacter xylinum có thể tổng họp được sợicellulose giống như những sợi bông [29].

1.2.3 Nấm men

Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ, hình quả

chanh kích thước tương đối lớn: đường kính khoảng 7ịim, chiều dài: 8-12|im Hìnhdạng và kích thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổikhác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau Nấm men thuộc nhóm sinh vật nhân chuẩnđơn bào, tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo khá phức tạp gồm thành tế bào,màng nguyên sinh chất, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ

Có rất nhiều cách phân loại, nấm men chủ yếu gồm hai lớp là nấm men thật(Ascomyces) và nấm men giả (Fungiim porfecti)

+ Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công nghiệpthuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; giống Schizosaccharomycesgiống Endomyces

Mycoderma ; Candida', Rhodotorula.

Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng đầy đủ, té bào nấm men tăngnhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều cho đến khi cơ chất củamôi trường giảm đến mức thấp nhất thì quá trình sinh trưởng phát triển của chúng chậm

và ngừng hẳn Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượngsinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn Tế bào sẽ già đi khi môi trường thiếu chất dinhdưỡng và tế bào không còn khả năng sinh sản nữa Tuy nhiên đa số nấm men sinh sảnbằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ [9], [35]

Quá trình lên men rượu được thực hiện nhờ quá trình lên men kị khí của nấmmen, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol Quá trình lên men rượu đượcbắt đầu từ hoạt động của nấm men trong dịch lên men tiết ra một loại enzyme Invetasechuyển hóa đường sucrozo thành glucozo và fructose Từ đây trong dung dịch dinhdưỡng mới có glucose [4], Nguồn glucose lúc này bị cạnh tranh bởi cả vi khuẩn và nấmmen (trong dung dịch chưa có ethanol), hoạt động lên men rượu được chia làm hai thời

kì chính:

Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, té bào nấmmen phát triển sinh khối

Thời kỳ lên men chuyển đường thảnh rượu: giai đoạn này nấm men chuyển sang

hô hấp kỵ khí Giai đoạn đường phân được tăng cường và trở thành nguồn cung cấpnăng lượng cho tế bào, sự chuyển hướng trao đổi chất của nấm men sẽ cho sản phẩm làethanol Trong quá trình lên men rượu, nấm men sử dụng các enzyme sẵn có thực hiệnxúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu Nấmmen không có khả năng chịu được môi trường có độ acid cao cho nên acid pyruvic sẽđược chuyển hoá thành CƠ2 và acetaldehyde rồi thành ethanol Trong lên men rượu,các đường đơn như glucose và fructose được phân giải theo con đường EMP và chutrình ATC ở giai đoạn đầu, sau đó giải phóng ATP Khi nấm men chuyển sang hô hấp

kị khí, quá trình lên men cho các sản phẩm chính là C02, ethanol và các sản phẩm phụtrong đó có glyxerol [4]

Phương trình tổng quát của quá trình lên men rượu có thể viết như sau:C6Hl206+2ADP+2Pi->2C2H50H+2C02+2ATP Quá trình chuyển hóa đường thànhEthanol và khí C02 diễn ra trong tế bào chất của nấm men Ngoài việc tạo ra Ethanol vàC02, tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men nhiều sản phẩm phụ và sảnphẩm lên men khác với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerolcùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este Trong quá trình này nhiều acid hữu

cơ được tạo thành, một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs Nếu quátrình lên men trong điều kiện kị khí không nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàmlượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic [4], [16]

1.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nhóm vi sinh vật lên men tạo đồ uống có bỗ sung tão xoắn (Spirulina spp.)

1.2.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic [23]

Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Chúngkhông chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như cacbon,nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác nhưvitamin, muối vô cơ

> Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit(glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến cácpolysaccarit (tinh bột, dextrin) Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp nănglượng, xây dựng cấu trúc té bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acidhữu cơ

> Nhu cầu dinh dưỡng nỉtơ

Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ Vì vậy

để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵntrong môi trường Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấmmen, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton Hiện nay cao nấm men là nguồnnitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất Tuy nhiên ở quy mô công nghiệpkhông thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

> Nhu cầu về Vitamin

Vitamin đóng vai trò là các Coenzyme ữong quá trình trao đổi chất của tế bào,nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không cókhả năng sinh tổng hợp Vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin.Các chất chứa Vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt haydịch tự phân nấm men

> Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và Vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơkhác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ

Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩnlactic như acid xitric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫnxuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản cácchủng vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quantrọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạngcác muối axetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

> Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các

muối vô cơ.

> Nhu cầu dinh dưỡng oxỉ

Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừasống được trong môi trường không có oxy Trong điều kiện kị khí sinh khối vi khuẩn sẽphát triển nhanh hơn so với điều kiện hiếu khí, trong điều kiện này từ một phân tửglucozo sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành C02 và H20 và tổng hợp các enzyme, từ một phân

tử glucozo tạo ra 36 hoặc 38 ATP

Dinh dưỡng nitơ: đa số nấm men không đồng hóa được nitrat mà chỉ có khảnăng sử dụng các muối amon ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ Nguồnnitơ hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid, urê, nucleotit Đạm vô cơ là cácmuối amon khử nitrat, Sulfat, acetat

Dinh dưỡng các chất sinh trưởng: các vitamin, các purin và prymidin là nhân tốsinh trưởng cơ bản của nấm men

1.2.4.2 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông quaviệc lên men lactic Dựa vào khả năng lên men lactic người ta chia vi khuẩn lactic làmhai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình

> Lên men lactic đồng hình [1], [4], [5]

Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men trong đó các sản phẩm acid lactictạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, aceton,di-acetyl

Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:

C6H1206 -►2CH3CHOHCOOH+21,8.104 JTrong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza được chuyển hoá theo chutrình Embden-Mayerhoff, vi khuẩn sử dụng cho qui trình này tất cả các loai enzymaldolase, còn hydro tách ra khi dehydro hoá triozophophat dược chuyển đến pyruvat Vìtrong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase cho nên acidpyruvic không phân huỷ nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic theo sơ đồ chuyển hoádưới đây [1], [4],

Cũng có một số tác giả cho rằng lên men lactic đồng hình tiến hành theo haigiai đoạn:

Giai đoạn 1: thời kỳ sinh trưởng cấp số mũ của vi khuẩn, từ hexoza nhờ sự oxihoá photphoglyceraldehyde kèm theo việc khử pividinnucleotide (PN) để tạo acidphotphoglycerinic

PCH2-CHOH+H2O+PN -► p CH2CHOG-COOH+PNH2

Giai đoạn 2: do chất nhận hydro là PN-H2 tăng mà thế oxy hoá khử của môitrường giảm xuống dẫn đến sự nhường hydro từ PN-H2 cho acid photphoglycerinic đểkhử nó thành acid lactic

CH2OP-CHOH-COOH+H2O (PN-H2) —► CH3CHOHCOOH + H3PO4+PN+

H 2 O

Tuỳ thuộc vào tính đặc hiệu quang học của enzym lactate- dehydrogenase và sự

có mặt của lactaxenase mà loại acid lactic dạng nào được tạo ra D(-), L(+) hoặc DL

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm acidlactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic, etanol, acidsuccinic, C02,

Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:

C6H 12 0 6 ^CH 3 CH0HC00H + HOOC(CH 2 )COOH + CH 3 COOH + C 2 H S OH + CO2

Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượuetylic và acid acetic 10% các lọai khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào đó

là sự tích luỹ một lượng ít acid íbocmic Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng

kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phứctạp hơn so với lên men lactic đồng hình

Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lênmen lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình

1.3 ứng dụng (Spirulina spp.) trong thực phẩm, xử lý môi trường, y học và mỹ

phẩm

Từ những năm 1970, ở Nhật Bản và ở Mỹ, tảo (Spiruỉina spp.) đã đựơc xem làmột loại siêu thực phẩm Đen những năm 1990 vấn đề tiêu thụ Spiruỉina spp đã pháttriển vượt bậc tại Trung Quốc, Ấn Độ, Châu Á, Bắc Mỹ làm cho Spirulinaspp ngàycàng trở nên phổ biến Gần đây, trên thị trường Việt Nam xuất hiện nhiều chế phẩmbán ở cửa hàng thực phẩm, siêu thị hoặc cả trong nhà thuốc với thành phần và côngdụng rất gần với thực phẩm dinh dưỡng và thuốc chữa bệnh Những ché phẩm đó làsản phẩm giao thoa giữa thực phẩm và thuốc - còn gọi là thực dược hay thực phẩmchức năng [22] Đặc biệt trong những tháng giữa năm 2005 tới nay, các chế phẩmchứa tảo (Spirulỉna spp.) đang bán ữong nhóm sản phẩm nêu trên được khá nhiềungười chú ý Thực phẩm dinh dưỡng được dùng ở dạng nước uống, siro, yaourt, bộtdinh dưỡng Có thể dùng tảo nguyên chất để uống hoặc trộn vào thức ăn như nấucanh, làm bánh, một số nước còn có trà Spiruỉina Ở Đức, người ta đã bắt đầu đưa tảovào bia, gọi là bia xanh Cơ thể có thể hấp thụ mỗi ngày 30 - 45g, dùng thừa cũng vô

chất dinh dưỡng.

1.3.2 ứng dụng trong xử lý môi trường

Ở Việt Nam hiện nay, quy mô và mức độ ô nhiễm kim loại nặng trong nướcthải công nghiệp đang gia tăng với tốc độ đáng lo ngại Việc áp dụng các biện pháphóa lý như đã nêu thường có giá thành cao, khiến nhiều hoạt động công nghiệp vẫntiếp tục thải nước thải chứa kim loại nặng vào môi trường Các điều tra cho thấy cácnhà máy ô tô, sản xuất pin và ắc qui, nhà máy thuộc da, các xí nghiệp mạ thải nướcthải chứa các kim loại nặng nguy hiểm như Ni, Cr, Fe, Hg, Cu, Pb Vì vậy nghiên cứu

sử dụng vi tảo để loại trừ kim loại nặng trong nước thải công nghiệp ở nước ta là mộthướng công nghệ đáng được quan tâm Tuy nhiên đây là một lĩnh vực còn rất mới mẻ

ở Việt Nam Đã có một vài công trình nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này đạt đượcmột số kết quả trong việc sử dụng chất hấp thu sinh học để xử lý ô nhiễm Cr, Ni và Pbtrong nước thải công nghiệp Thử nghiệm cố định tế bào tảo Spiruỉina platensỉs trêncác chất mang khác, xây dựng được phương pháp cố định té bào vi tảo ưên các chấtmang khác nhau như polyurethane, agar và carageenan Te bào tảo sau khi cố địnhvẫn có khả năng hoạt động sống bình thường trong một thời gian dài Sự hấp thu kimloại nặng phụ thuộc trạng thái của tảo khi đói dinh dưỡng có khả năng hấp thu caohơn Như vậy triển vọng sử dụng sinh khối vi tảo sống hay chét, tự do hay cố định vàoviệc loại trừ kim loại nặng trong nước thải là to lớn Nước thải sinh hoạt sau khi xử lýsinh học được tách bùn và dùng như là môi trường để nuôi cấy tảo, sinh khối đượctách ra và đem đi xử lý nhiệt hoặc đem đi cố định trong chất mang, sau đó sinh khốinày được sử dụng như chất hấp phụ sinh học để thu nhận kim loại nặng Nước thảicông nghiệp nặng có nồng độ kim loại cao và các chất độc sẽ được xử lý bằng cácphương pháp hóa lý trước sau đó hoặc được trộn với nước thải sinh hoạt đã xử lý vàtiến hành nuôi cấy các chủng tảo đã chọn lọc trong hồ nuôi tảo hoặc cho tiếp xúc vớichất hấp thụ sinh học làm từ sinh khối vi tảo trong bể hay cột hấp phụ Sinh khối tảosau khi thu hồi được xử lý theo chế độ xử lý bùn: phân giải yếm khí để tạo biogashoặc làm khô rồi thiêu hủy nhiệt hoặc chôn lấp, còn nước thải sau xử lý sẽ thải vào

công nghệ có nhiều tiềm năng Tuy nhiên còn rất nhiều thách thức phải vượt qua để cóthể hình thành và làm chủ được công nghệ này cần có nhiều sự quan tâm hơn nữa củacác khoa học cũng nhu các nhả quản lý đối với lĩnh vực nghiên cứu đang còn mới mẻnày [17], [22],

1.3.3 ứng dụng trongy học

Các yéu tố cấu tạo nên tảo lam gồm 75% là chất hữu cơ và 25% là khoángchất Vì thế tảo chứa các chất căn bản trong việc trị liệu Các đặc tính trị bệnh của tảorất nhiều nhu tái bổ sung nước, muối khoáng và dinh dưỡng cho cơ thể Thời gianngâm mình trong nước tảo thường kéo dài khoảng 20 phút Ngoài ra người ta thườngdùng tảo lam dưới dạng cao dán nóng đắp lên toàn cơ thể hay trên những vùng đặcbiệt trong 30 phút Trong các trường hợp khác, người ta xoa bóp thân thể với dượcliệu là tảo, có tác dụng làm dịu làn da hoặc dùng cả trong việc mát xa mặt Chất chiết

từ tảo lam được dùng làm chất tá dược bao viên thuốc, thuốc sủi hoặc thuốc viên nang

24 và cả những loại thuốc không tan trong dạ dày, chỉ phóng thích hoạt chất ở ruộtnon Ngoài ra tảo lam còn được nghiên cứu làm thuốc cầm máu và sát trùng Sau sựkiện này hàng loạt tập đoàn dược phẩm thế giới đã nhảy vào phát triển tảo thànhthuốc Hiện nay loài tảo này đã được trồng ở nhiều nước như Mỹ, Nhật, Thái Lan,Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp, Nigiêria, Nam Phi, Kênya [19], [22],

1.3.4 ửng dụng trong mỹ phẩm

nước tắm, trong kem xoa mặt và toàn thân nhờ hàm lượng magie và kali cao, là thànhtrì giúp cơ thể chống lại các khối u xơ ở cơ bắp Chất chiết từ tảo còn được sử dụngtrong một số sản phẩm như thuốc đắp, thuốc làm mặt nạ, kem hoặc để dùng tắm trongliệu pháp biển.

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm

2.1.2.1 Hóa chất

Nguồn cacbon: Glucose, fluctose, maltose, acid lactic

Nguồn nito: Nấm men, pepton, (NH4)2S04, dd NH3

Nguồn muối khoáng: MgS04.7H20, KH2P04

Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol

H2S04, CaC03, thạch Agar

2.1.2.2 Dụng cụ thỉ nghiệm

Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)

Nồi hấp Tommy (Nhật)

Box vô trùng (Haraeus)

Máy lac Orbital Shakergallenkump (Anh)

Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5 pl - 10ml

Cân (Precisa XT 320M - Thụy Sĩ)

Kính hiển viquang học Carl Zeiss (Đức)

Tủ lạnh Daewoo tủ lạnh sau, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang,

2.1.3.1 Môi trường phân lập giống vi khuẩn lactic: MRS thạch ị gã)

= 6

K2HP04: 2 g MgS04.7H20: 0,58 g

Khử trùng 121°c /15phút

2.1.3.2 Môi trường nhân giong vi khuắn lactic: MRS dịch thể (g/l)

Môi trường như trên nhưng bỏ CaC03 và thạch

2.1.3.3 Môi trường phân lập nấm men và vi khuẩn acetic: môi trường Hanxen(gA)

KH2P04: 3 g MgS04.7H20: 2 g

2.1.3.4 Môi trường nhân giống nấm men và vỉ khuẩn aceticịgã):

Môi trường như trên nhưng bỏ thạch

2.1.3.5 Môi trường lên men (gã):

Nước cất: lOOOml Bột tảo: lOg (bổ sung sau khử trùng)

2.2 Phương pháp nghiền cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Phương pháp phân lập vỉ khuẩn ỉactic và nấm men, quá trình quan sát hình thái

trên tiêu bản nhuộm gram

y Phân lập vi khuẩn và nấm men

Đe chọn một tập hợp vi khuẩn và té bào nấm men ta sử dụng phương pháp

phân lập trên hộp Petri Môi trường để tuyển chọn các vi khuẩn và khuẩn lạc nấm men

là môi trường MRS và Hanxen

Cách làm: môi trường phân lập được khử trùng và được phân bố vào các hộp

vô trùng Petri để nguội theo phương pháp Pasteur Dịch được lấy từ độ pha loãng từ

10'1- 10'10bằng nước cất Dùng pipet đã vô trùng nhỏ 1 giọt huyền phù với độ pha

loãng từ 10'5- 10'7 lên bề mặt thạch rồi dùng bàn trang vô trùng dàn đều Gói kín lại và

nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 - 30°c trong 3- 7 ngày Sau 3- 7 ngày trên

tròn, lồi, màu trắng, nhẵn, bóng đặc trưng cho nấm men và các vi khuẩn.

Phương pháp nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn lactic và té bào nấm men.Nhuộm Gram là nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bảnnhằm quan sát và định loại tế nấm men dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợpchất bền vững của protit đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt

Tiến hành: Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng có khả năng lên men

dịch tảo làm vết bôi trên lam kính nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram Sau

đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóngđại 1000 lần) [3], [6]

2.2.1.2.Phương pháp xác định số lượng tế bào vỉ sinh vật >

Phương pháp đếm khuẩn lạc

Lấy lml dịch huyền phù có chứa nấm men và vi khuẩn, pha loãng theo phươngpháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trênmôi trường thạch đĩa Nuôi ở 30°c sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môitrường đĩa Petri, từ đó xác định số lượng tế bào nấm men và vi khuẩn ữong lml dịchnuôi cấy ban đầu theo công thức [3], [6]

M _ A 1000 1

10010"

Trong đó: N- Tổng so CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu.

A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri.

10 " - Độ pha loãng dịch nuôi cấy 2.2.1.3 Bảo quản chủng giong

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong

ống thạch nghiêng, nuôi 3-5 ngày ở tủ ấm 30°c Sau đó giữ trong tủ lạnh 4°c dùng cho

nghiên cứu tiếp theo, cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng mộtlần [3], [6]

2.2.1.4 Xác định hoạt lực lên men

Xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm men đã được phân lập và tuyển

chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi kết hợp với việc xác định hàm lượng cồn để xác định hiệu suất lên men.

Phương pháp cân bình trọng lượng: Dịch được lên men trong các bình có cùngthể tích 250 ml môi trường, có cùng một lượng vi khuẩn lactic và tế bào nấm men củacác giống khác nhau Sau 24h lên men đem cân trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân

là 0,1 thì dừng lại [3], [6]

2.2.1.5 Xác định khả năng kết lẳng

Khả năng kết lắng của chủng nấm men được xác định bằng tốc độ lắng củasinh khối Phương pháp này được tiến hành như sau: hòa sinh khối vi sinh vật vàodung dịch đệm axetat (có pH: 4) được đựng trong ống nghiệm có hình dạng và kíchthước như nhau Lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 3-5 phút,

để lắng 12 phút, lúc này toàn bộ khối dịch phân thành 2 lớp, tiến hành đo chiều caolớp phía dưới (lớp kết lắng của tế bào vi sinh vật) toong từng ống nghiệm để xác địnhkhả năng kết lắng của tế bào [3], [6]

2.2.1.6 Phương pháp hoạt hóa

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phảihoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng té bào vi sinh vật cho quá trình lênmen Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạchagar, đem hấp thanh trùng ở 121°c trong 20 phút Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15

phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút toong 24giờ [3], [6],

2.2.2 Phương pháp hỏa sinh

2.2.2.1 Phát hiện khả năng oxy hóa acid acetic

Cao nấm men: 10 (g)

Thạch: 20 (g) pH:

7,0-7,2

Canxi acetat: 10 (g)Nước máy: lOOOml

tuyển chọn

Quan sát hiện tượng nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi làphản ứng dương tính, ngược lại là âm tính [3], [21]

2.2.2.2 Phát hiện hoạt tỉnh cataỉase

Nhỏ một giọt H202 3% lên bề mặt khuẩn lạc, néu thấy hiện tượng sủi bọt khí thìchủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase, ngược lại chủng vi khuẩn đókhông có hoạt tính catalase [3], [6],

2.2.2.3 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N

có phenolphtalain 0.1% làm chỉ thị

Cho vào cốc thủy tinh (loại lOOml hoặc 200ml) dịch lên men, thêm vào đó

1-2 giọt phenolphtalein 0,1% chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N Chú ý chuẩn độ cầnphải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt Sau đó tính số gam acidtổng số trong lOOml dung dịch lên men theo công thức [3], [6]:

x= (V.K.100)/10 (g/ml)Trong đó: X: số gam acid tổng số ữong lOOml dung dịch lên men

V: Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ lOml dung dịch lên menK: Lượng acid tổng số tương ứng với lml NaOH 0,1N (K=0,06)

10: Số ml dịch lên men đem chuẩn độ

2.2.2.4 Xác định độ pH

pH được đo bằng máy đo pH meter (có độ chính xác 0,01) Tiến hành đo 6 lần[3]

2.2.2.5 Sinh trưởng trên môi trường Hoyer

Hấp thanh trùng 121°c trong 15 phút Đe môi trường nguội bổ sung giốngnghiên cứu nuôi ở nhiệt độ khoảng 30°c trong 0, 12, 24, 48 giờ sau đó đếm số lượng tế

2.2.2.6 Phát hiện khả năng tổng hợp celluỉose

Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28 - 30°c trong vòng 3

-4 ngày, quan sát sự hình thành màng Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cáchnhỏ lên đó dung dịch lugol và H2S0460% nó chuyển hoá thành màu xanh lam

[3] , [6],

2.2.2.7 Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone

Để phát hiện khả năng hình thành dihydroxyacetone từ glycerol Hấp thanhtrùng 121°c trong 10 phút Đe môi trường nguội bổ sung giống vi khuẩn nghiên cứunuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 30°c trong vòng 48h Nhỏ dung dịch Fehling đểkiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone (cớ sự xuất hiện kết tủa Cu2 0 màu đỏ gạch)

2.1.2.9 Kiểm tra tỉnh đổi kháng của vỉ sinh vật

Các chủng vi sinh vật được tuyển chọn để nghiên cứu tiếp được nuôi trên môitrường Hanxen bằng phương pháp cấy vạch tiếp xúc giữa các chủng với nhau Sau 3

ngày, ở nhiệt độ 37°c, sau đó quan sát sự sinh trưởng của 3 chủng vi sinh vật [2], [3],

2.2.2.10 Xác định hàm lượng đường bằng phương pháp Bertrand

Từ thể tích kalipemanganat 0,1N đã dùng tra bảng Bectrand được số mgglucozo tương ứng, đổi ra gam

Hàm lượng đường khử (X) tính theo công thức sau:

X = (a.Vi.100) : (m.V)Trong đó:

a - lượng glucozo tương ứng(g)