NGHIÊN cứu ẢNH HƯỞNG của một số ELICITOR lên KHẢ NĂNG TÍCH lũy SOLASODINE ở tế bào IN VITRO của cây cà GAI LEO (solanum hainanense hance)

Trong thành phần h a học của cà gai leo, solasodine là hợp chất chính, đây là một steroid alkaloid được tìm thấy ở khoảng 250 loài cây khác nhau thuộc họ à, đặc biệt là chi Solanum, ch

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC



NGUYỄN HỮU THUẦN ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA

MỘT SỐ ELICITOR LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY

SOLASODINE Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO (Solanum hainanense Hance)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT

HUẾ - 2016

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC



NGUYỄN HỮU THUẦN ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY

SOLASODINE Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO (Solanum hainanense Hance)

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Mã số: 62 42 01 12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc

2 PGS.TS Cao Đăng Nguyên

HUẾ - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khác Những tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ ràng

Nếu có gì sai sót, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Thừa Thiên Huế, tháng 9 năm 2016

Tác giả

Nguyễn Hữu Thuần Anh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và

sâu sắc nhất đến Thầy giáo GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc, người đã tận tâm

giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án và cả trong cuộc sống hàng ngày Xin trân trọng cám ơn thầy giáo

PGS.TS Cao Đăng Nguyên đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực

hiện luận án

Tôi xin chân thành cám ơn Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế (giai đoạn 2011-2014) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô giáo, các anh chị em đồng nghiệp, các anh chị em học viên, sinh viên đã động viên, quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận án Đặc biệt cảm ơn các tác giả có tên trong các bài báo khoa học đã công bố đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm của luận án

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình tôi đã luôn luôn giúp

đỡ, động viên và khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần

Xin trân trọng cảm ơn!

Nguyễn Hữu Thuần Anh

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình, biểu đồ, sơ đồ

MỞ ĐẦU 1

Chư ng TỔNG QUAN T I LIỆU 4

1.1 SẢ XUẤT P ẤT T Ứ ẤP TỪ U ẤY T B T Ự V T 4

1.1 1 ác phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật 5

1.1 2 Sản xuất các hợp chất thứ cấp 7

1 1 3 ác nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp b ng nuôi cấy tế bào thực vật 10

1 2 Ứ T R Đ Ả T Ả T Y P ẤT T Ứ ẤP TR U ẤY T B T Ự V T 13

1.2.1 Elicitor 13

1.2.2 Nghiên cứu ứng dụng elicitor trong nuôi cấy tế bào thực vật 18

1 3 Y 22

1 3 1 Đặc điểm sinh học 22

1.3 2 ác nghiên cứu về solasodine 25

1 3 3 ác nghiên cứu khác trên đối tượng cà gai leo 33

Chư ng 2 ĐỐI TƯ NG NỘI DUNG V PHƯƠNG PH P NGHI N CỨU 35 2 1 Đ T ỨU 35

2 2 U ỨU 35

2 2 1 Xác định khả năng sinh trưởng và tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo 35

2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

solasodine của tế bào cà gai leo: 35

2.2.3 Khảo sát sơ bộ hoạt tính sinh học của dịch chiết solasodine lên khả năng ức chế collagenase 36

2.2.4 Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro của cây cà gai leo 36

2 3 P P P ỨU 36

2 3 1 Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật 36

2 3 2 Phương pháp h a sinh 38

2 3 3 X l số liệu 39

Chư ng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40

3 1 S TR Ở V T Y S S ỦA T BÀO CÀ GAI LEO 40

3 1 1 Sinh trưởng của tế bào 40

3 1 2 Tích lũy solasodine của tế bào 41

3.2 Ả ỞNG CỦA ELICITOR S TR Ở V T Y SOLASODINE CỦA T BÀO CÀ GAI LEO 42

3.2.1 Ảnh hưởng của methyl jasmonate 42

3.2.1.1 Nồng độ methyl jasmonate 42

3.2.1.2 Thời gian nuôi cấy 44

3.2.1.3 Thời điểm cảm ứng 46

3.2.3 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men 47

3.2.3.1 Nồng độ dịch chiết nấm men 47

3.2.3.2 Thời gian nuôi cấy 49

3.2.3.3 Thời điểm cảm ứng 50

3.2.4 Ảnh hưởng của salicylic acid 52

3.2.4.1 Nồng độ salicylic acid 52

3.2.4.2 Thời gian nuôi cấy 53

3.2.4.3 Thời điểm cảm ứng 55

3.2.5 Ảnh hưởng kết hợp của các elicitor 56

3.2.5.2 Thời gian nuôi cấy 58

3.2.5.3 Thời điểm cảm ứng 59

3.3 KHẢ S T S B HOẠT TÍNH CỦA SOLASODINE TỪ DỊCH CHI T T BÀO CÀ GAI LEO 60

3.4 QUY TRÌNH SẢN XUẤT SOLASODINE HI U SUẤT CAO TỪ T BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHI M 61

3.4.1 Nuôi cấy tạo nguyên liệu 61

3.4.1.1 Nuôi cấy cây in vitro 61

3.4.1.2 Nuôi cấy tạo callus 62

3.4.1.3 Nuôi cấy tạo tế bào huyền phù 62

3.4.2 Nuôi cấy sản xuất solasodine 63

3.4.3 Thu sinh khối tế bào và tách chiết solasodine 63

Chư ng 4 B N LUẬN 66

4 1 S TR Ở V T Y S S 66

4.2 Ả ỞNG CỦA METHYL JASMONATE 66

4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ methyl jasmonate 67

4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian x lý methyl jasmonate 68

4.3 Ả ỞNG CỦA DỊCH CHI T NẤM MEN 70

4.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết nấm men 70

4.3.2 Ảnh hưởng của thời gian x lý dịch chiết nấm men 72

4.4 Ả ỞNG CỦA SALICYLIC ACID 73

4.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ salicylic acid 74

4.4.2 Ảnh hưởng của thời gian x lý salicylic acid 76

4.5 Ả ỞNG PH I H P CÁC ELICITOR 76

4.6 SO SÁNH HI U QUẢ GIỮA CÁC ELICITOR 78

KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ 81

DANH MỤC C C CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HPLC : high performance liquid chromatography (sắc ký lỏng

hiệu năng cao)

3.2 Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng tích lũy solasodine của tế

3.3 Ảnh hưởng của thời điểm x l MeJ 50 µM lên sinh trưởng

của tế bào cà gai leo 46

3.4 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung MeJA 50 µM lên khả năng

tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo 47 3.5 Ảnh hưởng của Y lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo 48

3.6 Ảnh hưởng của YE lên khả năng tích lũy solasodine của tế bào

3.7 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng sinh

trưởng của tế bào cà gai leo 51

3.8 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng tích

lũy solasodine của tế bào cà gai leo 51 3.9 Ảnh hưởng của S lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo 52

3.10 Ảnh hưởng của SA lên khả năng tích lũy solasodine của tế bào

3.11 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM S lên sinh trưởng

của tế bào cà gai leo 55 3.12 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA lên khả năng tích

lũy solasodine của tế bào cà gai leo 55

3.13 Ảnh hưởng kết hợp của từng cặp elicitor lên sinh trưởng và tích

lũy solasodine của tế bào cà gai leo 56

3.14 Ảnh hưởng kết hợp của 3 elicitor lên sinh trưởng và tích lũy

solasodine của tế bào cà gai leo 57

3.15 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM S và 3 g/ Y đến

khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo 60

3.16 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM S và 3 g/ Y đến

khả năng tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo 60 3.17 Hoạt tính của dịch chiết solasodine của tế bào cà gai leo trên

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ SƠ ĐỒ

Số hiệu

1.1 Cấu trúc hóa học của solasodine 25

1.2 on đường khả thi tổng hợp steroid trong thực vật cải tiến từ của

2.1 Cây cà gai leo in vitro 35

3.1 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo không x lý

elicitor sau 7 tuần nuôi cấy 40

3.2

(a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo

trong môi trường không x lý elicitor sau 4 tuần nuôi cấy trên

môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L

2,4-D; tốc độ lắc 150 vòng/phút

41

3.3 Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo không x

lý elicitor sau 7 tuần nuôi cấy 42

3.4

(a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo

trong môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0

mg/L 2,4-D bổ sung 50 µM MeJA (lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc

độ lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy

44

3.5 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM

MeJA sau 7 tuần nuôi cấy 45

3.6 Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung

50 µM MeJA sau 7 tuần nuôi cấy 45

3.7

(a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo

trong môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0

mg/L 2,4-D bổ sung 3 g/L YE (lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc độ

lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy

49

3.8 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 3 g/L

YE sau 7 tuần nuôi cấy 49

3.9 Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung

3g/L YE sau 7 tuần nuôi cấy 50

3.10

(a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo

trong môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0

mg/L 2,4-D bổ sung 150 µM SA (lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc

độ lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy

53

3.11 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 150

µM SA sau 7 tuần nuôi cấy 54

3.12 Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung

150 µM SA sau 7 tuần nuôi cấy 54

3.13

(a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo

trong môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0

mg/L 2,4-D bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE (lúc bắt đầu nuôi

cấy) với tốc độ lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy

57

3.14 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 150

µM SA và 3 g/L YE sau 7 tuần nuôi cấy 58

3.15 Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ

sung 150 µM SA và 3 g/L YE sau 7 tuần nuôi cấy 59 3.16 Cây cà gai leo in vitro trong môi trường S0 sau 4 tuần nuôi cấy 61 3.17 Callus cà gai leo in vitro trong môi trường S2 sau 4 tuần nuôi cấy 62

3.18 Tế bào cà gai leo nuôi cấy trong môi trường S3 tốc độ lắc 150

3.19 Dịch chiết solasodine 64 3.20 Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế

bào in vitro của cây cà gai leo ở quy mô phòng thí nghiệm 65

MỞ ĐẦU

T nh ấp thi t a đ t i

Theo số liệu thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 -

50 tấn các loại dược liệu khác nhau để s dụng trong y học cổ truyền, làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu Trong đ , trên 2/3 khối lượng này được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên và trồng trọt trong nước Khối lượng dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa vào thương mại có tính phổ biến hiện nay Bên cạnh đ , còn nhiều loài dược liệu khác vẫn được thu hái, s dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa c những con

số thống kê cụ thể [10]

Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) còn gọi là cà quạnh, cà gai dây,

cà quýnh, cà vạnh, chẻ nan (Tày), b’rongoon (Ba a), c tên khoa học khác là

Solanum procumben Lour., thuộc họ Cà (Solanaceae) [18] Trong thành phần h a

học của cà gai leo, solasodine là hợp chất chính, đây là một steroid alkaloid được

tìm thấy ở khoảng 250 loài cây khác nhau thuộc họ à, đặc biệt là chi Solanum,

chúng thường tồn tại ở dạng glycoside ác nghiên cứu trước đây cho thấy solasodine c hoạt tính kháng viêm và bảo vệ gan, chống lại tế bào ung thư (đặc biệt là ngăn ngừa ung thư da) Solasodine còn là tiền chất để sản xuất các loại corticosteroid, testosteroid và thuốc tránh thai goài ra, chúng còn c tác dụng chống oxy h a, ngăn ngừa xơ gan [14] Gần đây, nghiên cứu cho thấy solasodine

còn có tác dụng bất hoạt các virus gây bệnh mụn giộp ở người như Herpes simplex,

H zoster và H genitalis (Chating và cs), bảo vệ chuột chống lại sự xâm nhiễm của

vi khuẩn Salmonella typhimurium, giảm lượng cholesterol trong máu… [64]

Tuy nhiên, từ trước đến nay cà gai leo được khai thác chủ yếu từ nguồn hoang dại, chúng thường phân tán manh múm và chất lượng không đồng đều, trữ lượng có giới hạn và hiện đang cạn kiệt do bị thu hái bừa bãi Vì thế, nguồn nguyên liệu này không đủ để đáp ứng cho việc nghiên cứu và điều trị

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật Phương pháp này với những ưu điểm vượt trội đã mở ra tiềm năng lớn để tăng thu sinh khối trong thời

gian ngắn, hàm lượng hợp chất thứ cấp (HCTC) cao, chủ động dễ điều khiển quy trình sản xuất tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết các hoạt chất sinh học trên quy mô công nghiệp, góp phần giải quyết những kh khăn n i trên [63]

licitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC trong tế bào đ [65] Elicitor thực vật báo hiệu việc hình thành các HCTC, bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy là phương thức để thu được các sản phẩm HCTC

có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất S dụng các elicitor sinh học và phi sinh học để kích thích hình thành các HCTC trong nuôi cấy tế bào vừa có thể rút ngắn thời gian lại đạt năng suất cao [42] Nghiên cứu nuôi cấy tế bào huyền phù có

bổ sung elicitor đã được thực hiện thành công ở một số đối tượng như cây nhân sâm

(Panax ginseng) [60], [99], rau má (Centella asiatica) [57], giây dác (Cayratia trifolia) [87], sen tuyết (Saussurea medusa) [106], [112], Pueraria tuberosa [80] …

Các elicitor thường được s dụng trong các nghiên cứu là methyl jasmonate (MeJA), salicylic acid (SA), dịch chiết nấm men (YE), jasmonic acid (JA), ethrel, chitosan [57], [62], [65]

Hiện nay đã c một số nghiên cứu sản xuất glycoalkaloid toàn phần nói chung và solasodine nói riêng từ cây cà gai leo, tuy nhiên hiệu suất chưa cao Nghiên cứu khả năng tích lũy glycoalkaloid toàn phần trong callus cà gai leo cho thấy hàm lượng đạt cao nhất 128,17 mg/g khối lượng khô sau 7 tuần nuôi cấy [56] Các tác giả cũng đã khảo sát khả năng tích lũy solasodine trong tế bào cà gai leo và kết quả cho thấy hàm lượng cao nhất thu được là 121,01 mg/g khối lượng khô sau 4 tuần nuôi cấy [59] Những nghiên cứu này đều thu được kết quả là hàm lượng glycoalkaloid toàn phần hay solasodine trong callus và tế bào đều cao hơn so với cây tự nhiên, tuy nhiên hiệu suất vẫn chưa cao S dụng các elicitor thực vật có thể cải thiện được vấn đề này

Xuất phát từ đ , chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng c a một

số elicitor lên khả năng t h lũy solasodine ở t bào in vitro c a cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) p dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù

nhiên cho các nghiên cứu trong lĩnh vực y học Các kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở cho việc xây dựng qui trình sản xuất solasodine từ sinh khối tế bào để ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm sau này

Đề tài là hướng nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất hoạt chất sinh học dùng làm dược liệu b ng nuôi cấy tế bào thực vật, góp phần vào việc bảo vệ và chăm s c sức khỏe cộng đồng

Những đ ng g p ới a luận n

Đây là một trong những công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong nuôi cấy tế bào cà gai leo Kết quả của luận án là đáng tin cậy và có thể s dụng để tiếp tục nghiên cứu phát triển sản xuất solasodine ở quy mô lớn hơn

Ph vi nghiên ứu

Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện in vitro tại Phòng thí

nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế từ tháng 11 năm 2011 đến tháng 11 năm 2014

Chư ng TỔNG QUAN T I LIỆU

1 SẢN UẤT C C H P CHẤT THỨ CẤP TỪ NUÔI CẤY TẾ B O THỰC VẬT

Phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh

hình thái của tế bào thực vật khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện in vitro c định

hướng thành những cấu trúc biệt h a hay chưa biệt hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật [42]

Nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng lớn trong việc cải thiện khả năng tổng hợp các HCTC có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp b ng phương pháp h a học Sự phát triển của các HCTC quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này u điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [64]

Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các HCTC

từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái Nhiều HCTC được sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng phân h a cao như rễ, lá và hoa Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp c khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có

sự tiếp xúc với môi trường khác các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện

ở một mức độ nào đ trong khối để tạo thành các HCTC [7]

Nuôi cấy tế bào thực vật sinh trưởng chậm hơn so với vi khuẩn, thời gian nhân đôi trong khoảng 24-72 giờ Sự khác nhau này dẫn đến việc phải s dụng các điều kiện vô trùng tuyệt đối cho nuôi cấy tế bào thực vật Thông thường, tế bào nuôi cấy không quang hợp, vì vậy phải bổ sung đường làm nguồn carbon Đây là nguồn

hơn so với nuôi cấy callus hay mô, cơ quan; thao tác dễ dàng và có khả năng tương thích với các thiết bị nuôi cấy tế bào s dụng cho vi sinh vật [79]

1.1.1 C phư ng ph p nu i ấy t o thực vật

1.1.1.1 Nuôi cấy mẻ

Nuôi cấy mẻ là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian nuôi cấy không thêm vào chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ sinh khối hay sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất Do vậy, các điều kiện môi trường thay đổi theo thời gian, mật độ tế bào tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống Nuôi cấy

mẻ được xem là một hệ thống đ ng, quần thể tế bào sinh trưởng và phát triển theo một số pha nhất định với những điều kiện đặc trưng [8]

Trước khi nuôi cấy mẻ, cần thiết phải tiến hành cấy chuyển Quá trình nuôi cấy đầu tiên trong bình tam giác, sau đ tế bào nuôi cấy được đưa vào hệ lên men nhỏ, rồi cấy chuyển vào hệ lên men lớn hơn ứ tiếp tục như vậy cho đến khi đạt được thể tích thích hợp Điều kiện bên trong hệ lên men sẽ thay đổi trong một chu

kỳ nuôi cấy mẻ, với sản phẩm và nồng độ tế bào tăng trong khi chất dinh dưỡng cạn kiệt dần hưng không c thành phần nào được bổ sung vào trong chu kỳ nuôi cấy Tất cả mẻ nuôi cấy sẽ được thu hồi khi sản phẩm thứ cấp đạt giá trị cực đại [8]

Các bình chứa mẫu được đặt trên máy lắc với tốc độ 50-200 vòng/phút hoặc

có thể nuôi cấy trong hệ lên men có cánh khuấy và sục khí tạo thuận lợi cho sự trao đổi khí, sự lưu thông của môi trường dinh dưỡng trong bình nuôi cũng như gia tăng

sự tiếp xúc giữa tế bào nuôi cấy với môi trường Trong đ , nuôi cấy dịch huyền phù chứa các tế bào và các khối tế bào sinh trưởng phân tán trong môi trường lỏng Thường khởi đầu b ng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy) [8]

Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết Tuy nhiên, cũng c những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào Mức độ

tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và

có thể điều chỉnh b ng cách thay đổi thành phần môi trường [63]

1.1.1.2 Nuôi cấy mẻ đ ạn

Phương pháp nuôi cấy mẻ hai giai đoạn được áp dụng đối với nhiều loại tế bào thực vật, và thành công đầu tiên là sản xuất hợp chất shikonin Trong phương pháp này, hai môi trường được s dụng Trong hệ lên men đầu tiên, điều kiện nuôi cấy được tối ưu h a cho sản xuất sinh khối tế bào Sau đ , các tế bào được tập trung

và đưa vào hệ lên men thứ hai chứa môi trường kích thích sự tổng hợp các sản phẩm thứ cấp [8]

1.1.1.3 Nuôi cấy mẻ có cung cấp d dưỡng

Đây là một hình thức khác của hệ thống nuôi cấy mẻ Sau khi tế bào nuôi cấy sinh trưởng cực đại, các chất dinh dưỡng sẽ dần cạn kiệt, lúc này các chất dinh dưỡng mới sẽ được cung cấp thêm vào hệ lên men mà không loại bỏ dịch nuôi cũ Trong hệ lên men này, có hệ thống điều khiển hàm lượng các chất dinh dưỡng được thêm vào giúp hạn chế hay tăng cường tốc độ sinh trưởng hoặc sự tích lũy T Tuy nhiên, trong trường hợp này thể tích dịch nuôi sẽ tăng lên, môi trường dinh dưỡng dưới dạng đậm đặc sẽ được s dụng để hạn chế vấn đề này Đây vẫn được gọi là nuôi cấy mẻ vì toàn bộ thể tích của hệ lên men cuối cùng vẫn được thu hồi theo từng mẻ [8]

1.1.1.4 Nuôi cấy liên tục

hược điểm của nuôi cấy mẻ là tốn thời gian kh trùng và cấy chuyển Nuôi cấy liên tục là phương pháp kinh tế hơn vì giúp kéo dài thời gian nuôi cấy hay kéo dài pha log ít nhất vài tháng Ở hệ thống này, dòng đi vào (môi trường mới) b ng với dòng đi ra (môi trường + tế bào và hợp chất trao đổi) để giữ thể tích luôn không đổi, và điều kiện của hệ thống luôn duy trì ổn định [79]

Do vậy, trong phương pháp nuôi cấy liên tục không những kích thước trung bình, trạng thái sinh lý của tế bào mà cả môi trường nuôi cấy đều không đổi và không phụ thuộc vào thời gian, điều này một mặt tạo điều kiện nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý của tế bào, mặt khác cải thiện quá trình sản xuất tế bào ở qui mô

Bản chất của quá trình nuôi cấy liên tục ở trạng thái ổn định cũng c thuận lợi do dễ dàng điều chỉnh hơn hệ lên men mẻ Trong suốt thời gian nuôi cấy mẻ, nhiệt lượng, sự sản xuất kiềm hoặc acid, và sự tiêu hao oxygen sẽ biến thiên từ các tốc độ rất thấp ở lúc bắt đầu tới tốc độ rất cao trong suốt pha log muộn Vì vậy, điều chỉnh môi trường của một hệ thống như thế kh hơn nhiều so với quá trình liên tục

ở trạng thái ổn định các tốc độ sản xuất và tiêu thụ là h ng số [79]

Về lý thuyết, nuôi cấy liên tục là phương pháp nuôi cấy đầy triển vọng để thu được các sản phẩm với nồng độ cao; Seki và cs (1997), Phisalaphong và Linden

(1999) đã nghiên cứu tăng hiệu suất paclitaxel b ng nuôi cấy liên tục tế bào Taxus cuspidata và s dụng nuôi cấy bán liên tục tế bào T canadensis [94]

Tuy nhiên, vẫn còn nhiều hạn chế trong nuôi cấy liên tục Các tế bào luôn ở trạng thái sinh l không đổi, nhưng sự tích lũy các HCTC thường diễn ra trong các

tế bào có tốc độ sinh trưởng thấp Vì vậy, kỹ thuật này chỉ nên áp dụng cho những sản phẩm trao đổi nào được sản xuất trong quá trình sinh trưởng Nhược điểm thứ hai của nuôi cấy liên tục là thời gian nuôi cấy dài làm tăng khả năng dễ bị nhiễm bởi

vi sinh vật (Ramawat và Merillon, 2004)

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện và sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị Khả năng ứng dụng của phương pháp này thể hiện qua việc có rất nhiều công trình nghiên cứu mới được công bố Những năm gần đây,

sự phát triển của các HCTC quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này, đặc biệt là khả năng c thể thay đổi nguồn lợi các hoạt chất sinh học từ thực vật b ng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào u thế về mặt nguyên lý của công nghệ này là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng dược chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [64]

1.1.2 Sản uất h p hất thứ ấp

1 p ấ ấp

Hiện tượng trao đổi chất thứ cấp đã được công nhận từ giai đoạn sớm của thí nghiệm thực vật hiện đại Trong công trình xuất bản năm 1873, Julius Sachs, một người tiên phong trong sinh lý thực vật, đã mô tả như sau: " húng ta c thể chỉ rõ các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất như là các hợp chất được tạo ra bởi

trao đổi chất, nhưng chúng không chỉ được s dụng cho việc hình thành các tế bào mới Vai trò quan trọng khác của những hợp chất này đối với việc kiểm soát bên trong thực vật vẫn chưa được biết đến" Sachs không đề cập đến những chức năng của các sản phẩm phụ mà ngày nay được biết đến là các HCTC (dẫn theo Neumannn, 2009) [66]

Các sản phẩm trao đổi thứ cấp thường chiếm một lượng nhỏ (nhỏ hơn 1% trọng lượng khô) và độc lập cao trong thời kỳ sinh lý và phát triển của thực vật Mặc dù vai trò của T dường như không được thừa nhận trong việc duy trì quá trình sống cơ bản của thực vật - nơi mà chúng được tổng hợp, chúng lại có vai trò quan trọng trong sự tương tác giữa thực vật với môi trường Nghiên cứu chất trao đổi thứ cấp thực chất là lĩnh vực hấp dẫn của sinh lý học thực vật nói riêng hay thực vật học nói chung [66]

Các HCTC có tác dụng dược lý hoặc độc tính đến con người và động vật được gọi là các hoạt chất sinh học ở thực vật Hoạt chất sinh học điển hình ở thực vật cũng được hình thành như các HCTC [27]

1.1.2.2 Vai trò củ p ấ ấp

H T được sản xuất trong cơ thể thực vật bên cạnh con đường sinh tổng hợp và chuyển h a sơ cấp của các hợp chất đích trong quá trình sinh trưởng và phát triển (như carbohydrate, amino acid, protein và lipid) húng c thể được xem như

là những sản phẩm hóa sinh "dự trữ" trong tế bào thực vật và không cần thiết cho các chức năng hàng ngày của cây Trong hệ thống phát sinh loài, hoạt chất sinh học thứ cấp ở thực vật được tổng hợp một cách ngẫu nhiên nhưng chúng có những vai trò nhất định Một số trong chúng có khả năng nắm giữ các vai trò quan trọng trong đời sống thực vật Ví dụ, flavonoid có thể bảo vệ chống lại các gốc tự do được sinh

ra trong quá trình quang hợp; terpenoid có thể thu hút côn trùng thụ phấn, phát tán hạt, hoặc ức chế cạnh tranh giữa các loài thực vật; alkaloid giúp tránh sự tấn công của động vật ăn cỏ hoặc các loại côn trùng (phytoalexin) HCTC còn có tác dụng phát tín hiệu phân t tế bào hoặc mang những chức năng khác trong cơ thể thực vật Việc sản xuất các HCTC ở thực vật thường tuân theo quy luật o đ , hầu hết các

xuất những loại hợp chất này Tuy nhiên, các loài thực vật c độc tính hoặc dược tính điển hình chứa những hoạt chất sinh học mạnh với nồng độ cao hơn so với các loại cây lương thực [27]

Tế bào thực vật đã được s dụng thành công như là một nhà máy sản xuất lượng lớn T dưới các điều kiện cụ thể [66] Sản xuất HCTC b ng nuôi cấy tế bào thực vật giúp khắc phục những kh khăn của phương pháp truyền thống như rút ngắn thời gian, giảm chi phí nhân công, vấn đề mặt b ng và nhất là có thể thu được một lượng lớn sản phẩm như mong muốn Ngày nay, phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trên quy mô lớn và ngày càng có nhiều nghiên cứu chuyên sâu nh m điều khiển để tăng hàm lượng các T tích lũy trong tế bào thực vật được nuôi cấy

Các nghiên cứu cho thấy r ng nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất các sản phẩm thứ cấp với hàm lượng lớn hơn so với các chất đ được chiết từ cây ngoài tự nhiên (Bảng 1.1) [63]

u điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên cơ sở:

- Tổng hợp các HCTC có giá trị được thực hiện dưới sự điểu khiển các yếu

tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và thổ nhưỡng

- Loại bỏ các ảnh hưởng sinh học đến sản xuất HCTC trong tự nhiên

- Chọn giống cây trồng cho nhiều loại HCTC với sản lượng cao hơn

- Với việc tự động h a, điều khiển sinh trưởng và điều hòa quá trình chuyển hóa của tế bào, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên

- Kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm

- Một số sản phẩm trao đổi chất từ dịch nuôi cấy huyền phù có chất lượng cao hơn cây hoàn chỉnh [64]

Bảng 1.1 Sản phẩm thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật so sánh với cây tự nhiên [63]

HCTC Loài thực vật

Hiệu suất (% dw) Nuôi cấy

t bào Cây tự nhiên

Morinda citrifolia Catharanthus roseus Coleus blumeii Nicotiana tabacum Dioscorea deltoides Thalictrurn minor Coptis japonica Galium verum

G aparbze

N tabacum Stephania cepharantha Tripterygium wilfordii

20,00 (s) 27,00 (c) 18,00 (s) 1,00 (s) 15,00 (s) 0,036 (s) 2,00 (s) 10,00 (s) 10,00 (s) 5,40 (s) 3,80 (s) 3,40 (c) 2,30 (s) 0,05 (s)

1,50 4,50 2,20 0,30 3,00 0,0003 2,00 0,01 2,00-4,00 1,20 0,20 2,00 0,80 0,001

* Chú thích: (c): nuôi cấy callus; (s): nuôi cấy huyền phù

1.1.3 C nghiên ứu sản uất h p hất thứ ấp ng nu i ấy t o thự vật

1 ư

Để sản xuất các sản phẩm thứ cấp từ thực vật, mô thực vật ngoại sinh từ cây hoàn chỉnh được nuôi cấy huyền phù trong điều kiện vô trùng Nhiều sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [42] Các HCTC không chỉ là gia vị, chất tạo màu, tạo mùi mà hầu hết là dược liệu

Ở nước ta, một số dược liệu cũng được nghiên cứu tách chiết từ tế bào thực vật Chẳng hạn, vincristin, vinblastin từ tế bào dừa cạn, solasodine từ tế bào cà gai leo, curcumin từ tế bào nghệ đen, asiaticoside từ tế bào rau má …

chứa nhiều alkaloid Từ dừa cạn người ta chiết được các chất chữa ung thư như vinblastin, vincristin và chữa cao huyết áp như ajmalicin, serpentin Tuy nhiên, hàm lượng của những chất này trong cây tự nhiên rất thấp Bùi Văn ệ và Nguyễn Ngọc Hồng (2006) đã nghiên cứu khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng lên quá trình tạo sinh khối tế bào và tích lũy alkaloid toàn phần có trong dịch nuôi cấy [5]

Solasodine là một hợp chất chính trong cây cà gai leo (S hainanense) có

nhiều tác dụng dược l đã được nghiên cứu và công bố Solasodine được tách chiết

từ cây tự nhiên nhưng hàm lượng chưa cao và nguồn nguyên liệu ngày càng khan hiếm Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2010) đã nghiên cứu sản xuất solasodine từ callus

cây cà gai leo in vitro và thu được kết quả cho thấy, hàm lượng solasodine tích lũy

trong callus cao hơn khoảng 8,5 lần so với tách chiết từ rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi [56] Nhóm tác giả này (2011) cũng tiếp tục nghiên cứu nuôi cấy tế bào cà gai leo trong chai tam giác để thu solasodine và nhận thấy, solasodine tích lũy trong tế bào cao hơn trong callus [59]

Asiaticoside là hoạt chất chính của rau má (Centella asiatica), có hoạt tính

chống oxy hóa, chữa lành vết bỏng, bảo vệ tế bào thần kinh và sinh tổng hợp collagen [7] Mặc dù có nhiều hoạt tính quan trọng nhưng hàm lượng asiaticoside trong cây rau má không đáng kể Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã nghiên cứu tạo callus và khảo sát khả năng tích lũy asiaticoside trong callus cây rau má [6] Thiết lập nuôi cấy tế bào huyền phù cây rau má và khảo sát sự tích lũy asiaticoside trong tế bào nuôi cấy cũng đã được Loc và An (2010) nghiên cứu [55]

Quinone là một nhóm chức nổi bật với tác dụng kháng lao, chống ung thư,

chữa phong, chống hen suyễn được xác nhận có trong thành phần của Drosera burmanni, là một loài thực vật bắt mồi nhỏ, thân thảo, mang nhiều giá trị ứng dụng

Quách Ngô Diễm Phương và cs (2010) đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền

phù tế bào cây D burmanni cho mục tiêu thu nhận quinone Kết quả ghi nhận hàm

lượng Plumbagin (một trong nhóm những hợp chất naphthoquinone) trong sinh khối

tế bào là 0,02% [11]

Dịch chiết các loài Drosera đã từng được chứng minh về khả năng kháng

oxy hóa từ rất nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như từ khả năng trị liệu trong những bài thuốc dân gian Quách Ngô Diễm Phương và cs (2011) đã sàng lọc và ly trích thành công một hợp chất flavonoid từ phân đoạn cao chiết có hoạt tính kháng

oxy hóa từ sinh khối cây D indica nuôi cấy in vitro Hợp chất được tinh sạch và xác

định cấu trúc là quercetin [13]

1 ư c

Một số dược chất có nguồn gốc thực vật như mao địa hoàng từ Digitalis purpurea chữa trị rối loạn tim mạch, codeine từ cây anh túc (Papaver somniferum) làm thuốc giảm đau, an thần, vinblastine và vincristine từ cây dừa cạn (C roseus) điều trị bệnh bạch cầu và quinine từ cây C officinalis bệnh sốt rét Routian và

Nickell nhận được b ng sáng chế đầu tiên về sản xuất một số hợp chất b ng nuôi cấy tế bào thực vật vào năm 1956 hiều nhà nghiên cứu đã sản xuất các hợp chất

có ích b ng nuôi cấy rễ tơ, callus và tế bào huyền phù Sự đa dạng của các nguyên liệu thực vật có thể thích ứng với nuôi cấy rễ tơ và callus uôi cấy tế bào huyền

phù Thalictrum minus sản xuất stomachic và berberine Nuôi cấy callus Stizolobium hassjo sản xuất thuốc chữa parkinson L-dopa Nuôi cấy huyền phù Hyoscyamus niger sản xuất một dẫn xuất của hyoscyamine chống tác động kiểu cholin [94]

gười ta cũng đã thu được các chất như caffein từ nuôi cấy tế bào cây cà phê

(Coffea arabica), betalain trong callus củ cải đường, berberin từ tế bào cây Coptis japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng đáng kể

berberin trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần b ng phương pháp nuôi cấy tế bào) Những chất này được s dụng rộng rãi trong công nghiệp hương liệu và trong y học [92]

Rễ của cây nhân sâm (P ginseng) là một loại dược phẩm quý giá, có tác

dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể Trong rễ của

nó chứa nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau Trong đ , ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích Furuya và cs (Đại học Kitasato,

Nhật) đã nghiên cứu nuôi cấy mô callus P ginseng từ những năm 1970 aisha

(1990) đã nghiên cứu quy trình sản xuất trên quy mô lớn, s dụng nhiều kiểu hệ lên

bào nuôi cấy P ginseng chứa ginsenoside hoi (1993) đã nghiên cứu nuôi cấy P ginseng trên quy mô công nghiệp, tác giả nhận thấy 2,4-D và KIN ảnh hưởng tới

hàm lượng saponin trong callus và các tế bào nuôi cấy huyền phù; 3,62% saponin tổng số được tìm thấy trong callus nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS bổ sung 5,00 mg/L 2,4- và 1,00 mg/ , nhưng lại thu được 8,78% khi nuôi cấy trên môi trường có 10,00 mg/L 2,4-D và 1,00 mg/L KIN (dẫn theo Misawa, 1994) [63]

Callus Taxus mairei được tạo ra từ mảnh lá và thân trên môi trường B5 bổ sung

2 mg/L 2,4- hoặc òng tế bào được tạo ra từ callus c nguồn gốc từ thân và lá Một trong những dòng tế bào này sau khi bổ sung các tiền chất và nuôi trong 6 tuần thì

cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ sản xuất khoảng 200 mg taxol [64]

hất tanshinone và cryptotanshinone của cây Salvia miltiorrhiza c tác dụng

ngăn ngừa biến chứng thiếu máu cục bộ ở cơ tim; tanshinone đã th nghiệm thành công trong điều trị lâm sàng chứng đau thắt ngực ở Trung Quốc Vincristine và

vinblastine được sản xuất b ng nuôi cấy tế bào ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus)

là các indole alkaloid đã trở thành thuốc c giá trị trong h a trị liệu ung thư (theo Vijaya, 2010) [103]

1.2 ỨNG DỤNG ELICITOR ĐỂ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY H P CHẤT THỨ CẤP TRONG NUÔI CẤY TẾ B O THỰC VẬT

1.2.1 Elicitor

1

licitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC trong tế bào Sự kích kháng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm lượng của elicitor [65] licitor bao gồm các chất c nguồn gốc từ mầm bệnh và các chất được tiết ra từ thực vật b ng phản ứng của mầm bệnh (elicitor nội sinh) Trên cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor c thể được phân thành 2 nh m là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học

- Elicitor p s là các chất c nguồn gốc không thuộc sinh vật học,

gồm các muối vô cơ, các kim loại nặng và các tác nhân vật l như s ng siêu âm, áp suất, nhiệt độ, và p

- El s là các chất c nguồn gốc sinh vật học, bao gồm các

polysacharide c nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin hoặc cellulose), các vi sinh vật (chitin hoặc glucan) và các glycoprotein, -protein hay các protein nội bào

có chức năng là gắn với các receptor và tác động b ng cách hoạt h a hoặc bất hoạt một số enzyme hoặc các kênh ion

Bảng 1.2 Phân loại elicitor trong sản xuất các hợp chất thứ cấp [65]

A Theo bản chất elicitor Các elicitor sinh học Các elicitor phi sinh học

- Được giải phóng trực tiếp từ vi sinh

vật và được chấp nhận bởi tế bào thực

vật (các enzyme, các mảnh thành tế

bào)

- Được tạo thành bởi hoạt động của vi

sinh vật trên tế bào thực vật (các đoạn

pectin)

- Được tạo thành bởi hoạt động của

enzyme thực vật trên các thành tế bào

vi khuẩn (chitosan, glucan)

- Các hợp chất: nội sinh và tạo thành

trong tự nhiên; được hình thành hoặc

tiết ra bởi tế bào thực vật khi đáp ứng

kích thích khác nhau

- Tác dụng tự nhiên của các tác nhân vật

lý hoặc hóa học theo đường nội sinh tạo thành các elicitor sinh học

- Tia UV, Windfall

- Các protein biến tính (Rnase)

+ Thuốc diệt nấm (maneb, butylamin, benomyl); thuốc diệt cỏ (acifluorofen)

B Theo nguồn gốc c a elicitor Các elicitor ngo i sinh Các elicitor nội sinh

- Hình thành từ bên ngoài tế bào, bao

gồm phản ứng trực tiếp hoặc qua các

chất nội sinh trung gian

- Polysaccharide: glucomanose,

glucan, chitosan

- Peptide và chuỗi các ion dương:

monilicolin, poly-L-lysine, polyamine,

glycoprotein

- Enzyme: polygalacturonase,

endo-polygalacturonase acid lyase, cellulase

- Acid béo: acid arachidonic, acid

- Được tạo thành qua các phản ứng thứ cấp, cảm ứng b ng một tín hiệu sinh học hoặc phi sinh học trong tế bào

- Dodeca-β-1,4-D-galacturonide

- Hepta-β-glucoside

- Alginate oligomer

Ngoài ra, có thể phân loại elicitor dựa trên nguồn gốc của chúng 2 loại elicitor là elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh

- Elicitor ạ s là các chất c nguồn gốc bên ngoài tế bào như các

polysaccharide, polyamine và các acid béo

- Elicitor ộ s là các chất c nguồn gốc bên trong tế bào, được hình thành

thông qua các phản ứng thứ cấp, được cảm ứng b ng tín hiệu sinh học hay phi sinh học, chẳng hạn như galacturonide hoặc hepta-β-glucoside v.v [65]

dụ

Elicitor thực vật là các h a chất c nguồn gốc khác nhau, c khả năng gây nên các đáp ứng về mặt hình thái, sinh l và tích lũy phytoalexin (chất được sinh ra ở thực vật khi chịu tác động của các tác nhân gây bệnh) húng c thể là các elicitor phi sinh học như các ion kim loại, hợp chất vô cơ hoặc elicitor sinh học c nguồn gốc từ nấm, vi khuẩn hoặc động vật ăn cỏ, mảnh vỡ thành tế bào thực vật cũng như các hợp chất được giải ph ng ra tại vị trí tổn thương của thực vật do mầm bệnh hoặc động vật tấn công Việc thực vật bị x l b ng chất kích kháng hoặc bị tấn công b ng mầm bệnh gây ra một loạt các phản ứng phòng vệ, bao gồm sự tích lũy các HCTC bảo vệ ở cả trong cây tự nhiên cũng như trong nuôi cấy Mặc dù đã c những nghiên cứu sâu về cơ chế ảnh hưởng của elicitor lên sự sản xuất HCTC trong các thực vật, tuy nhiên cơ chế của sự elicitor vẫn chưa được hiểu đầy đủ nhiều giả thuyết đã được đưa ra như cơ chế truyền tin bởi a2+, các yếu tố ảnh hưởng đến

sự nguyên vẹn của màng tế bào, các con đường ức chế hay hoạt h a nội bào hoặc sự thay đổi áp suất thẩm thấu [65]

Elicitor không chỉ cảm ứng sự hình thành phytoalexin de novo mà còn hoạt

hóa sự sinh tổng hợp nhiều hợp chất chủ yếu trong tế bào nuôi cấy Sự tổng hợp

sesquiterpene gossypol ở Gossypium arboretum tăng lên hơn 100 lần khi dùng elicitor có nguồn gốc từ Verticillum dablia, hay sự tăng sinh tổng hợp của

benzopheanthridine alkaloid sanguinarine lên 26 lần khi s dụng elicitor trong

nuôi cấy huyền phù tế bào Papaver somniferum Sự cảm ứng sinh tổng hợp isoflavonoid ở huyền phù tế bào Pueraria lobata b ng elicitor sinh học (dịch chiết

nấm men) hay elicitor phi sinh học (CuCl2) đã được nghiên cứu, đặc biệt ở mức độ

phân t Elicitor tạo điều kiện để nghiên cứu ở mức phân t của con đường truyền tín hiệu thông qua những tín hiệu ngoại bào dẫn đến sự sinh tổng hợp HCTC, liên quan tới chất truyền tín hiệu thứ hai như nh m oxygen hoạt hóa, Ca2+ và phosphoinositide [65]

Những nghiên cứu chuyên sâu đã g p phần hình thành cơ chế cho quá trình cảm ứng b ng elicitor ở thực vật Các nghiên cứu chủ yếu tập trung về các elicitor sinh học và carbohydrate thông thường, còn sự hiểu biết về tác động của các elicitor phi sinh học trong việc gia tăng vượt mức các HCTC ở thực vật vẫn còn rất sơ sài, quá trình cảm ứng b ng elicitor được giả thuyết là bao gồm tín hiệu Ca2+, các nhân

tố đảm bảo tính nguyên vẹn của tế bào, sự ngăn cản hay hoạt h a các con đường nội bào và thay đổi áp suất thẩm thấu hoạt động như một tác nhân gây stress

Những nghiên cứu bước đầu về sự tác động của các elicitor sinh học ở hệ thống thực vật được nghiên cứu dựa vào cơ chế cảm ứng trên tế bào động vật Ở tế bào động vật, các thụ quan (receptor) định vị ở màng tế bào sẽ hoạt hóa kênh ion và protein kinase Tương tự như thế, các b ng chứng chứng minh sự hiện diện của các thụ quan ở màng tế bào thực vật đã được ghi nhận ơ chế cảm ứng này dựa trên sự tương tác giữa elicitor-thụ quan Khi tế bào thực vật được x lý với elicitor thì một loạt các phản ứng sinh hóa xảy ra, bao gồm:

- Elicitor gắn vào thụ quan ở màng tế bào

- Thay đổi dòng ion vào thông qua màng tế bào thực vật như kênh l-, K+,…,

ở thực vật, Ca2+

hoạt động như chất truyền tin thứ hai với các đáp ứng khác nhau từ tín hiệu của môi trường kể cả mầm bệnh Ví dụ, ở tế bào cây ngò tây, người ta từng phát hiện ra kênh calci đáp ứng cảm ứng và một kênh vận chuyển vào của calci được tìm thấy trong vòng vài phút sau khi thêm vào elicitor từ nấm

- ia tăng hoạt tính của phospholipase thực vật được tìm thấy ở một vài mô thực vật và nuôi cấy tế bào thực vật sau khi x lý với elicitor, tổng hợp các tín hiệu thứ cấp như nsP3 và deacylglycerol ( ), giải phóng tín hiệu nội bào trung gian

Ca2+, nitric oxyde và con đường tín hiệu octadecanoid

- Sự thay đổi nhanh trong việc phosphoryl h a protein được quan sát dựa

đây chứng minh r ng sự phosphoryl h a đ ng một vai trò quan trọng trong sự chuyển tín hiệu thực vật chống lại mầm bệnh và stress, hoạt hóa protein kinase

- Hoạt hóa protein G (là một phần trong việc đáp ứng tín hiệu với elicitor)

- Hoạt h a P oxydase đáp ứng AOS (active oxide specie), acid hóa cytosol

- Tái sắp xếp lại bộ xương tế bào

- Tạo các oxy hoạt động

- Tích lũy các protein c liên quan đến mầm bệnh như chitinase và glucanase, endopolygalacturonase… các nhân tố ngăn cản protease

- Sự chết tế bào ở vị trí bị xâm nhiễm

- Sự thay đổi cấu trúc ở màng tế bào (lignin hóa màng tế bào, tích tụ mô sẹo)

- Hoạt h a phiên mã các gen đáp ứng kháng

- Các phân t đề kháng của thực vật như tanin, phytoalexin được phát hiện

2-4 giờ sau khi x lý với elicitor

- Tổng hợp jasmonic và acid salicylic như một thông tin thứ cấp

- Đáp ứng tập nhiễm SAR (systemic acquired resistance)

Không phải tất cả các elicitor đều diễn ra theo chuỗi sự kiện phía trên, những nghiên cứu về trật tự thời gian của những sự kiện này và sự kết nối bên trong giữa chúng còn nhiều phức tạp và vẫn đang được nghiên cứu [25]

Nồng độ elicitor: Nồng độ elicitor đ ng vai trò rất quan trọng trong quá trình

cảm ứng Prakash và cs (2008) nhận thấy khi bổ sung các elicitor jasmonic acid, YE

và chitosan ở các nồng độ khác nhau đều tác động đến sự tích lũy azadirachtin trong

tế bào Azadirachtin indica Bổ sung jasmonic acid và YE ở nồng độ cao (100 mg/L)

cho hiệu quả tích lũy azadirachtin tốt hơn ở nồng độ thấp (10-50 mg/L) Trong khi

đ , nồng độ chitosan thấp (50 mg/ ) kích thích azadirachtin tích lũy cao hơn và giảm dần khi tăng lượng chitosan (100-500 mg/L) [77]

Thời gian tiếp xúc với elicitor: ghiên cứu của amdeo và cs (2007) cho thấy sản xuất ajmalicine tăng khoảng 3 lần bởi ở tế bào C roseus được cảm ứng với dịch chiết của T viride trong 48 giờ, trong khi đ tăng 2 lần ở tế bào được cảm ứng bởi dịch chiết của A niger và F moniliforme Tuy nhiên, thời gian tiếp xúc cao hơn

96 giờ làm giảm ajmalicine tích lũy ết quả tương tự cũng được công bố bởi Rijhwani và Shanks (1998), Moreno và cs (1993), Negeral và Javelle (1995) [65]

Thời kỳ nuôi cấy: Thời điểm cấy chuyển là một yếu tố quan trọng trong sản

xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học nhờ sự cảm ứng ết quả sản xuất

ajmalicine từ tế bào C roseus của amdeo và cs (2007) cho thấy ajmalicine cao

nhất (166 µ/g, dw) được tích lũy trong tế bào 20 ngày tuổi được x l với dịch chiết

của T viride [65]

Thành phần dinh dưỡng: Thành phần môi trường cũng đ ng một vai trò quan

trọng cho quá trình cảm ứng Theo Namdeo và cs (2007), sự tích lũy ajmalicine trong môi trường Zenk nhiều hơn so với môi trường MS [65]

Ngoài ra, ảnh hưởng của sự cảm ứng cũng còn phụ thuộc vào đặc tính của elicitor, dòng tế bào hoặc các dòng vi sinh vật s dụng elicitor, sự có mặt của các chất điều hòa sinh trưởng, thành phần dinh dưỡng của môi trường và các điều kiện nuôi cấy [65]

1.2.2 Nghiên cứu ứng d ng elicitor trong nu i ấy t o thự vật

1.2.2.1 Nghiên c u ở ư

Tại Việt Nam, việc s dụng elicitor trong các nghiên cứu cải thiện khả năng tích lũy các HCTC khi nuôi cấy tế bào mới được quan tâm trong thời gian gần đây

Quách Ngô Diễm Phương và cs (2010) đã th nghiệm tăng sinh hàm lượng

quinone trong cây D burmanni in vitro b ng phương pháp s dụng elicitor Kết quả cho thấy khả năng làm thay đổi hàm lượng hoạt chất trong cây in vitro của các tác

nhân cảm ứng bao gồm: chất dẫn truyền tín hiệu (SA), tác nhân cảm ứng cây phản ứng phòng vệ (vi khuẩn và nấm men) hay kỹ thuật gây stress điều kiện nuôi cấy

(stress dinh dưỡng) Trong đ , khi bổ sung dịch chiết nấm men, hàm lượng quinone tăng từ 1,12-2,66 lần so với đối chứng, salicylic acid làm tăng 1,2-2,0 lần, sinh khối

vi khuẩn làm tăng 1,22-2,46 lần và gây stress dinh dưỡng làm tăng 1,15-1,5 lần hàm lượng quinone trong cây so với đối chứng [12]

Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2012) nghiên cứu ảnh hưởng của benzoic acid và dịch chiết nấm men đến việc tăng khả năng sinh tổng hợp

2-hydroxy-asiaticoside trong nuôi cấy tế bào cây rau má (Centella asiatica) Kết quả nhận thấy

khi bổ sung ở ngày thứ 10 của nuôi cấy lần lượt 100 µM 2-hydroxybenzoic acid và

4 g/L dịch chiết nấm men, hàm lượng asiaticoside tích lũy trong tế bào rau má tăng gấp 5 và 3,5 lần so với đối chứng không cảm ứng [57]

1.2.2.2 Nghiên c u ở trên th gi i

Trên thế giới cho đến nay đã c rất nhiều công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng và khả năng tích lũy HCTC từ nuôi cấy tế bào thực vật Hầu hết các nghiên cứu cho thấy hàm lượng HCTC tăng lên khi bổ sung elicitor Cụ thể:

Pereira và cs (2007) s dụng các elicitor sinh học (Candida albicans, Fusarium oxyporum, Penicillium avelanium và Saccharomyces cerevisiae) để

nghiên cứu tăng khả năng tích lũy triterpene (oleanolic acid và ursolic acid) trong

nuôi cấy tế bào Tebernaemontana catharinensis Kết quả cho thấy, S cerevisiae có

khả năng làm tăng tích lũy triterpene tốt nhất, đạt 5 và 7 mg/g khối lượng khô lần lượt cho ursolic và oleanolic acid Trong khi đ các elicitor còn lại ảnh hưởng kém

hơn đến khả năng tích lũy triterpene trong nuôi cấy tế bào T catharinensis [73]

Ramawat và cs (2008) đã nghiên cứu cải thiện khả năng tích lũy

isofllavonoid trong tế bào loài Pueraria tuberosa b ng MeJA, SA và YE Kết quả

cho thấy isoflavonoid đạt được cao nhất khi bổ sung 150 mg/L YE [80]

Keng và cs (2010) s dụng 4 loại elicitor: chitosan, NaH2PO4, Na2CO3 và polyvinylpyrrolidone (PVP) để khảo sát ảnh hưởng của chúng đến khả năng tích lũy

alkaloid trong tế bào Eurycoma longifolia nuôi cấy huyền phù Hai alkaloid trong

nghiên cứu này là 9-hydroxycanthin-6-one và 9-methoxycanthin-6-one Kết quả sau 13 ngày nuôi cấy có x lý elicitor cho thấy, bổ sung NaH2PO4 tăng khả năng tích lũy 2

loại alkaloid cao hơn các loại elicitor còn lại Cụ thể ở nồng độ 2 mg/L và 20 mg/L NaH2PO4 lần lượt đạt được 0,94% 9-methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-one là 0,75% so với đối chứng 0,08% [50]

Rhee và cs (2010) nghiên cứu tăng cường khả năng tích lũy decursin và

decursinol trong nuôi cấy rễ và rễ tự nhiên của cây Angelica gigas Nakai b ng

elicitor Các loại elicitor được s dụng gồm YE, chitin, MeJA, SA và Cu2+ Nuôi

cấy rễ A gigas với sự bổ sung kết hợp 2 g/L YE và 0,5 mM Cu2+ tại pha cuối của đường cong sinh trưởng đã tăng sự tích lũy decursin và decursinol lên 6,86 mg/l, cao gấp 3,22 lần so với đối chứng [86]

Cây nghệ vàng (Curcuma longa ) được nuôi cấy in vitro trong hệ lên men

2,5 L sau 17 đến 22 tuần ousins và cs (2010) đã s dụng nhiều elicitor khác nhau

để tăng khả năng tổng hợp các HCTC ở cây này Ở thí nghiệm thứ nhất, phenylalanine hoặc MeJ được bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ tuần thứ 12 đến

17 Thí nghiệm thứ 2, cây con được bổ sung các chất như proline, dịch chiết cá giàu proline, MeJA hoặc chitosan vào tuần thứ 20 (thời gian kéo dài 1,5 tuần) Sau 5 tuần x lý ở thí nghiệm thứ nhất, sinh khối của cây giảm và sự tích lũy các hợp chất chống oxy h a cũng giảm, sự suy giảm khả năng chống oxy h a tương tự nhau khi

x lý riêng lẽ phenylalanine, MeJA hoặc x lý kết hợp Ở thí nghiệm thứ 2, khi x

lý stress nitrogen ở nồng độ thấp, hàm lượng các hợp chất phenol tăng lên, chiếm 4,7% khối lượng khô, cao hơn đối chứng chiếm 4,1% khối lượng khô [40]

iệu quả của các oligosaccharide ( P4, P7 và P10) tách chiết từ Fusarium oxysporum zf17 lên khả năng sản xuất diosgenin ở cây Dioscorea zingiberensis đã

được i và cs (2011) nghiên cứu Tế bào huyền phù được x l elicitor sau 26 ngày nuôi (hỗn hợp oligosaccharide ở nồng độ 20 mg/ ) và thu vào ngày thứ 32 àm lượng diosgenin thu được cao nhất là (2,187 mg/ ), gấp 5,65 lần so với đối chứng (0,387 mg/ ) X l elicitor riêng lẻ ở các nồng độ 2-10 mg/ , công thức x l P7

6 mg/L cho hiệu quả cao nhất, hàm lượng diosgenin đạt 3,202 mg/ , gấp 8,27 lần đối chứng hi x l P7 hai lần vào ngày 24 và 26 và thu vào ngày 30, hàm lượng diosgenin tăng lên đáng kể (4,843 mg/ , gấp 12,38 lần so với đối chứng) [53]

Veerashree và cs (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor lên sự tạo thành

gymnemic acid trong nuôi cấy huyền phù tế bào Gymnema sylvestre Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào G sylvestre được x lý với 4 elicitor khác nhau: MeJA, YE,

chitin, và pectin Kết quả cho thấy cả 4 loại elicitor được th nghiệm đều cảm ứng

sự tạo thành gymnenic acid trong nuôi cấy huyền phù àm lượng gymnemic acid đạt được cao nhất sau khi x lý với YE (100,47 mg/L), tiếp đ MeJ (70,43 mg/ ), pectin (64,19 mg/L) và chitin (62,72 mg/L) Việc bổ sung elicitor đã có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng tế bào so với mẫu đối chứng tương ứng Hàm lượng gymnemic acid đạt cao nhất sau khi x lý với 0,5 g/L dịch YE trong 20 ngày nuôi cấy, cao gấp 5,25 lần so với mẫu đối chứng [102]

Bota và cs (2012) đã s dụng 2 chủng Botrytis và Sclerotinia là tác nhân cảm ứng để sản xuất flavonoid ở cây Digitalis lanata ác tác giả đã s dụng 1-2 mL

dịch nấm/100 m dịch huyền phù để cảm ứng dòng tế bào số 11 và 13 ết quả cho thấy ở cả 2 dòng tế bào và 2 elicitor, sự tích lũy flavonoid đều tăng theo thời gian và nồng độ x l àm lượng flavonoid thu được sau 96 giờ cảm ứng, tế bào dòng 11

đạt 1000 mg% với Botrytis và 999,81 mg% với Sclerotinia, dòng tế bào 13 đạt 1051,65 mg% với Botrytis và 1025,43 mg% với Sclerotinia [32]

dmeh và cs (2014) đã s dụng dịch chiết A niger, Penicillium notatum,

Y , và chitosan để cảm ứng sản xuất psoralen trong quá trình nuôi cấy tế bào cây

Psoralea corylifolia X l elicitor b ng A niger làm tăng quá trình sản xuất psoralen lên 9 lần so với đối chứng X l b ng Penicillium notatum, YE, và chitosan làm tăng tích lũy psoralen lên 4-7 lần ông thức x l A niger ở nồng độ

1% cho hiệu quả cao nhất, hàm lượng psoralen đạt 9,850 μg/g sinh khối khô [21]

Nghiên cứu ảnh hưởng của MeJ đến khả năng tích lũy astragaloside ở rễ tơ

cây Astragalus membranaceus 34 ngày tuổi, Jiao và cs (2014) nhận thấy hàm lượng

đạt cao nhất khi x lý 157,4 µM MJ trong 18,4 giờ Astragaloside đạt 5,5 ± 0,13 mg/g khối lượng khô, cao hơn 2,1 lần so với mẫu đối chứng (2,7 ± 0,05 mg/g khối lượng khô) [49]

Các elicitor sinh học (dịch chiết Rhizopus oligosporus và A niger) và phi

sinh học (MeJ và S ) đã được Vaddadi và cs (2015) s dụng để tăng cường khả

năng tổng hợp các hoạt chất sinh học ở cây cà phê vối (Coffea canephora) Kết quả

nghiên cứu cho thấy các elicitor đã làm tăng đáng kể các HCTC được tổng hợp, caffeine tăng 42%, theobromine tăng 39%, trigonelline tăng 46%, cafestol và kahweol tăng 32% [100]

1.3 C Y C GAI LEO

1.3 Đ điể sinh họ

1.3.1.1 N ố p ố

Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Cà (Solanaceae), còn

có tên khoa học khác là Solanum procumbens Ngoài ra, cà gai leo còn có nhiều tên

gọi địa phương khác như: cà quánh, cà quạnh, cà quýnh, cà bò, cà cạnh, cà hải nam,

cà gai dây [2]

Cà gai leo mọc rải rác ven rừng, lùm bụi, bãi hoang, ven đường, ở độ cao dưới 300 m Phân bố ở Bắc Giang (Yên Thế), Phú Thọ (Việt Trì), Hà Nội (Bưởi), Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Khánh Hoà, Gia Lai (An Khê, Kon Hà Nừng) Ngoài ra, còn có ở Trung Quốc (Hải Nam, Quảng Đông, Quảng Tây) [9]

1 đ dư l ủ l

1.3.1.2.1 Đặc điểm hình thái và thành phần hóa học

Cà gai leo thuộc loại cây leo, thân dài 0,6-1,0 m hay dài hơn, rất nhiều gai dẹp, cành xoè rộng, trên phủ lông hình sao Lá hình trứng hay thuôn, phần gốc lá hình rìu hay hơi tròn, mép nguyên hay lượn và khía thùy, hai mặt nhất là mặt dưới phủ lông trắng nhạt, phiến dài 3-4 cm, rộng 12-20 mm, có gai, cuống dài 4-5 mm Hoa tím nhạt, nhị vàng họp thành xim gồm 2-4 hoa Quả hình cầu, khi chín có màu vàng bóng, nhẵn, đường kính 5-7 mm Hạt màu vàng, hình thận, có mang dài 4 mm, rộng 2 mm [19]

Thành phần hoá học: toàn cây và đặc biệt ở rễ có chứa alkaloid, thành phần chính là solasodine, solasodinine Ngoài ra, còn chứa tinh bột, saponoside, flavonoside và diosgenine [2]

1.3.1.2.2 Giá trị dược lý

Cà gai leo là một cây thuốc quý, rễ được dân gian dùng làm thuốc chữa thấp khớp, ho, dị ứng, đau nhức xương, đau răng, trị rắn cắn, đau lưng, cảm cúm…

Thấp khớp là một bệnh khá phổ biến do nhiều tác nhân gây ra Trong y học

cổ truyền, có nhiều bài thuốc chữa thấp khớp kết hợp nhiều loại dược liệu trong đ

có cà gai leo Cà gai leo có tác dụng trừ phong thấp, tiêu độc, trừ ho, cầm máu, giảm đau Đoàn Thị hu và cs (1998) đã chứng minh cà gai leo có tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù thực nghiệm b ng cao hư, chống viêm mãn trên mô hình gây u hạt thực nghiệm b ng amian trên chuột cống trắng, đồng thời gây teo tuyến ức trên chuột cống non Ngoài ra, còn có những công trình nghiên cứu khác chứng minh cà gai leo có tác dụng kháng viêm, giảm đau, giảm sự phát triển của quá trình

xơ trong xơ gan thực nghiệm trên chuột [3]

Phạm im Mãn và cs (1999) đã nghiên cứu tác dụng chống ung thư của cà gai leo và kết luận r ng, chế phẩm dịch chiết từ cây cà gai leo nồng độ 5 mg/100 mL có tác dụng hủy diệt tế bào ung thư 180 Sarcoma với tỷ lệ tế bào chết là 52,8% [9]

Việc nghiên cứu thăm dò khả năng ngăn chặn tiến triển xơ của cà gai leo trên

mô hình gây xơ gan thực nghiệm của Maros (1966) cho thấy sau 3 tháng gây xơ gan trên chuột cống trắng, xơ gan hình thành rõ rệt, thể hiện trên các chỉ tiêu hóa sinh và

tổ chức học Ở thời điểm 5 tuần, quá trình bệnh lý mới tiến triển tới giai đoạn thoái

h a mô gan, chưa c sự gia tăng rõ rệt của collagen hưng khi xơ đã ở giai đoạn hoàn chỉnh, song song với các biến đổi về tổ chức học, hàm lượng collagen ở gan

xơ cũng tăng cao gấp 2,5 lần so với bình thường Dịch chiết cà gai leo với liều cho uống hàng ngày 6 g/kg thể trọng chuột, tuy không ngăn chặn hoàn toàn được quá trình xơ h a, nhưng c tác dụng làm chậm quá trình tiến triển của xơ àm lượng collagen trong gan ở lô chuột dùng dịch chiết cà gai leo chỉ b ng 71% so với lô chuột đối chứng gây xơ không dùng thuốc Về mặt tổ chức học, thí nghiệm cho thấy

toàn bộ chuột ở lô đối chứng gây xơ đều bị xơ nặng hoặc vừa, còn ở lô dùng cà gai leo hầu hết chỉ xơ nhẹ hoặc không xơ [18]

Gần đây, nhiều tác dụng khác của cà gai leo được phát hiện như: kháng viêm, ức chế xơ gan giai đoạn kịch phát, giảm nhẹ khối u Viện ược liệu (2001) đã bào chế thành công thuốc "Haina" từ cà gai leo, đạt tiêu chuẩn cơ sở c hàm lượng glycoalkaloid toàn phần trong mỗi viên từ 2,125 mg đến 2,875 mg tính theo solasodine Sau đ , tiến hành th tác dụng lâm sàng trên bệnh nhân viêm gan B mạn hoạt động Kết quả cho thấy Haina có tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm, ức chế xơ gan, đồng thời có tác dụng tốt trên các chỉ thị virus viêm gan B [3]

Trong những năm gần đây, vấn đề gốc tự do và các chứng bệnh gây ra do quá trình peroxide h a lipid gia tăng như lão h a, viêm hoại t tế bào, ung thư được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm Nguyễn Thị Bích Thu và cs (2001) đã khảo sát tác dụng chống oxy hóa của cà gai leo Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy dịch chiết glycoalkaloid toàn phần có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Những kết quả thu được góp phần giải thích cơ chế tác dụng kháng viêm, bảo vệ gan của chế phẩm Haina [14]

Cà gai leo có tác dụng bảo vệ gan chống lại những tổn thương gây ra bởi Trinitrotoluene (TNT), tác dụng này là do sự tương tác giữa các chất chuyển hóa của TNT với thành phần của cà gai leo và giữa cà gai leo với tế bào gan TNT xâm nhập vào cơ thể sẽ được chuyển hóa trong tế bào gan và làm gia tăng sự hình thành của superoxide và hydrogen peroxide Chúng tấn công vào cấu trúc lipoprotein của màng tế bào gan b ng chuỗi phản ứng lipoperoxide gây ra sự phá hủy tế bào gan Flavonoid là tác nhân kháng oxy hóa của cà gai leo có thể hạn chế chuỗi phản ứng lipoperoxide gây ra bởi tác nhân oxy hóa Cà gai leo còn chứa saponin steroid làm tăng sức chống chịu của màng tế bào gan dưới sự tấn công của TNT và các tác nhân oxy hóa [98]

1.3.2 C nghiên ứu v solasodine

1 s l s d

1.3.2.1.1 ấ o con đường ch ển h

- Công thức tổng quát: C27H43NO2

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của solasodine

- on đường chuyển hóa:

Sinh tổng hợp solasodine nói riêng hay spirosolane alkaloids nói chung có liên quan mật thiết với sinh tổng hợp spirostane steroids có cùng cấu trúc vòng [61]

Nhóm spirosolane chỉ khác nhóm spirostane ở nguyên t oxygen của vòng F được thay b ng -NH Một điểm cần chú ý là ở đây c isomer ở C-22 (khác với

nhóm spirostan) Ví dụ solasonin có trong cây cà Úc S laciniatum có cấu trúc (25R)

22 còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22 Việc thêm nitrogen vào alkaloid xảy ra muộn trong con đường phát sinh sinh vật Điều này phổ biến khi tìm thấy trong cả solasodine và diosgenine hay chlorogenine cùng nhau trong các loài thực vật Tỷ lệ giữa diosgenine và solasodine trong lá của

S laciniatum giới hạn trong khoảng 1:7 và 1:16 [61]

on đường thông thường được chấp nhận của sinh tổng hợp steroid trong thực vật được trình bày trong hình 1.2 Khởi đầu từ acetyl-CoA biến đổi thành cholesterol thông qua con đường mevalonic acid Những phản ứng giả thiết trong hình 1.6 cho thấy xuyên suốt quá trình nghiên cứu những hợp chất này là một chất

trung gian teinemine Teinemine có thể là một phần trong con đường sản xuất hai stereoisomer là solasodine và tomatidenol, hoặc là solanidine [61]

Hình 1.2 on đường khả thi tổng hợp steroid trong thực vật

Thí nghiệm chứng minh cho con đường giả thuyết này ở chỗ hầu hết toàn bộ các tiền chất đã biết trong thí nghiệm này có thể dự đoán được sản phẩm chuyển hóa cuối cùng Vòng carbon của cấu trúc steroid solasodine chắc hẳn xuất phát từ nhóm methyl hay carboxyl carbon của acetic acid Điều này được lưu bởi sự thoái

biến sau khi tiến hành nhiễm xạ acetic acid hay mevalonic acid cây S laciniatum,

xác nhận được c định vị phóng xạ trong carbon dự đoán của solasodine (dẫn theo Mann, 1979) [61]

Nhóm spirosolane chỉ khác nhóm spirostane ở nguyên t oxygen của vòng F được thay b ng -NH Một điểm cần chú ý là ở đây c isomer ở C-22 (khác với

nhóm spirostan) Ví dụ solasonin có trong cây cà Úc S laciniatum có cấu trúc (25R)

22 còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22 Việc thêm nitrogen vào alkaloid xảy ra muộn trong con đường phát sinh sinh vật Điều này phổ biến khi tìm thấy trong cả solasodine và diosgenine hay chlorogenine cùng nhau trong các loài thực vật Tỷ lệ giữa diosgenine và solasodine trong lá của

S laciniatum giới hạn trong khoảng 1:7 và 1:16 [61]

on đường thông thường được chấp nhận của sinh tổng hợp steroid trong thực vật được trình bày trong hình 2.2 Khởi đầu từ acetyl-CoA biến đổi thành cholesterol thông qua con đường mevalonic acid Những phản ứng giả thiết trong hình 1.6 cho thấy xuyên suốt quá trình nghiên cứu những hợp chất này là một chất trung gian teinemine Teinemine có thể là một phần trong con đường sản xuất hai stereoisomer là solasodine và tomatidenol, hoặc là solanidine [61]

Thí nghiệm chứng minh cho con đường giả thuyết này ở chỗ hầu hết toàn bộ các tiền chất đã biết trong thí nghiệm này có thể dự đoán được sản phẩm chuyển hóa cuối cùng

Vòng carbon của cấu trúc steroid solasodine chắc hẳn xuất phát từ nhóm methyl hay carboxyl carbon của acetic acid Điều này được lưu bởi sự thoái biến

sau khi tiến hành nhiễm xạ acetic acid hay mevalonic acid cây S laciniatum, xác

nhận được c định vị phóng xạ trong carbon dự đoán của solasodine (dẫn theo Mann, 1979) [61]

Nghiên cứu nuôi cấy mô cũng cung cấp thêm thông tin minh chứng Nuôi

cấy mô cây S xanthocarpum tổng hợp solasodine khi có 2,4- hơn là dùng như một auxin Khi nuôi cấy dịch huyền phù S xanthocarpum được bổ sung thêm

cholesterol thì solasodine thu được cao gấp 20 lần Điều này là phù hợp với giả thiết

ở hình 3.2 [61]

1.3.2.1.2 c d ng dược gi ị d ng

- Nhiệt độ nóng chảy: 200 – 202oC

Solasodine là một loại steroid alkaloid có trong các cây họ Cà (Solanaceae)

Nó có thể thay thế cho diosgenin để tổng hợp thương mại các loại hormon steroid khác nhau Solasodine đã được báo cáo là có thể chống ung thư [35], ức chế độc hại nhiều loài sinh vật [89] Solasodine alkaloid ức chế acetylcholinsterase - một enzyme quan trọng trong việc truyền xung động thần kinh [88] Gần đây, solasodine được biết như một tác nhân hóa trị liệu mới cho điều trị ung thư đặc biệt là ung thư

da [36]

1 sả ấ s l s d ấ ở

l

Có khoảng gần 100 loài Solanum khác nhau được công bố có chứa

solasodine ở một hay nhiều bộ phận khác nhau (bảng 1.2) Tuy nhiên, chỉ có một số

ít loài được xem là có thể sản xuất solasodine thương mại [61]

Bảng 1.3 Tổng hợp một số loài Solanum sinh ra solasodine [61]

Loài C quan solasodine H lư ng solasodine

(% khối lư ng khô)