Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được

MỞ ĐẦU Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt với tỷ lệ tử vong lên đến 30%. Bệnh do L. monocytogenes gây ra đƣợc gọi chung là listeriosis. Đối tƣợng có nguy cơ bị nhiễm bệnh này thƣờng là những ngƣời có hệ thống miễn dịch bị suy yếu nhƣ trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, ngƣời lớn tuổi. Nếu không đƣợc điều trị kịp thời bằng kháng sinh, bệnh nhân có thể bị nhiễm trùng máu, viêm màng não, sẩy thai và tử vong. Vi khuẩn L. monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh. Chúng đƣợc tìm thấy ở nhiều nơi nhƣ đất, nƣớc, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân ngƣời hoặc phân động vật. Chúng có thể sống và tăng trƣởng chậm ở các điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, hàm lƣợng khí oxy, pH và hoạt độ nƣớc. Đặc biệt loài vi khuẩn này có khả năng sinh trƣởng ở nhiệt độ lạnh (0-10 o C). Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L. monocytogenes trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm đƣợc bảo quản lạnh trong thời gian dài. Nhiều loại thực phẩm đƣợc bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn. Thêm nữa càng ngày ngƣời ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản hoặc không bị gia nhiệt để giữ đƣợc nguyên vẹn hƣơng vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu. Những sản phẩm nhƣ vậy thƣờng đƣợc bảo quản lạnh trƣớc khi sử dụng. Vì vậy, các sản phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cao. Rất nhiều các vụ ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L. monocytogenes trên khắp thế giới đã đƣợc thông báo. Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ các vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L. monocytogenes có khả năng gây bệnh và gây bùng phát dịch rất lớn, bên cạnh đó cũng có những kiểu huyết thanh hầu nhƣ không có khả năng gây bệnh và gây dịch. Cho đến thời điểm này chƣa có công bố nào về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm tại Việt Nam. Khả năng gây bệnh và gây dịch của L. monocytogenes nhiễm trong các thực phẩm tại Việt Nam vẫn là một ẩn số. Phƣơng pháp ISO 11290-1:1996 phát hiện L. monocytogenes là phƣơng pháp nuôi cấy. Một số các phƣơng pháp sinh học phân tử nhƣ PCR, real-time PCR hoặc các phƣơng pháp miễn dịch (ELISA) cũng đã đƣợc tiêu chuẩn hóa. Mấy năm trở lại đây, cùng với sự ra đời của một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt axit nucleic, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh đã đƣợc đơn giản hóa thêm một bƣớc. LAMP là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt đƣợc sử dụng phổ biến hơn cả. Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP không cần điện di là một trong các ƣu điểm nổi trội của phƣơng pháp này, giúp đơn giản hóa và rút ngắn thời gian phân tích. Kỹ thuật này đã nhanh chóng đƣợc ứng dụng để phát hiện L. monocytogenes trong thực phẩm ở nhiều nghiên cứu trên thế giới. Ở Việt Nam, phƣơng pháp tiêu chuẩn TCVN: 7700-1:2007 phát hiện L. monocytogenes là phƣơng pháp nuôi cấy, sau đó khuẩn lạc đặc trƣng đƣợc khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa. Đã có một số nghiên cứu về phƣơng pháp PCR và que thử sắc ký miễn dịch nhằm phát hiện vi khuẩn này, tuy nhiên thời gian phân tích còn dài hoặc yêu cầu cao về trang thiết bị hóa chất nên chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu phân tích phát hiện trong thực tế sản xuất. Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi nghiên cứu đề tài có tên là “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam”. Luận án này tập trung vào hai mục tiêu chính sau:  Phân tích đƣợc đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam.  Xây dựng đƣợc một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L. monocytogenes trong các loại thực phẩm ăn liền dựa trên kỹ thuật LAMP. Trong nghiên cứu này đối tƣợng nghiên cứu là L. monocytogenes. Phạm vi nghiên cứu tập trung phát triển phƣơng pháp phân tích phát hiện nhanh L. monocytogenes trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP. Qui trình phân tích cần tối ƣu sao cho đơn giản, chính xác, tiện lợi và nhanh nhất, góp phần kiểm soát chất lƣợng an toàn vệ sinh thực phẩm. Bên cạnh đó việc nghiên cứu dịch tễ học các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ thực phẩm cũng giúp chúng ta thấy đƣợc hiện trạng mức độ nguy hiểm của các dòng L. monocytogenes hiện đang nhiễm trên một số nhóm thực phẩm tại Việt Nam. Từ đó có thể giúp các nhà quản lý, sản xuất, phân phối và tiêu dùng có các biện pháp thích hợp nhằm nâng cao chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm đối với đối tƣợng vi khuẩn nguy hiểm này. Tính mới của luận án  Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam  Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển kỹ thuật LAMP cho phát hiện L. monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân tích

3

MỤC LỤC

MỤC LỤC 3

MỞ ĐẦU………14

1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN 16

1.1 Listeria monocytogenes ……16

1.1.1 Đặc điểm L monocytogenes 16

1.1.2 Vai trò của internalin J (inlJ) trong quá trình gây bệnh của L monocytogenes……20

1.1.3 Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L monocytogenes 23

1.1.4 Quy định kiểm soát L monocytogenes 24

1.2 Dịch tễ học phân tử của L monocytogenes 25

1.2.1 Đặc điểm dịch tễ các dòng giống (lineage) L monocytogenes 25

1.2.2 Đặc điểm dịch tễ các dòng phức hợp (clones complex) L monocytogenes 25

1.2.3 Đặc điểm dịch tễ các kiểu huyết thanh L monocytogenes 26

1.2.4 Các phương pháp phân loại sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử 27 1.2.4.1 Phương pháp điện di xung trường (PFGE) 27

1.2.4.2 Phương pháp ribotyping 28

1.2.4.3 Phương pháp đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) 28

1.2.4.4 Phương pháp đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc (AFLP)……….29

1.2.4.5 Phương pháp đa hình chiều dài các đoạn sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme giới hạn (PCR-RFLP) 29

1.2.4.6 Phương pháp khuếch đại các trình tự lặp (REP-PCR) 29

1.2.4.7 Phương pháp phân tích vùng lặp đối xứng của nhiều locus (MLVA) 30

1.2.5 Phương pháp phân loại dựa trên trình tự của nhiều locus (MLST)…….………….30

1.2.5.1 Phương pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus gen độc (MVLST) 31

1.2.5.1 Phương pháp phân loại dựa trên trình tự các gen giữ nhà 31

1.2.6 Cơ sở dữ liệu về phương pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus (MLST)……….34

1.3 Một số phương pháp phân tích phát hiện L monocytogenes 34

1.3.1 Phương pháp nuôi cấy 34

1.3.1.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình tăng sinh 35

1.3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tăng sinh 37

4

1.3.1.3 Ảnh hưởng của mẫu thực phẩm đến quá trình tăng sinh 37

1.3.1.4 Ảnh hưởng của thành phần vi sinh vật đồng nhiễm trong mẫu 38

1.3.2 Phương pháp miễn dịch 40

1.3.3 Phương pháp khuếch đại DNA (PCR, real-time PCR) 41

1.4 Kỹ thuật nhân gen đẳng điện tạo cấu trúc vòm (LAMP)……… 43

1.4.1 Nguyên tắc của kỹ thuật LAMP 43

1.4.2 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 45

1.4.3 Phát hiện sản phẩm LAMP 46

1.4.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phản ứng LAMP……… 47

1.4.5 Các nghiên cứu sử dụng phương pháp LAMP để phát hiện L monocytogenes trên thế giới……… 48

1.5 Một số kỹ thuật tách chiết thu nhận nhanh DNA cho các phản ứng khuếch đại DNA………50

1.5.1 Các yêu cầu đối với DNA sử dụng cho các kỹ thuật nhân gen……….50

1.5.2 Tách chiết và tinh sạch DNA……….51

1.5.3 Kiểm tra hiệu suất thu hồi và chất lượng DNA 54

2 CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56 2.1 Địa điểm nghiên cứu 56

2.2 Đối tượng nghiên cứu 56

2.3 Phương pháp nghiên cứu 57

2.3.1Phân lập L monocytogenes từ mẫu thực phẩm 57

2.3.2 Phản ứng Real-time PCR……… 56

2.3.3 Phản ứng PCR ……… 57

2.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen……….58

2.3.5 Phân loại các kiểu trình tự ST……….59

2.3.6 So sánh trình tự 7 đoạn gen của các chủng phân lập được với một số chủng trên ngân hàng dữ liệu……… 59

2.3.7 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP……….……… 59

2.3.8 Lựa chọn mồi LAMP………59

2.3.9 Tối ưu hóa phản ứng LAMP ……… … 59

2.3.10 Điện di DNA………60

5

2.3.11 Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm của phản ứng LAMP……….60

2.3.12 Xác định độ nhạy của phản ứng LAMP……….60

2.3.13 Xây dựng quy trình tăng sinh L monocytogenes nhanh………60

2.3.14 Xây dựng quy trình tách chiết nhanh DNA của L monocytogenes……….62

2.3.15 Xây dựng quy trình phân tích L monocytogenes trên mẫu thực phẩm………….63

2.3.16 Kiểm định bộ sinh phẩm……… 64

2.3.17 Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm………64

3 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66

3.1 Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập từ một số thực phẩm Việt Nam 66

3.1.1 Phân lập L monocytogenes từ các mẫu thực phẩm 66

3.1.2 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập 709

3.1.2.1 Giải trình tự các gen abcZ, bglA, cat, dapE, dat, ldh và lhkA của các chủng L monocytogenes phân lập……….70

3.1.2.2 Phân tích tính đa hình về trình tự nucleotid của các gen abcZ, bglA, cat, dapE, dat, ldh và lhkA từ các chủng L monocytogenes đã phân lập được……….70

3.1.2.3 Phân loại các chủng L monocytogenes đã phân lập được 72

3.1.2.4 So sánh các chủng L monocytogenes đã phân lập được với các chủng gây bệnh dịch trên thế giới……….………77

3.2 Xây dựng quy trình phân tích nhanh L monocytogenes trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP 80

3.2.1 Xây dựng phản ứng LAMP 82

3.2.1.1 Thiết kế mồi LAMP khuếch đại gen inlJ 81

3.2.1.2 Lựa chọn bộ mồi LAMP cho độ nhạy khuếch đại cao nh t 83

3.2.1.3 Tối ưu phản ứng LAMP 86

3.2.2 Xây dựng quy trình tăng sinh 93

3.2.2.1 Ảnh hưởng của loại môi trường cơ bản đến sự sinh trưởng L monocytogenes…94 3.2.2.2 Ảnh hưởng của một số thành phần môi trường đến sự sinh trưởng của L monocytogenes 95

3.2.2.3 Ảnh hưởng của acriflavin và acid nalidixic đến sự sinh trưởng của một số loài vi khuẩn khác 97

3.2.2.4 Thử nghiệm tăng sinh trên mẫu thực phẩm 98

3.2.3 Tối ưu hóa qui trình tách chiết DNA 100

6

3.2.3.1 Khả năng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes khi sử dụng Triton X100 kết hợp siêu âm và gia nhiệt ở 95 o

C 99

3.2.3.2 Khả năng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes khi sử dụng NaOH kết hợp siêu âm và gia nhiệt ở 95 o C 101

3.2.3.3 So sánh các phương pháp tách chiết nghiên cứu đối với canh trường L monocytogenes thuần 103

3.2.3.4 Đánh giá hiệu quả tách chiết DNA của các phương pháp đối với mẫu thực phẩm tăng sinh 104

3.2.3.5 Ảnh hưởng của lượng mẫu l y tách chiết DNA cho phản ứng LAMP 106

3.2.3.6 Thử nghiệm phản ứng LAMP trên các nền mẫu khác nhau 107

3.2.4 Đề xuất quy trình phân tích 110

3.2.5 Xác định độ nhạy của toàn bộ quy trình 111

3.2.6 Thiết kế, sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP phát hiện L monocytogenes……… 112

3.2.6.1 Thiết kế bộ sinh phẩm 112

3.2.6.2 Sản xu t thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO 114

3.2.7 Kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO………116

3.2.8 Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO……….118

4CHƯƠNG IV KẾT LUẬN 123

KIẾN NGHỊ 124

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN………… 124

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….……… ……… 125

PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined.

7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length

Polymorphism

Đa hình chiều dài các đoạn DNA

ALOA Chromogenic Listeria Agar

according to Ottaviani and Agosti

Môi trường tăng sinh BLEB

CAMP Christie, Atkins, Munch-Petersen Phản ứng CAMP

CDC Center for Disease Control and

Prevention

Trung tâm phòng chống và kiểm soát dịch bệnh

CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc

DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic

EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid Axit Ethylen Diamine Tetraacetic

ISO International Organization for

Bộ Nông nghiệp và dịch vụ kiểm soát an toàn thực phẩm Mỹ

Administration

Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống

LAMP Loop-Mediated Isothermal Khuếch đại đẳng nhiệt tạo cấu

PCPLC Phosphatidylcholine

phospholipase C

Phosphatidylcholine phospholipase C PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi ADN

PFGE Pulsed-field gel electrophoresis Kỹ thuật điện di xung trường RAPD Randomly amplified polymorphic

DNA

Đa hình dựa trên khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA

TAE Tris - Acetate - EDTA Tris - Acetate - EDTA

PCR-RFLP PCR-restriction fragment length

polymorphism

Đa hình chiều dài các đoạn sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme giới hạn

rep-PCR Repetitive element PCR Khuếch đại các trình tự lặp

MOX Modified Oxford Agar Môi trường Oxford Agar cải biến MLVA Multiple-locus variable number of

tandem repeat analysis

Phân tích vùng lặp đối xứng của nhiều locus

PFGE Pulsed-field gel electrophoresis Điện di xung trường

electrophoresis typing

Phân loại theo phổ điện di nhiều enzyme

9

DI Simpson's Diversity Index Chỉ số phân loại Simpson

VNTRs Variable numbers of tandem

repeats

Đa hình các đoạn DNA chứa vùng lặp đối xứng

TSBYE Tryptic Soy Broth Yeast Extract Môi trường dịch chiết nấm men

và trypton từ đậu tương

10

DANH MỤC HÌNH

Hình 1-1 Hình thái vi khuẩn L monocytogenes 16

Hình 1-2 Cơ chế xâm nhiễm của L monocytogenes vào tế bào người 19

Hình 1-3 C u tạo của 3 nhóm internalin từ L monocytogenes EGDe 21

Hình 1-4 Trình tự axit amin của inlJ 23

Hình 1-5 Tốc độ sinh trưởng của chủng L monocytogenes 1340 và chủng L innocua11288 trong canh trường hỗn hợp và canh trường riêng biệt, môi trường được sử dụng là TSBYE 39

Hình 1-6 Mô hình phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh L monocytogenes 40

Hình 1-7 Nguyên tắc kỹ thuật LAMP 44

Hình 1-8 Các phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP 46

Hình 1-9 Ảnh hưởng của nồng độ ion Mg 2+ đến phổ h p thụ của HNB trong dung dịch phản ứng LAMP 47

Hình 3-1 Kết quả phân lập L monocytogenes sử dụng môi trường RAPID’L.mono 66

Hình 3-2 Kết quả khẳng định bằng PCR các khuẩn lạc L monocytogenes giả định phân lập được trên môi trường RAPID’L.mono 67

Hình 3-3 Mối liên hệ về mặt di truyền của L monocytogenes đã phân lập được từ thực phẩm 79

Hình 3-4 Kết quả sàng lọc các bộ mồi LAMP dựa trên khả năng khuếch đại DNA của L monocytogenes 84

Hình 3-5 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP 87

Hình 3-6 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP 89

Hình 3-7 Độ bao trùm của phản ứng LAMP với các chủng L monocytogenes 89

Hình 3-8 Độ chọn lọc của phản ứng LAMP với các loài Listeria khác và các vi khuẩn thường nhiễm tạp trong thực phẩm 90

11

Hình 3-10 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu với HNB 91 Hình 3-11 So sánh độ nhạy của phản ứng LAMP phát triển trong nghiên cứu này với các phương pháp LAMP phát hiện L monocytogenes đã được công bố 93 Hình 3-12 Ảnh hưởng của nồng độ cao n m men đến sự sinh trưởng của L monocytogenes trong môi trường BLEB (canh trường thuần) 97 Hình 3-13 Ảnh hưởng của nồng độ pyruvat đến đến sự sinh trưởng của L monocytogenes trong môi trường BLEB (canh trường thuần) 97 Hình 3-14 Ảnh hưởng của nồng độ acriflavin và axít nalidixic đến sự sinh trưởng của

L monocytogenes trong môi trường BLEB (canh trường thuần) 98 Hình 3-15 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường thuần của các quy trình sử dụng NaOH, Triton X100 và sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit 104 Hình 3-16 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường tăng sinh mẫu xúc xích khi sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X100, sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit và quy trình tách chiết thông thường 105 Hình 3-17 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường tăng sinh mẫu xúc xích khi sử dụng quy trình tách chiết bằng đệm Glycine-Tris pH 8,3 và Triton X 100 107 Hình 3-18 Ảnh hưởng của thể tích mẫu canh trường tăng sinh được sử dụng đến khả năng khuếch đại đoạn gen inlJ của phản ứng LAMP 108 Hình 3-19 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh và nền mẫu đến khả năng phát hiện L monocytogenes dựa trên kỹ thuật LAMP khuếch đại gen inlJ 110 Hình 3-20 Sơ đồ quy trình phát hiện nhanh L monocytogenes được phát triển trong nghiên cứu này 111 Hình 3-21 Kết quả thử nghiệm quy trình phát hiện nhanh L monocytogenes dựa trên

kỹ thuật LAMP 113 Hình 3-22 Hình ảnh bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO 114 Hình 3-23 Sơ đồ qui trình sản xu t bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện nhanh L monocytogenes trong thực phẩm 116

12

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1-1 Đặc tính sinh hóa của các loài thuộc chi Listeria 17

Bảng 1-2 Các tổ hợp kháng nguyên bề mặt (O và H) trong các kiểu huyết thanh của Listeria 18 Bảng 1-3 Thống kê một số vụ dịch listeriosis tại Mỹ trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015 23

Bảng 1-4 Ảnh hưởng của một số ch t nhiễm tạp đến phản ứng LAMP và PCR 52Bảng 1-5 Các ch t ức chế phản ứng PCR thường gặp trong một số loại thực phẩm và

biện pháp loại bỏ 53

Bảng 2-1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR khẳng định L

monocytogenes 58 Bảng 2-2 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen giữ nhà 59 Bảng 3-1 Tổng hợp kết quả phát hiện L monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Việt Nam trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015 67 Bảng 3-2 Tổng hợp kết quả phát hiện L monocytogenes theo loại thực phẩm tại Việt Nam trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015 68 Bảng 3-3 Tính đa hình về trình tự nucleotide của các gen các gen abcZ, bglA, cat, dapE, dat, ldh và lhkA từ các chủng L monocytogenes đã phân lập được 72 Bảng 3-4 Tổng hợp các kiểu trình tự (ST), dòng phức hợp (CC) và dòng giống (lineage) của 48 chủng L monocytogenes phân lập được từ thực phẩm 73 Bảng 3-5 Phân loại các chủng L monocytogenes đã phân lập được theo kiểu trình tự

76

Bảng 3-6 Kết quả so sánh trình tự gen inlJ của chủng L monocytogenes EGD-e với các trình tự gen của L monocytogenes 82 Bảng 3-7 Trình tự các bộ mồi LAMP được thiết kế để khuếch đại gen inlJ 83 Bảng 3-8 Kết quả kiểm tra các điểm sai khác của bộ mồi LAMP với các trình tự gen inlJ trên ngân hàng gen NCBI 86

13

Bảng 3-9 Trình tự mồi LAMP sau suy biến 86 Bảng 3-10 Ảnh hưởng của loại môi trường cơ bản đến sự tăng sinh của L monocytogenes trong canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm 95 Bảng 3-11 Ảnh hưởng của hai loại môi trường cơ bản BLEB và HF đến sự sự tăng sinh của L monocytogenes trong canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm 96 Bảng 3-12 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh đến sự sinh trưởng của một số loài vi sinh vật chỉ thị trong môi trường BLEB (canh trường thuần) 99 Bảng 3-13 Ảnh hưởng của nồng độ acriflavin và axít nalidixic đến sự tăng sinh của L monocytogenes trong môi trường BLEB có bổ sung cao n m men, pyruvate và với

sự hiện diện của hệ vi sinh vật trong mẫu xúc xích 100 Bảng 3-14 Ảnh hưởng của nồng độ Triton X100 đến khả năng tách chiết DNA thể gen

L monocytogenes .101 Bảng 3-15 Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến khả năng tách chiết DNA thể gen

L monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X100 101 Bảng 3-16 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến khả năng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X100 102 Bảng 3-17 Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến khả năng tách chiết DNA thể gen

L monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH .102 Bảng 3-18 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến khả năng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes .103 Bảng 3-19 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến khả năng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH .104 Bảng 3-20 Ảnh hưởng của thể tích mẫu canh trường tăng sinh được sử dụng đến khả năng phát hiện L monocytogenes bằng kỹ thuật LAMP và real-time PCR 107 Bảng 3-21 Độ nhạy quy trình phát hiện L monocytogenes theo kỹ thuật LAMP 112 Bảng 3-22 Kết quả kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện L monocytogenes 117 Bảng 3-23 Kết quả ứng dụng bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện L monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội 119

Vi khuẩn L monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh Chúng được tìm thấy ở nhiều nơi

như đất, nước, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân người hoặc phân động vật Chúng có thể sống và tăng trưởng chậm ở các điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, hàm lượng khí oxy, pH và hoạt độ nước Đặc biệt loài vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ lạnh (0-10o

C) Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L monocytogenes

trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm được bảo quản lạnh trong thời gian dài Nhiều loại thực phẩm được bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn Thêm nữa càng ngày người ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản hoặc không bị gia nhiệt để giữ được nguyên vẹn hương vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu Những sản phẩm như vậy thường được bảo quản lạnh trước khi sử dụng Vì vậy, các sản

phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L monocytogenes cao Rất nhiều các vụ ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L monocytogenes trên khắp thế giới đã

được thông báo

Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập được từ các

vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L monocytogenes có khả năng gây

bệnh và gây bùng phát dịch rất lớn, bên cạnh đó cũng có những kiểu huyết thanh hầu như không có khả năng gây bệnh và gây dịch Cho đến thời điểm này chưa có công bố nào về

dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập từ thực phẩm tại Việt Nam Khả năng gây bệnh và gây dịch của L monocytogenes nhiễm trong các thực phẩm tại Việt Nam

vẫn là một ẩn số

Phương pháp ISO 11290-1:1996 phát hiện L monocytogenes là phương pháp nuôi cấy

Một số các phương pháp sinh học phân tử như PCR, real-time PCR hoặc các phương pháp miễn dịch (ELISA) cũng đã được tiêu chuẩn hóa Mấy năm trở lại đây, cùng với sự ra đời của một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt axit nucleic, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh đã được đơn giản hóa thêm một bước LAMP là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt được sử dụng phổ biến hơn cả Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trội của phương pháp này, giúp

15

đơn giản hóa và rút ngắn thời gian phân tích Kỹ thuật này đã nhanh chóng được ứng dụng

để phát hiện L monocytogenes trong thực phẩm ở nhiều nghiên cứu trên thế giới

Ở Việt Nam, phương pháp tiêu chuẩn TCVN: 7700-1:2007 phát hiện L monocytogenes là

phương pháp nuôi cấy, sau đó khuẩn lạc đặc trưng được khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa Đã có một số nghiên cứu về phương pháp PCR và que thử sắc ký miễn dịch nhằm phát hiện vi khuẩn này, tuy nhiên thời gian phân tích còn dài hoặc yêu cầu cao về trang thiết bị hóa chất nên chưa đáp ứng được nhu cầu phân tích phát hiện trong thực tế sản xuất

Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi nghiên cứu đề tài có tên là “Nghiên cứu chế

tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam”

Luận án này tập trung vào hai mục tiêu chính sau:

 Phân tích được đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L monocytogenes phân

lập được từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam

 Xây dựng được một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L monocytogenes trong các loại

thực phẩm ăn liền dựa trên kỹ thuật LAMP

Trong nghiên cứu này đối tượng nghiên cứu là L monocytogenes Phạm vi nghiên cứu tập trung phát triển phương pháp phân tích phát hiện nhanh L monocytogenes trong thực phẩm

dựa trên kỹ thuật LAMP Qui trình phân tích cần tối ưu sao cho đơn giản, chính xác, tiện lợi và nhanh nhất, góp phần kiểm soát chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm Bên cạnh đó

việc nghiên cứu dịch tễ học các chủng L monocytogenes phân lập được từ thực phẩm cũng giúp chúng ta thấy được hiện trạng mức độ nguy hiểm của các dòng L monocytogenes

hiện đang nhiễm trên một số nhóm thực phẩm tại Việt Nam Từ đó có thể giúp các nhà quản lý, sản xuất, phân phối và tiêu dùng có các biện pháp thích hợp nhằm nâng cao chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm đối với đối tượng vi khuẩn nguy hiểm này

Tính mới của luận án

 Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L

monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam

 Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển kỹ thuật LAMP cho phát hiện L monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân

tích

trẻ em và viêm màng não ở người lớn [109] Mãi đến những năm 1980, một loạt các vụ

bùng phát dịch bệnh gây ra bởi L monocytogenes xảy ra, khi đó vi khuẩn này mới được

xác định là một nguyên nhân gây bệnh listeriosis từ thực phẩm [109] Từ đó, các trường

hợp bệnh dịch do L monocytogenes đã được thông báo thường xuyên và L monocytogenes

hiện được công nhận là một vi khuẩn có nguy cơ cao trong ngành công nghiệp thực phẩm [109],[163]

Chi Listeria bao gồm sáu loài: L monocytogenes, L ivanovii, L innocua, L welshimeri, L seeligeri, và L grayi Tuy vậy, chỉ có L monocytogenes và L ivanovii có khả năng gây bệnh [157] Nhiều nghiên cứu cho thấy, L monocytogenes có khả năng gây bệnh cho cả người và động vật trong khi đó L ivanovii chủ yếu gây bệnh cho động vật và hiếm khi thấy

chúng gây bệnh cho người [157]

1.1.1 Đặc điểm L monocytogenes

Đặc điểm hình thái

Listeria monocytogenes là trực khuẩn Gram dương, tế bào có dạng hình que, trong một số

điều kiện nhất định chúng có thể ở dạng hình cầu Bề mặt tế bào có các lông roi nên giúp

L monocytogenes có khả năng di chuyển dễ dàng trong môi trường [157]

Hình 1-1 Hình thái vi khuẩn L monocytogenes [85]

Đặc tính sinh trưởng

Listeria monocytogenes là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, chúng có khả năng sinh trưởng

trong các điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, yếm khí và thậm chí trong điều kiện chân không

L monocytogenes có khả năng tồn tại trong điều kiện nhiệt độ từ - 4 tới 50°C, nhiệt độ tối

ưu cho sự sinh trưởng của chúng là 30-37°C Nhiệt độ dưới 0°C sẽ gây ức chế sự phát triển

của L monocytogenes [157] Listeria monocytogenes có thể phát triển trong khoảng pH từ

17

4,5 tới 7, sinh trưởng tốt nhất ở giá trị pH 7 Trong dạ dày, chúng có thể tồn tại một khoảng thời gian ở điều kiện pH 2,0 - 2,5 Hoạt độ nước (aw) thích hợp cho sự sinh trưởng và phát

triển của L monocytogenes từ 0,97 trở lên Tuy nhiên, một số chủng có thể sinh trưởng

trong điều kiện aw thấp hơn 0,9 thậm chí một vài chủng có thể tồn tại trong một thời gian dài ở aw rất thấp [157] Listeria monocytogenes sinh trưởng mạnh trong môi trường có

nồng độ muối vừa phải (6,5%), tuy nhiên nó vẫn có khả năng sinh trưởng trong môi trường

có nồng độ muối khá cao 10-12%, nhờ có các gen đáp ứng stress như betL, gbuABC, opuC, opuB, lmo1421 và bsh [109]

Đặc tính sinh hoá

Listeria monocytogenes có khả năng lên men nhiều loại đường và không sinh khí H2S

Trong 6 loài thuộc chi Listeria chỉ có L monocytogenes và L seeligeri có phản ứng CAMP dương tính với Staphylococcus aureus và âm tính với Rhodococcus equi trong khi đó, L ivanovii lại cho phản ứng CAMP ngược lại [157] Listeria monocytogene có thể phân biệt với L seeligeri và L ivanovii trong các thử nghiệm khả năng tạo axit từ các loại đường L-

rhamnose, D-xylose, β-methyl-D-mannoside (Bảng 1-1) [157] Đây là cơ sở cho các thử

nghiệm sinh hóa để khẳng định L monocytogenes trong các phương pháp phân tích dựa

trên kỹ thuật nuôi cấy như ISO11296-1:1996 và TCVN 7700-1:2007

Bảng 1-1 Đặc tính sinh hóa của các loài thuộc chi Listeria [157]

ogene

18

Chi Listeria có hai loại kháng nguyên bề mặt đặc hiệu, đó là kháng nguyên tế bào

(somatic) O và kháng nguyên tiên mao (flagellar) H Kháng nguyên O có 15 loại (I đến XV) còn kháng nguyên H có 4 loại (A đến D) Đây là cơ sở để phân loại các kiểu huyết

thanh của chi Listeria (Bảng 1-2)

Bảng 1-2 Các tổ hợp kháng nguyên bề mặt (O và H) trong các kiểu huyết thanh của Listeria

19

Đặc điểm lây nhiễm và gây bệnh

Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn gây bệnh nội bào nguy hiểm Thông qua con

đường ăn uống chúng lây nhiễm vào cơ thể người [66] Quá trình xâm nhiễm và gây độc

của L monocytogenes gồm các bước như Hình 1-2 dưới đây: Đi vào cơ thể qua con đường tiêu thụ thức ăn (bước 1) Tại dạ dày, L monocytogenes có khả năng kháng lại các enzyme

phân hủy protein của vật chủ, chịu đựng được môi trường axit của dạ dày (pH 2,0), muối mật và khi tấn công vào tế bào vật chủ chúng không gây triệu chứng viêm [179] Sau đó chúng bám vào tế bào chủ và xâm nhập vào tế bào chủ (bước 2), phá huỷ không bào, di chuyển trong nội bào và lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác Để sống sót qua giai

đoạn ban đầu này, L monocytogenes tham gia như là một bộ phận của tế bào chủ với sự

giúp đỡ của một nhóm các protein bề mặt được gọi là các internalin [70] Đến nay, các nhà

khoa học đã phát hiện được 8 loại internalin ở L monocytogenes (A, B, C, E, F, H, I, J),

chúng khác nhau ở cấu tạo và chức năng Trong đó internalin J (inlJ) là một trong những

protein bề mặt được xác định liên quan trực tiếp tới tính độc của L monocytogenes

Hình 1-2 Cơ chế xâm nhiễm của L monocytogenes vào tế bào người [109]

Trong đó:

1: L monocytogenes xâm nhập vào cơ thể thông qua thức ăn vào dạ dày

2: L monocytogenes xâm nhập vào tế bào chủ ở thành ruột

3-8: L monocytogenes sinh trưởng trong tế bào chủ và di chuyển đến các tế bào lân cận

Người bị mắc bệnh listeriosis, ban đầu sẽ có các triệu chứng giống như bị cúm như sốt và đau mỏi cơ đôi khi có hiện tượng tiêu chảy Sau đó, vi khuẩn có thể xâm nhập đến các cơ quan khác như vào máu gây tình trạng nhiễm trùng máu, vào não bộ gây viêm màng não, đến tử cung gây nhiễm trùng cổ tử cung có thể gây sẩy thai hoặc chết lưu Những tổn thương này có thể dẫn đến chết người Tỷ lệ chết do bệnh listeriosis trên người là khoảng 20-40% [109] Khả năng mắc bệnh tùy thuộc nhiều yếu tố như bản thân hệ miễn dịch của người bệnh, liều nhiễm, chủng vi khuẩn bị nhiễm Thường những người có hệ miễn dịch kém như trẻ nhỏ, người già, người mắc các bệnh suy giảm miễn dịch (lao, HIV, ung thư, cấy ghép nội tạng, ) và phụ nữ có thai có khả năng mắc bệnh cao hơn các đối tượng khác

20

[109] Liều nhiễm có khả năng gây bệnh phụ thuộc rất nhiều vào chủng vi khuẩn, có những chủng độc có khả năng gây bệnh ở liều gây chết trung bình thấp (LD 50 thấp), ngược lại có chủng ít độc hơn với LD 50 cao hơn [78] Thử nghiệm liều gây nhiễm qua thực phẩm trên khỉ cho thấy khi nhiễm 109

tế bào L monocytogenes, khỉ có dấu hiệu bệnh rõ ràng với triệu

chứng ở gan, dễ bị kích thích, ăn mất ngon và tiêu chảy [78] Với người bình thường, khi

sử dụng 50-100 g thực phẩm với mật độ nhiễm ≥ 10 3

-10 4 CFU/g là có nguy cơ rõ rệt về bệnh listeriosis [62]

1.1.2 Vai trò của internalin J (inlJ) trong quá trình gây bệnh của L monocytogenes

Như đã trình bày ở trên, quá trình gây bệnh của L monocytogenes là kết quả của sự xâm

nhập và sinh trưởng của loại vi khuẩn này trong một số loại tế bào động vật có vú bao gồm các tế bào không phải là thực bào (non-phagocytic cells) và các tế bào bạch huyết Trong

quá trình lây nhiễm truyền qua thực phẩm, L monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào biểu

mô ở ruột sau đó sẽ lây truyền đến gan và lá lách thông qua đường máu và hệ bạch huyết, rồi từ đây sẽ lan đến não và nhau thai

Khi nghiên cứu chức năng của các gen, protein trong quá trình gây bệnh của L monocytogenes, người ta nhận thấy rằng khả năng bám và xâm nhiễm vào tế bào vật chủ không phải là thực bào của L monocytogenes gắn liền với một nhóm protein có tên là internalin (Inl) [25] Trong hệ gen của chủng L monocytogenes EGDe có các khung đọc

mở mã hóa cho 25 loại internalin khác nhau (Hình 1-3) Toàn bộ các thành viên trong gia đình Inl này đều có cấu trúc chung là:

- Có một đoạn peptid dẫn đường ở đầu N,

- Có chứa vùng lặp chứa nhiều leucin ở đầu N (leucine-rich repeats: LRR), vùng lặp này có thể chứa từ 3 đến 28 trình tự lặp bao gồm 22 axít amin Các vùng lặp này đã được chứng minh là tham dự vào sự tương tác của internalin với thụ thể trên tế bào vật chủ [25]

Phổ biến nhất là các internalin nhóm I bao gồm 19 thành viên (Hình 1-3) vốn có một trình

tự dẫn đường ở đầu C giúp các protein này có thể biểu hiện trên vách tế bào của vi khuẩn Gram dương thông qua liên kết cộng hóa trị với lớp peptidoglycan Chính nhờ đặc tính này

mà internalin có khả năng tương tác với tế bào vật chủ, tạo điều kiện cho quá trình xâm nhiễm diễn ra Trình tự dẫn đường này bao gồm một đoạn trình tự peptid LPXTG sau đó là một vùng kỵ nước gồm khoảng 20 axít amin và một đuôi mang điện tích dương Trình tự dẫn đường này sẽ được phân cắt bởi transpeptidase có tên sortase A (SrtA) tại vị trí giữa axít amin threonin (T) và axít amin glycin (G) của đoạn trình tự peptid LPXTG Sau đó nhóm –COOH của threonin sẽ gắn với các tiền chất của lớp thành tế bào [25]

Các internalin nhóm II bao gồm 2 thành viên (Hình 1-3) là inlB và Lmo0549 có chung đặc

điểm là đầu cuối C có khả năng tương tác với vách tế bào của L monocytogenes nhờ các

21

liên kết phi cộng hóa trị Đối với inlB, vùng tương tác với vách tế bào là các đoạn lặp GW

(bao gồm 3 vùng lặp được bắt đầu bởi một dipeptid có trình tự Glycin (G) – Tryptophan

(W)) Trong khi đó đối với Lmo0549 thì vùng tương tác với vách tế bào được cho là do

vùng WxL quy định [25]

Nhóm internalin cuối cùng bao gồm các protein có kích thước nhỏ được tiết ra bên ngoài

môi trường mà điển hình nhất là inlC [25]

-

Hình 1-3 C u tạo của 3 nhóm internalin từ L monocytogenes EGDe [25]

(I): internalin với motif LPXTG;

(II): internalin GW hoặc WxL;

(III): internalin được tiết ra môi trường;

Các vùng trình tự tương đồng được đánh d u cùng màu với chú thích các vùng ở bên phải; các chữ số trong

các hộp màu chỉ số lượng các trình tự lặp

Chức năng của các internalin trong quá trình gây bệnh của L monocytogenes ở người được

phát hiện lần đầu tiên là ở inlA Loại internalin này nhận biết và xâm nhiễm vào tế bào

biểu mô ở ruột thông qua tương tác đặc hiệu với E-cadherin (Ecad) vốn là một protein

xuyên màng tế bào cần thiết cho quá trình kiến tạo vùng tiếp giáp bám dính ở lớp tế bào

biểu mô Ở tế bào động vật, tùy thuộc vào nồng độ Ca2+, các phân tử Ecad có khả năng

tương tác với nhau thông qua đầu N ngoại bào, trong khi đó vùng nội bào của Ecad sẽ

tham dự vào quá trình hình thành bộ khung tế bào (cytoskeleton) nhờ liên kết với các

catenin để tạo vùng tiếp giáp bám dính giữa các tế bào Khi inlA tương tác với Ecad sẽ

22

kích hoạt bộ máy của tế bào nhằm sắp xếp lại bộ khung tế bào Chính điều này sẽ tạo điều

kiện cho L monocytogenes có thể xâm nhập vào tế bào biểu mô ở ruột người [25]

Một trong những internalin khác cũng đã được chứng minh là liên quan đến quá trình gây

bệnh của L monocytogenes là inlJ Về mặt cấu trúc, inlJ là một protein bao gồm 851 axit

amin với điểm đặc thù là vùng LRR có chứa cystein (C) thay vì leucin (L) tại vị trí axit amin thứ bảy trong hầu hết 15 đơn vị lặp (Hình 1-4) Ngoài ra, khác với inlA, inlJ có bốn vùng lặp MucBP (Mucin-Binding Protein) vốn là các vùng protein có khả năng tương tác với một số glycoprotein ở niêm mạc ruột (Hình 1-4).Trong nghiên cứu đầu tiên về chức năng của inlJ, Sabet và các đồng tác giả [165] đã chỉ ra rằng việc bất hoạt gen inlJ (hay gen

lmo2821) làm giảm đáng kể độc lực của L monocytogenes khi tiêm vào tĩnh mạch chuột

hay khi cho lây nhiễm bằng đường miệng Nghiên cứu tiếp theo của Sabet và các đồng tác

giả vào năm 2007 [166] đã cho thấy protein inlJ không được tổng hợp khi nuôi cấy L monocytogenes trong canh trường BHI (Brain Heart Infusion) cũng như khi cho loại vi

khuẩn này sinh trưởng trong tế bào chất của một số dòng tế bào động vật nuôi cấy trong

phòng thí nghiệm Tuy nhiên, inlJ lại biểu hiện trên bề mặt của L monocytogenes trong máu và trong gan của chuột thí nghiệm được gây nhiễm Mặt khác, khi gen inlJ được biểu hiện dưới sự điều khiển của một đoạn khởi động ngoại lai trong L monocytogenes và L innocua giúp cho các vi khuẩn này có thể bám dính vào các dòng tế bào người nuôi cấy in

vitro Toàn bộ các kết quả này cho thấy inlJ đóng vai trò quan trọng trong quá trình bám

dính vào tế bào vật chủ của L monocytogenes khi lây nhiễm in vivo

Về mặt phân bố, trình tự gen inlJ có tính bảo thủ cao ở L monocytogenes trong khi đó lại không tồn tại trong các ở các loài Listeria khác [25] Khi phân tích sự có mặt của gen inlJ trong 248 chủng L monocytogenes phân lập từ thực phẩm tươi sống bằng phản ứng PCR, 99,2% số chủng cho kết quả dương tính với gen inlJ [203] Hai chủng phân lập âm tính

thuộc kiểu nhóm huyết thanh (serogroups) 1/2a-3a (xác định theo phương pháp PCR) vốn

ít khi gây bệnh trên người Trong nghiên cứu này, chỉ có gen hly là cho kết quả dương tính 100% (inlB (98.8%), inlA (99.6%), inlC (98.0%)) Tuy nhiên, gen hly cũng tồn tại trong các loài Listeria khác như L ivanovii và L seeligeri [148] Do vậy, các phương pháp phát hiện dựa trên gen mục tiêu hly có nguy cơ mắc phải hiện tượng dương tính giả đặc biệt là khi mật độ vi khuẩn L ivanovii và L seeligeri trong mẫu thực phẩm lớn Từ đây, có thể nhận thấy rằng việc lựa chọn gen inlJ như là gen mục tiêu trong các phương pháp sinh học

phân tử sẽ cho phép loại bỏ được hiện tượng dương tính giả cũng như nâng cao được độ nhạy của phương pháp do không bị bó buộc trong việc lựa chọn các trình tự mồi đặc hiệu

cho L monocytogenes

23

Hình 1-4 Trình tự axit amin của inlJ [165]

Đoạn peptid tín hiệu đầu N được in đậm ở đầu trình tự; tiếp theo là trình tự của 15 đoạn lặp LRR, các axit amin leucin, isoleucin, và valin được bôi nền đỏ và cystein được bôi nền màu xanh dương, các vùng bảo thủ khác in bằng chữ màu; vùng có cấu trúc tương tự Ig (Ig-like)được bôi nền màu xám; 4 vùng lặp MucBP với các trình tự bảo thủ được in đậm; đoạn trình tự peptid LPXTG ở đầu C được gạch chân, trình tự kỵ nước

được in chữ nghiêng

1.1.3 Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L monocytogenes

Theo các số liệu thống kê trong giai đoạn từ 1996 đến 2000, hơn 60% các vụ triệu hồi thực

phẩm ở Mỹ có nguyên nhân là do nhiễm L monocytogenes [109] Một loạt các thực phẩm nhiễm L monocytogenes đã gây ra các vụ bùng phát dịch listeriosis ở Bắc Mỹ và Châu Âu

như coleslaw, sữa, phomat mềm, pate, xúc xích, tôm, cá, … [109] Theo số liệu thống kê của CDC, hàng năm ở Mỹ có khoảng 1.600 người bị bệnh và 260 người chết do listeriosis [170] Tính theo tỷ lệ thì hàng năm cứ 100.000 người thì có 0,26 người mắc listeriosis hàng năm [52] Nếu so với giai đoạn 1996-1998 thì tỷ lệ người mắc bệnh listeriosis năm

2012 đã giảm 42 % Tuy nhiên nếu so với giai đoạn năm 2006-2008 thì con số này năm

2012 không hề giảm [40] Một số các vụ bùng phát dịch bệnh listeriosis gần đây tại Mỹ được thống kê trong Bảng 1-3 dưới đây

Bảng 1-3 Thống kê một số vụ dịch listeriosis tại Mỹ trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015

[41]

Thời gian Loại thực

phẩm

Số người mắc

Số người nhập viện

Số nguời chết

Nơi xảy ra

24

Ở châu Âu, một loạt các nước đã có thông báo về dịch bệnh do L monocytogenes Năm

2006 có 23 quốc gia thuộc cộng đồng chung châu Âu có thông báo về các trận dịch

listeriosisvới tổng số 1583 người mắc bệnh Trong đó Đức, Pháp, Anh là những quốc gia

chiếm 64 % số người mắc trên toàn châu Âu [56]

Ở Việt Nam, việc thống kê các vụ dịch nói chung và dịch bệnh do thực phẩm nói riêng cònchưa đầy đủ Hiện nay chủ yếu chỉ các vụ dịch lớn ở các bếp ăn tập thể mới được thống

kê Nguyên nhân gây nhiễm độc cũng chưa được phân tích cụ thể

Về nghiên cứu tình trạng nhiễm L monocytogenes trong thực phẩm Việt nam cho đến nay

đã có một số các công bố Năm 1996, trong số 215 mẫu thực phẩm các loại gồm sữa chua,

hải sản đông lạnh, thịt tươi sống, rau xanh và thực phẩm chế biến ăn liền, Viện Pasteur TP HCM đã phân lập được 2 chủng L monocytogenes, chiếm tỷ lệ 0,93 % Đến năm 1999, Viện Vệ sinh Y tế Công cộng cũng phân lập được 2 chủng L monocytogenes từ 20 mẫu

thực phẩm, chiếm tỷ lệ 10 % [11] Theo tổng kết của Viện Pasteur TP HCM, các mẫu hải

sản đông lạnh có tỷ lệ nhiễm L monocytogenes 23,9% (23/138 mẫu) [11]

Nghiên cứu phát hiện L monocytogenes dựa trên kỹ thuật PCR với 141 mẫu thực phẩm,

các tác giả phát hiện thấy 11 mẫu cho kết quả dương tính, chủ yếu là mẫu thịt hun khói [12] Sử dụng phương pháp que thử nhanh, phát hiện được 11/160 mẫu (xúc xích, pate,

sữa, pho mat) nhiễm L monocytogenes [8] Nghiên cứu của Cục Quản lý Chất lượng Nông

Lâm sản và Thủy sản cho thấy có 162/485 mẫu (bao gồm 29/120 mẫu nguyên liệu được lấy tại cửa nhà máy chế biến, 79/186 mẫu vệ sinh công nghiệp trong quá trình sản xuất và 22/95 mẫu vệ sinh công nghiệp sau khi vệ sinh, 8/28 mẫu tay công nhân, 24/36 mẫu bán

thành phẩm) bị phát hiện nhiễm L monocytogenes[1] [2]

Về bệnh do L monocytogenes gây ra tại Việt Nam, đã xuất hiện những ca bệnh nhiễm Listeria có bệnh cảnh lâm sàng phức tạp, khó chẩn đoán và tiên lượng Trần Thị Hồng Châu khi nuôi cấy vi khuẩn trong dịch não tủy đã phát hiện ba ca nhiễm L monocytogenes

gây viêm màng não tại Bệnh viện Lâm sàng Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh, trong đó hai bệnh nhận đã tử vong Bệnh viện Lâm sàng Nhiệt đới Quốc gia năm 2010 cũng phát

hiện được một ca bệnh nhiễm L monocytogenes, bệnh nhân may mắn được cứu sống [8],

[43]

1.1.4 Quy định kiểm soát L monocytogenes

25

Quy chuẩn về giới hạn nhiễm L monocytogenes trong thực phẩm cho các nước Châu Âu,

Mỹ hiện nay là 0 CFU/25 g, ml [86]

Ở Việt Nam, theo Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm, tiêu chuẩn về L monocytogenes nằm trong chỉ tiêu “không có vi sinh vật gây bệnh” tức là 0 CFU/25 g L monocytogenes được

kiểm soát trong tiêu chuẩn ngành thủy sản đối với thủy hải xuất khẩu sang châu Âu và Mỹ Theo Quyết định số 2670 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển nông thôn cấp ngày 29/8/2008 về việc “Công bố danh mục các chỉ tiêu chỉ định kiểm tra đối với l6 hàng thủy

sản”, chỉ tiêu L monocytogenes quy định giới hạn phát hiện là 0 CFU/25 g đối với hầu hết

các loại sản phẩm thủy sản Với qui định kiểm soát này, các phương pháp phân tích phát hiện cần đáp ứng được độ nhạy tối thiểu là 1 CFU/25 ml, g (khi lượng mẫu lấy là 25 g, ml)

1.2 Dịch tễ học phân tử của L monocytogenes

Dịch tễ học phân tử là lĩnh vực nghiên cứu có sự kết hợp giữa sinh học phân tử, thống kê

và dịch tễ Dịch tễ học phân tử xác định đặc điểm của các gen ở mức độ phân tử và xác định phân bố của các kiểu gen trong quần thể Từ đó mô tả mối tương quan giữa các kiểu

gen và khả năng gây bệnh, gây dịch của các chủng nghiên cứu Dịch tễ học phân tử L monocytogenes đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới Tuy vậy ở Việt Nam, cho đến nay,

chưa có công bố nào sử dụng các kỹ thuật phân tử trong phân loại, xác định đặc điểm phân

tử các chủng L monocytogenes để đánh giá khả năng gây bệnh, gây dịch của loài vi khuẩn

nguy hiểm này trên thực phẩm cũng như trên bệnh phẩm

1.2.1 Đặc điểm dịch tễ các dòng giống (lineage) L monocytogenes

Các phương pháp phân loại dựa trên kiểu gen chia L monocytogenes thành 4 dòng giống

chính, gồm dòng giống I, II, III và IV Các dòng này khác nhau về hệ sinh thái chúng thường tồn tại, tỷ lệ tái tổ hợp và hệ gen [45] Dòng giống I có các kiểu huyết thanh 1/2b, 3b, 3c và 4b là dòng thường gây ra các vụ dịch bệnh listeriosis ở nhiều nước trên thế giới Dòng giống II có các kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2c và 3a, là dòng chủ yếu được phân lập từ thực phẩm, nhà máy thực phẩm, môi trường và nông trại Trong khi đó dòng giống III và dòng giống IV thường bao gồm kiểu huyết thanh 4a và 4c [80]; [30] Đây là những dòng rất ít khi gặp trên người hoặc thực phẩm mà chủ yếu phân lập được từ động vật và ít được nghiên cứu [198]; [17]

1.2.2 Đặc điểm dịch tễ các dòng phức hợp (CC) L monocytogenes

Để nghiên cứu dịch tễ học, L monocytogenes được phân loại chi tiết hơn các dòng giống

đó là phân loại thành các dòng phức hợp (CC) Một số CC chuyên gây ra các vụ dịch bệnh

L monocytogenes được gọi là các dòng phức hợp gây bệnh (EC) Các nghiên cứu cho thấy,

có 4 EC là nguyên nhân gây ra phần lớn các vụ dịch listeriosis, đó là ECI, ECIa, ECII, và ECIII [198] Trong đó ECI, ECIa, và ECII là các nhóm riêng biệt trong kiểu huyết thanh 4b Đây là những dòng gây dịch bệnh listeriosis bùng phát lặp đi lặp lại ở Mỹ và châu Âu

1999 [94], dịch do thịt gà tây ở nhiều bang tại Mỹ năm 2002 Mặc dù không có các bằng chứng cho thấy có sự lan truyền của các dòng này giữa các vụ dịch, tuy nhiên khi phân loại dưới loài bằng nhiều phương pháp sinh học phân tử cho thấy các chủng thuộc cùng một EC rất gần gũi nhau về mặt di truyền ECIII là một dòng thuộc dòng giống II và có kiểu huyết thanh 1/2a, dòng này là nguyên nhân gây ra vụ dịch do bánh mỳ kẹp xúc xích tại Mỹ năm

1989 và vụ dịch do thịt gà tây tại Mỹ năm 2000 [94] ECIII cũng là clone đã tồn tại hơn một thập kỷ trong một nhà máy sau đó gây ra vụ dịch liên quan đến gà tây ở nhiều bang Tại Mỹ [198] Mới đây đã xuất hiện những EC mới có khả năng gây bùng phát dịch rất cao như vụ dịch do dưa ruột vàng cantaloupe tại Mỹ năm 2011 là do ECVI [112]

Có một số giả thuyết đã được đưa ra để giải thích nguyên nhân tại sao một số EC có khả năng thường xuyên gây bùng phát dịch bệnh Giả thuyết thứ nhất cho rằng các EC này có khả năng gây độc lớn hơn so với các CC không gây ra các vụ dịch bệnh khác, cụ thể là các

EC này có chứa các trình tự gen gây độc mà các CC khác không có Mặc dù giả thuyết này

đã được thử nghiệm bởi nhiều nghiên cứu khác nhau, tuy nhiên không thu được kết quả cuối cùng [45] Giả thuyết thứ hai có thể giải thích một số EC có khả năng gây dịch bệnh qua thực phẩm thường xuyên hơn là do nó có khả năng tồn tại trong môi trường chế biến thực phẩm trong khoảng thời gian dài Giả thuyết này đã được chứng minh bằng thực tế khi phân lập thấy chủng thuộc ECIII tồn tại trong cùng một nhà máy chế biến thực phẩm trong khoảng 11 năm [95]; [198] Một giả thuyết nữa cho rằng có thể các EC gây dịch cao

là những EC có liều gây bệnh thấp hơn các CC khác, nên chỉ cần nhiễm ở mật độ thấp thì người mang mầm bệnh đã phát bệnh và khi đó EC này có khả năng gây bệnh dịch cao [45]

1.2.3 Đặc điểm dịch tễ các kiểu huyết thanh L monocytogenes

Những số liệu thống kê cho thấy những trận dịch do L monocytogenes gây ra có liên quan

đến một số kiểu huyết thanh nhất định Hầu hết các ca gây bệnh trên người do vi khuẩn này đều thuộc ba kiểu huyết thanh 4b, 1/2a, 1/2b [66]; [125]; [174]; [175] Kiểu huyết thanh 4b thường được phân lập từ các vụ bùng phát dịch listeriosis [38] Kiểu huyết thanh 4b gây ra phần lớn các vụ dịch listeriosis trên người tại Anh [125] Trong giai đoạn từ 1976- 1985, 70% số ca listeriosis ở người tại Thụy Điển gây ra bởi các chủng thuộc kiểu huyết thanh 4b [65] Trong khi đó, các chủng phân lập từ thực phẩm, chủ yếu thuộc kiểu huyết thanh 1/2 [66]; [113] Các kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2b trước đây thường được phát hiện trong các trường hợp nhiễm bệnh rải rác [183]; [200] Đây cũng là kiểu huyết thanh thường phân lập được từ những người bị nhiễm trùng huyết hoặc sẩy thai [115] Các công

27

bố gần đây cho thấy sự phân bố của các kiểu huyết thanh đã thay đổi Rất nhiều các chủng thuộc kiểu huyết thanh 1/2 đã được phân lập trên người [76]; [126]; [114] Cụ thể là trong giai đoạn từ 1986-1999, tại Thụy Điển 45% các chủng phân lập từ người thuộc kiểu huyết thanh 4b, 44% thuộc kiểu huyết thanh 1/2a và 10% số chủng thuộc kiểu huyết thanh 1/2b

và 1/2c Vụ dịch xảy ra tại Bỉ năm 2011 do sản phẩm pho mát, làm 12 người mắc bệnh listeriosis là do kiểu huyết thanh 1/2a [205] Cùng năm đó vụ dịch tại Mỹ do dưa đỏ làm

146 người mắc bệnh listeriosis trong đó có 30 người chết, 1 người sảy thai cũng là do kiểu huyết thanh 1/2a và 1/2b [101]

1.2.4 Các phương pháp phân loại sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử

Để nghiên cứu dịch tễ học, cần sử dụng các phương pháp phân loại dưới loài vi sinh vật Phương pháp phân loại hữu dụng là phương pháp có khả năng phân biệt các dòng gây bệnh, gây dịch, các dòng có khả năng gây bệnh, gây dịch kém hơn hoặc không có khả năng gây bệnh, gây dịch Ngoài độ phân biệt của phương pháp, trong thực tế, để chọn được một phương pháp thích hợp còn cần quan tâm đến các yếu tố khác như độ phức tạp của phương pháp (cách tiến hành và phân tích kết quả), điều kiện phòng thí nghiệm nơi phân tích (trình

độ kỹ thuật viên và thiết bị); chi phí, thời gian thực hiện cũng như độ lặp lại của phương pháp [4]

Có hai nhóm phương pháp chính thường được sử dụng để phân loại dưới loài hiện nay, đó

là phân loại dựa trên kiểu hình và phân loại dựa trên kiểu gen Để đánh giá khả năng phân loại của một phương pháp người ta thường sử dụng chỉ số phân loại (DI) [87], Chỉ số này càng lớn thì khả năng phân loại càng lớn, kết quả nghiên cứu càng có ý nghĩa về mặt dịch

tễ học Các phương pháp phân loại dựa theo kiểu hình (serotyping; Phage typing; MLEE typing) có chỉ số DI không cao, chính vì vậy, ứng dụng của các phương pháp này trong nghiên cứu bệnh dịch có phần hạn chế [108]; [145]; [23]; [72] Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử thì chủ yếu dựa vào phương pháp phân loại dưới loài theo kiểu gen Sau đây là một số phương pháp phân loại dưới loài dựa trên kiểu gen thường sử dụng

1.2.4.1 Phương pháp điện di xung trường (PFGE)

Kỹ thuật điện di xung trường là một phương pháp tiêu chuẩn trong phân loại dưới loài các

vi khuẩn nói chung và L monocytogenes nói riêng Khi sử dụng phương pháp điện di

thông thường, các phân tử DNA có kích thước lớn (>15 kb) sẽ dịch chuyển cùng nhau và không thể phân biệt được các phân tử này trên gel Khi sử dụng PFGE, bằng cách thay đổi tuần tự chiều chạy điện di, các phân tử ADN có kích thước lớn có thể được phân tách ra khỏi nhau

Kỹ thuật PFGE thường sử dụng 2 loại enzyme giới hạn (AscI và ApaI) để cắt DNA thể gen của L monocytogenes thành các đoạn có kích thước dao động từ 40-600 kb Với kích

thước này không thể điện di theo phương pháp thông thường mà chỉ có thể tách ra bằng kỹ thuật PFGE, dưới tác dụng của dòng điện xoay chiều, các đoạn DNA di chuyển qua lại,

28

cuối cùng chúng phân tách ra thành các mảnh riêng lẻ Dựa vào phổ điện di các mảnh DNA này, sử dụng phần mềm tin sinh BioNumerics và cơ sở dữ liệu của PulseNet về phổ

điện di PFGE của các chủng L monocytogenes để phân loại các chủng nghiên cứu thuộc

nhóm nào và dự đoán được mức độ nguy hiểm của các chủng đó [30]; [29] Phương pháp PFGE có ưu điểm là cho khả năng phân loại và độ lặp lại cao [39] Nhược điểm của phương pháp này là mất nhiều thời gian (3-5 ngày), đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dụng, kỹ thuật cũng như kinh nghiệm của kỹ thuật viên yêu cầu cao Hơn nữa phương pháp này cũng không thể phân loại được toàn bộ các chủng, với mỗi kỹ thuật viên và phòng thí nghiệm khác nhau có thể cho ra một điện di đồ có một chút khác nhau đối với cùng một chủng Với hai băng cùng kích thước cũng chưa hẳn là cùng một đoạn DNA [39]; [49] Đôi khi các băng cũng không tách nhau ra hoàn toàn được Một số chủng cũng không thể phân loại được bằng PFGE [39] Với những nhược điểm trên, phương pháp này khó được áp dụng rộng rãi [129]

1.2.4.2 Phương pháp ribotyping

Ribotyping là một phương pháp phân biệt sự khác nhau phổ rRNA của vi sinh vật dựa trên

kỹ thuật RFLP Phương pháp này sử dụng đầu dò là một DNA ribosome có đánh dấu

phóng xạ để phát hiện ra các mảnh DNA được cắt bởi enzyme giới hạn (EcoRI, PvuII hoặc XhoI) Như vậy, chỉ các mảnh DNA có chứa các gen rRNA được nhận biết [80]; [31]

Phương pháp ribotyping có một số ưu điểm sau: Phổ kết quả của phương pháp này dễ phân tích hơn so với phương pháp PFGE Ribotyping không đòi hỏi các thiết bị đặc biệt trong nghiên cứu Ngoài ra, phương pháp này có thể cải biến để tự động hóa bằng hệ thống thiết

bị RiboPrinter Microbial Characterization System và có thể dễ dàng thực hiện với số lượng mẫu lớn Tuy nhiên phương pháp này có độ phân biệt kém phương pháp PFGE và

các phương pháp PCR [64] Thêm nữa, ribotyping không thể phân biệt được các dòng L monocytogenes liên quan và không liên quan đến các vụ dịch Trong khi đó phương pháp

PFGE và AP-PCR lại có khả năng phân biệt tốt hơn Tuy vậy, ribotyping cũng là một công

cụ hữu hiệu trong điều tra dịch tễ học phân tử L monocytogenes và theo dõi và xác định phân bố của các dòng L monocytogenes

1.2.4.3 Phương pháp đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD)

Phương pháp RAPD thực chất là quá trình nhân các đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên Các mồi này sẽ bắt cặp một cách ngẫu nhiên vào DNA khuôn ở bất kỳ vị trí nào mà tại đó có trình tự bổ sung với nó Chỉ cần một khác biệt nhỏ trong bộ gen cũng có thể tạo ra kích thước và số vạch sản phẩm trên điện di đồ khác

nhau, từ đó phân loại thành các dòng L monocytogenes khác nhau dựa trên phổ điện di đồ

này

Phương pháp này có ưu điểm là chỉ cần sử dụng cùng một bộ mồi cho phân loại nhiều loài

vi sinh vật khác nhau với một chút thay đổi về quy trình thực hiện, giá thành phương pháp

29

thấp Tuy nhiên, phương pháp này có khả năng phân loại trung bình, độ lặp lại thấp [129];

[49] và không thích hợp để sử dụng trong việc phân loại các chủng L monocytogenes

thuộc nhóm 4b Thêm nữa việc khó tiêu chuẩn hóa đã hạn chế việc áp dụng phương pháp

này trong phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử các dòng L monocytogenes [108]

1.2.4.4 Phương pháp đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc (AFLP)

Nguyên tắc của phương pháp này là DNA của mẫu nghiên cứu thường được cắt bởi hai

enzyme giới hạn, một enzyme có tần số cắt trung bình (như EcoRI) và một loại khác có tần

số cắt cao hơn (như MseI hoặc TaqI) Kết quả là DNA sẽ bị cắt thành nhiều đoạn có kích

thước khác nhau nhưng trình tự nucleotid ở hai đầu đoạn cắt là giống nhau và đã xác định Thiết kế các đoạn DNA kép với đầu gắn tương ứng với hai đầu của DNA mới được cắt (adaptor) Gắn chúng vào các đoạn DNA mới được cắt Thiết kế mồi PCR có phần trình tự

bổ sung với adaptor Với mồi thiết kế như trên chỉ có các đoạn DNA có trình tự hai đầu bắt cặp với trình tự mồi mới được khuếch đại Phương pháp này có nhiều ưu điểm như phản ứng có độ phân loại cao, ổn định, dễ thiết kế mồi ở lượng lớn và khả năng ứng dụng lớn

Phương pháp này đã được sử dụng để phân biệt L monocytogenes với các loài Listeria khác hoặc giữa các chủng L monocytogenes với nhau [156]; [96] Tuy vậy, AFLP là một

phương pháp phức tạp mất nhiều thời gian (2-3 ngày) với sự kết hợp nhiều kỹ thuật như tinh sạch DNA, cắt DNA bằng enzyme giới hạn, nối các adapter, việc cắt và nối không hoàn toàn có thể làm sai lệch kết quả

1.2.4.5 Phương pháp đa hình chiều dài các đoạn sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme giới hạn (PCR-RFLP)

Nguyên tắc của phương pháp PCR-RFLP là khuếch đại một hoặc nhiều gen sau đó sản

phẩm PCR được cắt bởi các enzyme giới hạn (ví dụ HhaI, SacI hoặc HinfI) và cuối cùng

được điện di trên gel agarose Từ phổ điện di thu được, người ta có thể phân biệt được sự

khác nhau giữa các chủng L monocytogenes [200] Các gen được sử dụng thường là các

gen mã hóa các tiểu phần ribosom hoặc các gen gây độc Phương pháp này là một phương pháp đơn giản, cho khả năng phân loại tương đối cao Tuy nhiên phương pháp này cũng có nhược điểm giống các phương pháp dựa trên phổ điện di, đó là khó khăn trong việc so sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm khác nhau [139] Khi sự phân cắt của enzyme không triệt để có thể làm sai lệch kết quả, hoặc các băng điện di mờ nhạt sẽ làm cho việc đánh giá kết quả khó khăn [49]

1.2.4.6 Phương pháp khuếch đại các trình tự lặp (REP-PCR)

Phương pháp này sử dụng các cặp mồi là các trình tự lặp lại, không mã hóa nằm rải rác trên hệ gen trong các vi sinh vật nhân sơ Các đoạn DNA nằm giữa các trình tự lặp này được nhân lên tạo thành một phổ các sản phẩm PCR trên điện di đồ Phổ điện di sản phẩm

PCR được sử dụng làm căn cứ trong phân loại dưới loài L monocytogenes Phương pháp

REP-PCR là một phương pháp phân loại dưới loài đơn giản cho kết quả nhanh, giá thành

Hệ thống này giúp phương pháp dễ dàng tiêu chuẩn hóa Tuy vậy ngay cả khi sử dụng hệ thống DiversiLab thì khả năng phân loại theo phương pháp này cũng chưa cao, thấp hơn so với PFGE Cho nên phương pháp này thích hợp hơn cho các nghiên cứu dịch tễ học dài hạn mà yêu cầu về khả năng phân loại không cao [160]

1.2.4.7 Phương pháp phân tích vùng lặp đối xứng của nhiều locus (MLVA)

MLVA là một phương pháp phân loại dưới loài dựa trên sự khuếch đại các đoạn DNA chứa vùng lặp đối xứng (VNTRs) Mỗi chủng sẽ có sự khác nhau về số lượng các vùng lặp

và độ dài các vùng lặp Sự khác nhau này sẽ được phân biệt trên hệ thống điện di mao quản hoặc điện di thường Nếu các vùng lặp VNTR có kích thước đủ lớn (lớn hơn hoặc bằng 9 bp) có thể thấy rõ sự khác biệt giữa hai alen trên gel [190] Có nhiều các nghiên cứu phân

loại dưới loài L monocytogenes được phát triển với sự khác nhau nhất định trong protocol

Lý do là mỗi nghiên cứu dựa trên một nhóm trình tự lặp VNTR khác nhau hoặc với mồi khác nhau cho cùng một vùng lặp VNTR Thậm chí còn nhiều protocol khác nhau được phát triển cho cùng một vùng lặp VNTR Điều này gây khó găn lớn cho việc so sánh kết quả MLVA giữa các phòng thí nghiệm khác nhau Kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy khi sử dụng phương pháp MLVA và phân tích sản phẩm khuếch đại trên gel agarose cho khả năng phân loại kém hơn so với phương pháp PFGE Chính vì những hạn chế này mà

MLVA được cho là không phù hợp để phân loại các chủng L monocytogenes từ các vụ

dịch và giám sát dịch tễ học [160]

1.2.5 Phương pháp phân loại dựa trên trình tự của nhiều locus (MLST)

Phương pháp MLST được phát triển đầu tiên cho Neisseria meningitidis vào năm 1998

[117] Không lâu sau đó, phương pháp này đã được sử dụng để nghiên cứu nhiều loài khác nhau Đến bây giờ nó đã trở thành một phương pháp rất thông dụng trong nghiên cứu dịch

tễ học phân tử và sự tiến hóa các loài vi sinh vật gây bệnh Nghiên cứu đầu tiên về phân

loại L monocytogenes theo phương pháp MLST được thực hiện trên 7 đoạn gen và vùng gen Trong đó có 2 đoạn gen giữ nhà (housekeeping gene) là recA và prs, 1 gen đáp ứng stress là sigB, 2 gen gây độc là actA và inlA, và 2 vùng giữa 2 gen hly-mpl và plcA-hly

[35] Kết quả cho thấy độ phân loại của 7 gen và vùng gen này tương đương với giải trình

tự toàn bộ một trong hai genactA (1,929 bp) và inlA (2,235 bp)

Một loạt các nghiên cứu về phân loại L monocytogenes bằng MLST sau đó được tiến

hành Các nghiên cứu này chia làm 2 hướng chính Hướng thứ nhất sử dụng các gen gây

31

độc và các gen liên quan đến độc tính hay còn gọi là phương pháp MVLST, hướng thứ 2

sử dụng các gen giữ nhà

1.2.5.1 Phương pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus gen độc (MVLST)

Wei Zhang lần đầu tiên nghiên cứu thiết lập phương pháp phân loại L monocytogenes theo phương pháp MVLST Trong đó tác giả sử dụng 3 gen gây độc (prfA, inlB, and inlC) và 3 gen liên quan đến độc tính (dal, lisR, and clpP) Kết quả nghiên cứu này cho thấy MVLST

có khả năng phân loại lớn hơn phương pháp ribotyping EcoRI-RT và tương đương phương

pháp PFGE Tuy nhiên mối quan hệ họ hàng trên cây phân loại giữa 2 phương pháp lại rất khác nhau Điều này rất phụ thuộc vào gen lựa chọn cho phương pháp MVLST [207] Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nếu sử dụng phương pháp MVLST với 6 gen gây độc và liên quan đến độc tính cho phân loại tốt hơn so với phương pháp sử dụng 3 đoạn gen giữ nhà sigB, prs, và recA Trong nghiên cứu phân loại L monocytogenes theo phương pháp MVLST ba đoạn gen gây độc prfA, inlB, và inlC và 3 đoạn gen liên quan đến tính độc dal, lisR, và clpP đã được sử dụng cho phân tích So với các phương pháp phân loại khác

như ribotyping EcoRI-RT và PFGE với enzyme giới hạn là ApaI cho thấy, MVLST có khả năng phân loại được các chủng mà hai phương pháp tham chiếu không có khả năng phân biệt Ribotyping phân thành vi khuẩn này 13 ribotype với chỉ số DI là 0,921; phương pháp PFGE phân thành 22 nhóm với chỉ số DI là 0,97 Trong khi đó nếu dựa trên trình tự 6

gen trên thì phương pháp MVLST cho chỉ số DI là1 [207]

1.2.5.2 Phương pháp phân loại dựa trên trình tự các gen giữ nhà

Phương pháp phân loại MLST dựa trên các gen giữ nhà là phương pháp cải biến từ phương pháp điện di nhiều enzyme (MLEE) Trong phương pháp MLEE việc phân loại dựa trên phổ điện di các sản phẩm được tổng hợp từ các gen giữ nhà (các enzyme), còn trong phương pháp MLST, các locus gen giữ nhà được giải trình tự Lý do để chọn các gen giữ nhà cho phương pháp phân loại MLST là vì chúng tồn tại trong mọi sinh vật, chúng được biểu hiện ở mọi điều kiện sống, tính đa hình của các gen giữ nhà ở mức trung bình vì chúng là những gen đóng vai trò quan trọng trong việc giúp vi sinh vật tồn tại [121] Chính

vì vậy phương pháp phân loại MLST sử dụng các gen giữ nhà được cho là đặc biệt phù hợp với các nghiên cứu dịch tễ học toàn cầuvà nghiên cứu dịch tễ học lâu dài cũng như

nghiên cứu sự tiến hóa và mối quan hệ họ hàng về kiểu gen giữa các chủng L monocytogenes khác nhau [63]

Một số gen giữ nhà thường được sử dụng cho phương pháp MLST như sau:

ABC (ATP-binding cassette) transporter (abcZ): Đối với các loài sinh vật nói chung

abcZ là một nhóm gen có vai trò quan trọng trong vận chuyển (việc hấp thu các chất dưỡng

và tiết các hợp chất thứ cấp ra môi trường), bên cạnh đó còn được tham gia vào quá trình

dịch mã của mRNA và sửa chữa DNA [55] Với L monocytogenes, abcZ được chứng

minh là có vai trò trong việc truyền tín hiệu để điều tiết giảm của sự hình thành màng sinh học (biofilm) trên bề mặt thực phẩm hoặc môi trường nơi chúng xâm nhiễm [208]

32

D-amino acid aminotransferase (dat): là gen mã hóa sinh tổng hợp enzyme D-amino acid

aminotransferase Enzyme này hoạt động trên đồng phân dạng D của alanine, leucine, aspartate, glutamate, aminobutyrate, norvaline và asparagin Enzyme này chuyển nhóm amin từ một D- axit amin cho các cofactor pyridoxal phosphate để tạo thành pyridoxamin

và axit alpha-keto trong nửa đầu của phản ứng Nửa sau của phản ứng là quá trình đảo ngược của các phản ứng nửa đầu, chuyển nhóm amin từ pyridoxamin đến một axit alpha-keto thứ hai để tạo thành các sản phẩm D-axit amin qua cơ chế ping-pong Đây là một quá trình quan trọng trong sự hình thành của D-alanine và D-glutamate, những thành phần cần thiết tạo lên vách tế bào vi khuẩn [142]; [184]

L-lactate dehydrogenase (ldh): Mã hóa sinh tổng hợp L-lactate dehydrogenase, enzyme

này là chịu trách nhiệm cho việc chuyển đổi L-lactate và NAD+

thành pyruvate và NADH [71]

Superoxide dismutase (sod): Mã hóa sinh tổng hợp enzyme Superoxide dismutase Đây là

một enzyme xúc tác chuyển hóa superoxide (O2-) tạo thành một trong hai dạng là oxy phân tử (O2) và hydrogen peroxide (H2O2) Superoxide được sinh ra như một sản phẩm phụ của quá trình chuyển hóa, chúng gây ra nhiều loại tổn thương cho tế bào Hydrogen peroxide cũng gây hại, nhưng kém hơn, và được phân hủy bởi các enzyme khác như catalase Như vậy, SOD là một tác nhân chống oxy hóa quan trọng trong gần như tất cả các

tế bào sống [189]

Catalase (cat): Mã hóa sinh tổng hợp enzyme catalase Đây là enzyme có ở hầu hết sinh

vật sống Enzyme này xúc tác phân hủy của hydrogen peroxide (H2O2) tạo thành nước và oxy Hydrogen peroxide là một sản phẩm phụ độc hại của nhiều quá trình trao đổi chất trong cơ thể sinh vật, để tránh thiệt hại cho các tế bào, H2O2 phải được nhanh chóng chuyển đổi thành các chất ít nguy hiểm khác Chính vì vậy catalase có vai trò quan trọng trong việc giải độc tế bào khỏi H2O2, điều này đặc biệt quan trọng đối với sự tồn tại của bản thân vi khuẩn,nhất là trong các điều kiện khắc nghiệt của môi trường sống như stress

do lạnh, do tan đông, …[127]

Succinyl diaminopimelate dessucinylase (dapE): Mã hóa sinh tổng hợp enzyme Succinyl

diaminopimelate dessucinylase Enzyme này thuộc nhóm mesodiaminopimelate (MDAP), tham gia vào đường hướng sinh tổng hợp lysine Các axit amin mDAP hoặc lysine là thành phần rất cần thiết để xây dựng lên vách tế bào peptidoglycan đối với hầu hết các loài vi khuẩn [77]

Phosphoglucomutase (pgm): Mã hóa sinh tổng hợp enzyme phosphoglucomutase

Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong sản sinh các hợp chất thứ cấp như lipopolysaccharide và axit lipoteichoic [141]; [26]

Beta-glucosidase (bglA): Mã hóa sinh tổng hợp enzyme beta-glucosidase Enzyme này

xúc tác phân hủy liên kết beta glucoside, đóng vai trò quan trọng trong việc đồng hóa hydrocacbon của vi khuẩn Sự biểu hiện của cả 2 gen listeriolysin (hly) và

33

phosphatidylinositol-specific phospholipase C (plcA) đầu bị ức chế bởi cellobiose Khi đó enzyme beta-glucosidase thủy phân cellobiose để giải sự ức chế này giúp vi khuẩn dễ dàng xâm lấn vào tế bào Enzyme beta-glucosidase cũng thủy phân β-D-glucoside esculin trong

môi trường phân lập Listeria tạo esculetin, hợp chất này phản ứng với ion Fe3+ để tạo

quầng đen xung quanh khuẩn lạc trên các môi trường phân lập L monocytogenes[54]

Histidine kinase (lhkA): Mã hóa sinh tổng hợp enzyme Histidine Kinases Enzyme này

xúc tác chuyển hóa protein L-histidine thành protein N-Phospho-L-histidine nhờ 1 phân tử ATP chuyển hóa thành 1 phân từ ADP Gen lhkA có vai trò quan trọng trong điều tiết sự

thích nghi của L monocytogenes đối với sự thay đổi của môi trường Nồng độ lhkA mRNA

trong tế bào vi khuẩn tăng lên khi phát triển trong điều kiện lạnh, dẫn đến có thể tăng sự tổng hợp histidine kinase, một cảm biến môi trường quan trọng trong việc thích nghi với điều kiện lạnh của vi khuẩn [110]

Hệ thống phân loại dựa trên 7 gen giữ nhà hiện nay bắt nguồn từ kết quả nghiên cứu của

Salcedo và cộng sự [168] Trong nghiên cứu này tác giả đã sử dụng 9 gen giữ nhà: abcZ; dat; ldh; sod; cat; dapE; pgm; bglA và lhkA Kết quả nghiên cứu này cho thấy hai gen sod

và pgm có tính đa hình rất thấp (trong 40 chủng thuộc kiểu huyết thanh 4b và 1/2b nghiên

cứu chỉ có duy nhất 1 alen) [168] Chính vì vậy tác giả cũng khuyến cáo các nghiên cứu

sau này nên bỏ 2 gen đó trong phương pháp MLST đối với L monocytogenes Một số các

thay đổi tiếp theo được thực hiện nhằm cải thiện khả năng phân loại của phương pháp Đầu

tiên, các trình tự gen ldh đã được mở rộng từ 354 lên 453 nucleotide để cải thiện sự phân

biệt giữa các chủng Sau đó, phương pháp MLST đã được tiêu chuẩn hóa bởi Viện Pasteur

Pháp [83] Hệ thống phân loại L monocytogenes theo phương pháp MLST này được tiến hành với 7 gen abcZ; dat; ldh; cat; dapE; bglA và lhkA, các mồi sử dụng cho nhân các gen

này đều được gắn với đuôi trình tự phổ cập Điều này cho phép giải trình tự các sản phẩm PCR của tất cả các gen chỉ sử dụng một cặp mồi duy nhất là trình tự đuôi phổ cập

Mỗi một chủng sẽ có một kiểu trình tự (ST) bao gồm một phổ alen (là một tập hợp 7 alen tương ứng với 7 đoạn gen giữ nhà) [120] Một dòng phức hợp (CC) là một tập hợp các ST

có ít nhất 6 alen giống nhau [46] Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là cơ sở dữ liệu của phương pháp rất phong phú, được tiêu chuẩn hóa và có độ lặp lại cao Cơ sở dữ liệu còn cung cấp cả phần mềm (eBURST) để xác định sự liên quan của chủng nghiên cứu với các chủng đã công bố trên đó [164] Nhược điểm lớn nhất của MLST là giá thành phương pháp tương đối cao Tuy nhiên với chi phí dịch vụ giải trình tự đang giảm dần thì phương pháp này hứa hẹn là phương pháp hữu hiệu và thích hợp cho nghiên cứu dịch tễ học phân

tử L monocytogenes

Nghiên cứu của Wei Zhang và cộng sự cho thấy độ phân loại của MVLST cao hơn so với

phương pháp MLST [207] Tuy nhiên, nghiên cứu của Wei Zhang chỉ dựa trên 3 gen prs, sigB, và recA và số lượng chủng nghiên cứu chỉ có 14 chủng Một nghiên cứu mới đây cho thấy khả năng phân loại 125 chủng L monocytogenes của phương pháp MLST trên 7 gen

34

giữ nhà có độ phân loại lớn hơn phương pháp MVLST với 8 gen gây độc và gen liên quan đến độc tính (số lượng alen trên 125 chủng của 2 phương pháp lần lượt là 51 và 40) Nghiên cứu này cũng cho thấy khả năng phân loại trong CC1 của phương pháp MLST cao hơn rất nhiều so với phương pháp MVLST (số lượng ST của 2 phương pháp lần lượt là 10

và 3) [36]

1.2.6 Cơ sở dữ liệu về phương pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus (MLST)

Độ chính xác của một phương pháp phân loại phụ thuộc vào cơ sở khoa học của phương pháp và cơ sở dữ liệu sử dụng cho so sánh Về cơ sở khoa học, MLST cho phép phân biệt

sự sai khác trong 7 đoạn gen giữ nhà ở mức độ nhỏ nhất (từ một nucleotit trở đi) Về cơ sở

dữ liệu, hiện nay có khá nhiều các nguồn cơ sở dữ liệu được sử dụng cho phương pháp MLST Tuy nhiên cơ sở dữ liệu của viện Pasteur Pháp là khá phong phú và tập trung (http://bigsdb.web.pasteur.fr/) Đây là một nguồn cơ sở dữ liệu mở được cập nhật thường xuyên bởi đội ngũ quản trị và người sử dụng trên toàn thế giới Đến thời điểm hiện tại, nếu

chỉ tính riêng loài L monocytogenes đã có 947 kiểu trình tự MLST với 7475 chủng L monocytogenes đầy đủ thông tin về trình tự của 7 đoạn gen giữ nhà cho phân tích MLST

cũng như một số thông tin bổ sung liên quan đến nguồn gốc, địa điểm phân lập, thời gian phân lập

1.3 Một số phương pháp phân tích phát hiện L monocytogenes

1.3.1 Phương pháp nuôi cấy [89]; [10]

Nguyên tắc của phương pháp này là tiến hành tăng sinh (1 hoặc 2 giai đoạn), sau đó cấy trải trên đĩa thạch môi trường chọn lọc như Oxford, PALCAM hoặc MOX hoặc một số môi trường chromogenic Các khuẩn lạc nghi ngờ được phân tích khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa, PCR hoặc miễn dich

Hiện nay có 2 loại môi trường chromogenic phổ biến cho phân tích phát hiện và định

lượng L monocytogenes đó là ALOA (môi trường được mô tả bởi Ottaviani và Agostivà được chỉ định sử dụng trong phương pháp ISO 11290-1:1997) và môi trường RAPID’L.mono Các môi trường chromogenic có tính phân biệt cao hơn so với các môi

trường thông thường, nên việc nhận dạng L monocytogenes sẽ dễ dàng hơn Trên môi trường ALOA, L monocytogenes sinh ra β-glucosidase Loại enzyme này phân cắt các hợp

chất chromogenic tạo thành khuẩn lạc màu xanh Lecithin trong môi trường thạch được

thủy phân bởi enzyme phospholipase (được tổng hợp bởi L monocytogenes và L ivanovii

tạo thành quầng sáng xung quanh khuẩn lạc [146] Trên môi trường ALOA, khuẩn lạc có hình tròn, đường kính không quá 3 mm Môi trường RAPID’L.mono sử dụng 2 loại chỉ thị, một là hợp chất chomogenic kiểm tra hoạt tính PIPLC (phosphatidylinositol-specific phospholipase) và hai là kiểm tra khả năng lên men đường xylose Khuẩn lạc có màu xanh

là L monocytogenes (có hoạt tính PIPLC) và không có khả năng lên men đường xylose) Khuẩn lạc có màu xanh với quầng sáng màu vàng là L ivanovii (có hoạt tính PIPLC và khả

năng lên men đường xylose) Khuẩn lạc có màu trắng với quầng sáng màu vàng hoặc

35

không có quầng sáng màu vàng là các loài Listeria khác (không có hoạt tính PIPLC và có

thể có hoặc không có khả năng lên men đường xylose)

Phương pháp nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc xác định L momocytogenes,

tuy nhiên phương pháp này tốn rất nhiều thời gian và nhân công (6 ngày để có kết quả dương tính) Hơn nữa phương pháp này sẽ gặp khó khăn khi trong mẫu phân tích có chứa

các loại vi sinh vật khác với mật độ nhiều hơn nhiều so với L monocytogenes Khi đó nếu

môi trường tăng sinh không có tính chọn lọc cao thì tại độ pha loãng mà các khuẩn lạc tách

rời nhau trên đĩa thạch, sẽ không có sự xuất hiện L monocytogenes, khi đó phép phân tích

cho kết quả âm tính giả

Qui định kiểm soát L monocytogenes trong một số thực phẩm hiện nay ở Việt Nam và trên

thế giới là 0 CFU/25 ml, g [2][1] Với quy định này, yêu cầu phân tích là phát hiện sản phẩm

có hay không có L monocytogenes trong 25 ml, g sản phẩm Như vậy ở mật độ vi khuẩn

quá thấp (0 CFU đến <100 CFU/ml, g sản phẩm) thì nhất thiết phải có quá trình tăng sinh trước khi tiến hành các bước phân tích tiếp theo Trong các phương pháp phân tích nhanh, tăng sinh là công đoạn chiếm phần lớn thời gian Việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng

đến khả năng sinh trưởng của L monocytogenes, từ đó tìm được điều kiện nuôi cấy tăng

sinh tốt nhất nhằm giảm thời gian tăng sinh có ý nghĩa lớn trong việc rút ngắn thời gian toàn bộ quy trình phân tích

1.3.1.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình tăng sinh

 Chất dinh dưỡng: Để sinh trưởng, vi khuẩn cần cung cấp các chất dinh dưỡng tối thiểu bao gồm nguồn nitơ (các axit amin, peptid, …) nguồn carbon; muối khoáng Trong các

môi trường tăng sinh L monocytogenes nguồn nitơ thường là cao nấm men, trypton, cao

thịt, pepton Các nguồn nitơ này là những nguồn nitơ hữu cơ, ngoài việc cung cấp nitơ, chúng còn cung cấp các vitamin, muối khoáng và các axit amin cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn Cao nấm men được coi là một nguồn nitơ giàu vitamin đặc biệt là vitamin

nhóm B

Một số các muối khoáng hay được sử dụng như muối potassium phosphates hoặc/và

sodium phosphate cũng thường có trong thành phần môi trường nuôi cấy tăng sinh L monocytogenes (các môi trường HF, UVM, BLEB) Đây vừa là nguồn cung cấp muối

khoáng vừa là tác nhân đệm giữ cho pH môi trường ổn định trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Sodium pyruvate thường có trong một số môi trường tăng sinh, hoạt chất này

có tác dụng giúp phục hồi các tế bào bị tổn thương do các stress về nhiệt độ, áp suất thẩm thấu, trong quá trình bảo quản và chế biến thực phẩm [33]; [60] Những tế bào bị tổn thương này nếu không được phát hiện có thể được phục hồi chậm và sau đó trở thành tế bào khỏe mạnh, sinh sôi, nảy nở trong thực phẩm

 Kháng sinh: Mỗi phương pháp phân tích thường được sử dụng một loại môi trường tăng

sinh Các loại môi trường đã thương mại hóa sử dụng trong tăng sinh L monocytogenes có

một số thành phần cơ bản giống nhau, tuy nhiên cũng có nhiều thành phần khác nhau rõ

36

rệt Độ chính xác của phương pháp phân tích phụ thuộc vào tính tăng sinh chọn lọc của môi trường Đặc biệt các phương pháp nuôi cấy thì tính chọn lọc của môi trường có ý nghĩa quyết định đến độ chính xác của phương pháp Một số nghiên cứu sử dụng môi

trường UVM cho khả năng phát hiện L monocytogenes trên thực phẩm tốt hơn các loại

môi trường khác như nước peptone [22]; [53] Lý do có thể là do môi trường UVM cho khả năng phục hồi tế bào bị thương bởi nhiệt tốt hơn các môi trường khác [16] Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, việc sử dụng môi trường tăng sinh chọn lọc cho khả năng phát hiện cao hơn so với việc sử dụng môi trường không chọn lọc [16] Một số kháng sinh

thường được sử dụng trong tăng sinh chọn lọc L monocytogenes như sau:

Acriflavine: Có tác dụng ức chế sự tổng hợp RNA Đây là loại kháng sinh hay được dùng

trong tăng sinh và trong các qui trình phân tích định lượng với nồng độ sử dụng từ 10-25 mg/l, chúng thường được sử dụng kết hợp với các tác nhân chọn lọc khác Ralovich và

cộng sự sử dụng acriflavin trong môi trường phân lập L monocytogenes lần đầu tiên năm

1971 Kết quả nghiên cứu này cho thấy, L monocytogenes phát triển tốt trong môi trường

có chứa acriflavin ở nồng độ lên đến 40 mg/l (trong khi đó, các cầu khuẩn gram dương bị

ức chế ở nồng độ này) [109] Theo Rijkelt Beumer và cộng sự [21], việc sử dụng acriflavin

trong các môi trường tăng sinh Listeria spp cho ảnh hưởng cả trực tiếp và gián tiếp lên khả năng phân lập được L monocytogenes Nồng độ acriflavine tăng lên sẽ tác động lên cả pha lag và thời gian thế hệ của L monocytogenes, trong khi đó kháng sinh này rất ít ảnh hưởng đến L innocua Acriflavin có thể liên kết với protein trong mẫu làm giảm hoạt tính kháng sinh và có thể làm giảm ảnh hưởng của kháng sinh lên L monocytogenes Ở pH <5,8 khả

năng liên kết với protein của kháng sinh này được cải thiện hơn, tuy nhiên khi pH quá thấp

lại có thể ức chế L monocytogenes phát triển Để hài hòa các yếu tố trên có thể sử dụng

acriflavine ở nồng độ thấp kết hợp với đệm thích hợp trong môi trường tăng sinh có thể

cho kết quả phân lập L monocytogenes tốt nhất

Acid nalidixic: Đây là loại kháng sinh có tác dụng ức chế sự tổng hợp DNA của tế bào và

được dùng làm tác nhân chọn lọc Listeria [109] và chúng được sử dụng khá phổ biến trong các môi trường cần ức chế vi khuẩn Gram âm Trong hầu hết các môi trường tăng sinh L monocytogenes, acid nalidixic được dùng kết hợp với các tác nhân ức chế khác [51]

Cycloheximide (actidione): Loại kháng sinh này ức chế sự tổng hợp protein trong các tế

bào nhân chuẩn bằng cách bám vào tiểu phần 80S rRNA [51] Trong các môi trường tăng

sinh cho phân lập L monocytogenes, chúng là tác nhân ức chế hầu hết nấm men và nấm

mốc Một số các sản phẩm có nguy cơ nhiễm nấm mốc và nấm men cao như phomai, sữa chua, … thì nên sử dụng loại kháng sinh này trong môi trường tăng sinh Các sản phẩm nguy cơ nhiễm nấm mốc, nấm men không cao thì không cần thiết phải sử dụng loại kháng

sinh này Trong các quy trình phát hiện nhanh L monocytogenes, thời gian tăng sinh

thường rất ngắn (6-12 giờ) do đó chưa đủ thời gian cho sự phát triển tạo sinh khối tối đa của nấm men, nấm mốc, nên cũng không cần sử dụng loại kháng sinh này

37

Trên đây là ba loại kháng sinh thường được sử dụng trong các môi trường tăng sinh L monocytogenes Ngoài các loại kháng sinh này thì một số môi trường tăng sinh L monocytogenes thương mại cũng có sử dụng một vài loại kháng sinh khác như

Amphotericin B, polymyxin, ceftazidime, tuy nhiên không phổ biến [51] Tuy rằng chúng

là những tác nhân chọn lọc trong phân lập L monocytogenes, nhưng các kháng sinh này vẫn ức chế sự sinh trưởng của bản thân L monocytogenes, nhất là khi sử dụng ở nồng độ

cao [106] Nồng độ kháng sinh thích hợp là nồng độ tại đó các loại kháng sinh này không

ảnh hưởng nhiều đến tốc độ sinh trưởng của L monocytogenes, tuy nhiên nó vẫn có khả

năng ức chế mạnh các vi sinh vật chỉ thị khác

 Chất chỉ thị: Trong môi trường tăng sinh, ngoài chất kháng sinh để chọn lọc còn có chất

chỉ thị giúp nhận biết được canh trường tăng sinh nào có khả năng dương tính, từ đó tiến hành các bước phân tích tiếptheo Tất cả các vi khuẩn Listeria spp đều có khả năng thủy

phân aesculin trong môi trường tăng sinh thành aesculetin và glucose Esculetin sẽ phản ứng với ion sắt III tạo màu từ xanh oliu đến đen, kết quả là làm chuyển màu canh trường tăng sinh theo màu tương ứng Nhờ tính chất này mà một số môi trường chọn lọc như Fraser, half Fraser, PALCAM … đều có chứa aesculin, ferric ammonium citrate, lithium clorua Trong quá trình tăng sinh (24-48 giờ), canh trường nào chuyển đen là những canh

trường có khả năng có Listeria Một ưu điểm khác trong việc bổ sung Ferric ammonium citrate là các ion sắt có tác dụng tăng cường sự phát triển của vi khuẩn L monocytogenes

Lithium clorua trong môi trường có thể ức chế sự phát triển của nhóm vi khuẩn đường ruột

(Enterococci), đây là nhóm cũng có khả năng thủy phân aesculin.

1.3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tăng sinh

Như đã nói, L monocytogenes có khả năng tồn tại trong điều kiện nhiệt độ từ - 4 tới 50 °

C, nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng là 30-37 °C Nhiệt độ càng thấp

thì vi khuẩn sinh trưởng càng chậm Chu kỳ nhân đôi của L monocytogenes ở 4 °

C là 43 giờ, ở 10 °C là 6,6 giờ và ở 37 °C là 1,1 giờ Nhiệt độ dưới 0 °C sẽ gây ức chế sự phát triển

của L monocytogenes [140] Nhiệt độ tăng sinh được khuyến cáo trong các phương pháp phát hiện L monocytogenes hiện nay thường là 30-37 oC Ở giai đoạn tiền tăng sinh, khi mẫu vừa được lấy từ điều kiện lạnh hoặc đông thường sử dụng môi trường dinh dưỡng không có kháng sinh hoặc nồng độ thâp, có bổ sung piruvate và tăng sinh ở nhiệt độ 25-30

oC Ở điều kiện này một số tế bào bị tổn thương bởi stress hoặc nhiệt độ sẽ nhanh chóng phục hồi và tiếp tục phát triển Giai đoạn tăng sinh tiếp theo, lượng kháng sinh sẽ cho đầy

đủ và nuôi ở 37 o

C, ở điều kiện này các vi sinh vật khác sẽ bị ức chế hoàn toàn hoặc một

phần, L monocytogenes chỉ bị ức chế nhẹ Ở nhiệt độ này L monocytogenes phát triển

mạnh mẽ hơn ở 30 o

C

1.3.1.3 Ảnh hưởng của mẫu thực phẩm đến quá trình tăng sinh

Các loại thực phẩm khác nhau cũng chứa các chất dinh dưỡng và các chất ức chế khác nhau đối với vi sinh vật, chính vì vậy chúng cũng ảnh hưởng rất khác nhau đến sự sinh

trưởng tạo sinh khối của L monocytogenes Các nghiên cứu về ảnh hưởng của loại thực

của L monocytogenes cao nhất trong các loại thực phẩm nghiên cứu, đạt hệ số sinh trưởng

(growth rate) là 1,148, tiếp đến là các loại hải sản đạt hệ số sinh trưởng là 1,03 Trong khi

đó trứng lại làm hệ số này giảm xuống còn 0,553 (mẫu đối chứng có hệ số sinh trưởng là

1) [13] Để tối ưu khả năng tăng sinh L monocytogenes, cần tối ưu quy trình trên các đối

tượng thực phẩm phân tích cụ thể

1.3.1.4 Ảnh hưởng của thành phần vi sinh vật đồng nhiễm trong mẫu

Thực phẩm có khả năng nhiễm L monocytogenes thường là những thực phẩm có bảo quản lạnh nên thường nhiễm các loài cùng chi Listeria khác tương đối gần gũi với L monocytogenes về mặt di truyền, nên khả năng tương tác với môi trường sống của chúng

cũng khá giống nhau, khả năng cạnh tranh nhau sẽ rất lớn Ngoài việc cạnh tranh khi tăng sinh các mẫu thực phẩm còn xảy ra hiện tượng ức chế vi khuẩn đích do cơ chế cảm ứng phân tử [162] Theo cơ chế này một vi khuẩn trong môi trường sống có thể cảm nhận được mật độ của vi khuẩn đang tồn tại trong môi trường sống thông qua các phân tử tín hiệu Cơ chế này cho phép vi khuẩn tự điều phối sự sinh trưởng của chúng Khi điều kiện môi trường thường xuyên thay đổi, vi khuẩn cần phải đáp ứng một cách nhanh chóng để tồn tại Một trong những đáp ứng này là việc chống lại các vi sinh vật khác có thể cạnh tranh về cùng nguồn dinh dưỡng như nhau Đây chính là khó khăn lớn trong việc tăng sinh chọn lọc

đặc biệt là đối với các phương pháp phát hiện L monocytogenes dựa trên nguyên tắc nuôi

cấy, điều này có thể dẫn tới kết quả âm tính giả khi mật độ ban đầu trong mẫu của các loài

Listeria khác tương đương hoặc vượt trội so với L monocytogenes [136]

Một số nghiên cứu cho thấy sự có mặt của vi khuẩn lactic ức chế sự phát triển của L monocytogenes trong môi trường tăng sinh [124]; [172]; [20] Vi khuẩn lactic làm giảm hệ

số tăng sinh từ 1 xuống còn 0,81 Trong khi đó Penicillium camemberti trong môi trường

tăng sinh có whey lại làm tăng đáng kể hệ số tăng sinh (1,74 lần) [13]

Nghiên cứu về khả năng cạnh tranh phát triển của L monocytogenes so với các loài khác trong quá trình tăng sinh cho thấy khi tăng sinh mẫu nhiễm L monocytogenes riêng lẻ thì tốc độ sinh trưởng của L monocytogenes trên môi trường Fraser và Half Fraser gần tương đương với các loài khác như L innocua, L welshimeri Tuy nhiên trong canh trường tăng sinh hỗn hợp L monocytogenes và L innocua thì tốc độ sinh trưởng tạo sinh khối tối đa của L monocytogenes trên cả hai môi trường Fraser và Half Fraser trên đều thấp hơn so với L innocua (lần lượt là 2 và 1 đơn vị log10 CFU/ml) Ngược lại với L welshimeri thì

39

khả năng sinh trưởng của L monocytogenes lại cao hơn thể hiện ở thời gian ở pha lag ngắn

hơn và mật độ vi khuẩn tối đa đạt được cao hơn [19]

Nghiên cứu của Ana Carvalheira [37] cho thấy trong khoảng 20 giờ đầu tốc độ phát triển

của L monocytogenes và L innocua là ngang nhau sau đó mật độ L monocytogenes giảm dần và giảm nhanh hơn so với L innocua (Hình 1-5)

Hình 1-5 Tốc độ sinh trưởng của chủng L monocytogenes 1340 và chủng L innocua11288 trong

canh trường hỗn hợp và canh trường riêng biệt, môi trường được sử dụng là TSBYE [37]

●-: L innocua trong canh trường hỗn hợp;

-: L innocua trong canh trường riêng biệt;

■-: L monocytogenes trong canh trường hỗn hợp;

□-:L monocytogenes trong canh trường riêng biệt

Trong môi trường không chọn lọc BHI, L innocua có tốc độ tăng trưởng nhanh hơn L monocytogenes đáng kể [59] Kết quả nghiên cứu của Petran và Swanson cũng cho thấy trên 2 môi trường chọn lọc UVM và Fraser, L innocua đạt tốc độ tăng trưởng nhanh hơn hẳn so với L monocytogenes (hơn 1 và 1,9 đơn vị log) [144] Kết quả tương tự đã được

kiểm chứng trên môi trường tăng sinh (Oxoid) với các chủng phân lập từ sữa bò [123] Các tác giả trong nghiên cứu này còn chỉ rõ sự khác biệt thời gian thế hệ giữa hai loài và phán đoán rằng kết quả này là do sự nhạy cảm khác nhau đối với các thành phần môi trường Nghiên cứu này cũng cho thấy, trong môi trường không chọn lọc TSB, thời gian thế hệ của

cả hai loài này tương đương nhau Curiale và Lewus tiến hành nhiễm chủ động cả hai loài

L monocytogenes và L innocua với tỷ lệ dao động từ 1:1 đến 1200:1 sau đó tăng sinh và phân lập trở lại L monocytogenes từ các mẫu này Kết quả khả năng phân lập được L monocytogenes đạt tỷ lệ dao động từ 0-92 % [53]

Từ các phân tích trên cho thấy nếu sử dụng các phương pháp phát hiện dựa trên nuôi cấy

và phân lập nếu tỷ lệ L innocua ban đầu vượt trội so với L monocytogenes rất dễ dẫn đến tình trạng dương tính giả do tốc độ sinh trưởng của L innocua vượt trội so với L monocytogenes Tuy nhiên khi sử dụng các phương pháp nhân gen như PCR, LAMP, hạn

chế này có thể bị loại bỏ hoàn toàn do sự bắt cặp giữa mồi và gen đích là rất đặc hiệu Khi

đó ta chỉ phải quan tâm đến lượng sinh khối L monocytogenes có đủ cho phép phân tích

40

không Trong các trường hợp mẫu có nhiều loại vi khuẩn nhiễm tạp và có mặt các loại có

khả năng ức chế L monocytogenes như L innocua, vi khuẩn lactic cần kéo dài thời gian

tăng sinh để lượng sinh khối vi khuẩn đích đạt ngưỡng phân tích

LZF7 (ABcam) được gắn ở vị trí vạch thí nghiệm (test line), kháng thể này phản ứng đặc

hiệu với protein màng tế bào L monocytogenes Một kháng kháng thể IgG chuột từ dê

được gắn trên vạch kiểm chứng (control line) Khi nhúng bản (que) sắc ký vào mẫu dương tính, kháng nguyên sẽ di chuyển theo lực mao dẫn và kết hợp với kháng thể trên vạch thí nghiệm Đồng thời kháng thể có gắn chất màu cũng được kết hợp với kháng nguyên đã gắn trên vạch thí nghiệm và kết hợp với kháng thể trên vạch kiểm chứng tạo thành hai vạch trên bản sắc ký Ngược lại với mẫu âm tính, sẽ không có hiện tượng gắn kháng nguyên trên vạch thí nghiệm nên cũng không có kháng thể gắn chất màu được lưu giữ ở vạch thí nghiệm, tuy nhiên kháng thể có gắn chất màu vẫn được kết hợp với kháng kháng thể trên vạch kiểm chứng Trường hợp này sẽ cho một vạch màu trên vạch kiểm chứng (Hình 1-6) Trong nghiên cứu này giới hạn phát hiện của phương pháp đạt 104 CFU/ml Phương pháp này có ưu điểm là nhanh, thao tác đơn giản, độ đặc hiệu cao, có thể thực hiện được ở hiện trường Nhược điểm của phương pháp này là giá thành phép phân tích cao do giá thành kháng thể đơn dòng cao, độ nhạy kém (khoảng 104

đến 106 CFU/ml) [105]; [8]

Hình 1-6 Mô hình phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh L monocytogenes [105]

Trong đó:

: C u trúc que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi;

b: Mô hình que thử đối với mẫu âm tính (không có L monocytogenes trong mẫu)

c: Mô hình que thử đối với mẫu dương tính (có L monocytogenes trong mẫu)

Trong kỹ thuật ELISA, kháng thể hoặc kháng nguyên được cố định trên giếng Sau đó cho kháng nguyên cần xác định hoặc kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần phân tích vào phản ứng Phức hợp kháng nguyên kháng thể đó được phát hiện bằng một enzyme (thường

là phosphatase kiềm hoặc peroxidase) được gắn với bản thân kháng thể trên hoặc một

41

kháng kháng thể trên Khi cho cơ chất đặc hiệu vào các giếng ELISA, enzyme sẽ thủy phân

cơ chất tạo chất màu Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với số lượng kháng nguyên cần phân tích trong mẫu Đa số các công bố về việc sử dụng kỹ thuật ELISA cho phát hiện

L monocytogenes là dựa trên các kháng thể có thể nhận biết toàn bộ tế bào vi khuẩn

Thông thường cần có bước tăng sinh mẫu thực phẩm số lượng tế bào vượt ngưỡng phát

hiện Tuy nhiên vì kháng thể nhận biết toàn bộ tế bào nên tính đặc hiệu loài đối với L monocytogenes không cao, dễ bị dương tính giả, theo tác giả, hầu hết các kháng thể sử

dụng cho ELISA trực tiếp chỉ đặc hiệu đến chi [49] Để tăng độ đặc hiệu của phương pháp ELISA, một số tác giả đã sử dụng kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên tiên mao [137], [97], tuy nhiên độ đặc hiệu cũng chỉ đặc hiệu đến chi và giới hạn phát hiện vẫn ở mức cao 105

CFU/ml Nghiên cứu của Marie-Laure và cộng sự cho thấy sử dụng phương pháp ELISA với protein đích là P60, cần tăng sinh hai giai đoạn với tổng thời gian tăng sinh là 43 giờ, giới hạn phát hiện đạt được là 1-9 CFU/25 g sản phẩm thực phẩm, phương pháp cho độ đặc hiệu đạt 100% trên số mẫu nghiên cứu, tuy nhiên trong nghiên cứu này, vẫn có 4 mẫu dương tính giả so với phương pháp ISO 11290-1 trong tổng số 329 mẫu phân tích [119]

Phương pháp miễn dịch phát hiện L monocytogenes trong môi trường tăng sinh thường

không được áp dụng phổ biến còn có một lý do, đó là sự biểu hiện các gen gây độc phụ

thuộc vào gen điều hòa prfA thường đạt hiệu suất thấp trong môi trường nuôi cấy Hơn nữa

phản ứng kháng nguyên kháng thể thường giảm đáng kể khi gặp điều kiện stress của môi

trường Đây là lý do tại sao phương pháp phát hiện L monocytogenes bằng các kháng thể

đặc hiệu với các yếu tố gây độc còn nhiều hạn chế [90]

1.3.3 Phương pháp khuếch đại DNA (PCR, real-time PCR)

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) hiện nay được sử dụng rộng rãi trong phân tích phát hiện nhiều tác nhân vi sinh vật trong mẫu bệnh phẩm, thực phẩm, cây trồng và môi trường Kỹ thuật này cho phép từ một trình tự DNA ban đầu nhân lên thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase chịu nhiệt, mồi và các nucleotid Sau phản ứng PCR, sản phẩm của của phản ứng PCR được phân tách bằng phương pháp điện

di trên gel agarose Đây là một phương pháp tương đối đặc hiệu, kết quả nhanh chóng có

thể phát hiện L monocytogenes trong phòng thí nghiệm với các loại mẫu khác nhau Độ

nhạy của phương pháp này cao hơn các phương pháp miễn dịch Độ nhạy của một quy trình phân tích phụ thuộc nhiều yếu tố trong đó có một số yếu tố chính như bản thân bộ mồi, thời gian tăng sinh, phương pháp tách chiết DNA và bản chất loại thực phẩm cần

phân tích Với mẫu không tăng sinh, phương pháp PCR khi sử dụng bộ mồi hlyA cho độ

nhạy khoảng 103

CFU/ml [48], mồi inlAB cho độ nhạy 105 CFU/ml [109] Nếu tăng sinh

24 giờ thì bộ mồi LMA/LMB hoặc LM1/LM2 (gen hlyA) có thể phát hiện được ở ngưỡng

10 CFU/ml, trong khi đó bộ mồi IAP1/IAP2 (gen iap) cho giới hạn phát hiện là 102 CFU/ml [15] Rip và cộng sự sử dụng gen hly phân tích mẫu sữa và mẫu thịt cho độ nhạy

42

đạt 8 CFU/ml với thời gian tăng sinh là 22 giờ [155] Rattanachaikunsopon phát triển kỹ

thuật Multiplex PCR để với một phản ứng phát hiện một số vi sinh vật đích khác nhau (L monocytogenes, L innocua, và L grayi) với gen đích là iap, giới hạn phát hiện đạt được là

50 CFU/ml [152]

Phương pháp real-time PCR dựa trên nguyên tắc nhân gen tương tự như PCR, tuy nhiên sản phẩm khuyếch đại có thể được đánh giá ngay trong quá trình nhân gen mà không cần thực hiện thêm các bước điện di sau PCR Ở giai đoạn đầu, khi số lượng bản sao gen đích còn thấp, cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng chưa đủ để máy ghi nhận được Đến một chu kỳ nhất định, số lượng bản sao đủ lớn để các chất huỳnh quang cho tín hiệu máy bắt đầu ghi nhận được, thời điểm đó có số chu kỳ gọi là chu kỳ ngưỡng (Ct) Chu kỳ ngưỡng (Ct) tỷ lệ thuận với số lượng bản sao ban đầu Nhờ đặc điểm này mà phương pháp real-time PCR được sử dụng trong phân tích định lượng gen đích Cho đến hiện nay, một

loạt các kít phát hiện L monocytogenes dựa trên kỹ thuật real-time PCR đã được tiêu

chuẩn hóa (chứng nhận bởi AOAC) như bộ kít LightCycler® Listeria monocytogenes có độ

nhạy 102 đến 103

CFU/ml, Veriflow® Listeria monocytogenes có độ nhạy 10.000 CFU/ml

Rất nhiều các nghiên cứu sử dụng phương pháp real-time PCR cho phân tích phát hiện và

định lượng L monocytogenes với nhiều gen đích khác nhau Ruiz- Rueda và cộng sự sử dụng bộ mồi từ gen hly cho phản ứng real-time PCR đạt độ nhạy 5 CFU/25 g thực phẩm với thời gian tăng sinh 24 giờ [161] Rossmanith sử dụng gen prfA làm gen đích cho phản

ứng real-time PCR, độ nhạy đạt được là 7.5 CFU/25 ml, g (với mẫu sữa tươi và pa tê) và 1–9 CFU/g (với cá hồi và phomat), độ chính xác 96%, độ đặc hiệu 100% và độ nhạy 76,9

% (khi so sánh với tiêu chuẩn ISO) [159] Gen actA đã được Oravcova và cộng sự sử dụng

làm gen đích cho phản ứng real-time PCR để phân tích 144 mẫu thịt, cá, sữa và rau tự nhiên và 61 mẫu cùng loại nhiễm chủ động với mật độ 1 CFU/25 g [135] Sau thời gian tăng sinh 24+6 giờ, các mẫu nhiễm chủ động đều được phát hiện, trong đó có 3 mẫu nhiễm chủ động phương pháp ISO không phát hiện được, tuy nhiên real-time PCR vẫn cho kết

quả dương tính O’Grady lại sử dụng gen ssrA làm gen đích cho phản ứng real-time PCR

để phát hiện 175 mẫu thực phẩm lấy từ nhà máy và kho trữ hàng với thời gian tăng sinh 24+8 giờ cho kết quả độ đặc hiệu đạt 99.44% độ nhạy đạt 96.15% và độ chính xác đạt 99.03% khi so sánh với phương pháp tiêu chuẩn ISO và giới hạn phát hiện là 1–5 CFU/25

g [132]

Từ những nghiên cứu trên cho thấy real-time PCR cho độ nhạy cao hơn PCR, tuy nhiên phép phân tích này cũng yêu cầu đầu tư về trang thiết bị và vật tư tiêu hao cao hơn so với PCR thường Phương pháp PCR yêu cầu thời gian tăng sinh khá dài (khoảng 24 giờ) Nhược điểm chung lớn nhất của kỹ thuật PCR là nó yêu cầu phải có thiết bị chu trình nhiệt

và quá trình điện di, soi gel (với PCR thường) nên không dễ dàng thực hiện bên ngoài các phòng thí nghiệm hiện đại Hơn nữa, phản ứng PCR chịu ảnh hưởng của nhiều các chất ức chế trong mẫu (bệnh phẩm, thực phẩm, môi trường) [91]; [67]; [133] Để loại bỏ các chất