Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường việt nam

(Thông tin đưa lên trang Web) Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 Nghiên cứu sinh: Phùng Thị Thủy Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Lê Quang Hòa 2. PGS.TS. Tô Kim Anh Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa +à Nội 7Ï07²7.Â78°10Þ,ê8°1È1 1. Đã phân lập được 59 chủng L. monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ nhiễm chung là 10,87 %. Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất là xúc xich và thịt hun khói cắt lát. 2. Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được cho thấy: 48 chủng L. monocytogenes phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và lineage II có 8 chủng. Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn lineage II. Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV và 1 chủng thuộc ECI có nguy cơ gây bùng phát dịch bệnh cao. 48 chủng có tất cả 16 ST trong đó có ST1 đặc biệt nguy hiểm vì ST1 đã từng gây ra nhiều vụ bùng phát dịch lớn trên thế giới. 3. Đã thiết kế được phản ứng LAMP cho phát hiện nhanh L. monocytogenes, bao gồm: thiết kế bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ, điều kiện tối ưu cho phản ứng LAMP là nhiệt độ 65oC, thời gian 4060 phút, nồng độ betain 0,9 M. 4. Đã tối ưu được quy trình phân tích trực tiếp L. monocytogenes từ thực phẩm dựa trên phản ứng LAMP, bao gồm: tăng sinh mẫu trong môi trường BLEB ở 37oC, tốc độ lắc 150 vòngphút trong thời gian 10 giờ cho sản phẩm thịt và 12 giờ cho sản phẩm sữa và mayonair; cải tiến phương pháp tách chiết nhanh thu DNA từ canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm. Quy trình phân tích đạt độ nhạy 1 CFU25 g với tổng thời gian phân tích 1214 giờ. 5. Đã thiết kế và chế tạo thành công bộ sinh phẩm LAMPL’MONO phát hiện nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm. Bộ sinh phẩm được kiểm định cho kết quả có độ tương đồng cao với các phương pháp truyền thống theo ISO 112901: 1996 và TCVN 77001:2007. Hà Nội, ngày 28 tháng 3 năm 2016 T± p thÇ Km ß ng d¯ n 1JKLrQFíXVLQK TS. Lê Quang Hòa PGS.TS. Tô Kim Anh Phùng ThÏ Thë yINFORMATION ON NEW CONCLUTION OF DOCTORAL THESIS (Information will be posted on the Website) Name of thesis: Study on rapid method for direct detection and molecular epidemiology of Listeria monocytogenes isolated from Vietnam foods Specialization: Biotechnology Code No.: 62420201 Name of PhD. student: Phung Thi Thuy Advisor: 1. Dr. Le Quang Hoa 2. Assoc. Prof. Dr. To Kim Anh Training Institution: Hanoi University of Science and Technology Summary of the new contributions of the Thesis 1. Fifty nine strains of L. monocytogenes were isolated from 543 Vietnam food samples. The average infection rate of L. monocytogenes in foods was 10.87% with the highest found in sausage and slide meat products. 2. Forty eight strains out of 59 isolated of L. monocytogenes were divided into two lineages, of which 40 isolates belonging to lineage I and 8 isolates belonging to lineage II. The lineage I strains was considered high risky than those of the lineage II. On the other hand, the isolates could be divided into 9 clonal clusters, among them 19 ECIV strains and one ECI strain were seen as outbreak causing strains. The 48 isolates also can be divided into 16 ST, of which ST1 strains were highly dangerous, causing many sever outbreaks worldwide. 3. A molecular method for rapid detection of L. monocytogenes based on LAMP reaction was established: a set of LAMP primers was designed to amplify inlJ gene, optimal condition for the reaction was 65 °C for 4060 min. with betaine concentration of 0.9 M. 4. The direct detection procedure of L. monocytogenes based on the LAM reaction was optimized, including enrichment for the bacteria in BLEB media at 37 °C, 150 rpm for 10 and 12 hours respectively for meat and dairy products; modified method for rapid DNA extraction. The sensitivity of detection procedure attained 1 CFU L. monocytogenes 25 g food with total analysis time of 1214 hours. 7. A LAMPLMONO kit for L. monocytogenes rapid detection based on LAMP technique was designed and validated and found to be conformed with ISO 112901: 1996 and TCVN 7700 1: 2007 methods. Hanoi, 28th, March, 2016 Advisor: PhD. Student Le Quang Hoa To Kim Anh Phung Thi ThuyTRÍCH YẾU LUẬN ÁN TIẾN SĨ 1. Tên tác giả: Phùng Thị Thủy Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam 2. Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 3. Tên cơ sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 4. Mục đích và đối tượng nghiên cứu của luận án  Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes phân lập được từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam. Thiết kế, chế tạo thử nghiệm và kiểm định bộ sinh phẩm LAMP phát hiện nhanh L. monocytogenes trong các loại thực phẩm ăn liền.  Đối tượng nghiên cứu: Mẫu thực phẩm: Tổng số 543 được lấy tại các siêu thị trên địa bàn Hà Nội Chủng vi khuẩn phân lập: Tổng số 48 chủng L. monocytogenes được phân lập từ thực phẩm đang lưu hành tại Việt Nam, Chủng vi khuẩn chuẩn: 17 chủng vi sinh vật khác ngoài L. monocytogenes 5. Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng  Phân lập L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm  Điện di DNA trên gel agarose  Phản ứng PCR khẳng định L. monocytogenes và khuếch đại các housekeeping gen cho giải trình tự  Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh sạch GeneJETTM PCR Purification (Fermentase)  Phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại dưới loài MLST và cơ sở dữ liệu của viện Pasteur Pháp  Giải trình tự gen: Tiến hành tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Mỗi trình tự gen được giải trình tự 2 chiều.  Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4  Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy của phản ứng LAMP  Phản ứng Realtime PCR  Các phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn  Kiểm định bộ sinh phẩm Phương pháp phát hiện L. monocytogenes theo TCVN 77001: 2007 và ISO 11290 1:1996  Xây dựng cây phân loại bằng phần mềm ClustalW 6. Các kết quả chính và kết luận  Các kết quả chính đã đạt được trong đề tài nghiên cứu: Đã phân lập được 59 chủng L. monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ nhiễm chung là 10,87 %. Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất (lần lượt là 30,34 % và 14,48 %). Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được cho thấy: 48 chủng L. monocytogeneses phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và lineage II có 8 chủng. Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn lineage II. Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV và 1 chủng thuộc ECI có nguy cơ gây bùng phát dịch bệnh cao. 48 chủng có tất cả 16 ST trong đó có ST1 đặc biệt nguy hiểm vì ST1 đã từng gây ra nhiều vụ bùng phát dịch lớn trên thế giới. Đã Thiết kế được bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ với độ nhậy trên mẫu vi khuẩn thuần là 16 CFU phản ứng, trên canh trường tăng mẫu xúc xích là 336 CFUml. Bộ mồi cho độ đặc hiệu, độ bao trùm cao (100 % số chủng nghiên cứu) Đã tối ưu được điều kiện cho phản ứng LAMP đó là thực hiện phản ứng tại nhiệt độ 65oC, thời gian 4060 phút, nồng độ betain là 0,9 M. Đã tối ưu được điều kiện tăng sinh cho phát hiện L. monocytogenes là: sử dụng môi trường BLEB (17 gl casein enzymeic hydrolysate; 3 gl papaic digest of soyabean meal; 5 gl NaCl; 2,5 gl K2HPO4, 2,5 gl dextrose; 6 gl cao nấm men;1,35 gl KH2PO4; 9,6 gl Na2HPO4; pyruvate 1,2 gl, nalidixic và acriflavin đều là 5 mgl), tăng sinh ở 37oC tốc độ lắc 150 vòng phút, thời gian 10 giờ (với sản phẩm thịt); 12 giờ (với sản phẩm sữa và mayonair). Đã tìm được điều kiện tách chiết nhanh thu DNA cho phản ứng LAMP từ canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm đó là sử dụng đệm glycine –tris 100 mM pH 8,3, gia nhiệt 5 phút tại 95oC, siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g trong 3 phút thu dịch DNA cho phản ứng LAMP. Đã xây dựng được quy trình phân tích nhanh L. monocytogenes monocytogenes trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP với độ nhạy đạt 1 cfu25 g với tổng thời gian phân tích khoảng 1214 giờ. Đã thiết kế và chế tạo thành công bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP mang tên LAMPL’MONO. Đã kiểm định và ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMPL’MONO cho kết quả có độ tương đồng cao với các phương pháp truyền thống theo ISO 112901: 1996 (sửa đổi lần 1: 2004) và TCVN 77001:2007. Độ đặc hiệu đạt 100 % (phòng thí nghiệm, trên mẫu thực và kiểm định). Độ chính xác (ổn định) đạt 100 % (phòng thí nghiệm, mẫu thực) và đạt 96 % (kiểm định), tỷ lệ dương tính giả 0% (phòng thí nghiệm và mẫu thực).  Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cho thấy thực tế tỷ lệ nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes trên thực phẩm khá cao, có những dòng phân lập được có khả năng gây dịch bệnh lớn. Tuy rằngcho đến hiện nay mới chỉ có công bố về một vài trường hợp bệnh nhên bị listeriosis, nhưng nếu không kiểm soát tốt vi khuẩn này trong chuỗi cung cấp thực phẩm thì đây có thể sẽ là nguy cơ lớn về dịch bệnh cho người tiêu dùng. Kết quả đề tài này cũng đã chế tạo thành công bộ kít phân tích phát hiện nhanh L. monocytogenes. Bộ kít này cho kết quả phân tích tương đồng với các phương pháp tiêu chuẩn như TCVN và ISO. Thêm nữa bộ kít còn có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp hiện nay đang sử dụng về giá thành, thời gian phân tích cũng như độ nhạy, độ đặc hiệu. Những ưu điểm này sẽ góp phần tích cực vào việc giảm thiểu sự tạp nhiễm loài vi khuẩn nguy hiểm này trong thực phẩm nhằm giảm tổn thất cho nhà sản xuất cũng như người tiêu dùng. Tập thể hướng dẫn Nghiên cứu sinh TS. Lê Quang Hòa PGS.TS. Tô Kim Anh Phùng Thị Thủy1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt với tỷ lệ tử vong lên đến 30%. Bệnh do L. monocytogenes gây ra được gọi chung là listeriosis. Đối tượng có nguy cơ bị nhiễm bệnh này thường là những người có hệ thống miễn dịch bị suy yếu như trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người lớn tuổi. Nếu không được điều trị kịp thời bằng kháng sinh, bệnh nhân có thể bị nhiễm trùng máu, viêm màng não, sẩy thai và tử vong. Vi khuẩn L. monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh. Chúng được tìm thấy ở nhiều nơi như đất, nước, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân người hoặc phân động vật. Chúng có thể sống và tăng trưởng chậm ở các điều kiện kh c nghiệt về nhiệt độ, hàm lượng khí oxy, pH và hoạt độ nước. Đặc biệt loài vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ lạnh (010oC). Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L. monocytogenes trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm được bảo quản lạnh trong thời gian dài. Nhiều loại thực phẩm được bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn. Thêm nữa càng ngày người ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản hoặc không bị gia nhiệt để giữ được nguyên vẹn hương vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu. Những sản phẩm như vậy thường được bảo quản lạnh trước khi sử dụng. Vì vậy, các sản phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cao. Rất nhiều các vụ ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L. monocytogenes trên kh p thế giới đã được thông báo. Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được từ các vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L. monocytogenes có khả năng gây bệnh và gây bùng phát dịch rất lớn, bên cạnh đó cũng có những kiểu huyết thanh hầu như không có khả năng gây bệnh và gây dịch. Cho đến thời điểm này chưa có công bố nào về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm tại Việt Nam. Khả năng gây bệnh và gây dịch của L. monocytogenes nhiễm trong các thực phẩm tại Việt Nam vẫn là một ẩn số. Phương pháp ISO 112901:1996 phát hiện L. monocytogenes là phương pháp nuôi cấy. Một số các phương pháp sinh học phân tử như PCR, realtime PCR hoặc các phương pháp miễn dịch (ELISA) cũng đã được tiêu chuẩn hóa. Mấy năm trở lại đây, cùng với sự ra đời của một số k thuật khuếch đại đ ng nhiệt axit nucleic, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh đã được đơn giản hóa thêm một bước. LAMP là k thuật khuếch đại đ ng nhiệt được sử dụng phổ biến hơn cả. Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trội của phương pháp này, giúp đơn giản hóa và rút ng n thời gian phân tích. K thuật này đã nhanh chóng được ứng dụng để phát hiện L. monocytogenes trong thực phẩm ở nhiều nghiên cứu trên thế giới. Ở Việt Nam, phương pháp tiêu chuẩn TCVN: 77001:2007 phát hiện Listeria monocytogenes là phương pháp nuôi cấy, sau đó khuẩn lạc đặc trưng được kh ng định bằng các phản ứng sinh hóa. Đã có một số nghiên cứu về phương pháp PCR và que thử s c2 ký miễn dịch nhằm phát hiện vi khuẩn này, tuy nhiên thời gian phân tích còn dài hoặc yêu cầu cao về trang thiết bị hóa chất nên chưa đáp ứng được nhu cầu phân tích phát hiện trong thực tế sản xuất. Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi nghiên cứu đề tài có tên là “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam”. 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của luận án  Phân tích được đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes phân lập được từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam.  Xây dựng được một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L. monocytogenes trong các loại thực phẩm ăn liền dựa trên k thuật LAMP. 3. Những đóng góp mới của luận án  Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam  Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển k thuật LAMP cho phát hiện L. monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân tích 4. Bố cục của luận án Luận án bao gồm 123 trang trong đó có 2 trang mở đầu, 38 trang tổng quan, 9 trang vật liệu và phương pháp nghiên cứu, 56 trang kết quả. NỘI DUNG CHÍNH Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về L. monocytogenes. Luận án đề cập đến các vấn đề liên quan đến đặc điểm sinh lý, sinh hóa của loài L. monocytogenes, từ đó cho thấy đây là một loài có khả năng phân bố rộng trong thực phẩm môi trường. Các thống kê cũng cho thấy có rất nhiều các công bố về các vụ gây dịch bệnh listeriosis do L. monocytogenes gây lên có liên quan đến các loại thực phẩm khác nhau trong đó chủ yếu là các loại thực phẩm có bảo quản lạnh trong thời gian dài. Chính vì vậy trong luận án này phần phân lập cũng được tiến hành chủ yếu trên các mẫu thực phẩm có quá trình bảo quản lạnh trước khi sử dụng. 1.2 Tổng quan về các phƣơng pháp phân loại dƣới loài L. monocytogenes Các phương pháp phân loại dưới loài dựa theo kiểu hình như enzyme hoặc kháng thể thường cho độ phân loại không cao, nên không phù hợp trong các nghiên cứu dịch tễ học các chủng L. monocytogenes gây dịch bệnh. Các phương pháp phân loại dưới loài dựa trên kiểu gen hiện nay khá phổ biến. Tuy nhiên kết quả phân loại phụ thuộc rất lớn vào cơ sở dữ liệu liên quan cho phân tích so sánh. MLST là một phương pháp phân loại dưới loài đơn giản và được sử dụng khá phổ biến. Cơ sở dữ liệu cho phương pháp MLST khá phong phú. Chính vì vậy luận án này sử dụng phương pháp MLST và sơ sở dữ liệu của viện3 Pasteur Pháp làm công cụ phân tích dịch tễ học các loài L. monocytogenes phân lập được. Từ đó đánh giá nguy cơ gây dịch bệnh của loài vi khuân này trên thực phẩm Việt Nam. 1.3 Tổng quan về các phƣơng pháp phát hiện L. monocytogenes Hiện nay có khá nhiều các phương pháp được sử dụng trong phân tích phát hiện L. monocytogenes. Ngoài các phương pháp tiêu chuẩn như phương pháp nuôi cấy theo ISO hoặc TCVN còn có các phương pháp nhân gen như realtime PCR hoặc các phương pháp sử dụng kít miễn dịch được tiêu chuẩn hóa. Tuy nhiên các phương pháp hiện nay có thời gian phân tích khá dài hoặc yêu cầu sử dụng các trang thiết bị, hóa chất đ t tiền, nên chưa đáp ứng được yêu cầu của việc kiểm soát loài vi khuẩn nguy hiểm này trong thực tế sản xuất. Chính vì vậy Luận án này đặt mục tiêu phát triển phương pháp phân tích nhanh, đơn giản và đạt độ nhạy, độ đặc hiệu cao. Chƣơng II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu  Mẫu thực phẩm Mẫu được lấy tại các siêu thị trên địa bàn Hà Nội Chủng vi sinh vật Một số chủng vi khuẩn được lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Hóa chất Hóa chất cho phản ứng PCR, LAMP, Real time PCR, điện di DNA, tách chiết DNA, nuôi cấy vi khuẩn Môi trường: Môi trường cơ bản cho tăng sinh; môi trường phân lập L. monocytogenes Các cặp mồi cho PCR, real time PCR, LAMP 2.2. Các thiết bị sử dụng chủ yếu Một số thiết bị sử dụng cho PCR, realtime PCR, điện di, siêu âm, ly tâm, bảo quản lạnh và lạnh đông, nuôi cấy vi sinh vật 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu  Phân lập L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm  Phản ứng PCR khẳng định L. monocytogenes và khuếch đại các gen giữ nhà cho giải trình tự  Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh sạch GeneJETTM PCR Purification (Fermentase) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.  Các phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại dưới loài MLST và cơ sở dữ liệu của viện Pasteur Pháp ( www.pasteur.frmlst)  Giải trình tự gen: Tiến hành tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Mỗi trình tự gen được giải trình tự 2 chiều.  Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4  Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy của phản ứng LAMP  Phản ứng Realtime PCR  Các phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn  Kiểm định bộ sinh phẩm  Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm  Phương pháp phát hiện L. monocytogenes theo TCVN 77001: 2007 và ISO 11290 1:19964 1 2 A B Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập từ một số thực phẩm Việt Nam 3.1.1. Phân lập L. monocytogenes từ các mẫu thực phẩm Trong nghiên cứu này, các mẫu thực phẩm được tăng sinh trên môi trường Half Fraser, những mẫu cho chuyển màu canh trường sang màu đen (bình 1 Hình 31 A) được cấy trải trên môi trường RAPID’L.mono (Biorad). Các mẫu thực phẩm dương tính với L. monocytogenes là những mẫu cho khuẩn lạc có hình thái đặc trưng (Hình 31 B) và có ít nhất một khuẩn lạc nghi ngờ được kh ng định dương tính bằng k thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu LM1LM2 khuếch đại đoạn gen hlyA có kích thước 702 bp. (Hình 32). Hình 31 Kết quả phân lập L. monocytogenes sử dụng môi trường RAPID’L.mono. A: T ng sinh trong môi trường l ng Half Fraser : mẫu dương t nh giả định môi trường chuyển sang màu đen : mẫu âm t nh môi trường không m t màu . : Hình thái khuẩn lạc L. monocytogenes tr n môi trường RAPID’L.mono các khuẩn lạc màu anh đen không c halo màu vàng tương ứng v i các khuẩn lạc nghi ngờ là L. monocytogenes. Hình 32 Kết quả khẳng định bằng PCR các khuẩn lạc L. monocytogenes giả định phân lập được tr n môi trường RAPID’L.mono : Mẫu dương t nh , , : a khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu cá hồi , ,7: a khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu c ch v i khuẩn lạc giếng 7 được khẳng định là L. monocytogenes , , 0, : n khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu sushi : mẫu âm t nh : thang chuẩn 00 bp O’GeneRulerTMcủa Fermentas 702 bp5 Tổng hợp các kết quả phân tích phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm đã phân tích từ năm 2011 đến 2015 được trình bày trong Bảng 31 sau. Bảng 31 Tổng hợp kết quả phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Việt Nam trong khoảng thời gian từ 0 đến 0 Loại thực phẩm Số lƣợng mẫu thực phẩm Số lƣợng chủng phân lập đƣợc Tỷ lệ nhiễm (%) Xúc xích 145 21 14,48 Các loại thịt hun khói 112 34 30,36 Thịt sống 43 1 2,33 Cá, tôm, cua, ốc 49 1 2,04 Bơ, sữa thanh trùng 45 1 2,22 Rau ăn sống 37 0 0 Sushi 52 1 1,92 Bánh mỳ kẹp thịt, hoa quả dầm 29 0 0 Nem chua 31 0 0 Tổng cộng 543 59 10,87 Có tổng số 59 543 mẫu được phát hiện là nhiễm L. monocytogenes. Trong đó các mẫu thịt hun khói và xúc xích có tỷ lệ nhiễm cao nhất. 3.1.2. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ thực phẩm Việt Nam Kết quả phân lập được 59 chủng L. monocytogenes, tuy nhiên trong quá trình giữ giống, một số chủng phân lập được đã bị chết, những chủng còn lại được tăng sinh, tách chiết DNA và tiến hành phản ứng PCR với các bộ mồi nhân 7 đoạn gen giữ nhà (housekeeping gene). Tinh sạch sản phẩm PCR, giải trình tự gen tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Dựa vào trình tự thu được, tra cứu các kiểu trình tự tương ứng với các đoạn gen. Tổ hợp các kiểu trình tự của 7 đoạn gen tra cứu được kiểu trình tự (ST), các dòng phức hợp (clone complex CC) và các dòng giống (ligneage) tương ứng của chủng phân lập. Tra cứu kiểu trình tự từng đoạn gen giữ nhà của 48 chủng L. monocytogenes phân lập được trên ngân hàng dữ liệu được các kiểu trình tự tương ứng của từng gen. Tổ hợp kiểu trình tự 7 đoạn gen của từng chủng phân lập là một kiểu trình tự (ST), một dòng phức hợp (CC) và thuộc một dòng giống. Từ các kiểu ST này phân loại 48 chủng phân lập được thành 16 nhóm có kiểu ST khác nhau. Nối 7 đoạn gen giữ nhà của mỗi nhóm với nhau, so sánh trình tự 7 đoạn gen của 16 nhóm này với 25 trình tự 7 đoạn gen tương ứng của các chủng đã từng gây dịch bệnh listeriosis trên thế giới. Sử dụng phần mềm clustal W thông qua mô6 hình NJ (Neighber joining) với độ lặp lại (bootstrap) 1000. Xây dựng được cây phân loại như Hình 33. Hình 33 Cây phân loại các nh m chủng L. monocytogenes đã phân lập được từ thực phẩm Chữ đ : T n các nh m và ký hiệu các chủng, dự đoán kiểu serotype của các chủng L. monocytogenes phân lập được từ thực phẩm Việt Nam Chữ đen: Các chủng L. monocytogenes đã từng gây ra các vụ bùng phát dịch bệnh tr n thế gi i đã công b trình tự 7 đoạn gen giữ nhà tr n ngân hàng dữ liệu MLST Kết quả cho thấy, đã xuất hiện dòng L. monocytogenes (chủng ký hiệu M49 phân lập từ thịt ba rọi xông khói) có trình tự các gen cấu trúc giống hệt các chủng có tần suất cao gây các vụ dịch lớn trên thế giới. Nhóm 1 chiếm 17 48 chủng có trình tự 7 đoạn gen giống hệt với trình tự các đoạn gen tương ứng của một số chủng gây ra vụ thai lưu năm 2005 tại Nga, vụ dịch tại Italia năm 1997. Và gần giống trình tự các đoạn gen tương ứng từ chủng phân lập từ vụ dịch tại Pháp năm 1993. Đa số các chủng còn lại, trình tự gen giống các chủng phân lập từ thực phẩm và gần giống các trình tự phân lập từ người hoặc gây ra các vụ dịch nhỏ trên thế giới. 3.2. Xây dựng quy trình phân tích nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP 3.2.1. Xây dựng phản ứng LAMP 3.2.1.1. Thiết kế mồi LAMP khuếch đại gen inlJ7 Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng trình tự gen inlJ của chủng chuẩn L. monocytogenes EGDe có số hiệu emb|AL591984.1 cho thiết kế mồi LAMP. Kiểm tra độ tương đồng của trình tự gen inlJ đưa vào thiết kế mồi so với các trình tự gen trên ngân hàng gen bằng phần mềm BlastN, cho thấy trình tự gen inlJ sử dụng cho thiết kế mồi LAMP của chủng này có độ tương đồng khá cao với trình tự gen inlJ với các chủng L. monocytogenes đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI. Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4 để thiết kế mồi. Lựa chọn các bộ mồi theo một số tiêu chí chính đã được khuyến cáo trong hướng dẫn sử dụng phần mềm https:primerexplorer.jpev4_manualpdfPrimerExplorerV4_Manual_1.pdf. Đã lựa chọn được 8 bộ mồi như bảng 32. Bảng 3 2. Trình tự các bộ mồi LAMP được thiết kế để khuếch đại gen inlJ Tên mồi Trình tự (5’3’) 1F3 CATGGTTTCAAACCCGCT 1B3 AATGCTGCTGCTACCTCT 1FIP GTTGGTTGAGTTGAGCTTGTTTCTTTTTAACATTCGCAGCAACG 1BIP ACACACTCAAAGCCGGTCAATTTTAGCAAAATTGTCATCAGGAA 2F3 ACAAGCTCAACTCAACCAA 2B3 GTTATGGATGAATTATGGCAATC 2FIP TGTCATCAGGAAACCAGTCGTTATTTTCTATAAAAAACACACTCAAAGCC 2BIP GCTTCAGAGGTAGCAGCAGCTTTTCTTGTTAGAGTAGCTAGTTGTTCT 3F3 GTTTCCTGATGACAATTTTGC 3B3 TTTGGCTAAGATCAAGGGT 3FIP AGTAGCTAGTTGTTCTTCGCTGATTTTTAGAGGTAGCAGCAGCATT 3BIP TCATCCATAACCGATATGACTGGTTTTTGGTAATGTTGTTACTTGTGCA 4F3 TGCAAGCAACTGACACTA 4B3 GGGTTACGTCAAGGTTTGT 4FIP TACCAGTCATATCGGTTATGGATGATTTTTCAGCGAAGAACAACTAGC 4BIP TTGCACAAGTAACAACATTACCACCTTTTTATTTGAATCACATGCCAGAT 5F3 GCGACACGAACAAACTCA 5B3 CAGTCTAAGGTTGTTAATTGAGT 5FIP ATTTCGGTTAAGGTGTTGCGCTTTTATGTAAGTCAAAATCCACTGTT 5BIP ATGTCAGCCACAATACACAATTAACTTTTGGTGTCACATCTAATTTGGTG 6F3 CCGCTTACAAAATTAACCTACT 6B3 AAGCTACAGTCTAAGGTTGT 6FIP TTGCGCGCGCAGTTTAAATAAGTTTTCGACACGAACAAACTCAC 6BIP CCGAAATAGATGTCAGCCACAATACTTTTGGTGTCACATCTAATTTGGTG 7F3 GCACAGACAATCCAGCCGTA 7B3 GTTGCGTTATCTGGAGTAGTCG 7FIP GTCTTCTCCTTTGATGGGTTGAGG ACGGAGCTATAGTAGGAACCGTA 7BIP TGGCGGATGATGAAGTTCTAAGC CGCTAGAAGTATAAGGATCGTCCA 8F3 CATTACCACCCTTGATCTTAGC 8B3 AGGTTGTTAATTGAGTTTGTGG 8FIP TGTGAGTTTGTTCGTGTCG – CAAACCTTGACGTAACCCCGC 8BIP GCGCAACACCTTAACCGAAA – TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG 3.2.1.2. Lựa ch n bộ mồi LAMP cho độ nhạy khuếch đại cao nh t Thực hiện các phản ứng LAMP với từng bộ mồi và sử dụng DNA khuôn là DNA tổng số tinh khiết của L. monocytogenes EGDe với lượng là 20, 2, 0,2 và 0 pg phản ứng. Sau đó, điện di 10 l sản phẩm trên gel agarose. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 34.8 Hình 34. Kết quả sàng l c các bộ mồi LAMP dựa tr n khả n ng khuếch đại DNA của L. monocytogenes Trong đ : , , , : DNA chuẩn GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific) , , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng , 7, , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng 0, , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng , , 7, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng , 0, , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng , , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng 7, , , 0: Sản phẩm LAMP v i bộ mồi 7 lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng , , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng Từ kết quả này, chúng tôi quyết định chọn bộ mồi 8 cho các nghiên cứu tối ưu hóa tiếp theo. Phân tích tính phù hợp của mồi 8 cho thấy các mồi đều phù hợp tiêu chí thiết kế về khoảng cách giữa các mồi, chiều dài mồi. Để tìm các vị trí có thể biến đổi trong loài của trình tự nucleotit trên gen, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự mồi với các trình tự gen inlJ trên ngân hàng GenBank của NCBI bằng chương trình ClustalW và BlastN. Tại những vị trí biến đổi, nucleotit biến đổi được thay thế bằng nuceotit suy biến. Kết quả chạy kiểm tra các mồi được trình bày cụ thể trong Bảng 33. Bảng 33 Kết quả kiểm tra các điểm sai khác của bộ mồi LAMP v i các trình tự gen inlJ tr n ngân hàng gen NCBI Tên mồi Trình tự Vị trí thay đổi Số lƣợng allele Trình tự mồi sau thay thế nucleotide suy biến F3 CATTACCACCCTTGATCTTAGC CATTACTACTCTTGATCTTAGC CATTACCACCCTTGATCTTAGC 2 CATTACYACYCTTGATCTTAGC B3C CCACAAACTCAATTAACAACCT Mồi B3c nằm trong vùng bảo thủ hoàn toàn 1 CCACAAACTCAATTAACAACCT F2 CAAACCTTGACGTAACCCCGC CAAACCTTGACGTAACCCCGC CAAACCTTGATGTAACCCCGC 2 CAAACCTTGAYGTAACCCCGC B2c TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG TCAGTTAATTGTGTATTGTGGCTG 2 TCRGTTAATTGTGTATTGTGGCTG F1c TGTGAGTTTGTTCGTGTCG Mồi F1c nằm trong vùng bảo thủ hoàn toàn 1 CGACACGAACAAACTCACA B1 GCGCAACACCTTAACCGAAA GCGCAACACCTTAACCGAAA GCGCAACACCCTAACCGAAA 2 GCGCAACACCYTAACCGAAA 3.2.1.3. T i ưu phản ứng LAMP9 Ảnh hƣ ng của nhiệt độ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP Khảo sát đồng thời ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và nồng độ betaine đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 35. Từ kết quả này, chúng tôi đã lựa chọn điều kiện nhiệt độ ủ 65 oC với nồng độ betain là 0,9 M (giếng 13) cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 35 nh hư ng của nhiệt độ ủ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP. Trong đ : : DNA chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder (Thermo Scientific) , : Sản phẩm LAMP oC, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP oC, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , 7: Sản phẩm LAMP oC, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP oC, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng 0, : Sản phẩm LAMP oC, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP oC, 0,9 M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP oC, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , 7: Sản phẩm LAMP oC, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP oC, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng Ảnh hƣ ng của th i gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP Thử nghiệm phản ứng LAMP với lượng DNA khuôn của L. monocytogenes là 0 và 0,2 pg phản ứng; thời gian ủ là 45, 60, 75 phút. Sau đó, điện di 3 l lượng sản phẩm LAMP trên gel agarose. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 36 dưới đây: Hình 36 nh hư ng của thời gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP Trong đ : : DNA chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific); : Sản phẩm LAMP sau 7 ph t lượng DNA khuôn của L. monocytogenes là 0 pg phản ứng , , : Sản phẩm LAMP v i lượng DNA khuôn là 0, pg phản ứng, thời gian ủ l n lượt là , 0, 7 ph t10 Kết quả cho thấy kết quả khuếch đại thực sự bão hòa sau 60 phút phản ứng (đường chạy số 4). Do vậy, chúng tôi lựa chọn thời gian ủ là 60 phút cho phản ứng LAMP ở điều kiện tối ưu là 65oC và nồng độ betain là 0,9 M. 3.2.1.4. Kiểm tra độ đặc hiệu, độ bao trùm của phản ứng LAMP Xác định tính bao trùm của phản ứng với một tập hợp 16 chủng L. monocytogenes. Kết quả điện di sản phẩm LAMP (Hình 37) cho thấy độ bao trùm của phản ứng LAMP với DNA của các chủng thuộc loài L. monocytogenes là 100%. Hình 37 ộ bao trùm của phản ứng LAMP v i các chủng L. monocytogenes Trong đ : : Thang chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific); : Mẫu kiểm chứng âm t nh , , , và 7: Sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L. monocytogenes ATCC 19117, L. monocytogenes EGDe, L. monocytogenes LO28; L. monocytogenes CIP7835; L. monocytogenes DSM20750; đến : sản phẩm LAMP v i DNA khuôn của các chủng L. monocytogenes được phân lập từ thực phẩm Hình 38 ộ ch n l c của phản ứng LAMP v i các loài Listeria khác và các vi khuẩn thường nhi m tạp trong thực phẩm Trong đ : : thang chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mi Thermo Scientific : âm t nh , , , và 7: sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L. monocytogenes ATCC 19117, L. monocytogenes EGDe, L. monocytogenes LO28; L. monocytogenes CIP7835; L. monocytogenes DSM20750 đến : sản phẩm LAMP v i 0 ng DNA khuôn của l n lượt các chủng L. innocua ATCC 0 L. seeligeri ATCC 35967; L. welshimeri ATCC 35897; L. grayi ATCC 19120; L. ivanovii ATCC 19119; Escherichia coli B41; Salmonella 9R12G2; Bacillus cereus H3081.97; B. subtilis 353B. Xác định tính chọn lọc của phản ứng LAMP với các loài Listeria khác và các loại vi khuẩn thường nhiễm tạp trong thực phẩm như Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus, B. subtilis. Kết quả điện di (Hình 38) cho thấy phản ứng LAMP có độ đặc hiệu đạt 100% trên tập hợp các chủng thử nghiệm. 3.2.1.5. ộ nhạy phản ứng LAMP Tiến hành phản ứng LAMP ở các nồng độ DNA khác nhau. Kết quả cho thấy ngư ng phát hiện của phản ứng LAMP là 50 fgphản ứng tương đương với khoảng 16 tế bào phản ứng (Hình 39).11 Hình 39 Ngư ng phát hiện của phản ứng LAMP đ i v i DNA tinh khiết của L. monocytogenes Trong đ : , , , , , và 7: Sản phẩm LAMP v i l n lượt , pg 0, pg 0 fg 0 fg fg fg 1, fg DNA của chủng L. monocytogenes EGDe 8: Mẫu âm t nh : Thang chuẩn GeneRulerTM kb DNA Ladder Thermo Scientific . Hình 310 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu v i HN Trong đ : 7,6,5,4,3 Ống phản ứng LAMP v i l n lượt 0 fg fg fg fg fg u hu g L. monocytogenes EGDe Kết quả trên cho thấy độ nhạy của hai phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP nghiên cứu tương đương nhau. 3.2.1.6. So sánh độ nhạy bộ mồi LAMP thiết kế v i các bộ mồi LAMP đã công b Tiến hành phản ứng LAMP với 4 bộ mồi, 1 bộ mồi LAMP đã thiết kế được với 3 bộ mồi tham chiếu đã được công bố trình tự. Kết quả thể hiện trên Hình 310.12 Hình 311 So sánh độ nhạy của phản ứng LAMP phát triển trong nghiên cứu này v i các phương pháp LAMP phát hiện L. monocytogenes đã được công b Trong đ : ): mẫu âm tính; (+): mẫu dương t nh 1: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 107 dung dịch DNA ban đ u 2: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 106 dung dịch DNA ban đ u 3: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 105 dung dịch DNA ban đ u 4: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 104 dung dịch DNA ban đ u L: DNA ladder (Sangon Biotech) A: Phản ứng LAMP v i mồi iap B: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA C: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA D: Phản ứng LAMP v i bộ mồi LAMP inlJ trong nghiên cứu này Kết quả trên cho thấy bộ mồi LAMP của gen inlJ trong nghiên cứu này cho độ nhạy tốt nhất (kết quả dương tính ở độ pha loãng DNA là 106). 3.2.2. Xây dựng quy trình tăng sinh 3.2.2.1. nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự sinh trư ng L. monocytogenes Tăng sinh mẫu xúc xích hun khói trong các môi trường cơ bản khác nhau. Sau 16 giờ nuôi, thu sinh khối, tách chiết DNA cho phản ứng realtime PCR. Đánh giá khả năng tăng sinh dựa trên giá trị chu kỳ ngư ng (Ct) của phản ứng realtime PCR, kết quả được thể hiện trên Bảng 34 sau: Bảng 34 nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự t ng sinh của L. monocytogenes trong canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm Loại môi trƣ ng cơ bản TSBYE có Kháng sinh TSBYE không có kháng sinh BLEB có kháng sinh BLEB không có kháng sinh Half fraser có kháng sinh UVM không có kháng sinh LEB có kháng sinh LEB không có kháng sinh Ct 21,40 ± 1,20 24,57 ± 1,13 15,71 ± 1,52 23,94 ± 0,97 14,26 ± 1,16 21,47 ± 2,01 18,29 ± 1,45 25,77 ± 1,7813 Kết quả cũng cho thấy môi trường HF và BLEB cho giá trị Ct thấp nhất và gần ngang nhau. Trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành tăng sinh mẫu xúc xích trên môi trường BLEB với nồng độ kháng sinh như ở môi trường Half Fraser (acriflavin và nalidixic acid lần lượt là 12,5 mg l và 10 mg l) trong 12 giờ, được kết quả như Bảng 35. Bảng 35 nh hư ng của hai loại môi trường cơ bản LE và HF đến sự sự t ng sinh của L. monocytogenes trong canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm Loại môi trƣ ng BLEB có kháng sinh Half fraser có kháng sinh Ct 31,57 ± 0,98 33,29 ± 0,68 Qua thí nghiệm này, môi trường BLEB được chọn là môi trường cơ bản cho tăng sinh L. monocytogenes. 3.2.2.2. nh hư ng của một s thành ph n môi trường đến sự sinh trư ng của L. monocytogenes Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men Hình 312 nh hư ng của nồng độ cao n m men đến sự sinh trư ng của L. monocytogenes trong môi trường LE canh trường thu n Tăng sinh với lượng giống ban đầu 3 x 104 CFU ml. Sau 4 giờ nuôi, đo độ đục canh trường ở bước sóng 600 nm. Từ kết quả Hình 313, nồng độ cao nấm men 6 g l được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. Ảnh hưởng của nồng độ pyruvate đến sinh trưởng phát triển của L. monocytogenes Nhiễm chủ động L. monocytogenes vào môi trường BLEB có bổ sung pyruvate với nồng độ từ 0,6 đến 1,6 g l với mật độ nhiễm là 2,7 x 102 CFU ml, sau 3 giờ nuôi, lấy canh trường đo độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 600 nm. Kết quả cho thấy mật độ vi khuẩn đạt cao nhất là tại giá trị nồng độ pyruvate đạt 1,2 và 1,4 g l. Qua thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn nồng độ pyruvate cần bổ sung vào môi trường BLEB là 1,2 g l. 3.2.2.3. nh hư ng của nalidi ic acid và acriflavin đến sự sinh trư ng của L. monocytogenes Vi khuẩn được nuôi trong những môi trường có nồng độ kháng sinh khác nhau, sau 4 giờ, xác định giá trị OD 600 nm thu được kết quả như Hình 314 sau:14 Hình 313 nh hư ng của nồng độ acriflavin và axít nalidi ic đến sự sinh trư ng của L. monocytogenes trong môi trường LE canh trường thu n Khi nồng độ hai loại kháng sinh trên giảm xuống 5 mg l, thì sự sinh trưởng của L. monocytogenes là tương đương với mẫu không có kháng sinh (sự sai khác không có ý nghĩa). Do vậy, trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành xem xét khả năng ức chế của các kháng sinh ở nồng độ thấp. 3.2.2.4. nh hư ng của kháng sinh đến sự sinh trư ng của một s loài vi khuẩn khác Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng của acriflavin và acid nalidixic lên ba loài vi khuẩn E. coli, Staphylococcus aureus và Lactobacillus plantarum ở 3 nồng độ 2,5; 5 và 10 mg l trong môi trường BLEB đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy, với nồng độ kháng sinh 5 mg l cho khả năng ức chế tốt trên cả 3 loài vi khuẩn nghiên cứu. Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn nồng độ 2 loại kháng sinh acriflavin và acid nalidixic đều là 5 mg l. Bảng 36 nh hư ng của nồng độ kháng sinh đến sự sinh trư ng của một s loài vi sinh vật chỉ thị trong môi trường LE canh trường thu n Loài vi khuẩn Th i gian tăng sinh (gi ) 0 3 5 7 E. coli Không kháng sinh 0,116 0,373 0,653 0,655 Acriflavin (2,5 mgl) 0,116 0,105 0,096 0,231 Acriflavin (5 mgl) 0,124 0,144 0,138 0,138 Acriflavin (10 mgl) 0,115 0,105 0,103 0,087 Nadilixic (2,5 mgl) 0,122 0,142 0,104 0,123 Nadilixic (5 mgl) 0,112 0,114 0,09 0,083 Nadilixic (10 mgl) 0,121 0,134 0,071 0,109 Staphylococcus aureus Không kháng sinh 0,031 0,596 2,357 4,5 Acriflavin (2,5 mgl) 0,03 0,039 0,034 0,045 Acriflavin (5 mgl) 0,039 0,041 0,037 0,047 Acriflavin (10 mgl) 0,033 0,031 0,03 0,047 Nadilixic (2,5 mgl) 0,024 0,035 0,036 0,038 Nadilixic (5 mgl) 0,025 0,042 0,036 0,037 Nadilixic (10 mgl) 0,025 0,036 0,036 0,047 Lactobacillus Không kháng sinh 0,144 ND 2,254 2,95915 plantarum Acriflavin (2,5 mgl) 0,148 ND 1,722 1,743 Acriflavin (5 mgl) 0,134 ND 0,114 0,147 Acriflavin (10 mgl) 0,137 ND 0,162 0,131 Nadilixic (2,5 mgl) 0,118 ND 0,541 0,943 Nadilixic (5 mgl) 0,117 ND 0,142 0,055 Nadilixic (10 mgl) 0,123 ND 0,138 0,052 ND: Không xác định 3.2.2.5. Thử nghiệm t ng sinh tr n mẫu thực phẩm Mẫu xúc xích hun khói được đồng hóa trong môi trường BLED, bổ sung 2 loại kháng sinh là acriflavin và acid nalidixic với nồng độ mỗi loại là 5 mg l và 10 mg l. Nhiễm chủ động với mật độ 10 CFU bình có chứa 100 ml hỗn dịch đồng hóa. Sau 12 giờ tăng sinh, lấy 1 ml canh trường tăng sinh tiến hành tách chiết DNA cho phản ứng realtime PCR. Kết quả thể hiện trên Bảng 37. Bảng 37 nh hư ng của nồng độ acriflavin và axít nalidixic đến sự t ng sinh của L. monocytogenes trong môi trường LE c bổ sung cao n m men, pyruvate và v i sự hiện diện của hệ vi sinh vật trong mẫu c ch Mẫu Acriflavin và nalidixic acid (5 mgl) Acriflavin và nalidixic acid (10 mgl) Ct 22,7 ± 1,04 26,17 ± 1,17 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Kết quả trên thêm một lần nữa kh ng định ở nồng độ kháng sinh 5 mg l cho khả năng tăng sinh L. monocytogenes tốt hơn so với nồng độ kháng sinh 10 mg l. 3.2.3. Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA Tro g ội du g ày á phươ g pháp tá h hiết đượ đá h giá thô g qu giá trị Ct ủ phả ứ g re ltime PCR, giá trị Ct à g hỏ hiệu suất tá h hiết à g lớ . 3.2.3.1. Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng triton X 00 kết hợp si u âm và gia nhiệt oC Mỗi thí nghiệm được tiến hành tách chiết với các lượng sinh khối tế bào như nhau. Lần lượt thay đổi từng yếu tố: Nồng độ triton X100 trong đệm chiết (0,6% đến 2,4%), thời gian gia nhiệt ở 95 °C (215 phút); thời gian siêu âm (04 phút), ly tâm thu dịch nổi có chứa DNA cho phản ứng Realtime PCR. Kết quả được trình bày trong các bảng sau. Bảng 38 nh hư ng của nồng độ Triton X 00 đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes. Nồng độ triton X100 (%) 0,6 1,2 1,8 2,4 Ct 15,56 ± 1,01 15,41 ± 0,63 15,93 ± 1,20 15,98 ± 0,78 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn16 Bảng 39 nh hư ng của thời gian ử lý nhiệt đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X 00 Th i gian xử lý nhiệt (phút) 2 5 10 15 Ct 15,92± 0,51 15,56 ± 1,04 15,61 ± 1,12 15,73 ± 0,75 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Bảng 310 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X 00. Th i gian siêu âm (phút) Không siêu âm 0,5 1 2 4 Ct 21,22 ± 0,63 18,35 ± 1,01 17,74 ± 0,81 15,72 ± 0,53 16,23 ± 0,22 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Kết quả ở các bảng trên điều kiện tách chiết được chọn là nồng độ triton X100 là 1,2%; gia nhiệt 95oC trong 5 phút siêu âm 2 phút. 3.2.3.2. Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng NaOH kết hợp si u âm và gia nhiệt oC Mỗi thí nghiệm được tiến hành tách chiết với các lượng sinh khối tế bào như nhau. Lần lượt thay đổi từng yếu tố: thời gian gia nhiệt ở 95 °C (520 phút); nồng độ NaOH (10mM 200mM), thời gian siêu âm (04 phút), ly tâm thu dịch nổi có chứa DNA cho phản ứng Realtime PCR. Kết quả được trình bày trong các bảng sau. Bảng 311 nh hư ng của thời gian ử lý nhiệt đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH. Th i gian (phút) 5 10 15 20 Ct 21,53 ± 1,12 21,86 ± 0,45 21,13 ± 1,21 21,89 ± 1,04 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Bảng 312 nh hư ng của nồng độ NaOH đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes Nồng độ NaOH (mM) 10 30 70 100 150 200 Ct 22,73 ± 1,02 22,40 ± 0,64 21,86 ± 0,73 20,65± 0,52 20,79 ± 0,91 20,37 ± 0,85 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn17 Bảng 313 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH. Th i gian siêu âm (phút) 0 0,5 1 2 3 4 Ct 20,72 ± 1,12 19,46 ± 0,71 17,72 ± 1,04 16,35 ± 0,54 16,81 ± 0,84 18,93 ± 0,97 Kết quả ở các bảng trên điều kiện tách chiết được chọn là nồng độ NaOH là 100 mM; gia nhiệt 95oC trong 5 phút siêu âm 2 phút, 3.2.3.3. So sánh các phương pháp tách chiết nghi n cứu đ i v i canh trường L. monocytogenes thu n không c mẫu thực phẩm Dùng 3 phương pháp tách chiết DNA (2 phương pháp sử dụng NaOH và Triton X100 đã tối ưu ở trên và 1 phương pháp sử dụng kít tách chiết thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit). Mỗi phương pháp tách chiết thực hiện trên 3 mẫu. Thực hiện phản ứng realtime PCR với DNA thu được từ 3 phương pháp tách chiết trên. Kết quả trình bày ở Hình 315 Hình 314 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường thu n của các quy trình sử dụng NaOH, Triton X 00 và sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit. Kết quả cho thấy trong canh trường thuần khả năng tách chiết DNA của 3 phương pháp trên không chênh lệch nhau nhiều, Ct hơn kém nhau khoảng 1 chu kỳ. 3.2.3.4. ánh giá hiệu quả tách chiết DNA của các phương pháp đ i v i mẫu thực phẩm t ng sinh Thí nghiệm được thực hiện với mẫu xúc xích được nhiễm chủ động, tách chiết theo 4 phương pháp tách chiết DNA(3 phương pháp tách chiết ở trên và phương pháp tách chiết thông thường có sử dụng dung môi hữu cơ) thực hiện phản ứng Realtime PCR. Kết quả trình bày tại Hình 316 sau.18 15 18 21 24 27 30 33 NaOH Triton Kit Thông thường Ct Hình 315 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường t ng sinh mẫu c ch khi sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X 00, sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit và quy trình tách chiết thông thường. Kết quả phân tích cho thấy khả năng tách chiết DNA từ mẫu xúc xích bằng phương pháp sử dụng kít cho kết quả tách chiết tốt nhất. Hai phương pháp sử dụng NaOH và phương pháp sử dụng Triton X100 cho kết quả tách chiết tương đương nhau. Phương pháp tách chiết DNA thông thường làm sạch DNA rất tốt, tuy vậy qúa trình tách chiết khá phực tạp mất nhiều thời gian và sử dụng nhiều dung môi độc hại, không phù hợp cho phân tích trong thực tế khi số mẫu lớn. Kết quả này cho thấy nếu mật độ vi khuẩn đích không đủ (tăng sinh ng n, mật độ ban đầu thấp), phản ứng nhân gen yêu cầu DNA có độ tinh sạch cao (realtime PCR) thì cần sử dụng phương pháp tách chiết DNA có công đoạn làm sạch tốt như phương pháp kít hoặc phương pháp thông thường để đảm bảo kết quả phân tích không bị âm tính giả. Ngược lại nếu mật độ vi khuẩn đích đủ lớn cho phản ứng nhân gen và thêm nữa có những phản ứng nhân gen yêu cầu DNA với độ tinh sạch không quá cao (LAMP) thì có thể sử dụng phương pháp tách chiết đơn giản (NaOH hoặc Triton X100) cho đơn giản mà vẫn hiệu quả. Trong nghiên cứu sử dụng bi từ g n kháng thể để cô đặc và làm sạch vi khuẩn sau giai đoạn tăng sinh. Tuy nhiên hiệu quả làm sạch và cô đặc L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm sau tăng sinh cho hiệu quả không cao, nên kết quả cụ thể không được trình bày trong phần kết quả của luận án này. Tuy nhiên trong thí nghiệm rửa giải vi khuẩn khỏi hạt từ và tách chiết DNA từ vi khuẩn thu được, kết quả cho thấy sử dụng đệm glycinetris pH 8,3 theo khuyến cáo của nhà cung cấp hạt từ (Gencrip) cho khả năng tách chiết DNA tốt hơn so với NaOH 100 mM. Chính vì vậy trong thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành so sánh khả năng tách chiết DNA từ canh trường tăng sinh mẫu xúc xích hun khói theo 2 phương pháp: sử dụng Triton X100 1,2 % với điều kiện đã được tối ưu ở trên và sử dụng đệm glycineTris 100 mM pH 8,3 với điều kiện tương tự. DNA sử dụng cho phản ứng realtime PCR. Kết quả thể hiện trên Hình 317.19 Hình 316 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường t ng sinh mẫu c ch khi sử dụng quy trình tách chiết bằng đệm GlycineTris pH 8,3 và Triton X 100 Từ kết quả trên phương pháp tách chiết được lựa chọn trong nghiên cứu này là sử dụng đệm glycine 100 mM, pH 8,3 gia nhiệt 95 oC trong 5 phút, siêu âm 2 phút. 3.2.3.5. nh hư ng của lượng mẫu l y tách chiết DNA cho phản ứng LAMP Nhiễm chủ động lượng tế bào vi khuẩn 6 CFU25 g, tăng sinh 12 giờ, tách chiết DNA cho phản ứng realtime PCR và LAMP. Kết quả thể hiện ở Bảng 314 sau: Bảng Error No text of specified style in document.14 nh hư ng của thể t ch mẫu canh trường t ng sinh được sử dụng đến khả n ng phát hiện L. monocytogenes bằng kỹ thuật LAMP và realtime PCR Thể tích mẫu (ml) 1 10 20 30 Real time PCR + ức chế ức chế ức chế LAMP (quan sát kết tủa sản phẩm phụ bằng m t thường) Khó phát hiện + + + LAMP (điện di sản phẩm) + + + + Xác định sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu với HNB + + + + Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn thể tích mẫu lấy đi phân tích là 10 ml 3.2.3.6. Thử nghiệm phản ứng LAMP tr n các nền mẫu khác nhau Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng 3 loại mẫu, nhiễm chủ động, tăng sinh 10, 12, 14 giờ, lấy mẫu cho tách chiết thu DNA cho phản ứng LAMP. Kết quả thể hiện trên Hình 3 1920 Hình 317 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh và nền mẫu đến khả năng phát hiện L. monocytogenes dựa trên kỹ thuật LAMP khuếch đại gen inlJ Trong đ : ( Mẫu âm t nh phản ứng LAMP , , : L n lượt là mẫu c ch, mẫu mayonair và mẫu sữa không nhi m L. monocytogenes. , , : L n lượt là mẫu c ch nhi m chủ động CFU g, t ng sinh 0, , giờ. 7, , : l n lượt là mẫu c ch nhi m chủ động CFU g, t ng sinh 0, , giờ. 0, : L n lượt là mẫu mayonair nhi m chủ động CFU g, t ng sinh , giờ. , : L n lượt là mẫu sữa nhi m chủ động CFU g, t ng sinh , giờ Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn thời gian tăng sinh cho mẫu thịt là ≥ 10 giờ, cho mẫu sữa và mayonair là ≥ 12 giờ. 3.2.4. Đề xuất quy trình phân tích Từ những kết quả thu được ở trên chúng tôi đề xuất quy trình phân tích L. monocytogenes dựa trên phản ứng LAMP như sau: Hình 318 Sơ đồ quy trình phát hiện nhanh L. monocytogenes được phát triển trong nghi n cứu này Lấy mẫu tách chiết DNA (ly tâm 10.000 g3 phút, gia nhiệt 95oC5 phút, siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g2 phút) Thực hiện phản ứng LAMP 65oC4060 phút; 80oC5 phút Đọc kết quả Tăng sinh chọn lọc 37oC12 gi 21 Tăng sinh chọn lọc: Cân 25 g thực phẩm cần phân tích, đồng hóa với 225 ml môi trường tăng sinh đã vô trùng (môi trường BLEB có thành phần: 17 gl casein enzymic hydrolysate; 3 gl papaic digest of soyabean meal; 5 gl NaCl; 2,5 gl K2HPO4, 2,5 g l dextrose; 6 g l cao nấm men;1,35 g l KH2PO4; 9,6 gl Na2HPO4; pyruvate 1,2 g l, nalidixic và acriflavin đều là 5 mg l). pH (tại 25°C) = 7,3. Các hóa chất của hãng Himedia (hoặc tương đương trở lên). Ủ ở 37 oC trong 12 giờ. Lấy mẫu tách chiết DNA Lấy 10 ml canh trường tăng sinh chuyển sang 1 ống falcon 15 ml sạch, ly tâm thu sinh khối ở tốc độ 10.000 g 3 phút, chuyển sang 1 ống eppendorf 1,5 ml. Rửa lần 1 bổ sung 1 ml nước deion, trộn đều, ly tâm 10.000 g 3 phút, loại bỏ dịch nổi thu sinh khối, rửa lần 2 tương tự lần 1. Bổ sung 100 l đệm chiết (đệm glycine 100 mM, pH 8,3), trộn đều, phá v tế bào ở 95 oC 5 phút; siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g 2 phút thu dịch nổi chứa DNA cho phản ứng LAMP. Hóa chất yêu cầu ở mức tinh khiết và phù hợp cho sinh học phân tử. Thực hiện phản ứng LAMP Sử dụng 3 µl DNA cho phản ứng LAMP. Thực hiện phản ứng LAMP với thể tích 20 l có thành phần như sau: 20 mM TrisHCl pH 8,8 ở 25 °C; 10 mM (NH4)2SO4; 10 mM KCl; 8 mM MgSO4; 0,1 % Triton X100; 1,2 mM dNTP; 1,2 M betaine; 1,6 M các mồi FIP và BIP; 0,2 M mồi F3 và B3; 8 U Bst 2.0 DNA polymerase. Phản ứng được ủ ở nhiệt độ 65 °C trong thời gian 4060 phút. Dừng phản ứng bằng ủ ở 80 °C trong 5 phút. Song song thực hiện 1 mẫu dương tính (thay DNA mẫu bằng DNA tách chiết từ L. monocytogenes EGDe với nồng độ bản sao l), 1 mẫu âm tính phản ứng LAMP (thay DNA từ mẫu bằng nước cất). Các hóa chất yêu cầu ở mức tinh khiết và phù hợp cho sinh học phân tử. Đọc kết quả: Sau phản ứng LAMP, quan sát màu dung dịch phản ứng, mẫu chuyển dung dịch phản ứng từ màu xanh tím than sang màu xanh da trời là mẫu dương tính (Hình 310). 3.2.5. n n n n Để xác định độ nhạy toàn bộ quy trình phân tích, chúng tôi nhiễm mẫu ở các mật độ khác nhau dao động trong khoảng xấp xỉ 110 CFU 25 g mẫu bình 225 ml môi trường. Tăng sinh 12 giờ lấy mẫu xác định sự có mặt của L. monocytogenes. Xác định mật độ chính xác đã nhiễm vào mẫu bằng hậu kiểm canh trường giống đã sử dụng để nhiễm mẫu bằng phương pháp trải trên đĩa môi trường O.A Listeria, sau đó quy ngược lại ra mật độ nhiễm ban đầu. Sau tăng sinh 12 giờ, lấy mẫu xác định sự có mặt của L. monocytogenes bằng phương pháp LAMP và cấy trải đĩa sau đó lấy khuẩn lạc đặc trưng chạy realtime PCR. Những mẫu dương tính với phản ứng realtime PCR mới được coi là mẫu đã được nhiễm. Kết quả thí nghiệm này được trình bày ở bảng sau:22 Bảng 315 ộ nhạy quy trình phát hiện L. monocytogenes theo kỹ thuật LAMP Mật độ nhiễm (CFUml) 13 47 810 1015 Số mẫu dƣơng tính với phản ứng LAMPtổng số mẫu phân tích 55 55 55 33 Kết quả trên cho thấy độ nhạy của quy trình trong phòng thí nghiệm đạt được ≥ 1 CFU 25 g mẫu. 3.2.5. Thiết kế, sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP phát hiện L. monocytogenes 3.2.5.1. Thiết kế bộ sinh phẩm Thành phần bộ kít Bộ kít được thiết kế gồm hai hợp phần cho hợp lý về mặt k thuật, bảo quản và tiện về mặt sử dụng. Thành ph n cho t ng sinh LAMPL’MONO – M) Gồm 10 túi mỗi túi chứa 10,83 g môi trường BLEB Thành ph n cho tách chiết DNA và phản ứng LAMP LAMPL’MONO – D) Dung dịch số 1: Đệm Glycine 0,1 M, pH 8,3. Thể tích 2 x 1,5 ml Dung dịch A: 33,33 mM TrisHCl; 16,66 mM KCl; 13,33 mM MgSO4; 0,16 % Triton X100; 1,66 mM dNTP, 2 M betain, 2,66 M các mồi FIP và BIP; 0,33 µM các mồi F3 và B3; 200 µM HNB. Thể tích 12 l, số lượng 10 ống eppendorf 0,5 ml Dung dịch B: Bst 120 U (1 ống x 15 l) Dung dịch C: Nước (ultrapure, DNAse, RNAse free) (1 ống x 50 µl) Dung dịch D: Kiểm chứng dương tính: 20 l dung dịch DNA Listeria monocytogenes với nồng độ 1000 bản sao l 3.2.5.2. iều kiện bảo quản bộ sinh phẩm Bộ sinh phẩm được thiết kế gồm 2 phần riêng biệt là phần môi trường tăng sinh (LAMPL’MONO – M) được bảo quản ở 4 oC, và phần các loại hóa chất cho tách chiết và phản ứng LAMP (LAMPL’MONO – D) được bảo quản ở điều kiện 20 oC. Theo các hướng dẫn sử dụng và bảo quản các hóa chất ở thể chưa trộn lẫn thành hỗn hợp thì các hoá chất cho phản ứng LAMP và tách chiết DNA hoàn toàn bền ở nhiệt độ 20 oC. 3.2.5.3. Sản u t thử nghiệm bộ sinh phẩm Bộ sinh phẩm được sản xuất thử nghiệm quy mô phòng thí nghiệm. 3.2.6. Kiểm định bộ sinh phẩm LAMPL’MONO Bộ sinh phẩm LAMPL’MONO được kiểm định tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm trên 30 mẫu thực phẩm nhiễm chủ động từ 5250 CFU25 g. Xác định sự có mặt của L. monocytogenes theo 2 phương pháp ISO 112901 : 1996 (thay đổi lần 1:2004) và phương pháp sử dụng bộ kít LAMPL’MONO. Kết quả kiểm định cho thấy chỉ sai khác duy nhất một mẫu được nhiễm ở mật độ 5 CFU 25 g thực phẩm cho kết quả dương tính với23 phương pháp ISO và cho kết quả âm tính với phương pháp LAMP. Kết quả tính toán cụ thể một số thông số về độ nhạy độ đặc hiệu, độ chính xác như dưới đây. Độ chính xác tương đối: AC = ((PA+NA)100) (PA+NA+PD) = (27+2)100(27+2+1)= 96,66 % Độ nhạy tương đối: SE= PA 100 (PA+PD) = 27 100 (27+1) = 96,43 % Độ đặc hiệu tương đối: SP = NA100 (ND+NA) = 2100 (0+2) = 100 % Tỷ lệ dương tính giả PN = ND 100(PA+NA+PD) = 0 % 3.2.7. Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm Bộ sinh phẩm được ứng dụng sử dụng tại Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội. Thử nghiệm phân tích trên 30 mẫu thực phẩm lấy trên thị trường Hà Nội. Sử dụng 3 phương pháp phân tích song song, phương pháp sử

THÔNG TIN TÓM TẮT VỀ NHỮNG KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN TIẾN SĨ

(Thông tin đưa lên trang Web)

Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201

Nghiên cứu sinh: Phùng Thị Thủy

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Lê Quang Hòa

2 PGS.TS Tô Kim Anh

Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

TÓM TẮT KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN

1 Đã phân lập được 59 chủng L monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ

lệ nhiễm chung là 10,87 % Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất là xúc xich và thịt hun khói cắt lát

2 Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập được cho thấy: 48 chủng L monocytogenes phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và

lineage II có 8 chủng Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn lineage II Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV

và 1 chủng thuộc ECI có nguy cơ gây bùng phát dịch bệnh cao 48 chủng có tất cả 16

ST trong đó có ST1 đặc biệt nguy hiểm vì ST1 đã từng gây ra nhiều vụ bùng phát dịch lớn trên thế giới

3 Đã thiết kế được phản ứng LAMP cho phát hiện nhanh L monocytogenes, bao gồm: thiết kế bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ, điều kiện tối ưu cho phản ứng LAMP là

nhiệt độ 65oC, thời gian 40-60 phút, nồng độ betain 0,9 M

4 Đã tối ưu được quy trình phân tích trực tiếp L monocytogenes từ thực phẩm dựa trên

phản ứng LAMP, bao gồm: tăng sinh mẫu trong môi trường BLEB ở 37o

C, tốc độ lắc

150 vòng/phút trong thời gian 10 giờ cho sản phẩm thịt và 12 giờ cho sản phẩm sữa và mayonair; cải tiến phương pháp tách chiết nhanh thu DNA từ canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm Quy trình phân tích đạt độ nhạy 1 CFU/25 g với tổng thời gian phân tích 12-14 giờ

5 Đã thiết kế và chế tạo thành công bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện nhanh

Listeria monocytogenes trong thực phẩm Bộ sinh phẩm được kiểm định cho kết quả

có độ tương đồng cao với các phương pháp truyền thống theo ISO 11290-1: 1996 và TCVN 7700-1:2007

Hà Nội, ngày 28 tháng 3 năm 2016

INFORMATION ON NEW CONCLUTION OF DOCTORAL THESIS

(Information will be posted on the Website)

Name of thesis: Study on rapid method for direct detection and molecular

epidemiology of Listeria monocytogenes isolated from Vietnam foods

Specialization: Biotechnology Code No.: 62420201

Name of PhD student: Phung Thi Thuy

Advisor: 1 Dr Le Quang Hoa

2 Assoc Prof Dr To Kim Anh

Training Institution: Hanoi University of Science and Technology

Summary of the new contributions of the Thesis

1 Fifty nine strains of L monocytogenes were isolated from 543 Vietnam food samples The average infection rate of L monocytogenes in foods was 10.87% with the highest found in

sausage and slide meat products

2 Forty eight strains out of 59 isolated of L monocytogenes were divided into two lineages, of

which 40 isolates belonging to lineage I and 8 isolates belonging to lineage II The lineage I strains was considered high risky than those of the lineage II On the other hand, the isolates could be divided into 9 clonal clusters, among them 19 ECIV strains and one ECI strain were seen as outbreak causing strains The 48 isolates also can be divided into 16 ST,

of which ST1 strains were highly dangerous, causing many sever outbreaks worldwide

3 A molecular method for rapid detection of L monocytogenes based on LAMP reaction was established: a set of LAMP primers was designed to amplify inlJ gene, optimal condition

for the reaction was 65 °C for 40-60 min with betaine concentration of 0.9 M

4 The direct detection procedure of L monocytogenes based on the LAM reaction was

optimized, including enrichment for the bacteria in BLEB media at 37 °C, 150 rpm for 10 and 12 hours respectively for meat and dairy products; modified method for rapid DNA

extraction The sensitivity of detection procedure attained 1 CFU L monocytogenes /25 g

food with total analysis time of 12-14 hours

7 A LAMP-L'MONO kit for L monocytogenes rapid detection based on LAMP technique

was designed and validated and found to be conformed with ISO 11290-1: 1996 and TCVN 7700 -1: 2007 methods

Hanoi, 28 th , March, 2016

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN TIẾN SĨ

1 Tên tác giả: Phùng Thị Thủy

Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam

2 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201

3 Tên cơ sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

4 Mục đích và đối tượng nghiên cứu của luận án

 Mục đích nghiên cứu:

- Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L monocytogenes phân lập được

từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam

- Thiết kế, chế tạo thử nghiệm và kiểm định bộ sinh phẩm LAMP phát hiện nhanh L

monocytogenes trong các loại thực phẩm ăn liền

 Đối tượng nghiên cứu:

- Mẫu thực phẩm: Tổng số 543 được lấy tại các siêu thị trên địa bàn Hà Nội

- Chủng vi khuẩn phân lập: Tổng số 48 chủng L monocytogenes được phân lập từ thực

phẩm đang lưu hành tại Việt Nam,

- Chủng vi khuẩn chuẩn: 17 chủng vi sinh vật khác ngoài L monocytogenes

5 Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng

 Phân lập L monocytogenes từ mẫu thực phẩm

 Điện di DNA trên gel agarose

 Phản ứng PCR khẳng định L monocytogenes và khuếch đại các housekeeping gen cho

 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4

 Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy của phản ứng LAMP

 Phản ứng Real-time PCR

 Các phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn

 Kiểm định bộ sinh phẩm

 Phương pháp phát hiện L monocytogenes theo TCVN 7700-1: 2007 và ISO

11290-1:1996

 Xây dựng cây phân loại bằng phần mềm ClustalW

6 Các kết quả chính và kết luận

 Các kết quả chính đã đạt được trong đề tài nghiên cứu:

- Đã phân lập được 59 chủng L monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ

nhiễm chung là 10,87 % Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất (lần lượt

- Đã Thiết kế được bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ với độ nhậy trên mẫu vi khuẩn

thuần là 16 CFU/ phản ứng, trên canh trường tăng mẫu xúc xích là 336 CFU/ml Bộ mồi cho độ đặc hiệu, độ bao trùm cao (100 % số chủng nghiên cứu)

- Đã tối ưu được điều kiện cho phản ứng LAMP đó là thực hiện phản ứng tại nhiệt độ

65oC, thời gian 40-60 phút, nồng độ betain là 0,9 M

- Đã tối ưu được điều kiện tăng sinh cho phát hiện L monocytogenes là: sử dụng môi

trường BLEB (17 g/l casein enzymeic hydrolysate; 3 g/l papaic digest of soyabean meal;

5 g/l NaCl; 2,5 g/l K2HPO4, 2,5 g/l dextrose; 6 g/l cao nấm men;1,35 g/l KH2PO4; 9,6 g/l

Na2HPO4; pyruvate 1,2 g/l, nalidixic và acriflavin đều là 5 mg/l), tăng sinh ở 37o

C tốc độ lắc 150 vòng/ phút, thời gian 10 giờ (với sản phẩm thịt); 12 giờ (với sản phẩm sữa và mayonair)

- Đã tìm được điều kiện tách chiết nhanh thu DNA cho phản ứng LAMP từ canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm đó là sử dụng đệm glycine –tris 100 mM pH 8,3, gia nhiệt 5 phút tại 95oC, siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g trong 3 phút thu dịch DNA cho phản ứng LAMP

- Đã xây dựng được quy trình phân tích nhanh L monocytogenes monocytogenes trong

thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP với độ nhạy đạt 1 cfu/25 g với tổng thời gian phân tích khoảng 12-14 giờ

- Đã thiết kế và chế tạo thành công bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes

trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP mang tên LAMP-L’MONO

- Đã kiểm định và ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO cho kết quả có độ tương đồng cao với các phương pháp truyền thống theo ISO 11290-1: 1996 (sửa đổi lần 1: 2004) và TCVN 7700-1:2007 Độ đặc hiệu đạt 100 % (phòng thí nghiệm, trên mẫu thực và kiểm định) Độ chính xác (ổn định) đạt 100 % (phòng thí nghiệm, mẫu thực) và đạt 96 % (kiểm định), tỷ lệ dương tính giả 0% (phòng thí nghiệm và mẫu thực)

 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cho thấy thực tế tỷ lệ nhiễm vi khuẩn L monocytogenes

trên thực phẩm khá cao, có những dòng phân lập được có khả năng gây dịch bệnh lớn Tuy rằng

cho đến hiện nay mới chỉ có công bố về một vài trường hợp bệnh nhên bị listeriosis, nhưng nếu không kiểm soát tốt vi khuẩn này trong chuỗi cung cấp thực phẩm thì đây có thể sẽ là nguy cơ lớn về dịch bệnh cho người tiêu dùng

Kết quả đề tài này cũng đã chế tạo thành công bộ kít phân tích phát hiện nhanh L

monocytogenes Bộ kít này cho kết quả phân tích tương đồng với các phương pháp tiêu chuẩn

như TCVN và ISO Thêm nữa bộ kít còn có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp hiện nay đang

sử dụng về giá thành, thời gian phân tích cũng như độ nhạy, độ đặc hiệu Những ưu điểm này sẽ góp phần tích cực vào việc giảm thiểu sự tạp nhiễm loài vi khuẩn nguy hiểm này trong thực phẩm nhằm giảm tổn thất cho nhà sản xuất cũng như người tiêu dùng

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết

Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt

với tỷ lệ tử vong lên đến 30% Bệnh do L monocytogenes gây ra được gọi chung là

listeriosis Đối tượng có nguy cơ bị nhiễm bệnh này thường là những người có hệ thống miễn dịch bị suy yếu như trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người lớn tuổi Nếu không được điều trị kịp thời bằng kháng sinh, bệnh nhân có thể bị nhiễm trùng máu, viêm màng não, sẩy thai và tử vong

Vi khuẩn L monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh Chúng được tìm thấy ở nhiều nơi

như đất, nước, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân người hoặc phân động vật Chúng có thể sống và tăng trưởng chậm ở các điều kiện kh c nghiệt về nhiệt độ, hàm lượng khí oxy, pH và hoạt độ nước Đặc biệt loài vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ lạnh (0-10o

C) Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L monocytogenes

trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm được bảo quản lạnh trong thời gian dài Nhiều loại thực phẩm được bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn Thêm nữa càng ngày người ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản hoặc không bị gia nhiệt để giữ được nguyên vẹn hương vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu Những sản phẩm như vậy thường được bảo quản lạnh trước khi sử dụng Vì vậy, các sản

phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L monocytogenes cao Rất nhiều các vụ ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L monocytogenes trên kh p thế giới đã

được thông báo

Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập được từ các

vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L monocytogenes có khả năng gây

bệnh và gây bùng phát dịch rất lớn, bên cạnh đó cũng có những kiểu huyết thanh hầu như không có khả năng gây bệnh và gây dịch Cho đến thời điểm này chưa có công bố nào về

dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập từ thực phẩm tại Việt Nam Khả năng gây bệnh và gây dịch của L monocytogenes nhiễm trong các thực phẩm tại Việt Nam

vẫn là một ẩn số

Phương pháp ISO 11290-1:1996 phát hiện L monocytogenes là phương pháp nuôi cấy

Một số các phương pháp sinh học phân tử như PCR, real-time PCR hoặc các phương pháp miễn dịch (ELISA) cũng đã được tiêu chuẩn hóa Mấy năm trở lại đây, cùng với sự ra đời của một số k thuật khuếch đại đ ng nhiệt axit nucleic, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh đã được đơn giản hóa thêm một bước LAMP là k thuật khuếch đại đ ng nhiệt được sử dụng phổ biến hơn cả Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trội của phương pháp này, giúp đơn giản hóa và rút ng n thời gian phân tích K thuật này đã nhanh chóng được ứng dụng

để phát hiện L monocytogenes trong thực phẩm ở nhiều nghiên cứu trên thế giới

Ở Việt Nam, phương pháp tiêu chuẩn TCVN: 7700-1:2007 phát hiện Listeria

monocytogenes là phương pháp nuôi cấy, sau đó khuẩn lạc đặc trưng được kh ng định

bằng các phản ứng sinh hóa Đã có một số nghiên cứu về phương pháp PCR và que thử s c

2

ký miễn dịch nhằm phát hiện vi khuẩn này, tuy nhiên thời gian phân tích còn dài hoặc yêu cầu cao về trang thiết bị hóa chất nên chưa đáp ứng được nhu cầu phân tích phát hiện trong thực tế sản xuất

Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi nghiên cứu đề tài có tên là “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam”

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của luận án

 Phân tích được đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L monocytogenes phân

lập được từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam

 Xây dựng được một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L monocytogenes trong các loại

thực phẩm ăn liền dựa trên k thuật LAMP

3 Những đóng góp mới của luận án

 Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L

monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam

 Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển k thuật LAMP cho phát hiện L monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân

1.1 Tổng quan về L monocytogenes

Luận án đề cập đến các vấn đề liên quan đến đặc điểm sinh lý, sinh hóa của loài L

monocytogenes, từ đó cho thấy đây là một loài có khả năng phân bố rộng trong thực phẩm

môi trường Các thống kê cũng cho thấy có rất nhiều các công bố về các vụ gây dịch bệnh

listeriosis do L monocytogenes gây lên có liên quan đến các loại thực phẩm khác nhau

trong đó chủ yếu là các loại thực phẩm có bảo quản lạnh trong thời gian dài Chính vì vậy trong luận án này phần phân lập cũng được tiến hành chủ yếu trên các mẫu thực phẩm có quá trình bảo quản lạnh trước khi sử dụng

1.2 Tổng quan về các phương pháp phân loại dưới loài L monocytogenes

Các phương pháp phân loại dưới loài dựa theo kiểu hình như enzyme hoặc kháng thể thường cho độ phân loại không cao, nên không phù hợp trong các nghiên cứu dịch tễ học

các chủng L monocytogenes gây dịch bệnh Các phương pháp phân loại dưới loài dựa trên

kiểu gen hiện nay khá phổ biến Tuy nhiên kết quả phân loại phụ thuộc rất lớn vào cơ sở

dữ liệu liên quan cho phân tích so sánh MLST là một phương pháp phân loại dưới loài đơn giản và được sử dụng khá phổ biến Cơ sở dữ liệu cho phương pháp MLST khá phong phú Chính vì vậy luận án này sử dụng phương pháp MLST và sơ sở dữ liệu của viện

3

Pasteur Pháp làm công cụ phân tích dịch tễ học các loài L monocytogenes phân lập được

Từ đó đánh giá nguy cơ gây dịch bệnh của loài vi khuân này trên thực phẩm Việt Nam

1.3 Tổng quan về các phương pháp phát hiện L monocytogenes

Hiện nay có khá nhiều các phương pháp được sử dụng trong phân tích phát hiện L

monocytogenes Ngoài các phương pháp tiêu chuẩn như phương pháp nuôi cấy theo ISO

hoặc TCVN còn có các phương pháp nhân gen như real-time PCR hoặc các phương pháp

sử dụng kít miễn dịch được tiêu chuẩn hóa Tuy nhiên các phương pháp hiện nay có thời gian phân tích khá dài hoặc yêu cầu sử dụng các trang thiết bị, hóa chất đ t tiền, nên chưa đáp ứng được yêu cầu của việc kiểm soát loài vi khuẩn nguy hiểm này trong thực tế sản xuất Chính vì vậy Luận án này đặt mục tiêu phát triển phương pháp phân tích nhanh, đơn giản và đạt độ nhạy, độ đặc hiệu cao

Chương II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Môi trường: Môi trường cơ bản cho tăng sinh; môi trường phân lập L monocytogenes

Các cặp mồi cho PCR, real time PCR, LAMP

2.2 Các thiết bị sử dụng chủ yếu

Một số thiết bị sử dụng cho PCR, real-time PCR, điện di, siêu âm, ly tâm, bảo quản lạnh và lạnh đông, nuôi cấy vi sinh vật

2.3 Phương pháp nghiên cứu

 Phân lập L monocytogenes từ mẫu thực phẩm

 Phản ứng PCR khẳng định L monocytogenes và khuếch đại các gen giữ nhà cho giải trình tự

 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh sạch

GeneJETTM PCR Purification (Fermentase) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

 Các phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại

dưới loài MLST và cơ sở dữ liệu của viện Pasteur Pháp ( www.pasteur.fr/mlst)

 Giải trình tự gen: Tiến hành tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc) Mỗi trình tự gen

được giải trình tự 2 chiều

 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4

 Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy của phản ứng LAMP

11290-4

1 2

A B

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân

lập từ một số thực phẩm Việt Nam

3.1.1 Phân lập L monocytogenes từ các mẫu thực phẩm

Trong nghiên cứu này, các mẫu thực phẩm được tăng sinh trên môi trường Half Fraser, những mẫu cho chuyển màu canh trường sang màu đen (bình 1 Hình 3-1 A) được cấy trải

trên môi trường RAPID’L.mono (Biorad) Các mẫu thực phẩm dương tính với L

monocytogenes là những mẫu cho khuẩn lạc có hình thái đặc trưng (Hình 3-1 B) và có ít

nhất một khuẩn lạc nghi ngờ được kh ng định dương tính bằng k thuật PCR với cặp mồi

đặc hiệu LM1-LM2 khuếch đại đoạn gen hlyA có kích thước 702 bp (Hình 3-2)

Hình 3-1 Kết quả phân lập L monocytogenes sử dụng môi trường RAPID’L.mono

A: T ng sinh trong môi trường l ng Half Fraser : mẫu dương t nh giả định môi trường chuyển sang màu đen : mẫu âm t nh môi trường không m t màu

: Hình thái khuẩn lạc L monocytogenes tr n môi trường RAPID’L.mono các khuẩn lạc màu anh đen không c halo màu vàng tương ứng v i các khuẩn lạc nghi ngờ là L monocytogenes

Hình 3-2 Kết quả khẳng định bằng PCR các khuẩn lạc L monocytogenes giả định phân lập được

tr n môi trường RAPID’L.mono

: Mẫu dương t nh , , : a khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu cá hồi , ,7: a khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu c ch v i khuẩn lạc giếng 7 được khẳng định là L monocytogenes , , 0, : n khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu sushi : mẫu âm t nh : thang chuẩn 00 bp O’GeneRuler TM của Fermentas

702 bp

5

Tổng hợp các kết quả phân tích phát hiện L monocytogenes trong các mẫu thực phẩm đã

phân tích từ năm 2011 đến 2015 được trình bày trong Bảng 3-1 sau

Bảng 3-1 Tổng hợp kết quả phát hiện L monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Việt Nam

trong khoảng thời gian từ 0 đến 0

mẫu thực phẩm

Số lƣợng chủng phân lập đƣợc

Tỷ lệ nhiễm (%)

Có tổng số 59 543 mẫu được phát hiện là nhiễm L monocytogenes Trong đó các mẫu thịt

hun khói và xúc xích có tỷ lệ nhiễm cao nhất

3.1.2 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập đƣợc từ

thực phẩm Việt Nam

Kết quả phân lập được 59 chủng L monocytogenes, tuy nhiên trong quá trình giữ giống,

một số chủng phân lập được đã bị chết, những chủng còn lại được tăng sinh, tách chiết DNA và tiến hành phản ứng PCR với các bộ mồi nhân 7 đoạn gen giữ nhà (housekeeping gene) Tinh sạch sản phẩm PCR, giải trình tự gen tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc) Dựa vào trình tự thu được, tra cứu các kiểu trình tự tương ứng với các đoạn gen Tổ hợp các kiểu trình tự của 7 đoạn gen tra cứu được kiểu trình tự (ST), các dòng phức hợp (clone complex - CC) và các dòng giống (ligneage) tương ứng của chủng phân lập

Tra cứu kiểu trình tự từng đoạn gen giữ nhà của 48 chủng L monocytogenes phân lập được

trên ngân hàng dữ liệu được các kiểu trình tự tương ứng của từng gen Tổ hợp kiểu trình tự

7 đoạn gen của từng chủng phân lập là một kiểu trình tự (ST), một dòng phức hợp (CC) và thuộc một dòng giống Từ các kiểu ST này phân loại 48 chủng phân lập được thành 16 nhóm có kiểu ST khác nhau Nối 7 đoạn gen giữ nhà của mỗi nhóm với nhau, so sánh trình

tự 7 đoạn gen của 16 nhóm này với 25 trình tự 7 đoạn gen tương ứng của các chủng đã từng gây dịch bệnh listeriosis trên thế giới Sử dụng phần mềm clustal W thông qua mô

6

hình NJ (Neighber joining) với độ lặp lại (bootstrap) 1000 Xây dựng được cây phân loại như Hình 3-3

Hình 3-3 Cây phân loại các nh m chủng L monocytogenes đã phân lập được từ thực phẩm

Chữ đ : T n các nh m và ký hiệu các chủng, dự đoán kiểu serotype của các chủng L monocytogenes phân lập được từ thực phẩm Việt Nam

Chữ đen: Các chủng L monocytogenes đã từng gây ra các vụ bùng phát dịch bệnh tr n thế gi i đã công b trình tự 7 đoạn gen giữ nhà tr n ngân hàng dữ liệu MLST

Kết quả cho thấy, đã xuất hiện dòng L monocytogenes (chủng ký hiệu M49 phân lập từ

thịt ba rọi xông khói) có trình tự các gen cấu trúc giống hệt các chủng có tần suất cao gây các vụ dịch lớn trên thế giới Nhóm 1 chiếm 17 48 chủng có trình tự 7 đoạn gen giống hệt với trình tự các đoạn gen tương ứng của một số chủng gây ra vụ thai lưu năm 2005 tại Nga, vụ dịch tại Italia năm 1997 Và gần giống trình tự các đoạn gen tương ứng từ chủng phân lập từ vụ dịch tại Pháp năm 1993 Đa số các chủng còn lại, trình tự gen giống các chủng phân lập từ thực phẩm và gần giống các trình tự phân lập từ người hoặc gây ra các

vụ dịch nhỏ trên thế giới

3.2 Xây dựng quy trình phân tích nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm

dựa trên kỹ thuật LAMP

3.2.1 Xây dựng phản ứng LAMP

3.2.1.1 Thiết kế mồi LAMP khuếch đại gen inlJ

7

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng trình tự gen inlJ của chủng chuẩn L

monocytogenes EGD-e có số hiệu emb|AL591984.1 cho thiết kế mồi LAMP Kiểm tra độ

tương đồng của trình tự gen inlJ đưa vào thiết kế mồi so với các trình tự gen trên ngân hàng gen bằng phần mềm BlastN, cho thấy trình tự gen inlJ sử dụng cho thiết kế mồi LAMP của chủng này có độ tương đồng khá cao với trình tự gen inlJ với các chủng L monocytogenes đã được

công bố trên ngân hàng gen NCBI Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4 để thiết kế mồi Lựa chọn các bộ mồi theo một số tiêu chí chính đã được khuyến cáo trong hướng dẫn sử dụng phần mềm [https://primerexplorer.jp/e/v4_manual/pdf/PrimerExplorerV4_Manual_1.pdf] Đã lựa chọn được 8 bộ mồi như bảng 3-2

Bảng 3 -2 Trình tự các bộ mồi LAMP được thiết kế để khuếch đại gen inlJ

3.2.1.2 Lựa ch n bộ mồi LAMP cho độ nhạy khuếch đại cao nh t

Thực hiện các phản ứng LAMP với từng bộ mồi và sử dụng DNA khuôn là DNA tổng số

tinh khiết của L monocytogenes EGD-e với lượng là 20, 2, 0,2 và 0 pg phản ứng Sau đó,

điện di 10 l sản phẩm trên gel agarose Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-4

8

Hình 3-4 Kết quả sàng l c các bộ mồi LAMP dựa tr n khả n ng khuếch đại DNA của L

monocytogenes

Trong đ : , , , : DNA chuẩn GeneRuler TM 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific)

, , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

, 7, , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

0, , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

, , 7, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

, 0, , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

, , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

7, , , 0: Sản phẩm LAMP v i bộ mồi 7 lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

, , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

Từ kết quả này, chúng tôi quyết định chọn bộ mồi 8 cho các nghiên cứu tối ưu hóa tiếp theo

Phân tích tính phù hợp của mồi 8 cho thấy các mồi đều phù hợp tiêu chí thiết kế về khoảng cách giữa các mồi, chiều dài mồi

Để tìm các vị trí có thể biến đổi trong loài của trình tự nucleotit trên gen, chúng tôi tiến

hành so sánh trình tự mồi với các trình tự gen inlJ trên ngân hàng GenBank của NCBI

bằng chương trình ClustalW và BlastN Tại những vị trí biến đổi, nucleotit biến đổi được thay thế bằng nuceotit suy biến Kết quả chạy kiểm tra các mồi được trình bày cụ thể trong

Bảng 3-3

Bảng 3-3 Kết quả kiểm tra các điểm sai khác của bộ mồi LAMP v i các trình tự gen inlJ tr n

ngân hàng gen NCBI

Từ kết quả này, chúng tôi đã lựa chọn điều kiện nhiệt độ ủ 65 oC với nồng độ betain là 0,9

M (giếng 13) cho các thí nghiệm tiếp theo

Hình 3-5 nh hư ng của nhiệt độ ủ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP

Trong đ :

: DNA chuẩn GeneRuler TM DNA Ladder (Thermo Scientific)

, : Sản phẩm LAMP o C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, : Sản phẩm LAMP o C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, 7: Sản phẩm LAMP o C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, : Sản phẩm LAMP o C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

0, : Sản phẩm LAMP o C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, : Sản phẩm LAMP o

C, 0,9 M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP o C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, 7: Sản phẩm LAMP o C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, : Sản phẩm LAMP o C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

Ảnh hƣ ng của th i gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP

Thử nghiệm phản ứng LAMP với lượng DNA khuôn của L monocytogenes là 0 và 0,2

pg phản ứng; thời gian ủ là 45, 60, 75 phút Sau đó, điện di 3 l lượng sản phẩm LAMP trên gel agarose Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-6 dưới đây:

Hình 3-6 nh hư ng của thời gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP

Trong đ :

: DNA chuẩn GeneRuler TM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific);

: Sản phẩm LAMP sau 7 ph t lượng DNA khuôn của L monocytogenes là 0 pg phản ứng

, , : Sản phẩm LAMP v i lượng DNA khuôn là 0, pg phản ứng, thời gian ủ l n lượt là , 0, 7 ph t

10

Kết quả cho thấy kết quả khuếch đại thực sự bão hòa sau 60 phút phản ứng (đường chạy số 4) Do vậy, chúng tôi lựa chọn thời gian ủ là 60 phút cho phản ứng LAMP ở điều kiện tối

ưu là 65oC và nồng độ betain là 0,9 M

3.2.1.4 Kiểm tra độ đặc hiệu, độ bao trùm của phản ứng LAMP

Xác định tính bao trùm của phản ứng với một tập hợp 16 chủng L monocytogenes Kết quả

điện di sản phẩm LAMP (Hình 3-7) cho thấy độ bao trùm của phản ứng LAMP với DNA

của các chủng thuộc loài L monocytogenes là 100%

Hình 3-7 ộ bao trùm của phản ứng LAMP v i các chủng L monocytogenes

Trong đ :

: Thang chuẩn GeneRuler TM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific);

: Mẫu kiểm chứng âm t nh

, , , và 7: Sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L monocytogenes ATCC

19117, L monocytogenes EGD-e, L monocytogenes LO28; L monocytogenes CIP7835; L monocytogenes DSM20750;

đến : sản phẩm LAMP v i DNA khuôn của các chủng L monocytogenes được phân lập từ thực phẩm

Hình 3-8 ộ ch n l c của phản ứng LAMP v i các loài Listeria khác và các vi khuẩn thường

nhi m tạp trong thực phẩm

Trong đ :

: thang chuẩn GeneRuler TM DNA Ladder Mi Thermo Scientific : âm t nh

, , , và 7: sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L monocytogenes ATCC

19117, L monocytogenes EGD-e, L monocytogenes LO28; L monocytogenes CIP7835; L monocytogenes DSM20750

đến : sản phẩm LAMP v i 0 ng DNA khuôn của l n lượt các chủng L innocua ATCC 0 L seeligeri ATCC 35967; L welshimeri ATCC 35897; L grayi ATCC 19120; L ivanovii ATCC 19119; Escherichia coli B41; Salmonella 9R12G2; Bacillus cereus H3081.97; B subtilis 353B

Xác định tính chọn lọc của phản ứng LAMP với các loài Listeria khác và các loại vi khuẩn thường nhiễm tạp trong thực phẩm như Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus, B

subtilis Kết quả điện di (Hình 3-8) cho thấy phản ứng LAMP có độ đặc hiệu đạt 100%

trên tập hợp các chủng thử nghiệm

3.2.1.5 ộ nhạy phản ứng LAMP

Tiến hành phản ứng LAMP ở các nồng độ DNA khác nhau Kết quả cho thấy ngư ng phát hiện của phản ứng LAMP là 50 fg/phản ứng tương đương với khoảng 16 tế bào phản ứng (Hình 3-9)

: Thang chuẩn GeneRulerTM kb DNA Ladder Thermo Scientific

Hình 3-10 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu v i HN

3.2.1.6 So sánh độ nhạy bộ mồi LAMP thiết kế v i các bộ mồi LAMP đã công b

Tiến hành phản ứng LAMP với 4 bộ mồi, 1 bộ mồi LAMP đã thiết kế được với 3 bộ mồi tham chiếu đã được công bố trình tự Kết quả thể hiện trên Hình 3-10

12

Hình 3-11 So sánh độ nhạy của phản ứng LAMP phát triển trong nghiên cứu này v i các

phương pháp LAMP phát hiện L monocytogenes đã được công b

Trong đ : -): mẫu âm tính; (+): mẫu dương t nh

1: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10 -7 dung dịch DNA ban đ u

2: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10 -6 dung dịch DNA ban đ u

3: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10 -5 dung dịch DNA ban đ u

4: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10 -4 dung dịch DNA ban đ u

L: DNA ladder (Sangon Biotech)

A: Phản ứng LAMP v i mồi iap

B: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA

C: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA

D: Phản ứng LAMP v i bộ mồi LAMP inlJ trong nghiên cứu này

Kết quả trên cho thấy bộ mồi LAMP của gen inlJ trong nghiên cứu này cho độ nhạy tốt

nhất (kết quả dương tính ở độ pha loãng DNA là 10-6)

3.2.2 Xây dựng quy trình tăng sinh

3.2.2.1 nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự sinh trư ng L monocytogenes

Tăng sinh mẫu xúc xích hun khói trong các môi trường cơ bản khác nhau Sau 16 giờ

nuôi, thu sinh khối, tách chiết DNA cho phản ứng real-time PCR Đánh giá khả năng tăng

sinh dựa trên giá trị chu kỳ ngư ng (Ct) của phản ứng real-time PCR, kết quả được thể

hiện trên Bảng 3-4 sau:

Bảng 3-4 nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự t ng sinh của L monocytogenes trong

canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm

có kháng sinh

BLEB

có kháng sinh

BLEB không

có kháng sinh

Half fraser

có kháng sinh

UVM không

có kháng sinh

LEB

có kháng sinh

LEB không

có kháng sinh

13

Kết quả cũng cho thấy môi trường HF và BLEB cho giá trị Ct thấp nhất và gần ngang nhau Trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành tăng sinh mẫu xúc xích trên môi trường BLEB với nồng độ kháng sinh như ở môi trường Half Fraser (acriflavin và nalidixic acid lần lượt là 12,5 mg l và 10 mg l) trong 12 giờ, được kết quả như Bảng 3-5

Bảng 3-5 nh hư ng của hai loại môi trường cơ bản LE và HF đến sự sự t ng sinh của L

monocytogenes trong canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm

Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men

Hình 3-12 nh hư ng của nồng độ cao n m men đến sự sinh trư ng của L monocytogenes

trong môi trường LE canh trường thu n

Tăng sinh với lượng giống ban đầu 3 x 104 CFU ml Sau 4 giờ nuôi, đo độ đục canh trường ở bước sóng 600 nm

Từ kết quả Hình 3-13, nồng độ cao nấm men 6 g l được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo

Ảnh hưởng của nồng độ pyruvate đến sinh trưởng phát triển của L monocytogenes

Nhiễm chủ động L monocytogenes vào môi trường BLEB có bổ sung pyruvate với

nồng độ từ 0,6 đến 1,6 g l với mật độ nhiễm là 2,7 x 102

CFU ml, sau 3 giờ nuôi, lấy canh trường đo độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 600 nm Kết quả cho thấy mật độ vi khuẩn đạt cao nhất là tại giá trị nồng độ pyruvate đạt 1,2 và 1,4 g l Qua thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn nồng độ pyruvate cần bổ sung vào môi trường BLEB là 1,2 g l

3.2.2.3 nh hư ng của nalidi ic acid và acriflavin đến sự sinh trư ng của L

monocytogenes

Vi khuẩn được nuôi trong những môi trường có nồng độ kháng sinh khác nhau, sau 4 giờ, xác định giá trị OD 600 nm thu được kết quả như Hình 3-14 sau:

14

Hình 3-13 nh hư ng của nồng độ acriflavin và axít nalidi ic đến sự sinh trư ng của L

monocytogenes trong môi trường LE canh trường thu n Khi nồng độ hai loại kháng sinh trên giảm xuống 5 mg l, thì sự sinh trưởng của L

monocytogenes là tương đương với mẫu không có kháng sinh (sự sai khác không có ý

nghĩa) Do vậy, trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành xem xét khả năng ức chế của các kháng sinh ở nồng độ thấp

3.2.2.4 nh hư ng của kháng sinh đến sự sinh trư ng của một s loài vi khuẩn khác

Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng của acriflavin và acid nalidixic lên ba loài vi khuẩn

E coli, Staphylococcus aureus và Lactobacillus plantarum ở 3 nồng độ 2,5; 5 và 10 mg l

trong môi trường BLEB đã được nghiên cứu Kết quả cho thấy, với nồng độ kháng sinh 5

mg l cho khả năng ức chế tốt trên cả 3 loài vi khuẩn nghiên cứu Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn nồng độ 2 loại kháng sinh acriflavin và acid nalidixic đều là 5 mg l

Bảng 3-6 nh hư ng của nồng độ kháng sinh đến sự sinh trư ng của một s loài vi sinh vật chỉ

thị trong môi trường LE canh trường thu n

Loài vi khuẩn Th i gian tăng sinh (gi ) 0 3 5 7

E coli

Không kháng sinh 0,116 0,373 0,653 0,655 Acriflavin (2,5 mg/l) 0,116 0,105 0,096 0,231 Acriflavin (5 mg/l) 0,124 0,144 0,138 0,138 Acriflavin (10 mg/l) 0,115 0,105 0,103 0,087 Nadilixic (2,5 mg/l) 0,122 0,142 0,104 0,123 Nadilixic (5 mg/l) 0,112 0,114 0,09 0,083 Nadilixic (10 mg/l) 0,121 0,134 0,071 0,109

Staphylococcus

aureus

Không kháng sinh 0,031 0,596 2,357 4,5 Acriflavin (2,5 mg/l) 0,03 0,039 0,034 0,045 Acriflavin (5 mg/l) 0,039 0,041 0,037 0,047 Acriflavin (10 mg/l) 0,033 0,031 0,03 0,047 Nadilixic (2,5 mg/l) 0,024 0,035 0,036 0,038 Nadilixic (5 mg/l) 0,025 0,042 0,036 0,037 Nadilixic (10 mg/l) 0,025 0,036 0,036 0,047

15

Acriflavin (5 mg/l) 0,134 ND 0,114 0,147 Acriflavin (10 mg/l) 0,137 ND 0,162 0,131 Nadilixic (2,5 mg/l) 0,118 ND 0,541 0,943 Nadilixic (5 mg/l) 0,117 ND 0,142 0,055 Nadilixic (10 mg/l) 0,123 ND 0,138 0,052

ND: Không xác định

3.2.2.5 Thử nghiệm t ng sinh tr n mẫu thực phẩm

Mẫu xúc xích hun khói được đồng hóa trong môi trường BLED, bổ sung 2 loại kháng sinh là acriflavin và acid nalidixic với nồng độ mỗi loại là 5 mg l và 10 mg l Nhiễm chủ động với mật độ 10 CFU bình có chứa 100 ml hỗn dịch đồng hóa Sau 12 giờ tăng sinh, lấy 1 ml canh trường tăng sinh tiến hành tách chiết DNA cho phản ứng realtime PCR Kết quả thể hiện trên Bảng 3-7

Bảng 3-7 nh hư ng của nồng độ acriflavin và axít nalidixic đến sự t ng sinh của L monocytogenes

trong môi trường LE c bổ sung cao n m men, pyruvate và v i sự hiện diện của hệ vi sinh vật trong

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Kết quả trên thêm một lần nữa kh ng định ở nồng độ kháng sinh 5 mg l cho khả năng

tăng sinh L monocytogenes tốt hơn so với nồng độ kháng sinh 10 mg l

3.2.3 Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA

Tro g ội du g ày á phươ g pháp tá h hiết đượ đá h giá thô g qu giá trị

Ct ủ phả ứ g re l-time PCR, giá trị Ct à g hỏ hiệu suất tá h hiết à g lớ

3.2.3.1 Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L monocytogenes khi sử dụng triton X 00 kết

hợp si u âm và gia nhiệt o

C

Mỗi thí nghiệm được tiến hành tách chiết với các lượng sinh khối tế bào như nhau Lần lượt thay đổi từng yếu tố: Nồng độ triton X100 trong đệm chiết (0,6% đến 2,4%), thời gian gia nhiệt ở 95 °C (2-15 phút); thời gian siêu âm (0-4 phút), ly tâm thu dịch nổi có chứa DNA cho phản ứng Real-time PCR Kết quả được trình bày trong các bảng sau

Bảng 3-8 nh hư ng của nồng độ Triton X 00 đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L

16

Bảng 3-9 nh hư ng của thời gian ử lý nhiệt đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L

monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X 00

Th i gian xử lý

nhiệt (phút)

Ct 15,92± 0,51 15,56 ± 1,04 15,61 ± 1,12 15,73 ± 0,75

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Bảng 3-10 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L

monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X 00

Th i gian siêu âm

(phút)

Không siêu âm

0,63

18,35 ± 1,01

17,74 ± 0,81

15,72 ± 0,53

16,23 ± 0,22

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Kết quả ở các bảng trên điều kiện tách chiết được chọn là nồng độ triton X100 là 1,2%; gia nhiệt 95o

C trong 5 phút siêu âm 2 phút

3.2.3.2 Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L monocytogenes khi sử dụng NaOH kết hợp

si u âm và gia nhiệt o

C

Mỗi thí nghiệm được tiến hành tách chiết với các lượng sinh khối tế bào như nhau Lần lượt thay đổi từng yếu tố: thời gian gia nhiệt ở 95 °C (5-20 phút); nồng độ NaOH (10mM -200mM), thời gian siêu âm (0-4 phút), ly tâm thu dịch nổi có chứa DNA cho phản ứng Real-time PCR Kết quả được trình bày trong các bảng sau

Bảng 3-11 nh hư ng của thời gian ử lý nhiệt đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L

monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH

Ct 21,53 ± 1,12 21,86 ± 0,45 21,13 ± 1,21 21,89 ± 1,04

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Bảng 3-12 nh hư ng của nồng độ NaOH đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L

21,86 ± 0,73

20,65±

0,52

20,79 ± 0,91

20,37 ± 0,85

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

17

Bảng 3-13 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L

monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH

± 1,12

19,46 ± 0,71

17,72 ± 1,04

16,35 ± 0,54

16,81 ± 0,84

18,93

± 0,97 Kết quả ở các bảng trên điều kiện tách chiết được chọn là nồng độ NaOH là 100 mM;

gia nhiệt 95o

C trong 5 phút siêu âm 2 phút,

3.2.3.3 So sánh các phương pháp tách chiết nghi n cứu đ i v i canh trường L

monocytogenes thu n không c mẫu thực phẩm

Dùng 3 phương pháp tách chiết DNA (2 phương pháp sử dụng NaOH và Triton X100 đã

tối ưu ở trên và 1 phương pháp sử dụng kít tách chiết thương mại GeneJET Genomic DNA

Purification Kit) Mỗi phương pháp tách chiết thực hiện trên 3 mẫu Thực hiện phản ứng

real-time PCR với DNA thu được từ 3 phương pháp tách chiết trên Kết quả trình bày ở

Hình 3-15

Hình 3-14 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường thu n của

các quy trình sử dụng NaOH, Triton X 00 và sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA

Purification Kit

Kết quả cho thấy trong canh trường thuần khả năng tách chiết DNA của 3 phương pháp

trên không chênh lệch nhau nhiều, Ct hơn kém nhau khoảng 1 chu kỳ

3.2.3.4 ánh giá hiệu quả tách chiết DNA của các phương pháp đ i v i mẫu thực phẩm

t ng sinh

Thí nghiệm được thực hiện với mẫu xúc xích được nhiễm chủ động, tách chiết theo 4

phương pháp tách chiết DNA(3 phương pháp tách chiết ở trên và phương pháp tách chiết

thông thường có sử dụng dung môi hữu cơ) thực hiện phản ứng Real-time PCR Kết quả

trình bày tại Hình 3-16 sau

Hình 3-15 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường t ng sinh

mẫu c ch khi sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X 00, sinh phẩm thương mại GeneJET

Genomic DNA Purification Kit và quy trình tách chiết thông thường

Kết quả phân tích cho thấy khả năng tách chiết DNA từ mẫu xúc xích bằng phương pháp sử dụng kít cho kết quả tách chiết tốt nhất Hai phương pháp sử dụng NaOH và phương pháp sử dụng Triton X100 cho kết quả tách chiết tương đương nhau Phương pháp tách chiết DNA thông thường làm sạch DNA rất tốt, tuy vậy qúa trình tách chiết khá phực tạp mất nhiều thời gian và sử dụng nhiều dung môi độc hại, không phù hợp cho phân tích trong thực tế khi số mẫu lớn

Kết quả này cho thấy nếu mật độ vi khuẩn đích không đủ (tăng sinh ng n, mật độ ban đầu thấp), phản ứng nhân gen yêu cầu DNA có độ tinh sạch cao (real-time PCR) thì cần sử dụng phương pháp tách chiết DNA có công đoạn làm sạch tốt như phương pháp kít hoặc phương pháp thông thường để đảm bảo kết quả phân tích không bị âm tính giả Ngược lại nếu mật độ vi khuẩn đích đủ lớn cho phản ứng nhân gen và thêm nữa có những phản ứng nhân gen yêu cầu DNA với độ tinh sạch không quá cao (LAMP) thì có thể sử dụng phương pháp tách chiết đơn giản (NaOH hoặc Triton X100) cho đơn giản mà vẫn hiệu quả

Trong nghiên cứu sử dụng bi từ g n kháng thể để cô đặc và làm sạch vi khuẩn sau giai

đoạn tăng sinh Tuy nhiên hiệu quả làm sạch và cô đặc L monocytogenes từ mẫu thực

phẩm sau tăng sinh cho hiệu quả không cao, nên kết quả cụ thể không được trình bày trong phần kết quả của luận án này Tuy nhiên trong thí nghiệm rửa giải vi khuẩn khỏi hạt từ và tách chiết DNA từ vi khuẩn thu được, kết quả cho thấy sử dụng đệm glycine-tris pH 8,3 theo khuyến cáo của nhà cung cấp hạt từ (Gencrip) cho khả năng tách chiết DNA tốt hơn

so với NaOH 100 mM Chính vì vậy trong thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành so sánh khả năng tách chiết DNA từ canh trường tăng sinh mẫu xúc xích hun khói theo 2 phương pháp: sử dụng Triton X100 1,2 % với điều kiện đã được tối ưu ở trên và sử dụng đệm glycine-Tris 100 mM pH 8,3 với điều kiện tương tự DNA sử dụng cho phản ứng real-time PCR Kết quả thể hiện trên Hình 3-17

19

Hình 3-16 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường t ng

sinh mẫu c ch khi sử dụng quy trình tách chiết bằng đệm Glycine-Tris pH 8,3 và Triton

X 100

Từ kết quả trên phương pháp tách chiết được lựa chọn trong nghiên cứu này là sử dụng đệm glycine 100 mM, pH 8,3 gia nhiệt 95 o

C trong 5 phút, siêu âm 2 phút

3.2.3.5 nh hư ng của lượng mẫu l y tách chiết DNA cho phản ứng LAMP

Nhiễm chủ động lượng tế bào vi khuẩn 6 CFU/25 g, tăng sinh 12 giờ, tách chiết DNA cho phản ứng real-time PCR và LAMP Kết quả thể hiện ở Bảng 3-14 sau:

Bảng Error! No text of specified style in document.-14 nh hư ng của thể t ch mẫu canh

trường t ng sinh được sử dụng đến khả n ng phát hiện L monocytogenes bằng kỹ thuật LAMP và

Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn thể tích mẫu lấy đi phân tích là 10 ml

3.2.3.6 Thử nghiệm phản ứng LAMP tr n các nền mẫu khác nhau

Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng 3 loại mẫu, nhiễm chủ động, tăng sinh 10, 12, 14 giờ, lấy mẫu cho tách chiết thu DNA cho phản ứng LAMP Kết quả thể hiện trên Hình 3-

19

20

Hình 3-17 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh và nền mẫu đến khả năng phát hiện L

monocytogenes dựa trên kỹ thuật LAMP khuếch đại gen inlJ

Trong đ :

(- Mẫu âm t nh phản ứng LAMP

, , : L n lượt là mẫu c ch, mẫu mayonair và mẫu sữa không nhi m L monocytogenes

, , : L n lượt là mẫu c ch nhi m chủ động CFU g, t ng sinh 0, , giờ 7, , : l n lượt là mẫu

c ch nhi m chủ động CFU g, t ng sinh 0, , giờ

0, : L n lượt là mẫu mayonair nhi m chủ động CFU g, t ng sinh , giờ

, : L n lượt là mẫu sữa nhi m chủ động CFU g, t ng sinh , giờ

Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn thời gian tăng sinh cho mẫu thịt là ≥ 10 giờ, cho mẫu sữa và mayonair là ≥ 12 giờ

3.2.4 Đề xuất quy trình phân tích

Từ những kết quả thu được ở trên chúng tôi đề xuất quy trình phân tích L monocytogenes

dựa trên phản ứng LAMP như sau:

Hình 3-18 Sơ đồ quy trình phát hiện nhanh L monocytogenes được phát triển trong nghi n cứu này

Lấy mẫu tách chiết DNA (ly tâm 10.000 g/3 phút, gia nhiệt 95 o C/5

phút, siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g/2 phút)

Thực hiện phản ứng LAMP 65 o C/40-60 phút; 80 o C/5

phút

Đọc kết quả Tăng sinh chọn lọc

37 o C/12 gi

21

Tăng sinh chọn lọc:

Cân 25 g thực phẩm cần phân tích, đồng hóa với 225 ml môi trường tăng sinh đã vô trùng (môi trường BLEB có thành phần: 17 g/l casein enzymic hydrolysate; 3 g/l papaic digest of soyabean meal; 5 g/l NaCl; 2,5 g/l K2HPO4, 2,5 g l dextrose; 6 g l cao nấm men;1,35 g l

KH2PO4; 9,6 g/l Na2HPO4; pyruvate 1,2 g l, nalidixic và acriflavin đều là 5 mg l) pH (tại 25°C) = 7,3 Các hóa chất của hãng Himedia (hoặc tương đương trở lên) Ủ ở 37 o

C trong

12 giờ

Lấy mẫu tách chiết DNA

Lấy 10 ml canh trường tăng sinh chuyển sang 1 ống falcon 15 ml sạch, ly tâm thu sinh khối ở tốc độ 10.000 g 3 phút, chuyển sang 1 ống eppendorf 1,5 ml Rửa lần 1 bổ sung 1

ml nước deion, trộn đều, ly tâm 10.000 g 3 phút, loại bỏ dịch nổi thu sinh khối, rửa lần 2

tương tự lần 1 Bổ sung 100 l đệm chiết (đệm glycine 100 mM, pH 8,3), trộn đều, phá v

tế bào ở 95 oC 5 phút; siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g 2 phút thu dịch nổi chứa DNA cho phản ứng LAMP Hóa chất yêu cầu ở mức tinh khiết và phù hợp cho sinh học phân tử

°C trong thời gian 40-60 phút Dừng phản ứng bằng ủ ở 80 °C trong 5 phút Song song

thực hiện 1 mẫu dương tính (thay DNA mẫu bằng DNA tách chiết từ L monocytogenes

EGD-e với nồng độ bản sao l), 1 mẫu âm tính phản ứng LAMP (thay DNA từ mẫu bằng nước cất) Các hóa chất yêu cầu ở mức tinh khiết và phù hợp cho sinh học phân tử

Đọc kết quả:

Sau phản ứng LAMP, quan sát màu dung dịch phản ứng, mẫu chuyển dung dịch phản ứng

từ màu xanh tím than sang màu xanh da trời là mẫu dương tính (Hình 3-10)

3.2.5 n n n n

Để xác định độ nhạy toàn bộ quy trình phân tích, chúng tôi nhiễm mẫu ở các mật độ khác nhau dao động trong khoảng xấp xỉ 1-10 CFU/ 25 g mẫu bình 225 ml môi trường Tăng

sinh 12 giờ lấy mẫu xác định sự có mặt của L monocytogenes Xác định mật độ chính xác

đã nhiễm vào mẫu bằng hậu kiểm canh trường giống đã sử dụng để nhiễm mẫu bằng

phương pháp trải trên đĩa môi trường O.A Listeria, sau đó quy ngược lại ra mật độ nhiễm ban đầu Sau tăng sinh 12 giờ, lấy mẫu xác định sự có mặt của L monocytogenes bằng

phương pháp LAMP và cấy trải đĩa sau đó lấy khuẩn lạc đặc trưng chạy real-time PCR Những mẫu dương tính với phản ứng real-time PCR mới được coi là mẫu đã được nhiễm Kết quả thí nghiệm này được trình bày ở bảng sau:

Thành ph n cho t ng sinh LAMP-L’MONO – M)

Gồm 10 túi mỗi túi chứa 10,83 g môi trường BLEB

Thành ph n cho tách chiết DNA và phản ứng LAMP LAMP-L’MONO – D)

- Dung dịch số 1: Đệm Glycine 0,1 M, pH 8,3 Thể tích 2 x 1,5 ml

- Dung dịch A: 33,33 mM Tris-HCl; 16,66 mM KCl; 13,33 mM MgSO4; 0,16 %

Triton X-100; 1,66 mM dNTP, 2 M betain, 2,66 M các mồi FIP và BIP; 0,33 µM các mồi F3 và B3; 200 µM HNB Thể tích 12 l, số lượng 10 ống eppendorf 0,5

ml

- Dung dịch B: Bst 120 U (1 ống x 15 l)

- Dung dịch C: Nước (ultrapure, DNAse, RNAse free) (1 ống x 50 µl)

- Dung dịch D: Kiểm chứng dương tính: 20 l dung dịch DNA Listeria

monocytogenes với nồng độ 1000 bản sao l

3.2.5.2 iều kiện bảo quản bộ sinh phẩm

Bộ sinh phẩm được thiết kế gồm 2 phần riêng biệt là phần môi trường tăng sinh L’MONO – M) được bảo quản ở 4 oC, và phần các loại hóa chất cho tách chiết và phản

(LAMP-ứng LAMP (LAMP-L’MONO – D) được bảo quản ở điều kiện - 20 o

C Theo các hướng dẫn sử dụng và bảo quản các hóa chất ở thể chưa trộn lẫn thành hỗn hợp thì các hoá chất cho phản ứng LAMP và tách chiết DNA hoàn toàn bền ở nhiệt độ - 20 o

C

3.2.5.3 Sản u t thử nghiệm bộ sinh phẩm

Bộ sinh phẩm được sản xuất thử nghiệm quy mô phòng thí nghiệm

3.2.6 Kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO

Bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO được kiểm định tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh

thực phẩm trên 30 mẫu thực phẩm nhiễm chủ động từ 5-250 CFU/25 g Xác định sự có mặt

của L monocytogenes theo 2 phương pháp ISO 11290-1 : 1996 (thay đổi lần 1:2004) và

phương pháp sử dụng bộ kít LAMP-L’MONO Kết quả kiểm định cho thấy chỉ sai khác

duy nhất một mẫu được nhiễm ở mật độ 5 CFU 25 g thực phẩm cho kết quả dương tính với

Độ nhạy tương đối: SE= PA *100 (PA+PD) = 27 *100 (27+1) = 96,43 %

Độ đặc hiệu tương đối: SP = NA*100 (ND+NA) = 2*100 (0+2) = 100 %

Tỷ lệ dương tính giả PN = ND * 100/(PA+NA+PD) = 0 %

3.2.7 Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm

Bộ sinh phẩm được ứng dụng sử dụng tại Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội Thử nghiệm phân tích trên 30 mẫu thực phẩm lấy trên thị trường Hà Nội Sử dụng 3 phương pháp phân tích song song, phương pháp sử dụng bộ sinh phẩm của đề tài, phương pháp PCR với cặp

mồi hlyA 177 nhân đặc hiệu đoạn gen hlyA có kích thước 112 bp, và phương pháp nuôi

1 Đã phân lập được 59 chủng L monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với

tỷ lệ nhiễm chung là 10,87 % Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất là xúc xich và thịt hun khói c t lát

2 Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập được cho thấy:

48 chủng L monocytogenes phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và

lineage II có 8 chủng Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn lineage

II Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV và 1 chủng thuộc ECI có nguy cơ gây bùng phát dịch bệnh cao 48 chủng có tất cả 16 ST trong đó có ST1 đặc biệt nguy hiểm vì ST1 đã từng gây ra nhiều vụ bùng phát dịch lớn trên thế giới

3 Đã thiết kế được phản ứng LAMP cho phát hiện nhanh L monocytogenes, bao gồm: thiết kế bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ, điều kiện tối ưu cho phản ứng LAMP

là nhiệt độ 65oC, thời gian 40-60 phút, nồng độ betain 0,9 M

4 Đã tối ưu được quy trình phân tích trực tiếp L monocytogenes từ thực phẩm dựa

trên phản ứng LAMP, bao gồm: tăng sinh mẫu trong môi trường BLEB ở 37oC, tốc độ l c

150 vòng/phút trong thời gian 10 giờ cho sản phẩm thịt và 12 giờ cho sản phẩm sữa và mayonair; cải tiến phương pháp tách chiết nhanh thu DNA từ canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm Quy trình phân tích đạt độ nhạy 1 CFU/25 g với tổng thời gian phân tích 12-14 giờ

5 Đã thiết kế và chế tạo thành công bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện nhanh

Listeria monocytogenes trong thực phẩm Bộ sinh phẩm được kiểm định cho kết quả có độ

24

tương đồng cao với các phương pháp truyền thống theo ISO 11290-1: 1996 và TCVN 7700-1:2007

Kiến nghị:

Do đây mới chỉ là các nghiên cứu bước đầu về dịch tễ học phân tử các chủng L

monocytogenes tại Việt Nam nên số lượng chủng phân lập được chưa nhiều Thiếu các

chủng phân lập từ người và từ các vụ dịch bệnh listeriosis cũng như các chủng phân lập từ môi trường nhà máy hoặc nguyên liệu sản xuất thực phẩm Cần có các nghiên cứu tiếp theo

bổ sung các mảng còn thiếu trên để có thể có một bức tranh hoàn thiện về tình hình dịch tễ

các chủng L monocytogenes đang lưu hành tại Việt Nam và các phán đoán về các mối liên

quan giữa môi trường sản xuất, sản phẩm thực phẩm và người bệnh về loài vi khuẩn này,

từ đó có các biện pháp thích hợp trong phòng ngừa và hạn chế tối đa dịch bệnh listeriosis Đối với bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO, số lượng mẫu thử nghiệm chưa nhiều, chủng loại mẫu chưa đa dạng, còn cần có các nghiên cứu tiếp theo để phát triển tiếp các kết quả đã đạt được của nghiên cứu này, bao gồm:

- Thử nghiệm sản xuất chế phẩm dưới dạng bột đông khô

- Nghiên cứu thời gian bảo quản bộ sinh phẩm

- Phát triển mẫu nội chuẩn

Từ đó có thể đưa phương pháp này thành một phương pháp thay thế các phương pháp nuôi cấy tốn nhiều thời gian và nhân công, nhằm góp phần kiểm soát sự nhiễm tạp loài vi khuẩn nguy hiểm này dễ dàng hơn

1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu, kết quả, hình ảnh nêu trong Luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất

cứ công trình của tác giả nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

TM tập thể Giáo viên hướng dẫn Nghiên cứu sinh

Phùng Thị Thủy

2

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa và PGS.TS Tô Kim Anh, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để tôi hoàn thiện Luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, đồng nghiệp của tôi trong Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình nghiên cứu luận án và trong cuộc sống hàng ngày Xin chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Thành Trung, Viện Kiểm nghiệm an toàn thực phẩm đã giúp đỡ tôi khi tôi thực hiện một phần luận án tại Viện Xin chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Thành Đông, Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội đã giúp đỡ tôi khi tôi thực hiện một phần luận án tại Trung tâm

Xin cảm ơn Sở KHCN HN đã cấp một phần kinh phí cho tôi thực hiện đề tài này thông qua đề tài cấp sở mã số 01C-06/04-2013-2

Xin cảm ơn KS Hà Thị Xuyên, KS Nguyễn Thu Hiền Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử Viện Công nghệ Sinh học thực phẩm đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu Luận án tại Viện

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng cấp Bộ môn và Hội đồng cấp cơ sở đã cho tôi những góp ý quý báu để hoàn thiện bản luận án này

Để hoàn thiện Luận án này tôi không thể không nói lời cảm ơn chân thành nhất đến bạn bè, người thân, gia đình đã luôn động viên và dành thời gian cho tôi thực hiện nghiên cứu này

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Phùng Thị Thủy

1.1.3 Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L monocytogenes 23

1.1.4 Quy định kiểm soát L monocytogenes 24

1.2 Dịch tễ học phân tử của L monocytogenes 25

1.2.1 Đặc điểm dịch tễ các dòng giống (lineage) L monocytogenes 25

1.2.2 Đặc điểm dịch tễ các dòng phức hợp (clones complex) L monocytogenes 25

1.2.3 Đặc điểm dịch tễ các kiểu huyết thanh L monocytogenes 26

1.2.4 Các phương pháp phân loại sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử 27

1.2.4.1 Phương pháp điện di xung trường (PFGE) 27 1.2.4.2 Phương pháp ribotyping 28 1.2.4.3 Phương pháp đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) 28

1.2.4.4 Phương pháp đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc

1.2.4.5 Phương pháp đa hình chiều dài các đoạn sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme giới hạn (PCR-RFLP) 29 1.2.4.6 Phương pháp khuếch đại các trình tự lặp (REP-PCR) 29 1.2.4.7 Phương pháp phân tích vùng lặp đối xứng của nhiều locus (MLVA) 30

1.2.5 Phương pháp phân loại dựa trên trình tự của nhiều locus (MLST)…….………….30

1.2.5.1 Phương pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus gen độc (MVLST) 31 1.2.5.1 Phương pháp phân loại dựa trên trình tự các gen giữ nhà 31

1.2.6 Cơ sở dữ liệu về phương pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus

(MLST)……….34 1.3 Một số phương pháp phân tích phát hiện L monocytogenes 34

1.3.1 Phương pháp nuôi cấy 34

1.3.1.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình tăng sinh 35 1.3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tăng sinh 37

4

1.3.1.3 Ảnh hưởng của mẫu thực phẩm đến quá trình tăng sinh 37 1.3.1.4 Ảnh hưởng của thành phần vi sinh vật đồng nhiễm trong mẫu 38

1.3.2 Phương pháp miễn dịch 401.3.3 Phương pháp khuếch đại DNA (PCR, real-time PCR) 41

1.4 Kỹ thuật nhân gen đẳng điện tạo cấu trúc vòm (LAMP)……… 43 1.4.1 Nguyên tắc của kỹ thuật LAMP 431.4.2 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 451.4.3 Phát hiện sản phẩm LAMP 46 1.4.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phản ứng LAMP……… 47

1.4.5 Các nghiên cứu sử dụng phương pháp LAMP để phát hiện L monocytogenes

trên thế giới……… 481.5 Một số kỹ thuật tách chiết thu nhận nhanh DNA cho các phản ứng khuếch đại DNA………50 1.5.1 Các yêu cầu đối với DNA sử dụng cho các kỹ thuật nhân gen……….50 1.5.2 Tách chiết và tinh sạch DNA……….51 1.5.3 Kiểm tra hiệu suất thu hồi và chất lượng DNA 54

2 CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

56

2.1 Địa điểm nghiên cứu 562.2 Đối tượng nghiên cứu 562.3 Phương pháp nghiên cứu 572.3.1Phân lập L monocytogenes từ mẫu thực phẩm 57

2.3.2 Phản ứng Real-time PCR……… 56 2.3.3 Phản ứng PCR ……… 57 2.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen……….58 2.3.5 Phân loại các kiểu trình tự ST……….59

2.3.6 So sánh trình tự 7 đoạn gen của các chủng phân lập được với một số chủng trên ngân hàng dữ liệu……… 59 2.3.7 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP……….……… 59 2.3.8 Lựa chọn mồi LAMP………59 2.3.9 Tối ưu hóa phản ứng LAMP ……… … 59 2.3.10 Điện di DNA………60

2.3.16 Kiểm định bộ sinh phẩm……… 64 2.3.17 Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm………64

3 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 663.1 Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập

từ một số thực phẩm Việt Nam 663.1.1 Phân lập L monocytogenes từ các mẫu thực phẩm 66

3.1.2 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập 709 3.1.2.1 Giải trình tự các gen abcZ, bglA, cat, dapE, dat, ldh và lhkA của các chủng L

monocytogenes phân lập……….70

3.1.2.2 Phân tích tính đa hình về trình tự nucleotid của các gen abcZ, bglA, cat, dapE, dat,

ldh và lhkA từ các chủng L monocytogenes đã phân lập được……….70

3.1.2.3 Phân loại các chủng L monocytogenes đã phân lập được 72 3.1.2.4 So sánh các chủng L monocytogenes đã phân lập được với các chủng gây bệnh

dịch trên thế giới……….………77 3.2 Xây dựng quy trình phân tích nhanh L monocytogenes trong thực phẩm dựa trên

kỹ thuật LAMP 803.2.1 Xây dựng phản ứng LAMP 82

3.2.1.1 Thiết kế mồi LAMP khuếch đại gen inlJ 81 3.2.1.2 Lựa chọn bộ mồi LAMP cho độ nhạy khuếch đại cao nh t 83 3.2.1.3 Tối ưu phản ứng LAMP 86

3.2.2 Xây dựng quy trình tăng sinh 93

3.2.2.1 Ảnh hưởng của loại môi trường cơ bản đến sự sinh trưởng L monocytogenes…94

3.2.2.2 Ảnh hưởng của một số thành phần môi trường đến sự sinh trưởng của L monocytogenes 95 3.2.2.3 Ảnh hưởng của acriflavin và acid nalidixic đến sự sinh trưởng của một số loài vi khuẩn khác 97

3.2.2.4 Thử nghiệm tăng sinh trên mẫu thực phẩm 98

3.2.3 Tối ưu hóa qui trình tách chiết DNA 100

6

3.2.3.1 Khả năng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes khi sử dụng Triton X100 kết hợp siêu âm và gia nhiệt ở 95 o

C 99

3.2.3.2 Khả năng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes khi sử dụng NaOH kết hợp

siêu âm và gia nhiệt ở 95 o

C 101 3.2.3.3 So sánh các phương pháp tách chiết nghiên cứu đối với canh trường L monocytogenes thuần 103 3.2.3.4 Đánh giá hiệu quả tách chiết DNA của các phương pháp đối với mẫu thực phẩm tăng sinh 104 3.2.3.5 Ảnh hưởng của lượng mẫu l y tách chiết DNA cho phản ứng LAMP 106 3.2.3.6 Thử nghiệm phản ứng LAMP trên các nền mẫu khác nhau 107

3.2.4 Đề xuất quy trình phân tích 1103.2.5 Xác định độ nhạy của toàn bộ quy trình 111

3.2.6 Thiết kế, sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP phát hiện L

monocytogenes……… 112 3.2.6.1 Thiết kế bộ sinh phẩm 112 3.2.6.2 Sản xu t thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO 114

3.2.7 Kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO………116

3.2.8 Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO……….118

4CHƯƠNG IV KẾT LUẬN 123KIẾN NGHỊ 124 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN………… 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO……….……… ……… 125

PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined.

7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length

Polymorphism

Đa hình chiều dài các đoạn DNA

ALOA Chromogenic Listeria Agar

according to Ottaviani and Agosti

Môi trường tăng sinh BLEB

CAMP Christie, Atkins, Munch-Petersen Phản ứng CAMP

CDC Center for Disease Control and

Prevention

Trung tâm phòng chống và kiểm soát dịch bệnh

CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc

DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic

EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid Axit Ethylen Diamine Tetraacetic

ISO International Organization for

Bộ Nông nghiệp và dịch vụ kiểm soát an toàn thực phẩm Mỹ

Administration

Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống

LAMP Loop-Mediated Isothermal Khuếch đại đẳng nhiệt tạo cấu

PCPLC Phosphatidylcholine

phospholipase C

Phosphatidylcholine phospholipase C PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi ADN

PFGE Pulsed-field gel electrophoresis Kỹ thuật điện di xung trường RAPD Randomly amplified polymorphic

DNA

Đa hình dựa trên khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA

PCR-RFLP PCR-restriction fragment length

polymorphism

Đa hình chiều dài các đoạn sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme giới hạn

rep-PCR Repetitive element PCR Khuếch đại các trình tự lặp

MOX Modified Oxford Agar Môi trường Oxford Agar cải biến MLVA Multiple-locus variable number of

tandem repeat analysis

Phân tích vùng lặp đối xứng của nhiều locus

PFGE Pulsed-field gel electrophoresis Điện di xung trường

electrophoresis typing

Phân loại theo phổ điện di nhiều enzyme

9

DI Simpson's Diversity Index Chỉ số phân loại Simpson

VNTRs Variable numbers of tandem

repeats

Đa hình các đoạn DNA chứa vùng lặp đối xứng

TSBYE Tryptic Soy Broth Yeast Extract Môi trường dịch chiết nấm men

và trypton từ đậu tương

10

DANH MỤC HÌNH

Hình 1-1 Hình thái vi khuẩn L monocytogenes 16

Hình 1-2 Cơ chế xâm nhiễm của L monocytogenes vào tế bào người 19

Hình 1-3 C u tạo của 3 nhóm internalin từ L monocytogenes EGDe 21

Hình 1-4 Trình tự axit amin của inlJ 23 Hình 1-5 Tốc độ sinh trưởng của chủng L monocytogenes 1340 và chủng L

innocua11288 trong canh trường hỗn hợp và canh trường riêng biệt, môi trường được sử dụng là TSBYE 39

Hình 1-6 Mô hình phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh L monocytogenes

40

Hình 1-7 Nguyên tắc kỹ thuật LAMP 44

Hình 1-8 Các phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP 46 Hình 1-9 Ảnh hưởng của nồng độ ion Mg 2+ đến phổ h p thụ của HNB trong dung dịch phản ứng LAMP 47

Hình 3-1 Kết quả phân lập L monocytogenes sử dụng môi trường RAPID’L.mono 66 Hình 3-2 Kết quả khẳng định bằng PCR các khuẩn lạc L monocytogenes giả định

phân lập được trên môi trường RAPID’L.mono 67

Hình 3-3 Mối liên hệ về mặt di truyền của L monocytogenes đã phân lập được từ thực

thường nhiễm tạp trong thực phẩm 90

11

Hình 3-10 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu với HNB 91 Hình 3-11 So sánh độ nhạy của phản ứng LAMP phát triển trong nghiên cứu này với

các phương pháp LAMP phát hiện L monocytogenes đã được công bố 93

Hình 3-12 Ảnh hưởng của nồng độ cao n m men đến sự sinh trưởng của L

monocytogenes trong môi trường BLEB (canh trường thuần) 97

Hình 3-13 Ảnh hưởng của nồng độ pyruvat đến đến sự sinh trưởng của L

monocytogenes trong môi trường BLEB (canh trường thuần) 97

Hình 3-14 Ảnh hưởng của nồng độ acriflavin và axít nalidixic đến sự sinh trưởng của

L monocytogenes trong môi trường BLEB (canh trường thuần) 98

Hình 3-15 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường

thuần của các quy trình sử dụng NaOH, Triton X100 và sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit 104

Hình 3-16 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường

tăng sinh mẫu xúc xích khi sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X100, sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit và quy trình tách chiết thông thường 105

Hình 3-17 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường

tăng sinh mẫu xúc xích khi sử dụng quy trình tách chiết bằng đệm Glycine-Tris pH 8,3 và Triton X 100 107

Hình 3-18 Ảnh hưởng của thể tích mẫu canh trường tăng sinh được sử dụng đến

khả năng khuếch đại đoạn gen inlJ của phản ứng LAMP 108

Hình 3-19 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh và nền mẫu đến khả năng phát hiện L

monocytogenes dựa trên kỹ thuật LAMP khuếch đại gen inlJ 110

Hình 3-20 Sơ đồ quy trình phát hiện nhanh L monocytogenes được phát triển trong

nghiên cứu này 111

Hình 3-21 Kết quả thử nghiệm quy trình phát hiện nhanh L monocytogenes dựa trên

kỹ thuật LAMP 113

Hình 3-22 Hình ảnh bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO 114 Hình 3-23 Sơ đồ qui trình sản xu t bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện nhanh L

monocytogenes trong thực phẩm 116