CHƯƠNG-1-CÔNG-NGHỆ-GEN-THỰC-VẬT-HongHa-171LeLois-conflicted-copy-2015-05-02

Giai đoạn 1: Giai đoạn chuyển gen biến nạp genTrong giai đoạn này, gen mong muốn thường được chuyển vào tế bào hoặc mô thực vật Giai đoạn 2: Tái sinh cây Trong giai đoạn này, các mô tế b

gene - enzyme

Học phần công nghệ gen - enzyme

Nội dung gồm:

Chương 1: Công nghệ gen thực vật

Chương 2: Những đặc tính của cây trồng chuyển gen

Chương 3: Công nghệ gen động vật

Chương 4: Những lợi ích và thách thức của sinh vật chuyển gen

Chương 5: Tổng quan về enzyme

[1] Trần Quốc Dung, Giáo trình công nghệ chuyển gen ở động vật và thực vật, Nxb ĐH Huế, Huế,

2006.

[2] Trần Thị Lệ, Giáo trình công nghệ chuyển gen trong nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, 2007.

[3] Đỗ Quý Hai, Giáo trình enzyme, Nxb ĐH Huế, Huế, 2008.

[4] Đỗ Quý Hai, Giáo trình công nghệ và ứng dụng enzyme, Nxb ĐH Huế, Huế, 2009.

11/2/16

Chương 1 Công nghệ gen thực vật

- Hiện nay đã có hơn 150 loài thực vật được chuyển gen, trong đó có nhiều loài cây trồng

- Lược sử thành tựu của công nghệ chuyển gen ở thực vật được thể hiện trong bảng sau:

Khái niệm chung

Kỹ thuật di truyền

11/2/16 9

Gen

Khái niệm chung

Gen là gì?

 Gen là một đơn vị của vật chất di truyền Bản thân nó hoặc kết hợp với các gen khác quy định

một tính trang của cơ thể.

 Về mặt phân tử, một gen là một đoạn ADN (ở virus là ARN) mã hóa hoặc trực tiếp hoặc tham gia

vào việc tổng hợp nên một phân tử protein hay trong một số trường hợp là phân tử ARNr, ARNt,

hoặc một số các phân tử ARN cấu trúc khác

Gen (ADN) → ARN → Protein → Tính trạng

11/2/16 11

Mục đích chuyển gen ở thực vật

Giai đoạn 1: Giai đoạn chuyển gen (biến nạp gen)

Trong giai đoạn này, gen mong muốn thường được chuyển vào tế bào hoặc mô thực vật

Giai đoạn 2: Tái sinh cây

Trong giai đoạn này, các mô tế bào được chọn lọc ra và cho tái sinh để phát triển thành cây

Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định thành công của một thí nghiệm biến nạp Nếu sự biến nạp xẩy ra mà không có sự tái sinh kèm theo hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp chưa thành công

Các yêu cầu cơ bản đối với hệ thống tái sinh

11/2/16 15

Ví dụ về PP thu nhận các cây biến nạp từ các TB khác nhau

11/2/16 17

 Các vector chuyển gen là các phân tử DNA mang gen cần biến nạp

 Ngoài ra chúng còn có các đoạn DNA có cấu trúc đặc thù nhằm tăng hiệu quả các

quá trình biến nạp giúp quá trình biến nạp có thể thực hiện được

Cấu trúc của vector chuyển gen

1 Có một đoạn DNA khởi động (promotor) Đây là đoạn

DNA có liên quan và cần thiết cho sự khởi đầu phiên mã

Nó thường có một vị trí bám cho enzyme RNA polimerase,

một điểm khởi đầu phiên mã và một số vị trí bám khác của

các protein điều khiển/ điều hòa quá trình phiên mã (CaMV,

35S- promotor, nos-promotor,…)

11/2/16 19

2 Có một đoạn DNA kết thúc (terminator) Đây là đoạn

DNA cần thiết cho sự kết thúc của quá trình phiên mã, giải

phóng phân tử mRNA khỏi sợi khuôn DNA Đoạn này

thường có một trật tự tín hiệu poly(A), như AATTAA hoặc

AACCAA, giúp cho phân tử mRNA bền vững hơn.

Cấu trúc của vector chuyển gen

3 Một đoạn DNA chịu trách nhiệm cho quá trình tái bản

(replication) thường có nguồn gốc vi khuẩn như ColE1.

11/2/16 21

4 Một đoạn DNA chứa các trật tự nucleotid đặc trưng

cho sự nhận biết của các enzyme giới hạn, thường kí

hiệu là MCS (multi cloning siter) Nhờ đoạn DNA người

ta có thể dùng enzyme giới hạn đặc hiệu để cắt và tái tổ

hợp phân tử DNA của vector với đoạn DNA mang gen cần

biến nạp.

Cấu trúc của vector chuyển gen

5 Các gen chọn lọc (selectable marker genes) và gen

chỉ thị (reporter genes) Các gen này thường tổng hợp

nên các phân tử protein giúp phân biệt các tế bào đã được

biến nạp khỏi các tế bào không được biến nạp (gen chọn

lọc), hoặc ghi nhận sự hoạt động của gen biến nạp (gen chỉ

thị)

Chuyển gen Chọn lọc,

sàng lọc

Chọn lọc, sàng lọc

Tái sinh cây hoàn chỉnh

Tái sinh cây hoàn chỉnh

Xác nhận sự chuyển gen

Xác nhận sự chuyển gen

Kiểm tra sự biểu hiện gen

Kiểm tra sự biểu hiện gen

1.1 Các phương pháp chuyển gen ở thực vật

- Có 3 nhóm phương pháp chuyển gen vào thực vật phổ biến sau:

+ Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumeficiens/ A rhizogens

+ Chuyển gen gián tiếp bằng phương pháp phi sinh học

+ Chuyển gen bằng tế bào trần

 ADN ngoại lai được đưa vào tế bào thực vật và tồn tại bền vững trong hệ gen

(genome)

 Các vi khuẩn đất A tumefaciens và một số loài họ hàng của chúng có khả năng

chuyển một phần nhỏ ADN vào tế bào thực vật và qua đó kích thích tạo khối u

(callus)

1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

11/2/16 27

1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

 Những khối u này là không gian sống của vi khuẩn

 Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn cũng được tạo ra trong những khối u

này

 Những opine phổ biến nhất là nopalin và octopin

11/2/16 29

1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

 Về hóa học opine là những sản phẩm ngưng tụ của một amino acid với một cetoacid

hoặc một amino acid với đường

 Octopin được tạo nên từ các amino acid là arginine và pyruvate

 Nopalin được tạo nên từ arginine và α-cetoglutaraldehyd

11/2/16 31

1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

 A tumefaciens đã thực hiện “kỹ thuật gen” với mục đích tạo ra cây biến đổi gen có lợi cho

nó

 Như vậy, việc khẳng định kỹ thuật gen là một quá trình nhân tạo là không hoàn toàn đúng

 Khả năng chuyển ADN của A tumefaciens được ứng dụng trong công nghệ gen hiện đại

 Để hiểu được quá trình này, điều đầu tiên là cần làm rõ sự tương tác sinh học giữa

Agrobacterium với thực vật

Sự tương tác sinh học giữa Agrobacterium với thực vật

Hình 1.2 Vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

- Việc sử dụng A tumefaciens bắt đầu từ 1970, khi người ta phát hiện vi khuẩn này có khả năng tạo

nên khối u ở cây hai lá mầm bị thương, được gọi là khối u cổ rễ (Hình 1.2)

- Trong những năm 1970, các nhà khoa học đã tìm thấy trong các chủng A tumefaciens tạo khối u

có một plasmid rất lớn kích thước khoảng 200 - 800 kb được gọi là Ti plasmid (tumor

inducingplasmid).

1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

11/2/16 37

1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

11/2/16 39

1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

Quá trình lây nhiễm

1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

Ti-plasmid của Agriobacterium

dạng nopalin

1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

 Có sự khác nhau giữa các loại plasmid ở Agrobacterium

+Ti plasmid của loại nopalin chỉ chứa một bản sao (copy) của T ADN

+ Ti plasmid octopin chứa đến ba bản sao

 Ở hình 1.4, trên đoạn T AND định vị những gen tổng hợp opine và tạo khối u.

 Khối u được tạo nên là do hai loại phytohormone (auxin và cytokinin) được tạo ra ở trong tế bào thực vật bị nhiễm, chúng kích thích sự phân chia tế bào và tạo nên mô không phân hóa (callus)

 Điều kiện cho việc chuyển TDN A vào thực vật trước hết là tế bào bị thương.

 Khi tế bào bị thương chúng tiết ra các hợp chất phenol (acetosyringone), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và gắn kết vi khuẩn với tế bào thực vật

 Cơ chế nhận biết được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A tumefaciens với cây hai lá mầm

 Ở cây một lá mầm thì phản ứng này chỉ có ở một ít loài → Agrobacterium chỉ được sử dụng hạn chế cho việc biến nạp gen ở cây một lá mầm.

 Khi bổ sung syringone người ta có thể biến nạp gen vào nấm nhờ A tumefaciens

 Thực vật một lá mầm quan trọng như ngô cũng có thể được biến nạp bằng A Tumefaciens.

1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

11/2/16 47

1.1.2 Chuyển gen bằng phương pháp phi sinh học

Gồm một số phương pháp sau:

11/2/16 49

PP dùng súng bắn gen

11/2/16 51

PP dùng súng bắn gen

11/2/16 53

PP dùng xung điện

11/2/16 55

PP dùng xung điện

11/2/16 57

PP dùng xung điện

11/2/16 59

PP dùng hóa chất (PEG)

11/2/16 61

PP vi tiêm

11/2/16 63

PP chuyển gen khác

1.1.3 Chuyển gen bằng phương pháp

dung nạp tế bào trần

pectinase, tiếp theo là cellulo được phân giải bằng

cellulase tạo ra các té bào hình tròn.

khăn trong tái sinh cây hoàn chỉnh

1.1.3 Chuyển gen bằng phương pháp

dung nạp tế bào trần

11/2/16 69

Một số hình ảnh

11/2/16 71

1.2 Hệ thống chọn lọc và chỉ thị

1.2 Hệ thống chọn lọc và chỉ thị

11/2/16 75

1.2 Hệ thống chọn lọc và chỉ thị

11/2/16 77

1.2 Hệ thống chọn lọc và chỉ thị

11/2/16 79

1.2 Hệ thống chọn lọc và chỉ thị

- Biến nạp gen vào thực vật khó hơn nhiều so với vi khuẩn hay nấm men.

của hầu hết các tế bào

gen

Phải thử nghiệm để tìm ra nguyên liệu ban đầu phù hợp

1.3 Tái sinh cây hoàn chỉnh

- Đâu là yếu tố quan trọng nhất điều

chỉnh sự sinh trưởng, phân chia của tế bào nuôi cấy

11/2/16 83

1.3 Tái sinh cây hoàn chỉnh

+ Cytokinin: kích thích tạo chồi

+ Auxin: phụ thuộc vào nồng độ cytokinin, kích thích tạo callus hoặc tạo rễ

Là một khối tế bào không màu, có kích thước lớn, không phân hóa và chứa không bào

Caluss?

11/2/16 85

- Điều kiện xác định cho sự thành công phải thử nghiệm cho từng loại cây

- Vídụ: Để phát triển thành callus hoặc chồi từ mảnh lá cây thuốc lá người ta

cần dùng 0,2 mg/l – NAA (anphal naphtly acetic acid) và 2,0mg/l BAP

1.3 Tái sinh cây hoàn chỉnh

11/2/16 87

- Trong quá trình tái sinh cây hoàn chỉnh thường có sự biến đổi lớn về kiểu hình vì:

bất thường trong NP, đột biến → Đột biến soma

- Không phải tất cả các loài đều dễ dàng tạo racâu hoàn chỉnh từ tế bào trần, tế bào

mô

+ Dễ với cây họ cà, cải cay, cam, táo, cà rốt

+ Đặc biệt khó với các loại ngũ cốc

1.4 Xác nhận sự thay đổi gen

-Thực tế thì một cây sau khi biến nạp sinh trưởng trên môi trường chọn lọc thì chưa đủ cơ sở để khẳng định biến nạp thành công vì:

+ Có thể tính kháng xuất hiện do đột biến tự nhiên

+ Tỉ lệ biến nạp thấp nằm trong khoảng tỉ lệ đột biến tự nhiên 10-6 – 10-8

1.4 Xác nhận sự thay đổi gen

- SVBĐG được chứng minh bằng việc phân tích các thành phần thay đổi:

+ Đặc biệt là những đặc tính (kháng một tác nhân gây bệnh nào đó)

+ Những protein thay đổi

+ Những protein mới

+ Xác định ADN lạ biến nạp

11/2/16 91

1.4 Xác nhận sự thay đổi gen

11/2/16 93

- Ngoài hai phương pháp trên ra người ta còn dùng một số phương pháp đơn giản như sau:

+ Dùng vector biểu hiện β-D-glucoronidase, hoạt động của nó được nhận biết dễ dàng

nhờ tạo ra một indigo màu xanh

+ GMO Soya Test KitTM với kháng thể đặc hiệu, protein EPSP synthetase được chứng

minh là có mặt trong đậu tương biến đổi gen

1.4 Xác nhận sự thay đổi gen

11/2/16 95

1.5 Biểu hiện của ADN ngoại lai

- Ở TV bậc cao, cơ thể gồm có rễ, thân, lá và các mô đặc hiệu như phân sinh, mô bảo

vệ (biểu bì) và hàng trăm loại tế bào khác nhau

- Một gen lạ có thể biểu hiện ở tất cả các tế bào hoặc một số mô đặc hiệu

- Người ta sử dụng Promoter trong các gen biến nạp vào, mỗi promoter điều khiển sự hoạt động của một gen

11/2/16 97

- Một số promoter có thể có ở hầu hết các tế bào, một số khác lại có tính chuyên hóa cao nên chỉ có ở một số tế bào, mô nhất định

- Trong những tế bào có nhiều bào quan như ty thể, lạp thể, nhân,… nhờ có promoter

mà các gen biến nạp biểu hiện ở những vị trí xác định mong muốn

1.5 Biểu hiện của ADN ngoại lai

11/2/16 99

1.5.1 Biểu hiện của gen ngoại lai ở nhiều vị trí

- Promoter 35S từ virus khảm hoa súp lơ

11/2/16 101

1.5.2 Biểu hiện của gen ở mô, tế bào đặc hiệu

- Ở thục vật, qt TĐC xẩy ra ở những vị trí xác định

- Các sản phẩm của nó được vận chuyển đi tới cơ quan đích nhờ hệ thống bó mạch

- Các promoter được xác định qua thực nghiệm bằng cách phân lập các pt ADN chỉ tồn tại trong các mô đặc hiệu

- Các promoter và các gen được xác định

-11/2/16 103

1.5 Biểu hiện của ADN ngoại lai

11/2/16 105

1.5 Biểu hiện của ADN ngoại lai

11/2/16 107

- Để tạo ra những dòng thực vật biến đổi gen thì sự biểu hiện bền vững của những gen biến nạp và sự truyền lại cho thế hệ sau có ý nghĩa quan trọng

- Độ bền vững của những gen biến nạp và sự biểu hiện của nó có thể thay đổi vì:

+ TV có cơ chế bất hoạt ADN ngoại lai

1.5 Biểu hiện của ADN ngoại lai

1.5.5 Sự bất hoạt của gen do methyl hóa

- Những gen biến nạp lặp lại dạng chùm thường gặp khi biến nạp tế bào trần, biến nạp phi sinh học, it gặp ở

biến nạp nhờ vi khuẩn Agriobacterium tumefaciens

- Sự methyl hóa thường xẩy ra ở nguyên tử thứ 5 của vòng cytosine, thường là ở trình tự CG hoặc CNG Các trình tự này thường bị methyl hóa hoặc không được phiên mã do đó sự biểu hiện của gen giảm hoặc bị ức chế hoàn toàn

11/2/16 111

1.5.6 Đồng ức chế

- Sự bất hoạt của gen không chỉ do bị methyl hóa mà còn do bị đồng ức chế sau phiên mã

- VD: + do sự sắp xếp lại các gen

+ giảm SL ARN xuống 20-50 lần

- Nguyên nhân là do sự tăng cường phân giải ARN

- Do ARN polymerase phụ thuộc vào SL của một ARN ít sao chép, SL của nó nằm trong giới hạn Các

ARN này sẽ kết hợp với các ARN antisense tạo ra ARN kép và bị ARN polymerase phân giải