Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam

Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trội của phương pháp này, giúp đơn giản hóa và rút ng n thời gian phân tí

Vi khuẩn L monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh Chúng được tìm thấy ở nhiều nơi

như đất, nước, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân người hoặc phân động vật Chúng có thể sống và tăng trưởng chậm ở các điều kiện kh c nghiệt về nhiệt độ, hàm lượng khí oxy, pH và hoạt độ nước Đặc biệt loài vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ lạnh (0-10o

C) Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L monocytogenes

trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm được bảo quản lạnh trong thời gian dài Nhiều loại thực phẩm được bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn Thêm nữa càng ngày người ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản hoặc không bị gia nhiệt để giữ được nguyên vẹn hương vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu Những sản phẩm như vậy thường được bảo quản lạnh trước khi sử dụng Vì vậy, các sản

phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L monocytogenes cao Rất nhiều các vụ ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L monocytogenes trên kh p thế giới đã

được thông báo

Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập được từ các

vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L monocytogenes có khả năng gây

bệnh và gây bùng phát dịch rất lớn, bên cạnh đó cũng có những kiểu huyết thanh hầu như không có khả năng gây bệnh và gây dịch Cho đến thời điểm này chưa có công bố nào về

dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập từ thực phẩm tại Việt Nam Khả năng gây bệnh và gây dịch của L monocytogenes nhiễm trong các thực phẩm tại Việt Nam

vẫn là một ẩn số

Phương pháp ISO 11290-1:1996 phát hiện L monocytogenes là phương pháp nuôi cấy

Một số các phương pháp sinh học phân tử như PCR, real-time PCR hoặc các phương pháp miễn dịch (ELISA) cũng đã được tiêu chuẩn hóa Mấy năm trở lại đây, cùng với sự ra đời của một số k thuật khuếch đại đ ng nhiệt axit nucleic, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh đã được đơn giản hóa thêm một bước LAMP là k thuật khuếch đại đ ng nhiệt được sử dụng phổ biến hơn cả Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trội của phương pháp này, giúp đơn giản hóa và rút ng n thời gian phân tích K thuật này đã nhanh chóng được ứng dụng

để phát hiện L monocytogenes trong thực phẩm ở nhiều nghiên cứu trên thế giới

Ở Việt Nam, phương pháp tiêu chuẩn TCVN: 7700-1:2007 phát hiện Listeria monocytogenes là phương pháp nuôi cấy, sau đó khuẩn lạc đặc trưng được kh ng định

bằng các phản ứng sinh hóa Đã có một số nghiên cứu về phương pháp PCR và que thử s c

2

ký miễn dịch nhằm phát hiện vi khuẩn này, tuy nhiên thời gian phân tích còn dài hoặc yêu cầu cao về trang thiết bị hóa chất nên chưa đáp ứng được nhu cầu phân tích phát hiện trong thực tế sản xuất

Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi nghiên cứu đề tài có tên là “Nghiên cứu chế

tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam”

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của luận án

 Phân tích được đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L monocytogenes phân

lập được từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam

 Xây dựng được một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L monocytogenes trong các loại

thực phẩm ăn liền dựa trên k thuật LAMP

3 Những đóng góp mới của luận án

 Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam

 Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển k thuật LAMP cho phát hiện L monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân

môi trường Các thống kê cũng cho thấy có rất nhiều các công bố về các vụ gây dịch bệnh

listeriosis do L monocytogenes gây lên có liên quan đến các loại thực phẩm khác nhau

trong đó chủ yếu là các loại thực phẩm có bảo quản lạnh trong thời gian dài Chính vì vậy trong luận án này phần phân lập cũng được tiến hành chủ yếu trên các mẫu thực phẩm có quá trình bảo quản lạnh trước khi sử dụng

1.2 Tổng quan về các phương pháp phân loại dưới loài L monocytogenes

Các phương pháp phân loại dưới loài dựa theo kiểu hình như enzyme hoặc kháng thể thường cho độ phân loại không cao, nên không phù hợp trong các nghiên cứu dịch tễ học

các chủng L monocytogenes gây dịch bệnh Các phương pháp phân loại dưới loài dựa trên

kiểu gen hiện nay khá phổ biến Tuy nhiên kết quả phân loại phụ thuộc rất lớn vào cơ sở

dữ liệu liên quan cho phân tích so sánh MLST là một phương pháp phân loại dưới loài đơn giản và được sử dụng khá phổ biến Cơ sở dữ liệu cho phương pháp MLST khá phong phú Chính vì vậy luận án này sử dụng phương pháp MLST và sơ sở dữ liệu của viện

3

Pasteur Pháp làm công cụ phân tích dịch tễ học các loài L monocytogenes phân lập được

Từ đó đánh giá nguy cơ gây dịch bệnh của loài vi khuân này trên thực phẩm Việt Nam

1.3 Tổng quan về các phương pháp phát hiện L monocytogenes

Hiện nay có khá nhiều các phương pháp được sử dụng trong phân tích phát hiện L monocytogenes Ngoài các phương pháp tiêu chuẩn như phương pháp nuôi cấy theo ISO

hoặc TCVN còn có các phương pháp nhân gen như real-time PCR hoặc các phương pháp

sử dụng kít miễn dịch được tiêu chuẩn hóa Tuy nhiên các phương pháp hiện nay có thời gian phân tích khá dài hoặc yêu cầu sử dụng các trang thiết bị, hóa chất đ t tiền, nên chưa đáp ứng được yêu cầu của việc kiểm soát loài vi khuẩn nguy hiểm này trong thực tế sản xuất Chính vì vậy Luận án này đặt mục tiêu phát triển phương pháp phân tích nhanh, đơn giản và đạt độ nhạy, độ đặc hiệu cao

Chương II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Môi trường: Môi trường cơ bản cho tăng sinh; môi trường phân lập L monocytogenes

Các cặp mồi cho PCR, real time PCR, LAMP

2.2 Các thiết bị sử dụng chủ yếu

Một số thiết bị sử dụng cho PCR, real-time PCR, điện di, siêu âm, ly tâm, bảo quản lạnh và lạnh đông, nuôi cấy vi sinh vật

2.3 Phương pháp nghiên cứu

 Phân lập L monocytogenes từ mẫu thực phẩm

 Phản ứng PCR khẳng định L monocytogenes và khuếch đại các gen giữ nhà cho giải trình tự

 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh sạch

GeneJETTM PCR Purification (Fermentase) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

 Các phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại dưới loài MLST và cơ sở dữ liệu của viện Pasteur Pháp ( www.pasteur.fr/mlst )

 Giải trình tự gen: Tiến hành tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc) Mỗi trình tự gen được giải trình tự 2 chiều

 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4

 Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy của phản ứng LAMP

11290-4

1 2

A B

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân

lập từ một số thực phẩm Việt Nam

3.1.1 Phân lập L monocytogenes từ các mẫu thực phẩm

Trong nghiên cứu này, các mẫu thực phẩm được tăng sinh trên môi trường Half Fraser, những mẫu cho chuyển màu canh trường sang màu đen (bình 1 Hình 3-1 A) được cấy trải

trên môi trường RAPID’L.mono (Biorad) Các mẫu thực phẩm dương tính với L monocytogenes là những mẫu cho khuẩn lạc có hình thái đặc trưng (Hình 3-1 B) và có ít

nhất một khuẩn lạc nghi ngờ được kh ng định dương tính bằng k thuật PCR với cặp mồi

đặc hiệu LM1-LM2 khuếch đại đoạn gen hlyA có kích thước 702 bp (Hình 3-2)

Hình 3-1 Kết quả phân lập L monocytogenes sử dụng môi trường RAPID’L.mono

A: T ng sinh trong môi trường l ng Half Fraser : mẫu dương t nh giả định môi trường chuyển sang màu đen : mẫu âm t nh môi trường không m t màu

: Hình thái khuẩn lạc L monocytogenes tr n môi trường RAPID’L.mono các khuẩn lạc màu anh đen không c halo màu vàng tương ứng v i các khuẩn lạc nghi ngờ là L monocytogenes

Hình 3-2 Kết quả khẳng định bằng PCR các khuẩn lạc L monocytogenes giả định phân lập được

tr n môi trường RAPID’L.mono

: Mẫu dương t nh , , : a khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu cá hồi , ,7: a khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu c ch v i khuẩn lạc giếng 7 được khẳng định là L monocytogenes , , 0, : n khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu sushi : mẫu âm t nh : thang chuẩn 00 bp O’GeneRuler TM của Fermentas

702 bp

5

Tổng hợp các kết quả phân tích phát hiện L monocytogenes trong các mẫu thực phẩm đã

phân tích từ năm 2011 đến 2015 được trình bày trong Bảng 3-1 sau

Bảng 3-1 Tổng hợp kết quả phát hiện L monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Việt Nam

trong khoảng thời gian từ 0 đến 0

mẫu thực phẩm

Số lƣợng chủng phân lập đƣợc

Tỷ lệ nhiễm (%)

Có tổng số 59 543 mẫu được phát hiện là nhiễm L monocytogenes Trong đó các mẫu thịt

hun khói và xúc xích có tỷ lệ nhiễm cao nhất

3.1.2 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập đƣợc từ

thực phẩm Việt Nam

Kết quả phân lập được 59 chủng L monocytogenes, tuy nhiên trong quá trình giữ giống,

một số chủng phân lập được đã bị chết, những chủng còn lại được tăng sinh, tách chiết DNA và tiến hành phản ứng PCR với các bộ mồi nhân 7 đoạn gen giữ nhà (housekeeping gene) Tinh sạch sản phẩm PCR, giải trình tự gen tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc) Dựa vào trình tự thu được, tra cứu các kiểu trình tự tương ứng với các đoạn gen Tổ hợp các kiểu trình tự của 7 đoạn gen tra cứu được kiểu trình tự (ST), các dòng phức hợp (clone complex - CC) và các dòng giống (ligneage) tương ứng của chủng phân lập

Tra cứu kiểu trình tự từng đoạn gen giữ nhà của 48 chủng L monocytogenes phân lập được

trên ngân hàng dữ liệu được các kiểu trình tự tương ứng của từng gen Tổ hợp kiểu trình tự

7 đoạn gen của từng chủng phân lập là một kiểu trình tự (ST), một dòng phức hợp (CC) và thuộc một dòng giống Từ các kiểu ST này phân loại 48 chủng phân lập được thành 16 nhóm có kiểu ST khác nhau Nối 7 đoạn gen giữ nhà của mỗi nhóm với nhau, so sánh trình

tự 7 đoạn gen của 16 nhóm này với 25 trình tự 7 đoạn gen tương ứng của các chủng đã từng gây dịch bệnh listeriosis trên thế giới Sử dụng phần mềm clustal W thông qua mô

6

hình NJ (Neighber joining) với độ lặp lại (bootstrap) 1000 Xây dựng được cây phân loại như Hình 3-3

Hình 3-3 Cây phân loại các nh m chủng L monocytogenes đã phân lập được từ thực phẩm

Chữ đ : T n các nh m và ký hiệu các chủng, dự đoán kiểu serotype của các chủng L monocytogenes phân lập được từ thực phẩm Việt Nam

Chữ đen: Các chủng L monocytogenes đã từng gây ra các vụ bùng phát dịch bệnh tr n thế gi i đã công b trình tự 7 đoạn gen giữ nhà tr n ngân hàng dữ liệu MLST

Kết quả cho thấy, đã xuất hiện dòng L monocytogenes (chủng ký hiệu M49 phân lập từ

thịt ba rọi xông khói) có trình tự các gen cấu trúc giống hệt các chủng có tần suất cao gây các vụ dịch lớn trên thế giới Nhóm 1 chiếm 17 48 chủng có trình tự 7 đoạn gen giống hệt với trình tự các đoạn gen tương ứng của một số chủng gây ra vụ thai lưu năm 2005 tại Nga, vụ dịch tại Italia năm 1997 Và gần giống trình tự các đoạn gen tương ứng từ chủng phân lập từ vụ dịch tại Pháp năm 1993 Đa số các chủng còn lại, trình tự gen giống các chủng phân lập từ thực phẩm và gần giống các trình tự phân lập từ người hoặc gây ra các

vụ dịch nhỏ trên thế giới

3.2 Xây dựng quy trình phân tích nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm

dựa trên kỹ thuật LAMP

3.2.1 Xây dựng phản ứng LAMP

3.2.1.1 Thiết kế mồi LAMP khuếch đại gen inlJ

7

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng trình tự gen inlJ của chủng chuẩn L monocytogenes EGD-e có số hiệu emb|AL591984.1 cho thiết kế mồi LAMP Kiểm tra độ tương đồng của trình tự gen inlJ đưa vào thiết kế mồi so với các trình tự gen trên ngân hàng gen bằng phần mềm BlastN, cho thấy trình tự gen inlJ sử dụng cho thiết kế mồi LAMP của chủng này có độ tương đồng khá cao với trình tự gen inlJ với các chủng L monocytogenes đã được

công bố trên ngân hàng gen NCBI Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4 để thiết kế mồi Lựa chọn các bộ mồi theo một số tiêu chí chính đã được khuyến cáo trong hướng dẫn sử dụng phần mềm [https://primerexplorer.jp/e/v4_manual/pdf/PrimerExplorerV4_Manual_1.pdf] Đã lựa chọn được 8 bộ mồi như bảng 3-2

Bảng 3 -2 Trình tự các bộ mồi LAMP được thiết kế để khuếch đại gen inlJ

3.2.1.2 Lựa ch n bộ mồi LAMP cho độ nhạy khuếch đại cao nh t

Thực hiện các phản ứng LAMP với từng bộ mồi và sử dụng DNA khuôn là DNA tổng số

tinh khiết của L monocytogenes EGD-e với lượng là 20, 2, 0,2 và 0 pg phản ứng Sau đó,

điện di 10 l sản phẩm trên gel agarose Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-4

8

Hình 3-4 Kết quả sàng l c các bộ mồi LAMP dựa tr n khả n ng khuếch đại DNA của L

monocytogenes

Trong đ : , , , : DNA chuẩn GeneRuler TM 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific)

, , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

, 7, , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

0, , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

, , 7, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

, 0, , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

, , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

7, , , 0: Sản phẩm LAMP v i bộ mồi 7 lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

, , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng

Từ kết quả này, chúng tôi quyết định chọn bộ mồi 8 cho các nghiên cứu tối ưu hóa tiếp theo

Phân tích tính phù hợp của mồi 8 cho thấy các mồi đều phù hợp tiêu chí thiết kế về khoảng cách giữa các mồi, chiều dài mồi

Để tìm các vị trí có thể biến đổi trong loài của trình tự nucleotit trên gen, chúng tôi tiến

hành so sánh trình tự mồi với các trình tự gen inlJ trên ngân hàng GenBank của NCBI

bằng chương trình ClustalW và BlastN Tại những vị trí biến đổi, nucleotit biến đổi được thay thế bằng nuceotit suy biến Kết quả chạy kiểm tra các mồi được trình bày cụ thể trong

Bảng 3-3

Bảng 3-3 Kết quả kiểm tra các điểm sai khác của bộ mồi LAMP v i các trình tự gen inlJ tr n

ngân hàng gen NCBI

GCGCAACACCCTAACCGAAA 2

GCGCAACACCYTAACCGAAA

3.2.1.3 T i ưu phản ứng LAMP

Từ kết quả này, chúng tôi đã lựa chọn điều kiện nhiệt độ ủ 65 oC với nồng độ betain là 0,9

M (giếng 13) cho các thí nghiệm tiếp theo

Hình 3-5 nh hư ng của nhiệt độ ủ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP

Trong đ :

: DNA chuẩn GeneRuler TM DNA Ladder (Thermo Scientific)

, : Sản phẩm LAMP o C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, : Sản phẩm LAMP o C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, 7: Sản phẩm LAMP o C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, : Sản phẩm LAMP o C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

0, : Sản phẩm LAMP o C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, : Sản phẩm LAMP o

C, 0,9 M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP o C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, 7: Sản phẩm LAMP o C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

, : Sản phẩm LAMP o C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

Ảnh hƣ ng của th i gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP

Thử nghiệm phản ứng LAMP với lượng DNA khuôn của L monocytogenes là 0 và 0,2

pg phản ứng; thời gian ủ là 45, 60, 75 phút Sau đó, điện di 3 l lượng sản phẩm LAMP trên gel agarose Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-6 dưới đây:

Hình 3-6 nh hư ng của thời gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP

Trong đ :

: DNA chuẩn GeneRuler TM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific);

: Sản phẩm LAMP sau 7 ph t lượng DNA khuôn của L monocytogenes là 0 pg phản ứng

, , : Sản phẩm LAMP v i lượng DNA khuôn là 0, pg phản ứng, thời gian ủ l n lượt là , 0, 7 ph t

10

Kết quả cho thấy kết quả khuếch đại thực sự bão hòa sau 60 phút phản ứng (đường chạy số 4) Do vậy, chúng tôi lựa chọn thời gian ủ là 60 phút cho phản ứng LAMP ở điều kiện tối

ưu là 65oC và nồng độ betain là 0,9 M

3.2.1.4 Kiểm tra độ đặc hiệu, độ bao trùm của phản ứng LAMP

Xác định tính bao trùm của phản ứng với một tập hợp 16 chủng L monocytogenes Kết quả

điện di sản phẩm LAMP (Hình 3-7) cho thấy độ bao trùm của phản ứng LAMP với DNA

của các chủng thuộc loài L monocytogenes là 100%

Hình 3-7 ộ bao trùm của phản ứng LAMP v i các chủng L monocytogenes

Trong đ :

: Thang chuẩn GeneRuler TM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific);

: Mẫu kiểm chứng âm t nh

, , , và 7: Sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L monocytogenes ATCC

19117, L monocytogenes EGD-e, L monocytogenes LO28; L monocytogenes CIP7835; L monocytogenes DSM20750;

đến : sản phẩm LAMP v i DNA khuôn của các chủng L monocytogenes được phân lập từ thực phẩm

Hình 3-8 ộ ch n l c của phản ứng LAMP v i các loài Listeria khác và các vi khuẩn thường

nhi m tạp trong thực phẩm

Trong đ :

: thang chuẩn GeneRuler TM DNA Ladder Mi Thermo Scientific : âm t nh

, , , và 7: sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L monocytogenes ATCC

19117, L monocytogenes EGD-e, L monocytogenes LO28; L monocytogenes CIP7835; L monocytogenes DSM20750

đến : sản phẩm LAMP v i 0 ng DNA khuôn của l n lượt các chủng L innocua ATCC 0 L seeligeri ATCC 35967; L welshimeri ATCC 35897; L grayi ATCC 19120; L ivanovii ATCC 19119; Escherichia coli B41; Salmonella 9R12G2; Bacillus cereus H3081.97; B subtilis 353B

Xác định tính chọn lọc của phản ứng LAMP với các loài Listeria khác và các loại vi khuẩn thường nhiễm tạp trong thực phẩm như Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus, B subtilis Kết quả điện di (Hình 3-8) cho thấy phản ứng LAMP có độ đặc hiệu đạt 100%

trên tập hợp các chủng thử nghiệm

3.2.1.5 ộ nhạy phản ứng LAMP

Tiến hành phản ứng LAMP ở các nồng độ DNA khác nhau Kết quả cho thấy ngư ng phát hiện của phản ứng LAMP là 50 fg/phản ứng tương đương với khoảng 16 tế bào phản ứng (Hình 3-9)

: Thang chuẩn GeneRulerTM kb DNA Ladder Thermo Scientific

Hình 3-10 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu v i HN

3.2.1.6 So sánh độ nhạy bộ mồi LAMP thiết kế v i các bộ mồi LAMP đã công b

Tiến hành phản ứng LAMP với 4 bộ mồi, 1 bộ mồi LAMP đã thiết kế được với 3 bộ mồi tham chiếu đã được công bố trình tự Kết quả thể hiện trên Hình 3-10

12

Hình 3-11 So sánh độ nhạy của phản ứng LAMP phát triển trong nghiên cứu này v i các

phương pháp LAMP phát hiện L monocytogenes đã được công b

Trong đ : -): mẫu âm tính; (+): mẫu dương t nh

1: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10 -7 dung dịch DNA ban đ u

2: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10 -6 dung dịch DNA ban đ u

3: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10 -5 dung dịch DNA ban đ u

4: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10 -4 dung dịch DNA ban đ u

L: DNA ladder (Sangon Biotech)

A: Phản ứng LAMP v i mồi iap

B: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA

C: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA

D: Phản ứng LAMP v i bộ mồi LAMP inlJ trong nghiên cứu này

Kết quả trên cho thấy bộ mồi LAMP của gen inlJ trong nghiên cứu này cho độ nhạy tốt

nhất (kết quả dương tính ở độ pha loãng DNA là 10-6)

3.2.2 Xây dựng quy trình tăng sinh

3.2.2.1 nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự sinh trư ng L monocytogenes

Tăng sinh mẫu xúc xích hun khói trong các môi trường cơ bản khác nhau Sau 16 giờ

nuôi, thu sinh khối, tách chiết DNA cho phản ứng real-time PCR Đánh giá khả năng tăng

sinh dựa trên giá trị chu kỳ ngư ng (Ct) của phản ứng real-time PCR, kết quả được thể

hiện trên Bảng 3-4 sau:

Bảng 3-4 nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự t ng sinh của L monocytogenes trong

canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm

có kháng sinh

BLEB

có kháng sinh

BLEB không

có kháng sinh

Half fraser

có kháng sinh

UVM không

có kháng sinh

LEB

có kháng sinh

LEB không

có kháng sinh