Tách và xác định một số độc tố nhóm Alkaliod trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI P

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã Số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người Hướng Dẫn Khoa Học: PGS TS Lê Thị Hồng Hảo

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Thị Hồng Hảo, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia – Bộ Y tế đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích, đã cho em những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm

An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và hoàn thành đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, năm 2015

Học viên

Đỗ Thị Thu Hằng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 Tổng quan về nhóm alkaloid Error! Bookmark not defined 1.1.1 Lịch sử phát hiện Error! Bookmark not defined 1.1.2 Khái quát về nhóm alkaloid Error! Bookmark not defined 1.1.3 Cấu tạo của một số alkaloid độc Error! Bookmark not defined 1.1.4 Tác dụng và độc tính của một số alkaloid Error! Bookmark not defined 1.2 Các phương pháp xác định Error! Bookmark not defined 1.2.1 Phương pháp điện di mao quản Error! Bookmark not defined 1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV Error! Bookmark not defined 1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổError! Bookmark not defined 1.3 Sắc ký lỏng khối phổ Error! Bookmark not defined 1.3.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng Error! Bookmark not defined 1.3.2 Detector khối phổ (Mass spectrometry – MS)Error! Bookmark not defined 1.3.2.4 Bộ phận phát hiện Error! Bookmark not defined 1.3.3 Phân tích định tính và định lượng bằng LC-MS/MSError! Bookmark not defined 1.4 Lấy mẫu Error! Bookmark not defined 1.5 Đánh giá phương pháp phân tích Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark

not defined

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứuError! Bookmark not defined 2.3.1 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.3.2 Dụng cụ Error! Bookmark not defined 2.3.3 Chất chuẩn Error! Bookmark not defined

2.3.4 Các loại hóa chất, dung môi khác Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined

3.1 Tối ưu điều kiện tách và xác định các alkaloid trên thiết bị LC/MS/MSError! Bookmark not defined 3.1.1 Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS/MS)Error! Bookmark not defined

3.1.2 Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)Error! Bookmark not defined

3.2 Tối ưu quá trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết Error! Bookmark not defined

3.2.2 Khảo sát dung dịch kiềm hóa Error! Bookmark not defined

3.2.3 Khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa Error! Bookmark not defined

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích Error! Bookmark not defined

3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc Error! Bookmark not defined

3.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩnError! Bookmark not defined

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp Error! Bookmark not defined 3.3.4 Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi Error! Bookmark not defined

3.4 Phân tích mẫu thực Error! Bookmark not defined

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined

KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined

KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO 2

PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc hoá học của một số alkaloid độc được xác định trong đề tài

Error! Bookmark not defined

Bảng3.1: Các mảnh ion định lượng và định tính của các alkaloidError! Bookmark

not defined

not defined

Bảng 3.3: Các hệ dung môi pha động khảo sát Error! Bookmark not defined Bảng 3.4: Diện tích các alkaloid khi sử dụng các hệ dung môi khác nhau Error!

Bookmark not defined

Bảng3.5: Các chương trình gradient khảo sát Error! Bookmark not defined Bảng3.6: Ảnh hưởng nồng độ amoniacetat tới diện tích píc các alkaloid Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết các alkaloid Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid

Error! Bookmark not defined

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của thể tích dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các

alkaloid Error! Bookmark not defined Bảng 3.10: Đường chuẩn các alkaloid Error! Bookmark not defined Bảng 3.11: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các alkaloid Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.12: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm

defined

Bảng 3.13: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm

chức năng tại nồng độ 0,1-1 mg/kg Error! Bookmark not defined

Bảng 3.14: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm

chức năng tại nồng độ 0,2-2 mg/kg Error! Bookmark not defined Bảng 3.15: Bảng kết quả phân tích mẫu thực Error! Bookmark not defined

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI Error! Bookmark not defined

Hình 1.2: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực chập ba Error! Bookmark not defined

Hình 3.1: Sắc đồ tỷ lệ các ion của koumin và atropin Error! Bookmark not defined

defined

defined

defined

defined

defined

defined

defined

defined

Hình 3.11: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dòng 0,6 mL/phút Error! Bookmark not defined

Hình 3.13: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dòng 0,4 mL/phút Error! Bookmark not defined

Hình 3.14: Biểu đồ sự phụ thuộc diện tích píc của các alkaloid vào nồng độ amoniacetat trong pha động Error! Bookmark not defined

Hình 3.15: Sơ đồ quy trình chiết mẫu dự kiến Error! Bookmark not defined

Hình 3.16 : Biểu đồ ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết các alkaloid

Error! Bookmark not defined

Hình 3.17 : Biểu đồ ảnh hưởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid Error! Bookmark not defined

Hình 3.18 : Quy trình chiết mẫu tối ưu Error! Bookmark not defined

Hình 3.19 : Sắc đồ chuẩn alkaloid, mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn Error!

Bookmark not defined

Hình 3.20: Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ Atropin trong khoảng

0,5-100 ng/mL Error! Bookmark not defined

Hình 3.21: Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ aconitin trong khoảng

5-1000 ng/mL Error! Bookmark not defined

Hình 3.22: Đường chuẩn Scopolamin (R2 = 0,9999) Error! Bookmark not defined

Hình 3.23: Sắc đồ của nicotin tại giới hạn phát hiện LOD 1,0 µg/kg (S/N = 3,6)

Error! Bookmark not defined

Hình 3.24: Sắc đồ của Brucin tại giới hạn định lượng LOQ 10 µg/kg (S/N = 11,5)

Error! Bookmark not defined

Hình 3.26: Sắc đồ atropin trong mẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,1 mg/kg Error! Bookmark not defined

Hình 3.27: Sắc đồ scopolamin trong mẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,2 mg/kg Error! Bookmark not defined

Hình 3.28: Sắc đồ mẫu phát hiện brucin Error! Bookmark not defined

Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phát hiện strychnin Error! Bookmark not defined

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

APCI Atmospheric pressure chemical

ionization

Chế độ ion hóa ở áp suất khí quyển

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IUPAC International Union of Pure and

Applied Chemistry

Liên minh quốc tế về hóa học

cơ bản và ứng dụng

UPLC-MS/MS

Ultral performance liquid

chromatography tandem mass

spectrometry

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của thực vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn cây thuốc và dược liệu quý Trong đó alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều cây thuốc Alkaloid là amin nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhưng các amin do động vật và nấm tạo ra cũng được gọi là các alkaloid Cấu trúc bao gồm carbon, hydro, nitơ, và thường có oxy Các alkaloid là bazơ hữu cơ tương tự như kiềm (bazơ

vô cơ); tên có nghĩa là như kiềm Alkaloid xuất hiện chủ yếu trong các chi khác nhau của thực vật có hạt, chẳng hạn như cây thuốc phiện và cây thuốc lá, mã tiền… Chúng có thể được tìm thấy trong hầu hết các bộ phận của các loại thực vật này, bao gồm cả lá, rễ, hạt, và vỏ cây Mỗi một phần của thực vật thường có chứa một số chất hóa học liên quan đến alkaloid Chức năng của alkaloids trong chuyển hóa thực vật chưa được biết, nhưng hầu hết các alkaloid có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ thống thần kinh của người và động vật khác Trong số hàng trăm alkaloid được tìm thấy trong tự nhiên, chỉ có khoảng 30 chất được sử dụng thương mại Một số alkaloid, chẳng hạn như nicotin, được sử dụng trong thuốc trừ sâu, và một số khác được sử dụng làm thuốc thử hóa học Tuy nhiên, các alkaloid được sử dụng chủ yếu trong y học, bởi vì chúng có thể tác động một cách nhanh chóng trên các khu vực cụ thể của

hệ thần kinh Alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều thuốc gây mê, thuốc an thần, các chất kích thích và thuốc an thần Chúng được dùng bằng đường uống và tiêm Ngoại trừ dưới sự giám sát của bác sĩ, sử dụng các alkaloid là nguy hiểm, bởi vì hầu hết hình thành thói quen (ví dụ, gần như tất cả các chất ma tuý là alkaloid) và dùng liều lượng lớn có thể là độc hại

Trong dân gian ta thường sử dụng các cây thảo dược như cà độc dược, mã tiền, củ ấu tàu… dùng để chữa bệnh nhưng trong các loại cây này có chứa một hàm

lượng không nhỏ các chất độc nhóm alkaloid Hiện nay, một số loại thực phẩm chức

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1 Trần Quốc Bình, Đỗ Thị Oanh (2011), "Góp phần nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu và bán thành phẩm cà độc dược sử dụng trong chế phẩm Camat", tạp chí Dược học,421,tr.45-49

2 Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007),

Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bản

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội

3 Khoa dược (2008), "Giáo trình dược liệu", tập II, NXB ĐH Y Dược TP.HCM

4 Phạm Thanh Kỳ (1998), "Bài giảng dược liệu", tập II, NXB Đại học Dược Hà Nội

5 Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học

6 Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, ĐH

Quốc Gia Hà Nội

7 Lương Thị Phấn (2014), Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin

trong huyết tương bằng phương pháp HPLC, khóa luận tốt nghiệp, Trường

Đại học Dược Hà nội

8 Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học

trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

9 Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóa

học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội

10 Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích, khoa Hóa

học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

11 Trần Thị Văn Thi, Trần Thanh Minh (2011), "Nghiên cứu phân lập và nhận dạng cấu trúc alkaloid trong dịch chiết từ lá vông nem Thừa Thiên Huế", tạp chí Khoa học Đại học Huế, 65, tr.225-230

12 Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 1, NXB Y học

13 Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 2, NXB Y học

14 Trường Đại học Dược Hà Nội (2001), Dược liệu, Nhà xuất bản Y học

15 TS Đỗ Thị Tuyên Viện CNSH Việt Nam , Bài giảng công nghệ tách chiết các

hợp chất thứ sinh

16 Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I,

NXB khoa học kỹ thuật

17 Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II,

NXB khoa học kỹ thuật

18 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), "Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật", NXB Khoa học và Kỹ thuật

Tiếng Anh

19 AOAC International (2007), How to meet ISO 17025 requirements for method

verification, USA

20 Borbla Boros, Agnes Farkas, Silvia Jakabova, Ivett Bacskay (2000), “LC-MS Quantitative Deterrmination of Atropine and Scopolamine in the Floral Nectar

of Datura Species”, Journal of Chromatographia, 58, 1–37

21 Dirk Steinmann, Markus Ganzera (2011), “Recent advances on HPLC/MS in

medicinal plant analysis”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, 55, 744-757

22 Hua-Tao Feng, Sam F.Y Li (2002), “Deterrmination of five toxic alkaloids in

two common herbal medicines with capillary electrophoresis”, Journal of

Chromatography A, 1-2, 243–247

23 Huiqin Wu, Xiaoting Xiong, Xiaolan Huang, Zhixin Zhu (2013), “ Simultaneous deterrmination of 17 toxic alcaloids in human fluids by liquid chromatography coupled whith electrospray ionization tandem mass

spectrometry”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies,

36:9, 1149-1162

24 Goodman, L (2006), “Goodman & Gilman's the pharmacological basis of

therapeutics” (11 ed.), New York: McGraw-Hill

25 José Diana Di Mavungu, Svetlana V Malysheva, Melanie Sanders, Daria Larionova (2012), “Development and validation of a new LC–MS/MS method for the simultaneous deterrmination of six major ergot alcaloids and their corresponding epimers Application to some food and feed commodities”,

Food Chemistry, 135, 292–303

26 Miao Li, Xiao-Fang Holi, Jie Zhang, Si-Cen Wang, Qiang Fu, Lang-Chong He (2011), “Applications of HPLC/MS in the analysis of traditional Chinese

medicines”, Journal of Pharmacertical Analysis, 1:2, 81- 91

27 Lounasmaa M.; Tamminem T.(1993), The Alkaloids, Academic Press: New

York, 114

28 Peihong Qiu, Xiaohong Chen, Xiang Chen (2008), “Simultaneous deterrmination of five toxic alkaloids in body fluids by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass

spectrometry”, Journal of Chromatography B, 875(2), 471–477

29 R.E Ardrey (2003), “Liquid chromatography-mass spectrometry: an

introduction”, New York, J Wiley

30 Somenath Mitra (2003), “Sample Preparation Techniques in Analytical

Chemistry’’, John Wiley & Sons

31 Tadeusz Aniszewski (2012), Alcaloids - Secrets of Life, Alkaloid Chemistry,

Biological Significance and applications and ecological Role, Elsevier Science