Phân lập và tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao từ bánh men thu thập tại Yên Phong Bắc Ninh.

Trước hiện trạng đó, để góp phần nâng cao chất lượng rượu và tối ưu hóa khả năng lên men của một số chủng nấm men tại địa phương tôi tiến hành “Phân lập và tuyển chọn những chủng nấm men

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MẪN VĂN HOẰNG

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG NẤM MEN

CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƯỢU CAO TỪ BÁNH MEN THU

THẬP TẠI YÊN PHONG - BẮC NINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoa :CNSH & CNTP Khóa học : 2011 - 2015

Thái Nguyên, 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MẪN VĂN HOẰNG

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG NẤM MEN

CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƯỢU CAO TỪ BÁNH MEN THU

THẬP TẠI YÊN PHONG - BẮC NINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoa : CNSH & CNTP

Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hướng dẫn: TS Trần Văn Chí

Thái Nguyên, 2016

LỜI CẢM ƠN

Được sự tạo điều kiện giúp đỡ, quan tâm của các thầy cô giáo và bạn

bè, trong thời gian vừa rồi tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình tại phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực Phẩm – Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS.Trần Văn Chí giảng viên khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực phẩm trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện làm khóa luận tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực Phẩm đã chỉ bảo, hướng dẫn tận tình các kỹ năng phòng thí nghiệm Động viên tình thần và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian hoàn thánh khóa luận

Thái Nguyên, ngày tháng năm

Người thực hiện

Mẫn Văn Hoằng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thành phần của 1 lít môi trường Hansen 30

Bảng 3.2 Thành phần của 1 lít môi trường Malt – Cao Nấm Men - Peptone 30

Bảng 4.1 Kết quả đo giá trị OD của 50 chủng nấm men phân lập được 35

Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 50 chủng nấm men 37

Bảng 4.3 Kết quả thử khả năng lên men các loại đường 40

Bảng 4.4 Kết quả thử khả năng lên men dịch chiết malt ở các tỉ lệ 41

Bảng 4.5 Kết quả chưng cất dịch tinh bột cơm và dịch chiết malt 43

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cấu tạo tế bào nấm men [11] 17 Hình 3.1 Hình ảnh 1 số khuẩn lạc 32 Hình 3.2 Ảnh kết quả của việc quan sát qua kính hiển vi chủng 43.1 33 Hình 4.1 Kết quả thử khả năng lên men đường glucose của một số chủng 40 Hình 4.2 Hình ảnh kết quả thử khả năng lên men trong dịch chiết malt 41 Hình 4.3 Hình ảnh một số chủng thử hoạt tính catalase 42 Hình 4.4 Đồ thị kháo sát sự ảnh hưởng của nồng độ đường tới sự phát triển

của chủng nấm men 34.1 44 Hình 4.5 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của nồng độ peptone đến sự phát triển

của chủng nấm men 34.1 44 Hình 4.6 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của PH ban đầu đến sự sinh trưởng phát

triển của chủng nấm men 34.1 45

MỤC LỤC

Trang

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 7

1.1 Đặt vấn đề 7

1.2 Mục tiêu và yêu của đề tài 8

1.2.1 Mục tiêu của đề tài 8

1.2.2 yêu cầu của đề tài 8

1.3 Ý nghĩa của đề tài 8

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 8

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 8

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

2.1 Sơ lược về rượu 9

2.1.1 Phân loại rượu 9

2.1.2 Quy trình sản xuất Rượu [9] 12

2.2 Nấm Men 16

2.2.1 Hình thái và cấu tạo nấm men [2] 16

2.2.2 Dinh dưỡng nấm men [2] 18

2.2.3 Sinh sản của nấm men [2] 22

2.2.4 Sinh trưởng của nấm men [2] 23

2.2.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men[2] 24

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Đối Tượng và Phạm Vi Nghiên Cứu 29

3.1.1 Đối Tượng 29

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 29

3.2 Thời gian và địa điểm 29

3.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 29

3.3.1 Thiết bị 29

3.3.2 Dụng cụ 29

3.3.3 Hóa chất 29

3.4 Nội dung nghiên cứu 30

3.5 Các phương pháp nghiên cứu 30

3.5.1 Phương pháp nghiền và pha loãng mẫu [7] 30

3.5.2 Phương pháp phân lập [3] 31

3.5.3 Phương pháp cấy truyền và giữ giống [3] 31

3.5.4 Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái 31

3.5.5 Phương pháp dịch chiết malt [1] 33

3.5.6 Phương pháp đếm số lương tế bào trên buồng đếm hồng cầu [7] 33

3.5.7 Phương pháp xác định sinh khối nấm men bằng phương pháp đo OD [7] 33

3.5.8 Phương pháp xác định khả năng lên men [1] 34

3.5.9 Phương pháp chưng chất xác định nồng độ rượu [8] 34

PHẦN 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 35

4.1 Kết quả phân lập 35

4.2 Tuyển chọn một số chủng nấm men cá khả năng lên men rượu mạnh 39

4.2.1 Thử khả năng lên men các loại đường 39

4.2.2 Thử khả năng lên men trong dịch chiết Malt 41

4.2.3 Thử hoạt tính Catalase 42

4.2.4 Xác định nồng độ cồn và tuyển chọn 42

4.3 Tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng và phát triển của chủng Sacchoromyces cerevisiae 34.1 43

4.3.1 Khả năng sử dụng nguồn carbon ( đường glucose) 43

4.3.2 Khả năng sử dụng nguồn nitơ (peptone) 44

4.3.4 Ảnh hưởng của PH 44

4.4 Định danh sơ bộ 45

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Đề nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Nước ta là một nước nông nghiệp, với nhiều nếp văn hóa truyền thống của từng vùng miền khác nhau Từ miền Bắc tới miền Nam cây lúa

đã gắn bó lâu đời và trở lên quen thuộc

Xa hơn, từ thời trung cổ ở châu Âu việc trồng lúa cũng khá là phổ biến và rộng rãi Cho lên các sản phẩm từ lúa cũng được con người tạo ra trong đó có bia, rượu Một loại đồ uống mà cho đến bây giờ vẫn được ưu chuộng sử dụng rộng rãi

Việc làm ra bia rượu lúc đó rất thô sơn đơn giản, nên chất lượng chưa được cao Vì lúc đó con người chưa hiểu rõ được bản chất của việc sinh ra rượu cũng như các điều kiện trong đó

Hiện tại sau nhiều thế kỉ, với sự tiến bộ và phát triển của loài người

đã nắm được nhiều kiến thức về khoa học kỹ thuật Chất lượng rượu đã được nâng lên rõ dệt, con người đã biết tuyển chọn lọc những chủng vi sinh vật trong quá trình làm rượu Quá trình đó gọi là lên men rượu, bia Chủng vi sinh vật sử dụng trong quá lên men chủ yếu là nấm men Mỗi vùng miền khác nhau lại có các chủng nấm men khác nhau và chất lượng rượu cũng khác nhau Ở quy mô sản xuất rượu nhỏ lẻ hộ gia đình ở các vung quê của nước ta, việc sử dụng các chủng nấm men vẫn còn mang tính dân dã theo kinh nghiệm Cho nên việc lên men rượu vẫn chưa được tối ưu hóa khả năng lên men và chất lượng rượu chưa được ổn định

Trước hiện trạng đó, để góp phần nâng cao chất lượng rượu và tối

ưu hóa khả năng lên men của một số chủng nấm men tại địa phương tôi

tiến hành “Phân lập và tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng

lên men rượu cao từ bánh men thu thập tại Yên Phong- Bắc Ninh”

nhằm tìm ra chủng nấm men tốt nhất tại đó và tối ưu hóa được các điều kiện sinh trưởng phát triển của nó Phục vụ cho viêc nghiên cứu và ứng dụng vào thực tế

1.2 Mục tiêu và yêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu của đề tài

Từ các mẫu bánh men thu thập được tại địa phương, ta tiến hành phân lập và tuyển chọn ra các chủng có khả năng lên men rượu tốt nhất

và tối ưu hóa được điêu kiện nuôi cấy

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

Phân lập được các chủng nấm nen từ mẫu bánh men

Tuyển chọn ra được các chủn nấm men có khả năng lên men rượu cao nhất và định danh

Tối ưu hóa điều kiện nuôi cây và sinh trưởng của các chủng nấm men đó

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Sơ bộ đánh giá được trong mẫu bánh men thu thập được có những loại vi sinh vật nào là chủ yếu và ý nghĩa của các loại vi sinh vật đó trong quá trình lên men

Tìm được chủng nấm men có khả năng lên men tốt nhất trong mẫu bánh men

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sau khi có kết quả của đề tài có thể ứng dụng vào quy mô sản xuất rượu nhỏ lẻ tại địa phương và là tiền đề để ứng dụng trong quá trình lên men rượu với quy mô công nghiệp

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về rƣợu

2.1.1 Phân loại rượu

Rượu là loại đồ uống chứa cồn (anchol) có nhiều loại rượu và hương vị cũng khác nhau tùy vào điều kiện sản xuất và vùng miền khí hậu khác nhau Dựa vào công nghệ sản xuất rượu, rượu được phân thành

3 loại rượu chính :

2.1.1.1 Rượu chưng cất: Loại rượu này dùng những nguyên liệu chứa

đường và tinh bột, nhưng sau khi lên men được cất lại Rượu chưng cất là những loại rượu nặng như: Brandy, Whisky, Rhum, và Vodka…

Cognac: Được sản xuất từ vùng Cognac của Pháp Cognac được chưng cất từ nho Sau khi hái trái, Nho được ép lấy nước cốt rồi mới đưa vào nồi cất Rượu mới cất không có màu chứa khoảng 70% cồn, còn mùi

vị trái cây Rượu được đổ vào thùng gỗ sẽ dần đổi thành màu hổ phách và

có hương vị nho dịu Cuối cùng chúng sẽ được pha chế sao cho có mùi vị ngon nhất trước khi đóng chai và dán nhãn

Armagnac: Được làm ở vùng Gscony của Pháp, và chúng cũng được ủ trong thùng gỗ sồi ở địa phương, sau đó pha trộn cho các chất trong rượu quyện vào nhau rồi đóng chai nhưng mùi nặng hơn

WHISKY

Là loại đồ uống có độ cồn cao, chưng cất từ ngũ cốc, có nguồn gốc

từ Ireland, sản xuất để phục vụ cho các buổi lễ và bán ra ngoài, sau đó mới được truyền bá sang Scotch và một số nước khác

Whisky là sản phẩm chưng cất từ những hạt lúa đại mạch, lúa đen, bắp và các loại hạt ngũ cốc có hạt nhỏ khác Trước năm 1820, tất cả các loại Whisky đều được làm ra từ mạch nha của lúa đại mạch (lên có tên gọi khác là Whisky đại mạch) Việc chưng cất loại whisky từ lúa đại mạch pha trộn với bắp xuất hiện vào năm 1830, sau khi bằng sáng chế được cấp Từ đó người ta mới phát hiện rằng Whisky pha trộn có mùi êm dịu hơn

RHUM

Rhum có một lịch sử bắt nguồn từ Châu Á, và được truyền lại sang phương Tây Cây mía được Columbus mang đến Châu Mỹ, Cuba, Rhum được xuất hiện đầu tiên tại vùng này Rhum được chưng cất từ cốt mía hay sản phẩm của cây mía Nó được chưng cất đến khoảng dưới 950 cồn

và được đóng chai ở độ cồn thấp hơn nhiều Rhum còn giữ lại phần lớn hương vị tự nhiên của sản phẩm gốc đó là cây mía

VODKA

Vodka là loại rượu mạnh không màu có nguồn gốc từ các nước Đông Âu điển hình là nước Nga Khi mới chưng cất Vodka đạt độ cồn khoảng 95 độ, sau giảm dần còn 400 – 500 Vodka không nhất thiết phải qua khâu ủ, nhưng cần sử lý nhằm loại bỏ hương vị và màu sắc để trở thành trong suốt, không mùi (chủ yếu sử dụng than hoạt tính để khử chất độc) Đây là loại rượu dễ bay hơi có thể pha chế với nhiều loại trái cây và các hỗn hợp đồ uống khác

GIN

Gin nổi tiếng là được sản xuất tại Hà Lan, Gin được chưng cất từ các loại hạt bắp (bắp, lúa mạch, lúa mì, lúa mạch đen) trộn với hương liệu thảo mộc như hạnh nhân, quế, hạt cooca, gừng, vỏ chanh, cam,….Độ cồn trong rượu Gin thường từ 34 – 47%

2.1.1.2 Rượu lên men thuần túy

Rượu được lên men từ các nguyên liệu có chứa đường và tinh bột

và đều có nồng độ thấp Những điển hình của loại rượu này là: Rượu vang, saké, rượu nếp…

Rượu Nếp Than

Là loại đồ uống có cồn ethanol, được sản xuất hoàn toàn bằng phương pháp thủ công từ một loại gạo nếp đặc biệt Nếp Than (Nếp Cẩm), giống như quy trình sản xuất rượu vang, nếp than thu được từ quá trình lên men không qua chưng cất Điểm khác biệt ở chỗ là sản phẩm cuối là loại rượu chứa cả dịch lên men và bã lên men đã được làm nhuyễn Tức

là sản phẩm rượu được dùng dưới dạng không trong suốt Trong thành phần của mình, ngoài một lượng rượu và một lượng đường với nồng độ nhất định, rượu Nếp Than còn chứa một số chất mà không thể có ở một

số loại rượu chưng cất như vitamin, đặc biệt là các vitamin nhóm B, các aminoacid như asparagine, lysine, glutamic… Vì vậy, rượu Nếp Than là một loại thức uống bổ dưỡng, giúp tiêu hóa tốt thức ăn nếu dùng ở mức

độ vừa phải Người sử dụng sẽ thích thú với cảm giác cay nồng vừa ngọt vừa có hương thơm đặc trưng hấp dẫn không thể có ở các loại rượu khác

Rượu Cần

Là thức uống mang bản sắc văn hóa đặc trưng vùng miền độc đáo của người miền núi Nó được dùng phổ biến ở các dịp lễ hội, ma chay, cưới hỏi trong cộng đồng người dân tộc thiểu số, đặc biệt la đồng bào khu vực Tây Nguyên

Rượu Cần là loại rượu có vị ngọt hơn so với rượu cất, có độ rượu nhẹ và giàu dinh dưỡng Rượu Cần thu được từ quá trình lên men không qua chưng cất

Nguyên liệu chính của rượu Cần là các loại gạo lúa nương Gạo được sát vỏ trấu và được bổ xung nước vào đem nấu, cơm được nấu phải đảm bảo khô, không được nhão Xới cơm tãi trên một tấm đệm và để nguội

Vỏ trấu được dùng để trộn với cơm trước khi cấy men vào hoặc để lót thành lớp mỏng ở dưới đáy bình và phủ lên bề mặt của bình rượu

Việc dùng vỏ trấu nhằm tăng độ tới sốp của cơm và tránh việc thoát hơi nước của nguyên liệu

2.1.1.2 Rượu pha chế

Đây là thứ rượu lên men hoặc rượu cất có pha thêm đường, hương liệu, dược liệu….mà thành Trong nhóm này có các thứ rượu bổ, rượu sâm, Liqueur, cocktail

Cocktail là thức uống rất phổ biến trên thế giới, có tính bổ dưỡng

và không gây say xỉn hỗn hợp được kết hợp từ hai loại rượu trở lên, hoặc được pha trộn với các thức uống không ga hoặc nước uống trái cây,…theo một công thức được quy định tương đối, và vì đây được xem

là thức uống khá dinh dưỡng và mang đầy tính nghệ thuật cho nên cách pha chế cocktail đòi hỏi người pha cần có cảm tính, chứ không phải theo công thức cứng ngắc

2.1.2 Quy trình sản xuất Rượu [9]

2.1.2.1 Chế biến nguyên liệu thành dịch rỉ đường

Nguyên liệu

Trong sản xuất rượu người ta thường sử dụng các loại nguyên liệu sau: Nguyên liệu có sẵn đường như: mật, rỉ đường…

Nguyên liệu có tinh bột như: gạo, ngô, sắn…

Nguyên liệu có cellulose như: gỗ, mùn cưa, rơm dạ…

Trong công nghệ sản xuất rượu hiện nay sử dụng hai loại nguyên liệu phổ biến có sẵn đường và tinh bột Trừ nguyền liệu từ đường và rỉ đường, các nguyên liệu khác đều phải trải qua quá trình đường hóa mới

có thể thực hiện được quá trình lên men nhờ nấm men

Các phương pháp đường hóa

Các nguyên liệu chứa cellulose, hemicellulose được đường hóa bằng acid (HCl, H2SO4) và nhiệt độ cao Các nguyên liệu chứa tinh bột được đường hóa bằng nhiều phương pháp khác nhau

Phương pháp đường hóa bằng bánh men

Đây là phương pháp đường hóa được sử dụng rộng dãi trong dân gian để đường hóa các nguyên liệu chứa tinh bột Trong bánh men có

nấm mốc được nuôi cấy phát triển trên môi trường tinh bột sống Nấm mốc trong bánh men có hệ enzyme amylaza có vai trò trong đường hóa tinh bột Quá trình đường hóa tinh bột không nhất thiết phải hồ hóa tinh bột thành dung dịch mà chỉ cần làm chín tinh bột (theo kiểu đồ cơm) ở nhiệt độ khoảng 130 – 1400C để các cấu trúc tinh bột dễ dàng bị phá vỡ Lúc này tinh bột chuyển sang dạng dễ tan, làm cho hệ enzyme amylaza của nấm mốc có thể phân hủy dễ dàng Tuy vậy, do tinh bột không ở dạng dung dịch nên hạn chế sự tác dụng của enzyme amylaza lên các mạch tinh bột làm cho hiệu xuất của quá trình đường hóa không cao, dễ

bị nhiễm tạp khuẩn, khi lên men sẽ tạo ra nhiều sản phẩm trung gian Phương pháp này chỉ được sử dụng trong sản xuất rượu thủ công

Phương pháp Maltase

Người ta thường dùng enzyme (α và β amylaza) của malt để

chuyển hóa tinh bột đã được hồ hóa thành đường lên men

Phương pháp này có những ưu điểm như:

- Thời gian hồ hóa tinh bột ngắn

- Chất lượng rượu không bị ảnh hưởng mà còn tạo ra hương thơm đặc biệt dễ chịu

- Ít bị nhiễm khuẩn

Tuy nhiên phương pháp này cũng có nhược điểm như:

- Hiệu suất đường hóa không cao, không triệt để do hệ enzyme amylase trong malt không hoàn chỉnh

- Thường áp dụng cho các nước sứ lạnh có điều kiện trồng đại mạch và tiểu mạch

- Giá thành sản xuất rượu cao, do hàm lượng bột malt sử dụng để đường hóa cao, nhất là với các nước phải nhập khẩu bột malt

Phương pháp Myco – Malt

Đây là phương pháp được dùng phổ biến hơn ở cả trong và ngoài nước, quá trình đường hóa nhờ enzyme của vi sinh vật chủ yếu la nấm

mốc Các loại nấm mốc được sử dụng có khá nhiều loài thuộc chi

Aspergillus và chi Endomycopsis thời gian thực hiện quá trình đường hóa

dài hay ngắn con tùy thuộc vào chủng nấm mốc và nguyên liệu sử dụng

Chất lượng của quá trình đường hóa được đánh giá theo hoạt lực của amylaza, dextrinaza, glucoamylaza

Kết quả của quá trình đường hóa sẽ cho ra các sản phẩm hỗn hợp gồm dextrin, maltoza, glucoza trong đó glucose chiếm tỉ lệ cao nhất

2.1.2.2 Lên men đường thành rượu [9]

Đây là giai đoạn quan trọng nhất trong sản xuất rượu – quyết định đến chất lượng của sản phẩm tạo thành

Sau khi có dịch đường hóa hay hay dịch đường đã sử lý, người ta

se bổ xung thêm một số thành phần để cung cấp thêm vitamin và amino acid như muối ammonium, muối phốt phát dịch thủ phân nấm men…

Quá trình lên men: Môi trường lên men sau khi khử trùng, kiểm tra nồng độ đường đạt 90 – 120 g/l và PH = 4,5 – 4,8 thì có thể cấy giống vào Thời gian lên men từ 60 - 72 giờ trong đó 10 giờ đầu có sục khí cho nấm men sinh sôi nảy nở và bắt đầu lên men yếm khí

Phương trình tổng quát của quá trình lên men đường thành rượu:

C6H12O6 →2C2H5OH +2CO2 + 27kcal Trong quá trình lên men rượu, dịch lên men thu được sau khi quá trình lên men kết thúc, ngoài sinh khối nấm men còn có các thành phần khác: sản phẩm chính là ethanol, CO2 và các sản phẩm phụ như glixerin, acid succinic, các aldehyde, và một số loại rượu bậc cao như isomalic Isobutylic, propiolic…

Cơ chế của quá trình lên men

Đường và các chất dinh dưỡng của môi trường lên men được hấp thụ và khuếch tán vào bên trong tế bào nấm men qua màng tế bào Trong

tế bào nấm men, nhờ hoạt động sống của tế bào và hoạt động xúc tác của hàng loạt các Enzyme làm cho những phản ứng hóa sinh sảy ra dẫn đến

sự phân giải và tổng hợp các chất khác nhau Rượu và CO2 được tạo thành và thoát khỏi tế bào

2.1.2.3 Chưng cất và tinh chế cồn[9]

Khi kết thúc lên men rượu, sau khi đã loại bỏ tế bào nấm men muốn được rượu tinh khiết cần phải chưng cất dịch lên men để loại bỏ tạp chất kỹ thuật cất rượu có ảnh hưởng lớn đến chất lượng rượu thu được, tỷ

lệ tạp chất cũng như chất lượng rượu rượu bị ảnh hưởng bởi nguyên liệu nuôi cấy

Quá trình chưng cất rượu diễn ra theo các giai đoạn sau:

- Giai đoạn thu rượu thô: Khi kết thúc quá trình lên men, đem chưng cất dịch lên men ta thu được rượu thô (quá trình chưng cất sẽ tách rượu và các chất dễ bay hơi khác ra khỏi dịch lên men)

- Giai đoạn tinh chế: Tách tạp chất ra khỏi cồn thô để thu được rượu tinh khiết Trong cồn thô, ngoài rượu ethanol còn chứa nhiều tạp chất khác Dựa vào trọng lượng phân tử và khả năng bay hơi người ta chia tạp chất ra làm 3 loại:

+ Tạp chất đầu: Loại này có nhiệt độ sôi cao hơn thấp hơn nhiệt

độ sôi của ethanol như aldehyde acetic, ethyl acetat… chúng được lấy ra

ở giai đoạn đầu của quá trình tinh chế

+ Tạp chất cuối: Loại này có nhiệt độ sôi cao hơn ethanol và khó bay hơi, đó là các rượu cao phân tử như isoamylic, isobutylic….chúng ít hòa tan trong nước

+ Tạp chất trung gian: Đặc tính của tạp chất trung gian là tùy vào nồng độ rượu và tính chất vật lý của các tạp chất mà nó sẽ bay hơi cùng với tạp chất đầu hay ở lại cung tạp chất cuối

Sau tinh chế tách được 3 loại tạp chất trên ta sẽ thu được rượu tinh khiết Giống vi sinh vật trong sản xuất rượu được sử dụng chủ yếu là các

chủng nấm men Sacchoromyces cerevisiae Các chủng nấm men dùng

trong sản xuất phải có những đặc điểm sau:

- Có đầy đủ các đặc điểm đặc trưng của nấm men

- Tốc độ phát triển mạnh, hoạt lực lên men cao

- Lên men được nhiều loại đường khác nhau và có tốc độ lên men cao

- Thích nghi được với các điều kiện khí hậu không thuận lợi của môi trường, đặc biệt là chất sát trùng

- Riêng các chủng nấm men ở nước ta phải có khả năng lên men trong nhiệt độ cao ≥350C

Mặc dù ở mỗi vùng có những loại rượu riêng và phương pháp sản xuất riêng Nhưng đều có đặc điểm chung là được lên men truyền thống

từ hệ vi sinh vật có trong bánh men đặc trưng của từng vùng

và giai đoạn phát triển

Tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn, chiều dài khoảng 8 đến 10 micromet

2.2.1.2 Cấu tạo tế bào nấm men[1]

- Tế bào nấm men có cấu tạo dạng đơn bào Gần giống với tế bào động vật và thực vật, đã tiến hóa hơn so vơi tế bào vi khuẩn có những cấu tạo (nhân có màng, có nhiễm sắc thể, phân bào có tơ)

- Tế bào nấm men có cấu tạo phức tạp, trong tế bào có những cơ quan tử của tế bào các chất nội bào, thể vùi của tế bào

Hình 2.1 Cấu tạo tế bào nấm men [11]

Vỏ Tế Bào: Bao quanh tế bào nấm men là lớp màng mỏng, đàn hồi,

để định hình cũng như chống lại các tác nhân bên ngoài ngoài ra còn mang điện Để điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào, điều chỉnh các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi vào trong tế bào Có cấu tạo hóa học bao gồm các phức hợp chất chứa protein-polysacarit Phosphate và lipit dày khoảng 25nm và chiếm khoảng 25% trọng lượng của tế bào

Tế Bào Chất: Tế bào chất hay còn gọi là nguyên sinh chất ở thể dạng keo chứa tất cả các cấu trúc cơ bản của tế bào như riboxom, ti thể, các chất dự chữ, lưới nội chất… tế bào chất thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi của nó, khi trẻ nguyên sinh chất ở dạng đồng nhất còn khi già nó trở nên không đồng nhất Xuất hiện không bào, giọt chất béo, lipit, polysacarit, các thể vùi, các Enzyme tham gia vào các phản ứng sinh hóa…vv

Riboxom: Ở dạng các hạt siêu hiển vi cấu tạo từ lipit, protit, và axit ribonucleic (RNA) Tại đây diễn ra quá trình tổng hợp protein từ các chuỗi amino axit được hoạt hóa từ ti thể

Ti Thể: Ở dạng hạt rất nhỏ hoặc dạng que dạng sợi phân bố trong

tế bào chất ở khoảng không giữa vỏ tế bào và không bào Trong tế bào nấm men tế bào nấm men thường có từ 1 đến 50 ti thể, tùy vào nồng độ glucose trong môi trường Ở môi trường có nồng độ glucose thấp có

khoảng 100 đến 200 ti thể Trong ti thể có chứa các enzyme để thực hiện các phản ứng oxy hóa để cung cấp năng lượng và tham gia vào các phản ứng tiếp theo

Nhân: Nhân tế bào nấm men có màng nhân, bảo vệ nhân và tham gia vào quá trình điều hòa của nhân Có đường kính khoảng 2 micromet kích thước của nhân không đồng nhất ở các tế bào khác nhau và ở các giai đoạn phát triển khác nhau và phần lớn ở dạng hình cầu hình elip… Trong nhân chứa nhiều axit nucleic tham gia vào quá trình truyền đạt thông tin di truyền

2.2.2 Dinh dưỡng nấm men [2]

Người ta thường chia dinh dưỡng nấm men thành 2 nguồn đó là dinh dưỡng nội bào và dinh dưỡng ngoại bào Các chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng vào bên trong tế bào, khi môi trường đã cạn kiệt các chất dinh dưỡng thì các chất dự trữ nội bào như glycogen, lipit, sẽ được

sử dụng

Vận Chuyển Các Chất Qua Màng Tế Bào:

Các chất được vận chuyển qua màng tế báo nấm men theo 2 cơ chế chủ động và thụ động Vận chuyển chủ động đòi hỏi tiêu hao năng lượng để thấm các hợp chất chứa Oxy vào để thực hiện các phản ứng khử tiếp theo

Dinh Dưỡng Cacbon

Nguồn dinh dưỡng cacbon của nấm men bào gồm các chất như đường và các dẫn xuất, rượu, amino axit, axit hữu cơ Đa số các chủng nấm men đều không có enzyme xenlulaza và amylaza nên không thể sử dụng trực tiếp được tinh bột và xululoza, gần đây có một số công trình

nghiên cứu cho thấy một số chủng giống thuộc Candida có hoạt tính

amylaza ngoại bào, song vẫn chưa chủng này vào trong sản xuất công nghiệp cũng như trong thực tế

Các nguồn Carbon dinh dưỡng trước hết phải kể đến các loại đường glucose thuộc loại đường 6 (hexose) được tất cả các loại nấm men

sử dụng

Tỷ số các đường được nấm men sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài Qua đây ta có thể xây dựng được phương pháp chuẩn đoán các

loại nấm men Phần lớn các loài giống Saccharomyces khác nhau giữa

chúng trước hết là quan hệ với các đường trong quá trình trao đổi chất hydratcarbon Đối với nguồn các bon khác như các loại rượu và acid hữu

cơ thì mối quan hệ này giống nhau ở tất cả các loài của cùng một giống

Các loài Saccharomyces lên men rượi vang sử dụng glucose,

fructose, maltose, saccarose và galactose

Axit axetic và glucose được sử dụng đồng thời như là một quy luật, trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn cacbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trưởng tốt sẽ được sử dụng trước

Trong nuôi cấy liên tục nấm men có tốc độ sinh trưởng cùng với tốc độ pha loãng của môi trường thì những hợp chất có nhiều Carbon trong phân tử sẽ được sau cùng

Những loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cũng có khả năng đồng hóa vật chất như nhau Có thể nói, các loài khác nhau

đồng hóa dinh dưỡng là khác nhau Thí dụ: các loài Candida natalensis

và C.parapsilosis đồng hóa rất tốt galactoza nhưng C.clausseni lại không đồng hóa được đường này Sacchoromyces cerevisia chỉ bắt đầu sử dụng

được galactose từ ngày thứ hai sau khi nuôi cấy

Những disacarit (maltoza và saccaroza) trước khi được nấm men

sử dụng phải qua thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men Nấm men chuyển từ sống kỵ khí sang sống hiếu khí thì khả năng sử dụng glucose và maltose sẽ bị giảm, nhưng với saccarose hoạt tính sử dụng lại được tang gấp 2,5 lần Nấm men sử dụng Maltose chỉ khi trong môi trường không có mặt của glucose và fructose Maltose được lên men hoàn toàn trong pha sinh trưởng ổn định của nấm men

Các acid hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men và có thể là nguồn dinh dưỡng carbon và năng lượng duy nhất

Sử dụng hydrocacbon từ dầu mỏ và khí đốt làm nguồn carbon nuôi cấy nấm men rất được quan tâm trong vài thập kỷ gần đây Đặc biệt là thu sinh khối nấm men từ hydrocacbon làm nguồn protein – vitamin dùng

bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có rất nhiều triển vọng Nhưng vẫn còn ý kiến e ngại các sản phẩm này còn dư lượng những chất nào đó còn chưa

rõ hoặc không xác định được nó ảnh hưởng đến sức khỏe của con người

và vật nuôi ra sao

Ngày nay người ta hoàn thiện thực nghiệm về vai trò của CO2 trong quá trình trao đổi chất của nấm men Thật vậy, giữa tất cả các nguồn carbon hữu cơ có thì khí CO2 là chất hoạt động sinh học Những dạng liên kết với CO2 đều là sản phẩm cần thiết cho nấm men

Dinh Dưỡng Nitơ

Nguồn nitơ cần thiết cho tổng hợp các cấu trúc chứa nitơ của tế bào chất là các hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ có sẵn trong môi trường

Các hợp chất hữu cơ chứa N của tế bào là các acid amine, các nucleotit, purin, pyrimidine, protein và một số vitamin Nấm men có khả năng tổng hợp được tất cả các acid amine …thành phần protein trực tiếp

từ các hợp chất vô cơ trong khi sử dụng nguồn carbon là các chất hữu cơ– sản phẩm trung gian của quá trình dị hóa hydratcacbon trong hô hấp và lên men

Đa số nấm men không đồng hóa được nitrate Song, giống

Hasenula và giống Pichialại đồng hóa được chất này Một số loài thuộc

giống Brettanomyses cũng đồng hóa được nitrate

Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt nhất là các muối moni của acid vô cơ cũng như hữu cơ Đó là amoni sulfat, phosphate rồi đến các muối acetat, lactade, malade và succinade

Trong môi trường có muối ammonium, đặc biệt là sulfate, thì nấm men sẽ sử dụng gốc acid còn lại sẽ được sử dụng sau hoặc ít sử dụng sẽ làm cho môi trường acid hóa, giảm PH

Trong môi trường lỏng ammoniac (NH3) ở NH4

+

gần với tiền chất nhất của Nitơ hữu cơ là nguồn N rất dễ cho nấm men sử dụng, chỉ xếp sau các acid amine Nấm men còn sử dụng được urea và peptone Trong môi trường lỏng urea sẽ bị ureaza của nấm men phân ly thành NH4+

và

CO2 Để thu sinh khối Saccharomyces được tốt trong môi trường nên có

mặt cả nguồn Nitơ vô cơ và hữu cơ

Các nguồn Nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amine (Nấm men chỉsử dụng được acid amine ở dạng tự nhiên), các peptide, các nucleotide…Trong thực tế người ta hay dùng ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc…) làm nguồn N hữu cơ

Dinh Dưỡng các nguyên tố vô cơ

Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh nói chung, trong đó có nấm men, phosphor (P) được quan tâm trước hết,sau đó là kali (K) và magie (Mg), lưu huỳnh (S)…

Như chúng ta đã biết phosphor tham gia vào quá thành phần quan trọng của tế bào như các nucleoproteide, acid nucleic, polyphosphate, phospholiphid….các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt biệt là trao đổi chất hydrocarbon trong vận chuyển năng lượng Nấm men sử dụng rất tốt nguồn phosphor

vô cơ là orthophosphate Hợp chất này chuyển thành polyphosphate và sau khi hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp Khi không đủ P trong môi trường sự troa đổi chất ở nấm men bị thay đổi đáng kể liên quan đến sự phá vỡ nhau cầu và sử dụng hydratcacbon và nitơ Nhu cầu sinh lý về P đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10 – 13 mg P

Trong phòng thí nghiệm vi sinh ta thường dùng KH2PO4 và

K2HPO4 làm nguồn cung cấp P và K Trong sản xuất thường dùng dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P

Lưu huỳnh là thành phần của một số acid amine trong phân tử protein và là nhóm (-SH) của enzyme CoA Bởi vậy, khi không có mặt lưu huỳnh trong môi trường nuôi cấy thì sự trao đổi chất của tế bào bị vi phạm và có thể không tổng hợp được protein Trong môi trường với hàm lượng lưu huỳnh nhỏ làm tang sự nảy chồi của nấm men Nhưng ở nồng

độ 1mg/l S đã kìm hãm quá trình này Do vậy, khi sử dụng các nguồn lưu huỳnh dinh dưỡng cho vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men cần phải thận trọng

Dinh Dưỡng Các Chất Sinh Trưởng

Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các bazơ purin

và pyrimidin Nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men không có sắc

tố là 6 vitamin nhóm B

Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men (dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo hoặc cám mì) dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme

và đặc biệt là rỉ đường

Acid amine ngoài vai trò là nguồn nitơ hữu cơ và cả nguồn carbon hữu cơ được vi sinh vật sử dụng trực tiếp làm vật liệu xây dựng tế bào còn là các chất kích thích sinh trưởng của một số chủng nấm men

2.2.3 Sinh sản của nấm men [2]

Nấm men có hai hình thức sinh sản: sinh sản hữu tính (bằng bào tử) và vô tính bằng nảy chồi hoặc phân cắt tế bào Tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy nấm men sẽ sinh trưởng vô tính hay sinh sản hữu tính