Nghiên cứu phân lập và khả năng lên men của một số chủng vi sinh trong môi trường có bổ sung tảo xoắn (spỉulina spp ) (LV02004)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 HÀ ÁNH NGỌC NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢ NĂNG LÊN MEN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG CÓ BỔ SUNG TẢO XOẮN SPIRULINA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

HÀ ÁNH NGỌC

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢ NĂNG LÊN MEN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT

TRONG MÔI TRƯỜNG CÓ BỔ SUNG

TẢO XOẮN (SPIRULINA spp.)

Chuyên ngành: Sinh thái học

Mã số: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2016

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ của Viện Vệ sinh Dịch

tễ Trung ương đã giúp đỡ tôi trong quá trình chụp ảnh mẫu để hoàn thành nghiên cứu của mình

Cảm ơn cán bộ ở khoa học công nghệ - Tỉnh Vĩnh Phúc đã giúp đỡ tôi phân tích mẫu hoàn thành luận văn của mình

Cùng với đó là sự biết ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Hà Nội, tháng 08 năm 2016

Học viên

Hà Ánh Ngọc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung Luận văn này không có sự trùng lặp với các

đề tài khác

Hà Nội, tháng 08 năm 2016

Học viên

Hà Ánh Ngọc

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

6 Đóng góp mới của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về tảo xoắn (Spirulina spp.) 4

1.1.1 ơ lược về tảo xoắn ( pirulina spp.) 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học của tảo xoắn ( pirulina spp.) 4

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng và công dụng của tảo xoắn ( pirulina spp.) 6

1.1.4 Tình hình nghiên cứu của tảo xoắn ( pirulina spp.) hiện nay 8

1.2 Vi sinh vật và quá trình lên men tạo đồ uống có bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 11

1.2.1 Vi khu n lactic 11

Cơ chế của quá trình lên men lactic 12

1.2.2 Vi khu n acetic 13

1.2.3 Nấm men 13

1.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nhóm vi sinh vật lên men tạo đồ uống có bổ sung tảo xoắn ( pirulina spp.) 15

1.3 Ứng dụng (Spirulina spp.) trong thực phẩm, xử lý môi trường, y học và mỹ phẩm 20

1.3.1 Ứng dụng trong thực ph m 20

1.3.2 Ứng dụng trong xử lý môi trường 21

1.3.3 Ứng dụng trong y học 22

1.3.4 Ứng dụng trong mỹ ph m 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 23

2.1.3 Các loại môi trường 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp vi sinh 24

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 26

2.2.2.8 Xác định độ cồn [43] 28

2.2.3 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả [18] 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 30

3.1.1 Phân lập chủng vi khu n lactic có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 30

3.1.2 Phân lập chủng vi khu n acetic có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn ( pirulina spp.) 32

3.1.3 Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường có bổ sung tảo xoắn tảo xoắn ( pirulina spp.) 33

3.2.Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường có bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 35

3.2.1 Tuyển chọn chủng vi khu n lactic có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 35

3.2.2 Tuyển chọn chủng vi khu n acetic có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn ( pirulina spp.) 39

3.2.3 Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường có bổ sung tảo xoắn ( pirulina spp.) 44

3.2.3.1 Tuyển chọn chủng có hoạt lực lên men cao 44

3.2.3.2 Khả năng chịu cồn của các chủng nấm men 45

3.2.4 Kiểm tra tính đối kháng của nhóm vi sinh vật được tuyển chọn lên men

tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn ( pirulina spp.) 47

3.3 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men chế tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 48

3.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trình lên men chế tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn ( pirulina spp.) 48

3.3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ hữu cơ tới quá trình lên men chế tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn ( pirulina spp.) 50

3.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng KH 2 PO 4 tới quá trình lên men chế tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn ( pirulina spp.) 52

3.3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng Mg O 4 7H 2 O tới quá trình lên men chế tạo đồ uống có bổ sung tảo xoắn ( pirulina spp.) 54

3.4 Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến quá trình lên men chế tạo đồ uống trong môi trường có bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 56

3.4.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu 56

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men 58

3.5 Ứng dụng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 60

3.5.1 Lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.) 61

3.5.2 Kiểm tra chất lượng sản ph m 62

3.5.3 Đánh giá cảm quan sản ph m 66

KẾT LUẬN 69

1 Kết luận 69

2 Kiến nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình d ng t o Spirulina spp.) dưới kính hiển vi 5

Hình 3.1 Ảnh chụp tế bào vi khuẩn lactic trên kính hiển vi quang học × 1000 lần 31

Hình 3.2 Ảnh chụp tế bào vi khuẩn lactic trên kính hiển vi điện tử × 10000 lần 32

Hình 3.3 Tế bào vi khuẩn acetic trên kính hiển vi quang học × 1000 lần 33

Hình 3.4 Tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học × 1000 lần 34

Hình 3.5 Ảnh chụp tế bào nấm men trên kính hiển vi điện tử × 10000 lần 34

Hình 3.6 Chuyển hoá ethanol thành acid acetic của các mẫu vi khuẩn acetic 40

Hình 3.7 Ho t tính catalase của vi khuẩn acetic 41

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào ở các mức pH khác nhau trong môi trường lên men của các nhóm vi sinh vật tuyển chọn 58

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào ở các mức nhiệt độ khác nhau trong môi trường lên men của các nhóm vi sinh vật đã tuyển chọn 60

Hình 3.10 Ba mẫu lên men t o nước gi i khát có bổ sung t o xoắn (Spirulinaspp.) 62

Hình 3.11 Kết qu kiểm tra vi sinh đánh giá s n phẩm nước gi i khát 63

Hình 3.12 Kết qu đánh giá s n phẩm nước gi i khát trước khi lên men 64

Hình 3.13 Kết qu đánh giá s n phẩm nước gi i khát sau khi lên men 65

Hình 3.14 Kiểm tra tổng số lợi khuẩn có trong nước gi i khát lên men 66

Hình 3.15 Quy trình lên men t o s n phẩm nước gi i khát có bổ sung t o xoắn (Spirulinaspp.) 68

DANH MỤC BẢNG

B ng 1.1 Thành phần của t o xoắn (Spirulina spp.) 6

B ng 3.2 Đặc điểm hình thái và kích thước của vi khuẩn acetictrong các mẫu phân lập 32

B ng 3.3 Đặc điểm hình thái và kích thước của nấm mentrong các mẫu phân lập 33

B ng 3.4 Độ pH, hàm lượng axit của chủng vi khuẩn lactic 35

B ng 3.5 Chiều cao cặn men của vi khuẩn lactic 36

B ng 3.6 Kết qu thử nghiệm ho t tính catalase của các chủng vi khuẩn lactic 36

B ng 3.7 Kh năng sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn lactic 37

B ng 3.8 Kết qu nhuộm gram của các chủng vi khuẩn lactic 37

B ng 3.9 Kết qu của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn 39

B ng 3.10 Đặc điểm sinh hóa của 6 chủng vi khuẩn acetic 43

B ng 3.11 Hàm lượng khí CO2 gi i phóng sau 7 ngày lên men của nấm men 44

B ng 3.12 Kh năng lên men ở các nồng độ cồn khác nhaucủa 9 chủng nấm men 45

B ng 3.13 Kh năng kết lắng khác nhau của nấm men 46

B ng 3.14 Kh năng lên men các lo i đường 48

B ng 3.15 Ảnh hưởng của hàm lượng đường sacarose đến quá trình lên men của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 49

B ng 3.16 Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ hữu cơ đến quá trình lên men củacác chủng vi sinh vật tuyển chọn 51

B ng 3.17 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến quá trình lên men của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 53

B ng 3.18 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến quá trình lên men của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 55

B ng 3.19 Ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men củacác chủng vi sinh vật tuyển chọn 57

B ng 3.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên mencủa các chủng vi

sinh vật tuyển chọn 59

B ng 3.21 Đánh giá chất lượng s n phẩm nước gi i khátbằng phương pháp

c m quan 67

BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Cùng với sự phát triển ngày càng cao của xã hội thì nghành công nghiệp s n xuất nước gi i khát cũng phát triển m nh mẽ Với xu hướng của thời đ i các s n phẩm nước nước gi i khát lên men được làm từ các nguồn nguyên liệu giá trị dinh dưỡng cao ngày càng được ưa chuộng Hiện nay trên thị trường xuất hiện nhiều lo i nước gi i khát với nhiều hương vị khác nhau (nho, mận, táo, ….) Tuy nhiên, trên thực tế thì hầu như không có các s n phẩm nước gi i khát làm từ t o xoắn

T o xoắn là một lo i vi t o d ng sợi xoắn màu xanh lục T o xoắn (Spirulina

spp.) đã được nghiên cứu từ nhiều năm nay Chúng có những đặc tính ưu việt và giá

trị dinh dưỡng cao Các nhà khoa học trên thế giới đã coi t o (Spirulina spp.) là sinh

vật có ích cho loài người Tổ chức Y tế thế giới WHO/OMS) công nhận t o

(Spirulina spp.) là thực phẩm b o vệ sức khỏe tốt nhất của loài người trong thế kỉ

21 Cơ quan qu n lí thực phẩm và dược phẩm Hoa Kì FDA) công nhận nó là một trong những nguồn protein tốt nhất [17, 36, 39]

Trên thế giới, s n phẩm từ t o xoắn đã được biết đến ở d ng là: thực phẩm,

dược phẩm và mỹ phẩm Năm 1960, Spirulina spp mới bắt đầu được biết đến, lo i

t o này do tiến sĩ Clement người Pháp tình cờ phát hiện khi đến hồ Sat ở Trung Phi Năm 1963 Viện dầu ho Pháp đã bắt đầu quan tâm đến báo cáo về lo i bánh t o

Dihe Được biết đó là t o Spirulina platensis, họ đã tiến hành nghiên cứu lo i t o

này trong phòng thí nghiệm rồi xây dựng quy trình s n xuất thử Từ năm 1970 Công

ty Soda – Texcoco vừa s n xuất soda vừa s n xuất t o trên diện tích kho ng 12 ha với s n lượng mỗi ngày là trên 1 tấn t o khô Năm 1973, Tổ chức Lương nông quốc

tế và Tổ chức Y tế thế giới đã chính thức công nhận Spirulina spp là nguồn dinh

dưỡng và dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa T i

Ấn Độ, một nghiên cứu năm 1995 đã chứng tỏ với liều 1g Spirulina/ngày, có tác

dụng trị ung thư ở những bệnh nhân ung thư do thói quen nhai trầu thuốc Ở Nhật Hiroshi Nakamura cùng Christopher Hill thuộc Liên đoàn vi t o quốc tế cùng một

số nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu Spirulina spp từ năm 1968 Hiện nay trong các

đề tài nghiên cứu chống HIV/AIDS của Nhật, có đề tài sử dụng Spirulina spp [14],

[33]

Ở Việt Nam, s n phẩm từ t o xoắn chủ yếu được biết đến dưới d ng dược phẩm Trong những năm 1985 -1995 đã có nghiên cứu thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học cấp nhà nước như nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Hữu Thước và cộng sự

với đề tài “Công nghiệp nuôi trồng và và xử lý t o Spirulina” Tuy nhiên, s n phẩm

này chỉ mới phát triển ở những năm gần đây và chưa có đề tài nghiên cứu quá trình lên men trong môi trường có bổ sung t o xoắn Vì vậy, việc nghiên cứu quá trình lên men dịch t o xoắn từ đó ứng dụng vào chế biến nước gi i khát t o xoắn, sẽ góp phần làm phong phú các s n phẩm nước uống trên thị trường và tận dụng các ích lợi

từ nguồn dược liệu này đến người tiêu dùng, chính vì vậy tôi tiến hành: “Nghiên

cứu phân lập và khả năng lên men của một số chủng vi sinh vật trong môi trường có bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.)”

2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật có kh năng lên men t o đồ

uống trong môi trường có bổ sung t o xoắn (Spirulina spp.)

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Phân lập chủng vi khuẩn, nấm men có kh năng lên men t o đồ uống

trong môi trường có bổ sung t o xoắn (Spirulina spp.)

3.2 Tuyển chọn được chủng vi khuẩn, nấm men có kh năng lên men t o đồ

uống trong môi trường có bổ sung t o xoắn (Spirulina spp.)

3.3 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men t o đồ

uống trong môi trường có bổ sung t o xoắn (Spirulina spp.)

3.4 Ảnh hưởng của điều kiện lên men t o đồ uống trong môi trường có bổ

sung t o xoắn (Spirulina spp.)

3.5 Ứng dụng để lên men t o đồ uống trong môi trường có bổ sung t o xoắn

(Spirulina spp.)

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu: chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic, nấm men

tuyển chọn từ môi trường lên men có bổ sung t o xoắn (Spirulina spp.)

4.2 Ph m vi nghiên cứu: chủng vi khuẩn và nấm men có kh năng lên men

t o nước gi i khát trong môi trường bổ sung t o xoắn (Spirulina spp.)

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

5.1 Ý nghĩa khoa học

Ứng dụng cơ sở khoa học của quá trình lên men lactic, lên men acetic, lên men

rượu để lên men t o đồ uống trong môi trường có bổ sung t o xoắn (Spirulina spp.)

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

T o đồ uống gi i khát trong môi trường có bổ sung t o xoắn (Spirulina spp.)

6 Đóng góp mới của đề tài

Phân lập được 15 chủng vi khuẩn lactic, 10 chủng vi khuẩn acetic và 9 chủng

nấm men Tuyển chọn sơ bộ được 9 chủng vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus: L 2 ,

L 5 , L 11 , L 4 , L 9 , L 1 , L 7 , L 12 , L 14 , 6 chủng vi khuẩn thuộc giống Acetobacter: G 1 , G 2 , G 3 ,

G 6 , G 7 , G 8 và 3 chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae:N 1 , N 4 , N 7. Lựa chọn

được 3 chủng gồm: vi khuẩn Lactobacillus L 2 , vi khuẩn Acetobacter G 1, nấm men

Saccharomyces cerevisiae N 1 lên men t o đồ uống trong môi trường bổ sung t o

xoắn (Spirulina spp.) Tìm được môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men thích

hợp cho quá trình lên men t o đồ uống trong môi trường bổ sung t o xoắn

(Spirulina spp.) đ t tiêu chuẩn về an toàn thực phẩm: hàm lượng đường Sacarose 100 (g/l), t o xoắn (Spirulina spp.) 9 (g/l), KH2PO4 1(g/l), MgSO4.7H2O 0,6(g/l), pH = 4,5, nhiệt độ 300C Xây dựng quy trình lên men t o s n phẩm nước gi i khát quy

mô phòng thí nghiệm

NỘI DUNG CHƯ NG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về tảo xoắn (Spirulina spp.)

1.1.1 Sơ lược về tảo xoắn (Spirulina spp.)

T o lam hay còn gọi là vi khuẩn lam theo tiếng Hi L p thì cyanos-blue là một ngành vi khuẩn mà có kh năng hấp thu năng lượng qua quá trình quang hợp

T o xoắn (Spirulina spp.) là vi khuẩn lam d ng sợi thuộc ngành vi khuẩn lam hay

t o lam T o xoắn (Spirulina spp.) là một loài vi t o có d ng xoắn hình lò so, màu

xanh lam với kích thước chỉ kho ng 0,25 mm Chúng sống trong môi trường giàu bicarbonate (HCO3-) và độ kiềm cao (pH 8,5-9,5) Chúng có những đặc tính ưu việt và giá trị dinh dưỡng cao Do hình thái “lò so xoắn” dễ nhận biết qua kính hiển vi,

người ta cũng thường gọi t o này là “t o xoắn” T o (Spirulina spp.) vẫn tiếp tục

được nghiên cứu sử dụng như thức ăn –vị thuốc trong tương lai do kh năng phát

triển cực kỳ nhanh của một vi sinh vật đơn bào T o (Spirulinaspp.) xuất hiện cách

đây hơn 3 tỷ năm Nó là vi khuẩn lam cố định có lịch sử lâu đời hơn t o nhân thật hoặc thực vật bậc cao tới 1 tỷ năm Hơn 1 ngàn năm trước tổ tiên của những người Aztect ở

Mexico đã biết thu hái (Spirulina spp.) từ các hồ kiềm tính, phơi dưới ánh nắng mặt trời và dùng làm thực phẩm Tên gọi (Spirulina spp.) do nhà t o học Deurben người

Đức) đặt năm 1927, dựa trên hình thái của t o là d ng sợi xoắn ốc (spiralis) [23]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của tảo xoắn (Spirulina spp.)

1.1.2.1 Phân loại

T o (Spirulina spp.) phân bố rất rộng rãi trong các môi trường khác nhau và

và có thể phát triển trong các môi trường các lo i t o khác không thể sinh sống Một

vài loài thuộc chi Spirulina tiêu biến như Spirulina platensis, Spirulina maxima,

Spirulina geilleri F.geiller Ngành t o lam sắp liền sau ngành vi khuẩn và tách riêng

với các nhóm t o khác là vì: Chưa có nhân rõ rệt,không có sự sinh s n hữu tính, có

chứa sắc tố, t n đơn sơ, đơn bào hoặc hình sợi

1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý

T o xoắn (Spirulina spp.) là một lo i vi t o d ng sợi xoắn màu xanh lục, chỉ có

thể quan sát thấy hình xoắn sợi do nhiều tế bào đơn cấu t o thành dưới kính hiển vi

Hình 1.1 Hình dạng tảo (Spirulina spp.) dưới kính hiển vi [8]

Giống như các thực vật khác, Spirulina spp cần có chất dinh dưỡng để phát

triển như nước, cacbon, nitơ, photpho, kali, lưu huỳnh, sắt và các chất khoáng khác Khi có ánh sáng mặt trời quá trình quang hợp x y ra và loài vi t o này chuyển hóa các chất dinh dưỡng kể trên thành chất nuôi tế bào, đồng thời th i ra khí oxy Các tế bào s n sinh một cách đơn gi n là tự phân và một số loài có kh năng tăng gấp đôi

số tế bào trong vòng vài giờ đồng hồ trong điều kiện phòng thí nghiệm [8], [30] Trong hồ tự nhiên và dưới nước biển, t o phát triển nhanh chóng và sau đó chết theo từng mùa Việc chất dinh dưỡng sẵn có trong hồ tự nhiên hoặc t i các hệ thống thủy sinh thái thường là nhân tố chủ yếu h n chế sự tăng trưởng Mưa làm trôi chất dinh dưỡng của đất xuống hồ ao, sông ngòi t o điều kiện cho t o mùa phát triển Ở

đ i dương, chỉ có những đụn giàu chất dinh dưỡng do các luồng nước chính t o ra gặp vùng đất rộng có thể làm hình thành các vùng tăng trưởng thường xuyên cho quần l c thực vật phù du này là cơ sở của m ng lưới thực phẩm và hỗ trợ cho mọi

sự sống dưới nước thuộc hình thái cao hơn T i các hồ cấy vi t o người ta không cần đất màu Tuy nhiên do vi t o phát triển với tốc độ lớn như vậy, nên ph i cung cấp chất dinh dưỡng nhanh hơn so với cây trồng trên c n Ph i bơm xuống nước đủ lượng CO2 và ph i luôn luôn cung cấp chất dinh dưỡng có kh năng hòa tan khác để các hồ luôn luôn có vi t o được thu ho ch [8], [23]

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng và công dụng của tảo xoắn (Spirulina spp.)

1.1.3.1 Giá trị dinh dưỡng của tảo xoắn (Spirulina spp.)

Spirulina còn có tên thương m i là Arthrospira platensis mà được nuôi trồng

trên thế giới như một nguồn thực phẩm, chúng rất giàu chất dinh dưỡng Hiện nay được phổ biến như là thực phẩm bổ dưỡng t i US và Europe

Protein: 55%-70%

Giàu các vitamin: vitamin A, B1, B2, B3, B6, B12, vitamin C, vitamin D, vitamin E, folate, vitamin K, biotin, axit pantothenic, beta carotene – tiền chất của vitamin A, inositol

Giàu các chất khoáng: Canxi, mangan, sắt, chromium, photpho, magie, selen Giàu các sắc tố: phycoxyanin, chlorophyll,carotenoid và xanthophyll và các sắc tố khác

Các hợp chất hữu cơ: Axit gama linoleic, glycolipid, các pholysaccharide Các axit amin: Isoleucine, phenylalanine, leucine, threonine, lysine, trytophan, methionine, valine, alanine, glycine, arginine, histidine, axit aspartic, proline, cystine, serine, axit glutamic, tyrosine

Đặc biệt chúng chứa nhiều axit amin không thay thế mà động vật không thể tự

tổng hợp được Vì vậy Spirulina spp được nuôi trồng rất phổ biến trên thế giới, được

sử dụng vào nhiều vào mục đích khác nhau: Y – Dược, mỹ phẩm, thực phẩm, nông nghiệp thủy s n và được coi là thức ăn của con người trong tương lai [20, 26]

Nguồn t o mà tôi sử dụng là bột t o do công ty Dược Hậu Giang cung cấp và

đã được phân tích thành phần dinh dưỡng như sau:

Bảng 1.1 Thành phần của tảo xoắn (Spirulina spp.)

1.1.3.2 Công dụng của tảo xoắn (Spirulina spp.)

 Protein chất lượng cao

T o xoắn (Spirulina spp.) là một lo i t o đơn bào nhỏ d ng xoắn ốc, chứa protein cân bằng hoàn chỉnh và nhiều chất dinh dưỡng có giá trị Spirulina spp chứa

kho ng 70% protein dễ tiêu, lượng protein cao hơn bất kỳ lượng thực phẩm nào

khác Ngoài ra thành phần của t o (Spirulina spp.) còn chứa 18/22 axit amin, tất c

những axit amin cần thiết này t o thành một nguồn thực vật hoàn chỉnh về protein

Hơn nữa, protein trong Spirulina spp dễ tiêu hóa hơn so với các nguồn thịt Thực vậy, protein thịt bò được ước lượng chỉ dễ tiêu 20%, trong khi protein Spirulina spp là 95% T o (Spirulina spp.) không những là thực phẩm tuyệt vời giúp cơ thể

dễ dàng hấp thụ protein chất lượng cao mà còn chứa các men hỗ trợ quá trình tiêu hóa [14], [26], [27]

 Chất giàu dinh dưỡng tự nhiên

Nguồn dinh dưỡng thực phẩm tự nhiên hoàn chỉnh được tìm thấp trong thực

phẩm này cho ta những điều lợi ích vô tận về sức khỏe, Spirulina spp có lượng

beta-calotene cao –tiềm chất của vitamin A gấp 25 lần cà rốt, đây là chất chống oxy hóa m nh, b o vệ cơ thể khỏi những tổn h i cơ b n không giống vitamin A tổng hợp và giàu gan cá, beta-calotene hoàn toàn không độc h i, thậm chí khi sử dụng

với số lượng lớn T o (Spirulina spp.) giàu vitamin A được chuyển hóa cần thiết

cho mắt, làn da, răng, móng, xương và một hệ thống miễn dịch tốt b o vệ cơ thể

Spirulina spp là một nguồn cung cấp vitamin B tuyệt vời cụ thể là vitamin B12,

quan trọng với người ăn chay gấp 2-6 lần gan bò sống thực phẩm dinh dưỡng này cũng chứa vitamin E là nguồn sắt cao và chứa 14 chất khoáng tự nhiên và nhiều vi lượng [17]

 Siêu thực ph m cho người ăn kiêng

T o (Spirulina spp.) là một trong những thực phẩm giàu chất dinh dưỡng nhất và chứ ít chất béo Nhiều người nhận thấy rằng sử dụng Spirulina spp trước

bữa ăn sẽ làm gi m lượng thức ăn của họ sẽ làm gi m nhu cầu thèm ăn của họ, cách này thích hợp cho người ăn kiêng Đối với những người suy dinh dưỡng, cần tăng

trọng cách tốt nhất là bổ sung Spirulina spp sau mỗi bữa ăn Chất dinh dưỡng sẽ

được tích lũy l i, giúp người suy dinh dưỡng mau chóng hồi phục Lo i siêu thực phẩm này có thể là một thành phần giá trị của bất kỳ của chương trình tăng cân hoặc

gi m cân sức khỏe nào Spirulina spp cũng là nguồn cung cấp cacbonhydrate phức

hợp tuyệt vời, nó chứa glycogen dễ được cơ thể hấp thụ và biến đổi nhanh chóng thành năng lượng chúng ta cần mỗi ngày [8], [17], [40]

 Hỗ trợ miễn nhiễm tự nhiên

T o (Spirulina spp.) chứa đựng nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự miễn

nhiễm tối ưu như GLA, beta-carotene và các carotenoid khác Lượng giàu chứa GLA gấp 3 lần so với dầu cây anh th o Nghiên cứu đã tìm ra GLA giúp làm gi m bệnh huyết áp cao và gi m lượng cholesterol trong máu, làm dễ chịu các trường hợp viêm

khớp, các cơn đau tiền kinh nguyệt và các bệnh khác về da [8], [17] T o (Spirulina

spp.) được nghiên cứu rộng rãi nhằm công bố đặc tính tăng cường miễn nhiễm, các

nghiên cứu cho thấy (Spirulina spp.) có thể làm tăng mức độ kháng thể và ho t

động đ i thực bào, c hai đều quan trọng đối với một hệ thống miễn nhiễm m nh

mẽ, nó cũng giúp cân bằng ho t động hệ thống miễn nhiễm của b n [8], [17], [41]

 Lọc và giải độc

Còn một lý do khiếp cho Spirulina spp quan trọng chúng chứ diệp lục gấp

nhiều lần so với cỏ linh lăng hoặc lúa mì Chất diệp lục là sắc tố giúp thực vật có màu xanh và rất trong s ch, với nhiệm vụ là làm s ch hệ thống kim lo i nặng và các độc tố

khác trong cơ thể có h i cho sức khỏe [40, 41, 42]

1.1.4 Tình hình nghiên cứu của tảo xoắn (Spirulina spp.) hiện nay

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trước những năm 1960, việc cấy trồng Spirulina spp làm thực phẩm chưa có một khát niệm thực sự Năm 1960, Spirulina spp mới biết đến, lo i t o này do tiến sĩ

Clement người Pháp tình cờ phát hiện khi đến hồ Sat ở Trung Phi Năm 1963, Viện dầu hỏa Pháp đã bắt đầu quan tâm đến báo cáo về lo i bánh t o Dihe [14] Được biết

đó là t o (Spirulina spp.), họ đã tiến hành nghiên cứu lo i t o này trong phòng thí

nghiệm rồi xây dựng quy trình s n xuất thử Tuy nhiên điều kiện tự nhiên của nước

Pháp không thuận lợi cho việc nuôi trồng lo i t o này Durand, Giám đốc công ty

s n xuất soda ở hồ Texcoco - Mêhicô đã ứng dụng quy trình của viện dầu ho Pháp

tiến hành nuôi t o (Spirulina spp.) trên một phần diện tích của hệ thống bay hơi nhờ

năng lượng mặt trời của hồ Texcoco Từ năm 1970, Công ty Soda – Texcoco vừa

s n xuất soda vừa s n xuất t o trên diện tích kho ng 12 ha với s n lượng mỗi ngày

là trên 1 tấn t o khô [8], [31] Năm 1973, Tổ chức Lương nông quốc tế và Tổ chức

Y tế thế giới đã chính thức công nhận Spirulina spp là nguồn dinh dưỡng và dược

liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa Đáng lưu ý trước hết là công trình nghiên cứu phòng chống ung thư gây ra bởi tia phóng x h t nhân cho các n n nhân của sự cố Nhà máy Điện h t nhân Chernobul đã thu được kết qu

rất tốt khi điều trị bằng Spirulina spp nguyên chất Khi uống Spirulina spp., lượng

chất phóng x đã được đào th i khỏi đường tiểu của người bị nhiễm x rất cao Kết

qu này đã được biểu dương t i hội nghị quốc tế về t o năm 1998 ở cộng hòa Czech T i Ấn Độ, một nghiên cứu năm 1995 đã chứng tỏ với liều 1g

Spirulina/ngày, có tác dụng trị ung thư ở những bệnh nhân ung thư do thói quen

nhai trầu thuốc [8, 17]

Ở Nhật Hiroshi Nakamura cùng Christopher Hill thuộc Liên đoàn vi t o quốc

tế cùng một số nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu Spirulina spp từ năm 1968 Hiện

nay trong các đề tài nghiên cứu chống HIV/AIDS của Nhật, có đề tài sử dụng

Spirulina spp S n lượng Spirulina spp trên thế giới kho ng 1000 tấn khô/năm

Những nước đi đầu s n xuất đ i trà lo i t o này là Mehico, Mỹ, Đài Loan, Ấn Độ

Tr i t o lớn nhất là ở Hawaii có kho ng 25 ha và mới đây là Trung Quốc có kho ng

16 ha Nhu cầu Spirulina spp trên thế giới là rất lớn, tuy nhiên s n xuất chưa nhiều, nên giá bán những chế phẩm Spirulina spp rất đắt Gần đây việc phát hiện và đưa vào sử dụng một số chất có ho t tính sinh học ở Spirulina spp đã góp phần không

nhỏ thúc đẩy quá trình nghiên cứu, s n xuất cũng như ứng dụng có hiệu qu sinh khối t o này [8], [17]

1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

T o (Spirulina spp.) được giáo sư Ripley D.Fox- nhà nghiên cứu về t o và

các chế phẩm của t o t i “Hiệp hội chống suy dinh dưỡng bằng các s n phẩm từ

t o” t i Pháp đưa vào Việt Nam năm 1985 Trong những năm 1985 -1995 đã có những nghiên cứu thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học cấp nhà nước như nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Hữu Thước và cộng sự -Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với đề tài “Công nghiệp nuôi trồng và và sử lý

t o pirulina” Đề tài cấp thành phố của Bác sĩ Nguyễn Thị Kim Hưng –TP Hồ Chí

Minh và cộng sự với đề tài “Nghiên cứu s n xuất và sử dụng thức ăn có t o

Spirulina trong dinh dưỡng điều trị” [17], [32]

Cho đến nay, nhiều cơ sở nuôi trồng, s n xuất và chế biến các s n phẩm từ

t o Spirulina đã được thành lập Đó là các cơ sở như Vĩnh H o - Bình Thuận, Châu

Cát, Lòng Sông - Thuận H i, Suối Nghệ - Đồng Nai, Đắc Min - Đắc Lắc Nguồn

CO2 từ lò nung vôi sau khi đã lọc bụi và các hầm khí bioga cũng đã được nghiên cứu tận dụng để phát triển nuôi trồng t o và cũng đã thu được một số kết qu kh

quan Ngoài các s n phẩm Spirulina nhập từ Thái Lan, Trung Quốc với nhiều tên

gọi khác nhau, bán hàng theo phương thức phân phối đa cấp với tỉ lệ chiết khấu cao

gây thiệt thòi cho người tiêu dùng Các s n phẩm được chế biến từ t o Spirulina t i

Việt Nam cũng đã xuất hiện ngày càng nhiều và đa d ng Trước đây đã từng có bột dinh dưỡng Enalac, Sonalac có 5% t o [7] Nay đã có 5 s n phẩm Spir@ của Công

ty DETECH - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam được Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế cấp phép lưu hành trên thị trường Đó là các s n phẩm:

1.Spir@ B - T o bồi bổ: T o xoắn Spirulina dùng cho người suy dinh dưỡng,

người mới ốm dậy cần bồi bổ phục hồi sức khoẻ

2.Spir@ HA - T o điều hoà huyết áp: T o xoắn Spirulina kết hợp tinh chất

hoa hòe, hoa cúc dùng cho người bị tăng huyết áp, gi m stress và tăng cường trí nhớ cho người già

3.Spir@ CĐ - T o phòng chống độc: T o xoắn Spirulina kết hợp tinh chất

cao h t nho dùng để tăng sức đề kháng, chống độc, khử gốc tự do

4.Dia-Spir@ - T o phòng chống tiểu đường: T o xoắn Spirulina kết hợp

vitamin, khoáng chất dùng cho người bị bệnh đái tháo đường týp 1 và týp 2

5.Spir@ Cid - T o phòng chống ung thư: Tinh nghệ nguyên chất kết hợp với

t o xoắn Spirulina, cao h t nho dùng hỗ trợ cho việc phòng và chữa các bệnh ung

thư [17], [32]

Tất c các s n phẩm trên có thể không ph i là “thần dược” Nhưng với xu thế hòa nhập cùng thế giới, nhất là sau khi đã tham gia vào WTO chúng ta cũng không thể phủ nhận những tác dụng của thực phẩm chức năng mà thế giới đã thừa nhận Do vậy người tiêu dùng, nhất là người bệnh và những người có điều kiện về kinh tế nên tìm hiểu và nên sử dụng ngày càng nhiều hơn các lo i thực phẩm chức năng như là

t o (Spirulina spp.) vì sức khoẻ của chính mình

1.2 Vi sinh vật và quá trình lên men tạo đồ uống có bổ sung tảo xoắn

(Spirulina spp.)

Hệ vi sinh vật lên men dịch t o xoắn (Spirulina spp.) là một tập đoàn vi sinh

vật bao gồm các vi khuẩn và nấm men

sinh axít lactic đều thuộc về họ Lactobacillaceae và được xếp bốn chi:

Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc Chúng có d ng hình

cầu hoặc hình que, Gram dương, không bào tử, không di động Tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số giống trong họ vi khuẩn lactic có kh năng t o bào tử Vi

khuẩn lactic không khử nitrate, ph n ứng catalase âm tính, kị khí tuỳ ý, một vài loài

kị khí sống trong hệ tiêu hoá của con người [10], [34], [38]

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng cao Để sinh trưởng bình thường, ngoài nguồn cacbon, chúng cần nitơ, một phần dưới d ng các axit amin, một số vitamin, các chất sinh trưởng và các chất khoáng… Chúng không thể phát triển được trong môi trường có thành phần đơn gi n như glucozo và NH4+ như một số loài khác Vì thế người ta ph i cho vào môi trường một số chất giàu dinh dưỡng: cao nấm men, cao thịt, các lo i đường để chúng có thể lên men

Vi khuẩn lactic có thể tồn t i trong môi trường khô, có thể chịu được hàm lượng cồn từ 10 – 15% và có thể chịu được nồng độ CO2 cao Chúng được tìm thấy

khắp nơi trong tự nhiên, dưới da, trong hệ tiêu hoá… Lactobacillus có vai trò quan

trọng nhất trong lên men lactic, là vi khuẩn kị khí Gram dương, có d ng hình que dài, không sinh bào tử, tế bào thường xếp đôi hoặc thành chuỗi, không di động Chúng là nhóm chính của vi khuẩn axit lactic, hầu hết các chủng của chúng biến đổi đường lactozo và những đường khác thành axit lactic Chúng là vi khuẩn rất phổ biến và thường là lành tính Ở người, chúng có mặt ở âm đ o và ở ruột Nhiều loài

có ở thực vật đang phân rã Sự s n xuất axit lactic làm ngăn c n sự phát triển của một vài loài vi khuẩn có h i khác [2], [10], [38]

Cơ chế của quá trình lên men lactic

Lên men lactic là một quá trình trao chuyển hóa sinh học kị khí làm biến đổi các hợp chất đường thành acid lactic (chủ yếu) và một số s n phẩm khác Các s n phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn th i vào môi trường lên men còn các phân tử ATP được giữ l i trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật Kết qu là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm gi m pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác [1] Có hai kiểu lên men lactic:

Lên men lactic đồng hình hầu như chỉ cho ra s n phẩm là acid lactic

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men lactic ngoài s n phẩm acid lactic còn có các s n phẩm khác như acid acetic, ethanol, CO2…

Ngoài ra, trong dịch lên men còn xuất hiện nhiều hợp chất hóa học mới là

s n phẩm trung gian hoặc s n phẩm phụ của quá trình lên men Một số hợp chất dễ bay hơi có vai trò quan trọng góp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho các s n phẩm lên men lactic Lượng s n phẩm phụ thu được hoàn toàn phụ thuộc vào giống

vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngo i c nh [4]

1.2.2 i hu n acetic

Vi khuẩn aceticlà tác nhân chính của quá trình lên men acetic Giống vi khuẩn acetic, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể dễ dàng tìm thấy các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, giấm, rượu, bia, hoa

qu … Ngà y na y ngư ời ta đã biết tới hơn 20 loài v i k h u ẩ n có kh năng lên men acetic thuộc các nhóm khác nhau [22] Về hình d ng tế bào vi khuẩn acetic là những trực khuẩn hình que hay hình elip, hình chỉ, hình cầu hoặc có hình bán nguyệt, kích thước tế bào thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0μm) Các tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, có hoặc không có tiêm mao, sống và phát triển trong điều kiện hiếu khí bắt buộc hóa dị dưỡng hữu cơ, không sinh bào tử Ở môi trường dịch thể vi khuẩn acetic có sự hình thành màng trên mặt thoáng, màng t o thành có độ dày mỏng khác

nhau và đặc điểm của các lo i màng cũng khác nhau tùy lo i [11]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic rất phong phú Nguồn cacbon có thể được cung cấp từ các hợp chất đường, rượu etylic

và các acid hữu cơ Vi khuẩn acetic có thể sử dụng các muối amon làm nguồn cung cấp nitơ và phân gi i pepton Một số acid amin như acid pantothenic và các chất khoáng K,

Mg, Ca, Fe, P, S… cũng có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển

Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước m ch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Một số loài vi khuẩn còn tổng hợp được vitamin B1, vitamin B2, oxy hoá sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp s n xuất

vitamin C), hay như Acetobacter xylinum có thể tổng hợp được sợi cellulose giống như

những sợi bông [29]

1.2.3 Nấm men

Tế bào nấm men thường có d ng hình cầu, ovan, elip, hình trụ, hình qu

chanh… kích thước tương đối lớn: đường kính kho ng 7μm, chiều dài: 8–12μm Hình d ng và kích thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau Nấm men thuộc nhóm sinh vật nhân chuẩn đơn bào, tế bào nấm men có thành phần và cấu t o khá phức t p gồm thành tế bào, màng nguyên sinh chất, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các h t dự trữ

Có rất nhiều cách phân lo i, nấm men chủ yếu gồm hai lớp là nấm men thật

(Ascomyces) và nấm men gi (Fungiim porfecti)

+ Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; giống

Schizosaccharomyces giống Endomyces

+ Lớp nấm men gi (Fungi imporfecti) gồm: Crytococus (toscula,

tornlopsis); Mycoderma; Candida; Rhodotorula

Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều cho đến khi cơ chất của môi trường gi m đến mức thấp nhất thì quá trình sinh trưởng phát triển của chúng chậm

và ngừng hẳn Các nấm men sinh s n bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn Tế bào sẽ già đi khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không còn kh năng sinh s n nữa Tuy nhiên đa số nấm men sinh s n bằng phương pháp n y chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ [9], [35]

Quá trình lên men rượu được thực hiện nhờ quá trình lên men kị khí của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol Quá trình lên men rượu được bắt đầu từ ho t động của nấm men trong dịch lên men tiết ra một lo i enzyme Invetase chuyển hóa đường sucrozo thành glucozo và fructose Từ đây trong dung dịch dinh dưỡng mới có glucose [4] Nguồn glucose lúc này bị c nh tranh bởi c vi khuẩn và nấm men (trong dung dịch chưa có ethanol), ho t động lên men rượu được chia làm hai thời kì chính:

Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đo n này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối

Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu: giai đo n này nấm men chuyển sang hô hấp kỵ khí Giai đo n đường phân được tăng cường và trở thành nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào, sự chuyển hướng trao đổi chất của nấm men sẽ cho

s n phẩm là ethanol Trong quá trình lên men rượu, nấm men sử dụng các enzyme sẵn có thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, t o thành rượu Nấm men không có kh năng chịu được môi trường có độ acid cao cho nên acid pyruvic sẽ được chuyển hoá thành CO2 và acetaldehyde rồi thành ethanol Trong lên men rượu, các đường đơn như glucose và fructose được phân gi i theo con đường EMP và chu trình ATC ở giai đo n đầu, sau đó gi i phóng ATP Khi nấm men chuyển sang hô hấp kị khí, quá trình lên men cho các s n phẩm chính là

CO2, ethanol và các s n phẩm phụ trong đó có glyxerol [4]

Phương trình tổng quát của quá trình lên men rượu có thể viết như sau:

C6H12O6+2ADP+2Pi→2C2H5OH+2CO2+2ATP Quá trình chuyển hóa đường thành Ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế bào chất của nấm men Ngoài việc t o ra Ethanol và CO2, tế bào nấm men còn tổng hợp

và th i vào dịch lên men nhiều s n phẩm phụ và s n phẩm lên men khác với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este Trong quá trình này nhiều acid hữu cơ được t o thành, một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs Nếu quá trình lên men trong điều kiện kị khí không nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic [4], [16]

1.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nhóm vi sinh vật lên men tạo đồ uống có bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.)

1.2.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khu n lactic [23]

Các lo i vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ b n như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…

 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều lo i hydrat cacbon từ các monosaccarit glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin) Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ

 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ Vì vậy để đ m b o cho sự sinh trưởng và phát triển chúng ph i sử dụng các nguồn nitơ

có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton… Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu qu nhất Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

 Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho ho t động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có kh năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các

lo i vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…

 Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ

Một số acid hữu cơ có nh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid xitric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và b o

qu n các chủng vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới

d ng các muối axetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

 Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đ m b o cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các

muối vô cơ

 Nhu cầu dinh dưỡng oxi

Vi khuẩn lactic vừa có kh năng sống được trong môi trường có oxy và vừa sống được trong môi trường không có oxy Trong điều kiện kị khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện hiếu khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucozo sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucozo t o ra 36 hoặc 38 ATP

Dinh dưỡng nitơ: đa số nấm men không đồng hóa được nitrat mà chỉ có kh năng sử dụng các muối amon ở d ng hòa tan, có thể là đ m hữu cơ hoặc vô cơ Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid, urê, nucleotit… Đ m

vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat, acetat…

Dinh dưỡng các chất sinh trưởng: các vitamin, các purin và prymidin là nhân tố sinh trưởng cơ b n của nấm men

1.2.4.2 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic Dựa vào kh năng lên men lactic người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình

 Lên men lactic đồng hình [1], [4], [5]

Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men trong đó các s n phẩm acid lactic t o ra chiếm 90% tổng số các s n phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl…

Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:

C6H12O6 2CH3CHOHCOOH+21,8.104 J Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza được chuyển hoá theo chu trình Embden-Mayerhoff, vi khuẩn sử dụng cho qui trình này tất c các loai enzym aldolase, còn hydro tách ra khi dehydro hoá triozophophat dược chuyển đến pyruvat Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase cho nên acid pyruvic không phân huỷ nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic theo sơ

đồ chuyển hoá dưới đây [1], [4]

Sơ đồ chuyển hóa glucozo thành acid lactic

Cũng có một số tác gi cho rằng lên men lactic đồng hình tiến hành theo hai giai đo n:

Giai đo n 1: thời kỳ sinh trưởng cấp số mũ của vi khuẩn, từ hexoza nhờ sự oxi hoá photphoglyceraldehyde kèm theo việc khử pividinnucleotide PN) để t o acid photphoglycerinic

PCH2-CHOH+H2O+PN P CH2CHOG-COOH+PNH2

Giai đo n 2: do chất nhận hydro là PN-H2 tăng mà thế oxy hoá khử của môi trường gi m xuống dẫn đến sự nhường hydro từ PN-H2 cho acid photphoglycerinic

để khử nó thành acid lactic

CH2OP-CHOH-COOH+H2O (PN-H2) CH3CHOHCOOH + H3PO4+PN+ H2OTuỳ thuộc vào tính đặc hiệu quang học của enzym lactate- dehydrogenase và sự

có mặt của lactaxenase mà lo i acid lactic d ng nào được t o ra D(-), L(+) hoặc DL

 Lên men lactic dị hình [1], [4], [5]

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài s n phẩm acid lactic còn t o ra một lượng đáng kể các s n phẩm phụ như acid acetic, etanol, acid succinic, CO2,…

Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:

C6H12O6CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2… Trong đó, acid lactic chiếm kho ng 40%, acid succinic kho ng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các lọai khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào

đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic Như vậy, các s n phẩm phụ khác nhau đáng kể t o thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức t p hơn so với lên men lactic đồng hình

Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình

1.3 Ứng dụng (Spirulina spp.) trong thực phẩm, xử lý môi trường, y học và mỹ

phẩm

1.3.1 Ứng dụng trong thực ph m

Từ những năm 1970, ở Nhật B n và ở Mỹ, t o (Spirulina spp.) đã đựơc xem là một lo i siêu thực phẩm Đến những năm 1990 vấn đề tiêu thụ Spirulina spp đã phát triển vượt bậc t i Trung Quốc, Ấn Độ, Châu Á, Bắc Mỹ làm cho Spirulinaspp ngày

càng trở nên phổ biến Gần đây, trên thị trường Việt Nam xuất hiện nhiều chế phẩm bán ở cửa hàng thực phẩm, siêu thị hoặc c trong nhà thuốc với thành phần và công dụng rất gần với thực phẩm dinh dưỡng và thuốc chữa bệnh Những chế phẩm đó là

s n phẩm giao thoa giữa thực phẩm và thuốc - còn gọi là thực dược hay thực phẩm chức năng [22] Đặc biệt trong những tháng giữa năm 2005 tới nay, các chế phẩm

chứa t o (Spirulina spp.) đang bán trong nhóm s n phẩm nêu trên được khá nhiều

người chú ý Thực phẩm dinh dưỡng được dùng ở d ng nước uống, siro, yaourt, bột dinh dưỡng Có thể dùng t o nguyên chất để uống hoặc trộn vào thức ăn như nấu

canh, làm bánh, một số nước còn có trà Spirulina Ở Đức, người ta đã bắt đầu đưa

t o vào bia, gọi là bia xanh Cơ thể có thể hấp thụ mỗi ngày 30 – 45g, dùng thừa

cũng vô h i Người bị bệnh nặng không ăn được có thể bơm t o thẳng vào d dày là

đủ các chất dinh dưỡng

1.3.2 Ứng dụng trong xử lý môi trường

Ở Việt Nam hiện nay, quy mô và mức độ ô nhiễm kim lo i nặng trong nước

th i công nghiệp đang gia tăng với tốc độ đáng lo ng i Việc áp dụng các biện pháp hóa lý như đã nêu thường có giá thành cao, khiến nhiều ho t động công nghiệp vẫn tiếp tục th i nước th i chứa kim lo i nặng vào môi trường Các điều tra cho thấy các nhà máy ô tô, s n xuất pin và ắc qui, nhà máy thuộc da, các xí nghiệp m th i nước

th i chứa các kim lo i nặng nguy hiểm như Ni, Cr, Fe, Hg, Cu, Pb Vì vậy nghiên cứu sử dụng vi t o để lo i trừ kim lo i nặng trong nước th i công nghiệp ở nước ta

là một hướng công nghệ đáng được quan tâm Tuy nhiên đây là một lĩnh vực còn rất mới mẻ ở Việt Nam Đã có một vài công trình nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này đ t được một số kết qu trong việc sử dụng chất hấp thu sinh học để xử lý ô nhiễm Cr, Ni và Pb trong nước th i công nghiệp Thử nghiệm cố định tế bào t o

Spirulina platensis trên các chất mang khác, xây dựng được phương pháp cố định tế

bào vi t o trên các chất mang khác nhau như polyurethane, agar và carageenan Tế bào t o sau khi cố định vẫn có kh năng ho t động sống bình thường trong một thời gian dài Sự hấp thu kim lo i nặng phụ thuộc tr ng thái của t o khi đói dinh dưỡng

có kh năng hấp thu cao hơn Như vậy triển vọng sử dụng sinh khối vi t o sống hay chết, tự do hay cố định vào việc lo i trừ kim lo i nặng trong nước th i là to lớn Nước th i sinh ho t sau khi xử lý sinh học được tách bùn và dùng như là môi trường

để nuôi cấy t o, sinh khối được tách ra và đem đi xử lý nhiệt hoặc đem đi cố định trong chất mang, sau đó sinh khối này được sử dụng như chất hấp phụ sinh học để thu nhận kim lo i nặng Nước th i công nghiệp nặng có nồng độ kim lo i cao và các chất độc sẽ được xử lý bằng các phương pháp hóa lý trước sau đó hoặc được trộn với nước th i sinh ho t đã xử lý và tiến hành nuôi cấy các chủng t o đã chọn lọc trong hồ nuôi t o hoặc cho tiếp xúc với chất hấp thụ sinh học làm từ sinh khối vi t o trong bể hay cột hấp phụ Sinh khối t o sau khi thu hồi được xử lý theo chế độ xử lý bùn: phân gi i yếm khí để t o biogas hoặc làm khô rồi thiêu hủy nhiệt hoặc chôn

lấp, còn nước th i sau xử lý sẽ th i vào nguồn tiếp nhận nước Sử dụng sinh khối vi

t o để lo i bỏ kim lo i nặng là một hướng công nghệ có nhiều tiềm năng Tuy nhiên còn rất nhiều thách thức ph i vượt qua để có thể hình thành và làm chủ được công nghệ này Cần có nhiều sự quan tâm hơn nữa của các khoa học cũng như các nhà

qu n lý đối với lĩnh vực nghiên cứu đang còn mới mẻ này [17], [22]

ho t chất ở ruột non Ngoài ra t o lam còn được nghiên cứu làm thuốc cầm máu và sát trùng Sau sự kiện này hàng lo t tập đoàn dược phẩm thế giới đã nh y vào phát triển t o thành thuốc Hiện nay loài t o này đã được trồng ở nhiều nước như Mỹ, Nhật, Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp, Nigiêria, Nam Phi, Kênya [19], [22]

1.3.4 Ứng dụng trong mỹ ph m

Trong mỹ phẩm t o lam làm phóng thích các ho t chất tác động hiệu qu trong nước tắm, trong kem xoa mặt và toàn thân nhờ hàm lượng magie và kali cao,

là thành trì giúp cơ thể chống l i các khối u xơ ở cơ bắp Chất chiết từ t o còn được

sử dụng trong một số s n phẩm như thuốc đắp, thuốc làm mặt n , kem hoặc để dùng tắm trong liệu pháp biển

CHƯ NG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Các chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic và nấm men được phân lập có kh

năng lên men trong môi trường có bổ sung t o xoắn (Spirulina spp.) để t o nước

gi i khát trong phòng thí nghiệm vi sinh, trường Đ i học Sư ph m Hà Nội 2

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm

2.1.2.1 Hóa chất

Nguồn cacbon: Glucose, fluctose, maltose, acid lactic

Nguồn nito: Nấm men, pepton, (NH4)2SO4, dd NH3

Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4

Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol

H2SO4, CaCO3, th ch Agar

2.1.2.2 Dụng cụ thí nghiệm

Tủ ấm, tủ sấy Binder Đức)

Nồi hấp Tommy (Nhật)

Box vô trùng (Haraeus)

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

Micropipet Jinson (Pháp) các lo i từ 0.5μl – 10ml

Cân (Precisa XT 320M - Thụy Sĩ)

Kính hiển viquang học Carl Zeiss Đức)

Tủ l nh Daewoo tủ l nh sau, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn,… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

2.1.3 Các loại môi trường

2.1.3.1 Môi trường phân lập giống vi khu n lactic: MRS thạch (g/l)

Glucose: 20 g K2HPO4: 2 g

KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 0,58 g

2.1.3.2 Môi trường nhân giống vi khu n lactic: MRS dịch thể (g/l)

Môi trường như trên nhưng bỏ CaCO3 và th ch

2.1.3.3 Môi trường phân lập nấm men và vi khu n acetic: môi trường Hanxen(g/l)

 Phân lập vi khu n và nấm men

Để chọn một tập hợp vi khuẩn và tế bào nấm men ta sử dụng phương pháp phân lập trên hộp Petri Môi trường để tuyển chọn các vi khuẩn và khuẩn l c nấm men là môi trường MRS và Hanxen

Cách làm: môi trường phân lập được khử trùng và được phân bố vào các hộp

vô trùng Petri để nguội theo phương pháp Pasteur Dịch được lấy từ độ pha loãng

từ 10-1– 10-10

bằng nước cất Dùng pipet đã vô trùng nhỏ 1 giọt huyền phù với độ pha loãng từ 10-5– 10-7 lên bề mặt th ch rồi dùng bàn trang vô trùng dàn đều Gói kín l i và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 – 300C trong 3- 7 ngày Sau 3- 7 ngày trên

bề mặt th ch sẽ xuất hiện các khuẩn l c với đặc điểm: to, tròn, lồi, màu trắng, nhẵn, bóng đặc trưng cho nấm men và các vi khuẩn

Phương pháp nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn lactic và tế bào nấm men Nhuộm Gram là nhuộm sử dụng hai hay nhiều lo i thuốc nhuộm trên một tiêu b n nhằm quan sát và định lo i tế nấm men dựa trên kh năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt

Tiến hành: Lấy các khuẩn l c trong các ống th ch nghiêng có kh năng lên

men dịch t o làm vết bôi trên lam kính nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram Sau đó soi tiêu b n dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đ i 1000 lần) [3], [6]

2.2.1.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật

 Phương pháp đếm khu n lạc

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa nấm men và vi khuẩn, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới h n rồi dùng micropipet hút 0,1ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường th ch đĩa Nuôi ở 300C sau 3 ngày đếm số khuẩn l c (CFU) trong môi trường đĩa Petri, từ đó xác định số lượng tế bào nấm men và vi khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức [3], [6]

Trong đó: N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu

A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri

10 -n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy 2.2.1.3 Bảo quản chủng giống

Các khuẩn l c sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống th ch nghiêng, nuôi 3 - 5 ngày ở tủ ấm 300C Sau đó giữ trong tủ l nh 40

C dùng cho nghiên cứu tiếp theo Cấy chuyền giữ giống trên th ch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [3], [6]

2.2.1.4 Xác định hoạt lực lên men

Xác định ho t lực lên men của các mẫu nấm men đã được phân lập và tuyển chọn thông qua xác định hàm lượng CO2 thoát ra (g/l dịch lên men) bằng phương pháp

cân bình trọng lượng Hàm lượng CO2 thoát ra càng nhiều thì chứng tỏ ho t lực lên men càng tốt Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi kết hợp với việc xác định hàm lượng cồn để xác định hiệu suất lên men

Phương pháp cân bình trọng lượng: Dịch được lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trường, có cùng một lượng vi khuẩn lactic và tế bào nấm men của các giống khác nhau Sau 24h lên men đem cân trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng l i [3], [6]

2.2.1.5 Xác định khả năng kết lắng

Kh năng kết lắng của chủng nấm men được xác định bằng tốc độ lắng của sinh khối Phương pháp này được tiến hành như sau: hòa sinh khối vi sinh vật vào dung dịch đệm axetat có pH: 4) được đựng trong ống nghiệm có hình d ng và kích thước như nhau Lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 3-5 phút,

để lắng 12 phút, lúc này toàn bộ khối dịch phân thành 2 lớp, tiến hành đo chiều cao lớp phía dưới (lớp kết lắng của tế bào vi sinh vật) trong từng ống nghiệm để xác định kh năng kết lắng của tế bào [3], [6]

2.2.1.6 Phương pháp hoạt hóa

Giống từ ống nghiệm được b o qu n trong tủ l nh, trước khi đem sử dụng

ph i ho t hóa giống, nhân giống đ m b o đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp ho t hóa giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không

có th ch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống th ch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [3], [6]

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Phát hiện khả năng oxy hóa acid acetic

Sử dụng môi trường sau để thử kh năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn

Cao nấm men: 10 (g) Canxi acetat: 10 (g)

pH: 7,0-7,2

Quan sát hiện tượng nếu xung quanh khuẩn l c có vòng phân gi i canxi là

ph n ứng dương tính, ngược l i là âm tính [3], [21]

2.2.2.2 Phát hiện hoạt tính catalase

Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn l c, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có ho t tính catalase, ngược l i chủng vi khuẩn đó không có ho t tính catalase [3], [6]

2.2.2.3 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chu n độ với NaOH 0,1N có phenolphtalain 0.1% làm chỉ thị

Cho vào cốc thủy tinh (lo i 100ml hoặc 200ml) dịch lên men, thêm vào đó

1-2 giọt phenolphtalein 0,1% chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N Chú ý chuẩn độ cần ph i lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nh t Sau đó tính số gam acid tổng số trong 100ml dung dịch lên men theo công thức [3], [6]:

X= (V.K.100)/10 (g/ml) Trong đó: X: Số gam acid tổng số trong 100ml dung dịch lên men

V: Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 10ml dung dịch lên men K: Lượng acid tổng số tương ứng với 1ml NaOH 0,1N (K=0,06) 10: Số ml dịch lên men đem chuẩn độ

2.2.2.4 Xác định độ pH

pH được đo bằng máy đo pH meter có độ chính xác 0,01) Tiến hành đo 6 lần [3]

2.2.2.5 inh trưởng trên môi trường Hoyer

Hấp thanh trùng 1210C trong 15 phút Để môi trường nguội bổ sung giống nghiên cứu nuôi ở nhiệt độ kho ng 300C trong 0, 12, 24, 48 giờ sau đó đếm số lượng tế bào trên buồng đếm [3], [21]

2.2.2.6 Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose

Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28 - 300C trong vòng 3

- 4 ngày, quan sát sự hình thành màng Kiểm tra kh năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá thành màu xanh lam [3], [6]

2.2.2.7 Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone

Để phát hiện kh năng hình thành dihydroxyacetone từ glycerol Hấp thanh trùng 1210C trong 10 phút Để môi trường nguội bổ sung giống vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong vòng 48h Nhỏ dung dịch Fehling để

kiểm tra sự t o thành dihydroxyacetone (có sự xuất hiện kết tủa Cu 2 O màu đỏ gạch)

K2Cr2O7 + 6KI + 14HNO3 = 3I2 + 2Cr(NO3)3 + 8KNO3 + 7H2O

2.2.2.9 Kiểm tra tính đối kháng của vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật được tuyển chọn để nghiên cứu tiếp được nuôi trên môi trường Hanxen bằng phương pháp cấy v ch tiếp xúc giữa các chủng với nhau Sau 3 ngày, ở nhiệt độ 370C, sau đó quan sát sự sinh trưởng của 3 chủng vi sinh vật [2], [3]

2.2.2.10 Xác định hàm lượng đường bằng phương pháp Bertrand

Từ thể tích kalipemanganat 0,1N đã dùng tra b ng Bectrand được số mg glucozo tương ứng, đổi ra gam

Hàm lượng đường khử (X) tính theo công thức sau:

CHƯ NG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường

bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.)

3.1.1 Phân lập chủng vi hu n lactic có hả năng lên men tạo đồ uống trong môi trường bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.)

Sử dụng dịch lên men có bổ sung t o xoắn hòa tan vào môi trường MRS dịch thể và ủ ở 37OC trong 24 giờ Sau khi ủ, dung dịch mẫu được cấy chuyển qua môi trường MRS agar Quá trình cấy chuyển trên đĩa môi trường th ch được lặp l i nhiều lần cho đến độ thuần vi khuẩn được xác định Kiểm tra hình thái khuẩn l c đặc trưng cho vi khuẩn lactic [6] Kết qu phân lập vi khuẩn lactic: khuẩn l c trắng đục, không màu, bờ láng, lồi, bìa nguyên hoặc chia thùy Khuẩn l c này nằm trên đường cấy chuyển và không lẫn với những khuẩn l c có hình thái và màu sắc l Sau khi được tách dòng, những dòng phân lập sẽ được kiểm tra hình thái và quan sát độ thuần dưới kính hiển vi Tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn lactic được xác định khi những dòng phân lập có hình tròn hoặc hình que, không sinh bào tử, Gram dương phân gi i được CaCO3