Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cllulose trong dạ cỏ động vật nhai lại và ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---o0o--- HOÀNG HẢI YẾN Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG DẠ CỎ ĐỘNG VẬT NHAI LẠI VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -o0o -

HOÀNG HẢI YẾN

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG DẠ CỎ ĐỘNG VẬT NHAI LẠI VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -o0o -

HOÀNG HẢI YẾN

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG DẠ CỎ ĐỘNG VẬT NHAI LẠI VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hướng dẫn : TS Trần Văn Chí

Thái Nguyên, năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, thầy cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Văn Chí, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, đã tạo điều kiện, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ

em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời tri ân tới các thầy cô giáo trong và ngoài khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã ân cần dạy dỗ, truyền đạt kiến thức chuyên môn cũng như kinh nghiệm trong cuộc sống

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose 13

Bảng 3.1: Môi trường CMC 21

Bảng 3.2: Môi trường thử hoạt tính cellulose 22

Bảng 4.1: Thử sơ bộ hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn 36

Bảng 4.2: Giá trị OD (mật độ quang) của canh trường 38

Bảng 4.3: Hoạt tính enzyme cellulase bằng phương pháp đục lỗ thạch 40

Bảng 4.4: Hàm lượng glucose thay thế thành phần CMC trong môi trường ban đầu 42

Bảng 4.5: Hàm lượng saccharose thay thế thành phần CMC trong môi trường ban đầu 43

Bảng 4.6: Tối ưu điều kiện môi trường có bổ sung nguồn nitơ 45

Bảng 4.7: Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn và nấm mốc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Cấu trúc phân tử cellulose 9

Hình 2.2: Sơ đồ phân giải cellulose của Srinivasan, 1973 15

Hình 4.1: Hình ảnh cấy trang vi sinh vật trên môi trường đĩa thạch 34

Hình 4.2: Hình ảnh cấy chuyển khuẩn lạc để giữ giống vi khuẩn 35

Hình 4.3: Hình ảnh dịch enzyme 39

Hình 4.4: Xác định hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ thạch 40

Hình 4.5: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của chủng vi khuẩn B20 46

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CBD : Cellulose binding domain CMC : Careboxymethyl cellulose HEC : Hydroxyethyl cellulose

OD : Optical density

MỤC LỤC

Trang

Phần 1 : MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về vi sinh vật và vi khuẩn phân giải cellulose 3

2.1.1 Giới thiệu về vi sinh vật 3

2.1.2 Vi khuẩn phân giải cellulose 4

2.2 Enzyme từ vi sinh vật 8

2.2.1 Giới thiệu chung về cellulose 8

2.2.2 Enzyme cellulase 9

2.3 Ứng dụng của công nghệ vi sinh vật trong xử lý rác thải 15

2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 18

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 19

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu 20

3.1.1 Đối tượng (vật liệu) nghiên cứu 20

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 20

3.1.3 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 20

3.1.4 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu 20

3.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu 21

3.2.1 Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải cellulose: môi trường CMC (MT1) 21

3.2.2 Môi trường thử nghiệm khả năng phân giải cellulose (MT2) 22

3.3 Nội dung nghiên cứu 22

3.4 Phương pháp nghiên cứu: 22

3.4.1 Tiến hành phân lập vi khuẩn 23

3.4.2 Các phương pháp giữ giống vi khuẩn sau phân lập 25

3.4.3 Xác định khả năng phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn 25

3.4.4 Đo mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD 28

3.4.5 Phương pháp thử khả năng phân giải cellulose bằng phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường thử nghiệm 29

3.4.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn 30

3.4.7 Định danh vi khuẩn 32

3.4.8 Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng vi sinh vật (nấm mốc) 32

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose 34

4.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn 34

4.1.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose 37

4.2 Kết quả tối ưu hóa điều kiện môi trường 41

4.2.1 Thử khả năng đồng hóa nguồn cacbon 41

4.2.2 Thử khả năng đồng hóa nguồn nitơ 43

4.3 Định danh sơ bộ vi khuẩn 46

4.4 Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng vi

sinh vật khác (nấm mốc) 47

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 48

PHỤ LỤC

Nước ta là một nước nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú, khoảng một nửa hợp chất cacbon trong sinh khối trên mặt đất là cellulose, chiếm tới 35-50% lượng sinh khối thực vật Tất cả sản phẩm sinh khối sẽ được khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme được cung cấp bởi vi sinh vật Hệ thống phân giải cellulose thường chậm và không hoàn toàn Tuy nhiên trong khoảng thời gian ngắn (48h) hệ vi sinh vật trong dạ cỏ (vi khuẩn kỵ khí) có thể phân giải 60 - 65 % cellulose [4] Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đã và đang rất được quan tâm

Từ những luận điểm trên chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại và ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường”

1.2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu những loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại, ứng dụng sản xuất chế phẩm

sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ dịch dạ cỏ động vật nhai lại

- Tối ưu hóa điều kiện lên men để thu sinh khối và thu chế phẩm enzyme

- Định danh sơ bộ về chủng vi khuẩn mà mình phân lập được dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, độ phân giải…

- Thử khả năng khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng vi sinh vật khác

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học

- Củng cố cho sinh viên tác phong cũng như kỹ năng làm việc sau này

- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về vi sinh vật và vi khuẩn phân giải cellulose

2.1.1 Giới thiệu về vi sinh vật [12]

Vi sinh vật là một thế giới sinh vật vô cùng nhỏ bé mà ta không thể quan sát bằng mắt thường Nó phân bố ở khắp mọi nơi, trong đất, trong nước, trong không khí, trong thực phẩm…

Vi sinh vật đóng vai trò vô cùng quan trọng trong thiên nhiên cũng như trong cuộc sống của con người, từ xa xưa, con người ta đã biết sử dụng vi sinh vật trong đời sống hàng ngày như làm dấm, làm tương, muối chua thực phẩm và các quá trình làm rượu Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò của vi sinh vật thì nó được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả hơn, ví dụ như chế vacxin phòng bệnh, sản xuất kháng sinh và các dược phẩm quan trọng khác, vi sinh vật được ứng dụng trong bảo vệ môi trường, chế tạo phân bón sinh học thuốc bảo vệ thực vật không gây độc hại cho môi trường, bảo vệ cân bằng sinh thái Ngoài những vi sinh vật có lợi còn có một số vi sinh vật gây hại gây bệnh cho người, động vật, thực vật, các nhóm vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm, ô nhiễm các nguồn nước, đất và không khí…

- Trong lĩnh vực nông nghiệp: cải tạo giống cây trồng, sản xuất chế phẩm (phân bón), sản xuất chế phẩm vi sinh vật dùng trong bảo vệ thực vật

- Trong lĩnh vực bảo quản chế biến: hệ vi sinh vật trong thực phẩm và công nghệ bảo quản chế biến thực phẩm

- Trong lĩnh vực công nghiệp: ứng dụng vi sinh vật lên men, nhân sinh khối tế bào sản phẩm như sản xuất protein đơn bào, sản xuất bột ngọt, bia, rượu, cồn, nước ngọt có ga

- Trong vấn đề năng lượng và bảo vệ môi trường: sản xuất cồn làm nguồn năng lượng thay xăng dầu chạy xe các loại, tạo khí sinh học (biogas), trong bảo vệ môi trường công nghệ vi sinh đã tham gia tích cực trong xử lý phế thải công nghiệp, nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước thải, làm sạch môi trường

Trong vấn đề bảo vệ môi trường công nghệ vi sinh đã tham gia tích cực trong việc xử lý phế thải công nghiệp, nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước thải, làm sạch môi trường Đây là vấn đề cấp thiết trên toàn cầu hiện nay

2.1.2 Vi khuẩn phân giải cellulose

2.1.2.1 Dạ cỏ động vật nhai lại

Dung tích dạ cỏ khoảng 60÷100 lít, niêm mạc dạ cỏ có nhiều gờ nổi lên làm tăng thêm diện tích Dạ cỏ không có tuyến bài tiết HCL và dịch vị mà chỉ tiết dịch nhày Tiêu hóa trong dạ cỏ chủ yếu nhờ enzyme của vi sinh vật cư trú trong đó

Môi trường dạ cỏ với các đặc điểm thiết yếu cho sự lên men vi sinh vật

đó là: có độ ẩm cao (80-90%), độ pH cao (6,4-7,5), độ pH dạ cỏ tương đối ổn định, luôn luôn được đệm bởi bicarbonate và phosphates của nước bọt, nhiệt

độ khoảng 39-410C, luôn luôn được nhào trộn bởi sự co bóp của dạ cỏ, dòng dinh dưỡng lưu thông liên tục Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men ra khỏi dạ cỏ và các cơ chất được nạp vào thông qua thức ăn ăn vào hàng ngày,

có sự chế tiết vào dạ cỏ những chất cần thiết cho vi sinh vật phát triển và khuếch tán ra ngoài những sản phẩm tạo ra trong dạ cỏ Ðiều này làm cho áp suất thẩm thấu của dạ cỏ luôn ổn định Thời gian thức ăn tồn lưu trong dạ cỏ kéo dài tạo điều kiện cho vi sinh vật công phá Những điều kiện đó là lý tưởng cho sự phát triển của vi sinh vật dạ cỏ Ðiều này được đánh giá bởi sự phong phú về chủng loại và mật độ vi sinh vật Môi trường dạ cỏ được kiểm soát và điều khiển bởi nhiều yếu tố như: số lượng và chất lượng thức ăn ăn vào, nhào trộn theo chu kỳ thông qua co bóp dạ cỏ, nước bọt và nhai lại, khuyếch tán và chế tiết vào dạ cỏ, hấp thu dinh dưỡng từ dạ cỏ, chuyển dịch các chất xuống bộ máy tiêu hóa [1]

2.1.2.2 Hệ vi sinh vật dạ cỏ

Hệ vi sinh vật cộng sinh trong dạ cỏ và dạ tổ ong rất phức tạp và thường gọi chung là vi sinh vật dạ cỏ Hệ vi sinh vật dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính là: vi thực vật, nấm và vi động vật

Vi khuẩn xuất hiện trong dạ cỏ loài nhai lại trong lứa tuổi còn non, mặc

dù chúng được nuôi cách biệt hoặc cùng với mẹ chúng Thông thường vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong vi sinh vật dạ cỏ và là tác nhân chính trong quá trình tiêu hóa xơ Tính từ năm 1941 là năm Hungate công bố những công trình nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật dạ cỏ đến nay đã có tới hơn 200

loài vi khuẩn dạ cỏ đã được mô tả (Theodorou và France, 1993) Tổng số vi khuẩn có trong dạ cỏ thường vào khoảng 109

-1010 tế bào/g chất chứa dạ cỏ Trong dạ cỏ vi khuẩn ở thể tự do chiếm khoảng 25-30%, số còn lại bám vào

các mẩu thức ăn, trú ngụ ở các nếp gấp biểu mô và bám vào protozoa

Sự phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể được tiến hành dựa vào cơ chất mà

vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng Sau đây là một

số nhóm vi khuẩn dạ cỏ chính:

- Vi khuẩn phân giải cellulose

- Vi khuẩn phân giải hemixenlulose

- Vi khuẩn phân giải gluxit

- Vi khuẩn phân giải ure và vi khuẩn sử dụng NH3

- Vi khuẩn sử dụng các axit hữu cơ tạo ra trong dạ cỏ

- Vi khuẩn phân giải protein và dẫn xuất của protein

- Vi khuẩn tạo metan (CH4)

- Vi khuẩn tổng hợp vitamin (B12)

Sự phân chia cũng chỉ là tương đối vì nhiều loại vi khuẩn có khả năng phân giải nhiều cơ chất khác, ngoài khả năng phân giải chúng còn tổng hợp chất dinh dưỡng khác nhau cho bản thân chúng mà cuối cùng là nguồn dinh dưỡng cho động vật nhai lại [1]

Vi khuẩn phân giải cellulose là nhóm có số lượng rất lớn trong dạ

cỏ của những gia súc sử dụng khẩu phần giàu cellulose Những loài vi khuẩn phân giải cellulose như là:

2.1.2.3 Tác dụng tiêu hóa của vi sinh vật dạ cỏ [1]

- Tiêu hóa cơ học: tiên mao trùng cắn xé thức ăn thành từng mảnh nhỏ, tạo điều kiện cho vi khuẩn phân giải tiếp theo

- Tiêu hóa hóa học: chủ yếu do tác dụng của các enzyme do vi khuẩn

và một số tiên mao trùng tiết ra

- Tiêu hóa gluxit: vi sinh vật trong dạ cỏ có hệ enzyme tiêu hóa gluxit như: amilaza, mantaza…

- Tiêu hóa protein và nitơ-phi protein trong dạ cỏ: trong dạ cỏ vi sinh vật phân giải protein tạo ra peptit, axit amin và cuối cùng là ammoniac (NH3), sau đó sử dụng NH3 để tổng hợp protein của bản thân vi sinh vật

- Tiêu hóa cellulose và hemicellulose (xơ):

+ Cellulose là một pilisaccarit gồm 2000÷4000 phân tử β-D-glucose tạo thành Trong thành phần của tế bào thực vật thì cellulose chiếm 20÷40%, hemicellulose chiếm 10÷40%

+ Hemicellulose do các đường đơn arabinose, galactose, ksilose, axit glucoronic, manose và ramnose tạo thành Vi sinh vật có enzyme cellulase phân giải xơ (các vật nuôi khác không có enzyme này)

+ Hệ enzyme phân giải xơ gồm: enzyme nội bào phân giải xơ tự nhiên, enzyme ngoại bào phân giải xơ hòa tan

Quá trình phân giải xơ gồm 3 giai đoạn chính:

Cellulose => cellobiose

Cellobiose => glucose

Glucose => axit béo bay hơi (axit axetic, propionic, butyric và valeric)

Tỉ lệ tiêu hóa xơ trong dạ cỏ từ 30÷80% Tùy thuộc vào mức độ lignin hóa của thức ăn Cỏ non có tỉ lệ tiêu hóa cao, rơm rạ, cỏ già hàm lượng lignin cao thì tỉ lệ tiêu hóa thấp hơn

2.2 Enzyme từ vi sinh vật

2.2.1 Giới thiệu chung về cellulose

Trong tự nhiên, cellulose là một pholysaccarit có số lượng nhiều nhất, chiếm ½ tổng lượng hydrocacbon hữu cơ trong sinh quyển, gặp phổ biến ở thực vật là thành phần chủ yếu của tế bào thực vật Thông thường cellulose của thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái đất chúng ta Hàng ngày hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy lại trong đất do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống Một phần không nhỏ là do con người thải ra dưới dạng rác rưởi, giấy vụn, mùn cưa…Nếu không có quá trình phân giải của vi sinh vật thì lượng chất hữu cơ khổng lồ này sẽ tràn ngập trái đất [8]

Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật cellulose có cấu tạo dạng sợi, các sợi cellulose trong tự nhiên thường chứa khoảng 10.000-12.000 gốc gluco, các sợi này liên kết thành bó sợi gọi là microfibrin [6]

Hình 2.1: Cấu trúc phân tử cellulose [6]

Cellulose có cấu trúc phân tử là 1 polymer mạch thẳng Mỗi đơn vị là một disaccarit gọi là cellobiose Cellobiose có cấu trúc từ 2 phân tử D-glucose Cấu trúc bậc 2 và 3 rất phức tạp thành cấu trúc dạng lớp gắn với nhau bằng lực liên kết hydro Liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên rất bền vững, bởi vậy cellulose là hợp chất khó phân giải Dịch tiêu hóa của người và động vật không tiêu hóa được chúng Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải ra các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm,

xạ khuẩn và vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ

phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007) động vật nhai lại tiêu hóa được cellulose là nhờ khu hệ vi sinh vật sống trong dạ cỏ [8]

2.2.2 Enzyme cellulase

2.2.21 Giới thiệu chung [16]

Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết -1,4-glucoside trong cellulose Cellulase có khả năng thủy phân cellulose thành đường Con người và động vật không có khả năng phân giải cellulose Phương pháp tìm chế phẩm cellulase còn hạn chế

Chế phẩm Cellulase thường được dùng để:

- Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc

- Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật

Enzyme cellulase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới Đây là enzyme được ứng dụng rất rộng rãi, chỉ đứng sau protease và amylase

2.2.2.2 Nguồn gốc của enzyme cellulase [29]

- Động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm…

- Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa

mì, mạch đen…

- Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…

Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật Các chủng vi sinh vật thường sử dụng:

- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae…

- Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticul…

- Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis…

Cellulase thủy phân cellulose (liên kết 1,4 - β-D-glucoside) tạo ra sản phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides

2.2.2.3 Phân loại enzyme cellulase

Có 3 loại enzyme cellulase chính: [20, 21, 22]

- Cellulobiohydrolase: enzyme này cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Khối lượng phân tử của các enzyme thuộc nhóm này trong khoảng 53-75 kDa Các enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng

- Endo- β-D-cellulase: có khối lượng phân tử trong khoảng 42-49 kDa

Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose trong lichenin và β-D-glucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose

- β-glucosidase: có khả năng hoạt động ở PH rất rộng (pH 4,4-4,8), khối lượng phân tử trong khoảng 50-98 kDa β-glucosidase tham gia thủy phân cellobiose tạo thành glucose

Cellulose có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó có nguồn gốc từ vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc

và một số loại nấm men Do ưu điểm về thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất các chế phẩm enzyme

2.2.2.4 Cấu trúc của enzyme cellulase

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, các axit amin được nối với nhau bởi liên kết peptid -CO-NH- Ngoài ra, trong cấu trúc còn có những phần phụ khác Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endoglucanase và exoglucanase giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi

là vùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain) Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể Trong quá trình phân hủy cellulose

có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose Hơn nữa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính cellulase đối với tinh thể cellulose Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể Vùng gắn kết với cellulose

có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme [9,

18, 19]

2.2.3.5 Tính chất của enzyme cellulase

Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC)

Cellulase cắt liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose, lichenin và các glucan của ngũ cốc

β-D-Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau, cellulase hoạt động ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5 Nhiệt độ tối ưu từ 40-

500C, hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 800C trong 10 đến 15 phút

Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellubiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng thay đổi từ 30-110 KDa (Begunin, 1990, Gilkes và cộng sự, 1991)

2.2.2.6 Sinh tổng hợp cellulase ở vi sinh vật

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí, bình nhiệt hoặc ái nhiệt Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện

tự nhiên rất phong phú, chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn được tìm thấy nhiều trong đất, nước, đường tiêu hóa một số động vật và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân giải cellulose [4]

Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose đã được nghiên cứu được trình bày ở bảng sau:

Bảng 2.1: Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose [7]

2.2.2.7 Cơ chế tác động

Cellulose là một cơ chất không hòa tan, khó phân giải vì vậy muốn phân giải được cellulose các loại vi sinh vật phải tiết ra men cellulase Men

cellulase là men ngoại bào [12]

Hệ enzyme cellulase bao gồm 4 enzyme khác nhau Enzyme C1 có tác dụng cắt đứt liên kết hydro, biến dạng cellulose tự nhiên có cấu hình không gian thành dạng cellulase vô định hình, enzyme này gọi là Cellobiohydrase Enzyme thứ 2 là Endoglucanase có khả năng cắt đứt các liên kết β-1,4 bên trong phân tử tạo thành những chuỗi dài Enzyme thứ 3 là Exo-gluconase tiến hành phân giải các chuỗi trên thành disaccarit gọi là cenlobiose Cả 2 loại enzyme Endo và Exo-gluconase được gọi là Cx Enzyme thứ 4 là β-glucosidase tiến hành thủy phân cellobiose thành glucose

Cellulose C1 Cellulose Cx Cellobiose β-glucosidase Glucose [8] (tự nhiên) (vô định hình)

Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme cellulase endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Thiếu một trong ba loại enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng Từ những nghiên cứu riêng lẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đều đưa

ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động của cellulose, nhiều tác giả đã trình bày sơ

đồ quá trình phân giải cellulose nhờ men (Mandes và Recse (1964); Ogawa, Toyam (1964); Iwasaki, Hayoshi, Walabayais, Nisizwa (1964); Funata (1965); King (1965) và Srinivasan (1973) [6]

Hình 2.2: Sơ đồ phân giải cellulose của Srinivasan, 1973 [6]

- A: ở nấm Trichodesma viride

- B: ở vi khuẩn Cellvibriofuvus

- C: ở nhiều vi sinh vật khác

2.3 Ứng dụng của công nghệ vi sinh vật trong xử lý rác thải

Hiện nay rác thải sinh hoạt và phế thải, nước thải nông nghiệp, công nghiệp là một thảm họa khó lường trong sự phát triển mạnh mẽ của quá trình sản xuất, công nghiệp và hoạt động của toàn xã hội, phế thải không chỉ làm ô nhiễm môi trường sinh thái, ô nhiễm nguồn nước, ô nhiễm đất, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của con người, vật nuôi và cây trồng

Việt Nam là nước nông nghiệp có nguồn phế thải rất lớn, rất đa dạng, nhưng người ta xếp thành 3 nhóm sau: phế thải hữu cơ, phế thải rắn, phế thải lỏng

Các chất thải hữu cơ chiếm một khối lượng rất lớn trong tổng số chất thải Trong các chất thải hữu cơ có nguồn gốc thực vật, cellulose chiếm khoảng 50% Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường là những chất rất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên Nếu để các chất hữu cơ phân hủy trong điều kiện tự nhiên thì thời gian phân hủy rất lâu (khoảng hơn tám tháng

ở điều kiện khí hậu nhiệt đới), tuy nhiên nếu bổ sung vi sinh vật giàu cellulase thì thời gian phân hủy sẽ rút ngắn chỉ còn khoảng một tháng Điều này rất có

ý nghĩa trong việc bảo vệ môi trường (hạn chế sự ô nhiễm nước, không khí và đất) đồng thời thúc đẩy quá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu

và sản xuất [10]

Thành phần của rác thải hữu cơ: các chất hữu cơ trong rác thải là các phần của thực vật, động vật bị loại bỏ, chúng có chứa các thành phần như trong cơ thể sinh vật bị loại bỏ, trong đó quan trọng nhất là: hydratcacbon, protein, lipit

- Các hydratcacbon: chiếm tỷ trọng lớn nhất trong sinh khối động vật, thực vật, vi sinh vật Chúng tương đối phức tạp và khó phân hủy Trong rác thải thường gặp các loại như: cellulose, hemincellulose, ligin, tinh bột, pectin

- Protein: là hợp chất hữu cơ cao phân tử chứa nitơ, thường chứa 15% - 17% nitơ, là phần quan trọng trong cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật

- Lipit: lipit là các chất sáp có nhiều trong cơ thể sinh vật [8, 11, 13]

Chế phẩm xử lý chất thải

- Khái niệm chế phẩm xử lý chất thải: chế phẩm xử lý chất thải là một loại chế phẩm sinh học bao gồm tập hợp các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy và xử lý chất thải tạo thành các chất ít hoặc không gây ô nhiễm môi trường [17]

- Nguyên lý sử dụng vi sinh vật trong xử lý rác thải

Xử lý rác thải bằng công nghệ vi sinh vật là nhờ hoạt động sống của vi sinh vật phân hủy rác thải thành các thành phần nhỏ hơn, hình thành sinh khối

vi sinh vật cao hơn, các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật và các loại khí như CO2, CH4,…Các quá trình chuyển hóa này có thể xảy ra ở điều kiện hiếu khí hay kỵ khí Việc lựa chọn các vi sinh vật xử lý rác thải cần dựa trên những nguyên tắc sau:

Các chủng vi sinh vật phải có hoạt tính sinh học cao như khả năng sinh phức hệ enzyme cellulase cao và ổn định

- Sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện thực tế của đống ủ

- Có tác dụng cải tạo đất và có lợi cho thực vật khi sản xuất được phân

Vi sinh vật phân giải các chất hữu cơ [13]

Các vi sinh vật phân giải cellulose như:

Các nhóm vi khuẩn và xạ khuẩn: trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân huỷ cellulose nhờ có hệ enzym cellulase ngoại bào nhưng chủ yếu là các chi thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kỵ khí và các xạ khuẩn hiếu khí

- Vi khuẩn: Cytophaga, Sporocytophaga, Sporangium, Clostridium,

Bacillus, Bacterioides, Cellulomonas, Acetobacter, Pseudomonas…

- Nấm sợi: Aspergillus, Trichoderma, Alternaria…

- Xạ khuẩn: Actinomyces, Streptomyces…

Vi khuẩn có khả năng phân huỷ cellulose, tuy nhiên cường độ không mạnh bằng vi nấm Nguyên nhân là do số lượng enzym tiết ra môi trường của

vi khuẩn thường ít hơn, thành phần các loại enzym không đầy đủ Thường ở trong đống ủ rác có ít loài vi khuẩn có khả năng tiết ra đầy đủ bốn loại enzym trong hệ enzyme cellulase Nhóm này tiết ra một loại enzyme, nhóm khác tiết

ra loại khác, chúng phối hợp với nhau để phân giải cơ chất trong mối quan hệ

hỗ sinh

2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

Hiện nay, ngành công nghệ enzyme đang phát triển rất mạnh mẽ trên thế giới, các chế phẩm enzyme, đặc biệt là enzyme cellulase được sản xuất và

sử dụng ngày càng nhiều trong hầu hết các lĩnh vực của đời sống như: công nghiệp dệt nhuộm, công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp thực phẩm và thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất giấy Ứng dụng quan trọng nhất của cellulase hiện nay được dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối thực vật Với

sự cạn kiệt của nguồn nhiên liệu hóa thạch và gia tăng nhu cầu tìm kiếm nguồn nhiên liệu thay thế, sự quan tâm nghiên cứu cellulase đã được bắt đầu trong những thập kỷ gần đây cho ứng dụng chuyển đổi sinh khối thực vật thành nhiên liệu sinh học Sự sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối thực vật đã và đang được xem như là phương thức tiềm năng cho nguồn nhiên liệu tái sinh và phát triển bền vững [23]

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu phân lập và xác định vi khuẩn từ các nguồn khác nhau sản xuất enzyme cellulase như nghiên cứu của Aihemaiti M, Zhen F, Li Y, Aibaidoula G, Yimit W, đã phân lập được 84 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulase từ dạ cỏ của cừu, bò, lạc đà ở Tân Cương, trong đó đã xác định được 40 chủng có khả năng phân giải mạnh cellulose [24] Trong nghiên cứu của Liang YL, Zhang Z, Wu M, Wu Y, Feng

JX, đã phân lập được 245 chủng vi khuẩn hiếu khí trên đĩa thạch trong khu bảo tồn thiên nhiên cận nhiệt đới ở Trung Quốc, trong đó có 22 chủng có khả năng phân giải cellulose [25]…

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, trong những năm gần đây, đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật phân giải cellulose như trong nghiên cứu của Hà Thanh Toàn và cộng

sự, đã phân lập được 62 dòng vi khuẩn phân giải các chất hữu cơ trong nước

rỉ từ bãi rác thành phố Cần Thơ, trong đó có 24 dòng phân giải cellulose [2] Các nghiên cứu về vi sinh vật phân giải cellulose và cellulase (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng

sự , 2007; Nguyễn Ngọc Minh và cộng sự, 2006) Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulose như: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulose và tinh sạch, đánh giá tính chất lý hóa của cellulose từ

chủng Penicillium sp Nghiên cứu phân loại và xác định hoạt tính cellulose

của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XK2 (Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006)

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng (vật liệu) nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn trong dạ cỏ động vật nhai lại (trâu, bò)

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Dịch dạ cỏ động vật nhai lại (trâu, bò)

3.1.3 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

Địa điểm: Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thời gian nghiên cứu: 12/2014 đến 5/2015

3.1.4 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu

3.1.4.1 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Dụng cụ:

- Bình định mức, ống đong, cốc thuỷ tinh

- Bình tam giác

- Pipet, đũa thủy tinh

- Đĩa peptri, ống nghiệm, dụng cụ đục lỗ thạch và một số dụng cụ khác Thiết bị:

- Máy ly tâm (Trung Quốc)

- Tủ lạnh ( việt Nam)

- Máy đo pH (HANNA, Ba Lan)

- Máy UV-VIS (Labomed, INC)

- Tủ ấm (MITECOM)

- Box cấy AIRTECH (Trung Quốc)

- Máy lắc ổn nhiệt (JING HONG, Trung Quốc)

- Cân điện tử (ELECTRONIC SCALE, Trung Quốc)

- Tủ sấy (MITECOM)

- Nồi hấp khử trùng (MITECOM)

3.1.4.2 Hóa chất

- Thạch agar Hạ Long (Việt Nam)

- (NH4)2SO4, K2HPO4.3H2O, MgSO4.7H2O, NaCl, HCl, KCl, NaNO3, FeSO4.7H2O (Trung Quốc)

- Cacboxymetyl cellulose (CMC) (Singma - Mỹ)

- Đường glucose, saccarose (Việt Nam)

- Thuốc thử lugol (nghiền 2g KI trong cối sứ với 5-10ml nước cất, thêm vào 1g I2 và nghiền cho đến khi hòa tan hoàn toàn, thêm nước cất đến 300ml Bảo quản trong lọ tối màu)

3.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu

3.2.1 Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải cellulose: môi trường CMC (MT1)

Công thức cho 1 lít môi trường

Bảng 3.1: Môi trường CMC

K2HP04.3H20 1,31g MgS04.7H2O 0,5g

3.2.2 Môi trường thử nghiệm khả năng phân giải cellulose (MT2)

Công thức cho 1 lít môi trường:

Bảng 3.2: Môi trường thử hoạt tính cellulose

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ

dịch dạ cỏ động vật nhai lại

- Nội dung 2: Tối ưu hóa điều kiện môi trường (tối ưu hóa quá trình tăng

sinh khối và khả năng sinh enzyme bằng cách thay đổi thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy), lựa chọn môi trường thích hợp để có điều kiện lên men thu sinh khối và thu chế phẩm enzyme

- Nội dung 3: Định danh sơ bộ về chủng vi khuẩn mà mình phân lập

được dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, độ phân giải…

- Nội dung 4: Thử khả năng kết hợp của chủng vi sinh vật phân lập

được với các chủng vi sinh vật khác

3.4 Phương pháp nghiên cứu:

Phân lập vi khuẩn phân giải cellulose trên môi trường với nguồn cacbon là CMC