Nghiên cứu sự ô nhiễm vi khuẩn escherichia coli, salmonella spp trên thịt lợn tại các chợ thuộc thành phố tuyên quang và đề xuất biện pháp khống chế

Thực tế hiện nay các loại thực phẩm có nguồn gốc từ động vật đặc biệt là thịt lợn được bầy bán ở các khu tập trung đông dân cư, chợ và kể cả trong các siêu thị không đảm bảo chất lượng t

NGUYỄN THẾ ANH

NGHIÊN CỨU SỰ Ô NHIỄM VI KHUẨN

ESCHERICHIA COLI, SALMONELLA SPP

TRÊN THỊT LỢN TẠI CÁC CHỢ THUỘC THÀNH PHỐ TUYÊN QUANG VÀ ĐỀ XUẤT

BIỆN PHÁP KHỐNG CHẾ

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Thái Nguyên - 2015

NGUYỄN THẾ ANH

NGHIÊN CỨU SỰ Ô NHIỄM VI KHUẨN

ESCHERICHIA COLI, SALMONELLA SPP

TRÊN THỊT LỢN TẠI CÁC CHỢ THUỘC THÀNH PHỐ TUYÊN QUANG VÀ ĐỀ XUẤT

LỜI CAM ĐOAN

Nội dung Luận văn và các số liệu thu thập để phục vụ Luận văn tốt nghiệp

được thực hiện hoàn toàn trung thực và chính xác, kết quả phân tích mẫu được thực

hiện tại Bộ môn Vệ sinh Thú y thuộc Viện Thú y Quốc gia và Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên Mọi tài liệu tham khảo và trích dẫn trong Luận văn đều

được chỉ rõ nguồn gốc

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt 2 năm học tập, với nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, đến nay luận văn của tôi đã được hoàn thành Nhân dịp này, cho phép tôi được tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới:

Ban Giám hiệu, Khoa Sau Đại học, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Bộ môn Vệ sinh Thú y- Viện Thú y Quốc gia cùng toàn thể cán bộ, giảng viên trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Với lòng biết ơn chân thành, tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Đặng Xuân Bình

đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn

thành luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn về sự ủng hộ, động viên, giúp đỡ của gia

đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành

tốt Luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2015

Học viên

Nguyễn Thế Anh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2.Ý nghĩa thực tiễn 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Ngộ độc thực phẩm 4

1.1.1 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E coli 5

1.1.2 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella spp 9

1.1.3 Thịt tươi và các dạng hư hỏng của thịt tươi 11

1.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và E coli gây ngộ độc thực phẩm ở trong nước và trên thế giới 16

1.2.1 Nghiên cứu ở Việt Nam 16

1.2.2 Nghiên cứu trên thế giới 17

Chương 2: NỘI DUNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nội dung nghiên cứu 20

2.2 Vật liệu nghiên cứu 20

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm 21

2.4.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt lợn 21

2.4.3 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli và Salmonella trong thịt

lợn tươi 23

2.4.4 Quy định kỹ thuật đối với chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt 25

2.4.5 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli và Salmonella phân

lập được 28

2.4.6 Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi

khuẩn E coli và Salmonella phân lập được 29

2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 30

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn thành phố

Tuyên Quang 31 3.2 Xác định chỉ tiêu tổng số VKHK nhiễm trên thịt lợn 33

3.3 Xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli nhiễm trên thịt lợn 35 3.4 Xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli nhiễm trên thịt lợn theo thời gian

lấy mẫu 45 3.10 So sánh kết quả thực tế với chỉ tiêu vệ sinh về sự ô nhiễm của vi khuẩn

3.13 Xác định độc lực của chủng vi khuẩn E coli phân lập được 50

3.14 Xác định độc lực của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 51

3.15 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của chủng vi khuẩn E coli phân lập được 51

3.16 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 53

3.17 Đề xuất một số biện pháp khống chế 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57

1 Kết luận 57

2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

(Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm)

(Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế)

(Tổ chức Y tế thế giới)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Độc lực của các chủng E coli 7

Bảng 1.2: Đánh giá kết quả cảm quan thịt 12

Bảng 1.3: Tiêu chuẩn đánh giá thịt tươi bằng các phản ứng sinh hóa học 13

Bảng 2.1: Các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi TCVN 7046: 2002 28

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn thành phố Tuyên Quang 31

Bảng 3.2: Kết quả xác định chỉ tiêu tổng số VKHK nhiễm trên thịt lợn 33

Bảng 3.3: Kết quả xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli nhiễm trên thịt lợn 35

Bảng 3.4: Kết quả xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli nhiễm trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu 37

Bảng 3.5: Kết quả xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli nhiễm trên thịt lợn theo tháng lấy mẫu 39

Bảng 3.6: So sánh giữa kết quả thực tế với chỉ tiêu cho phép về số lượng vi khuẩn E coli nhiễm trên 1g thịt lợn 41

Bảng 3.7: Kết quả xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella nhiễm trên thịt lợn 42

Bảng 3.8: Kết quả xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella nhiễm trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu 43

Bảng 3.9: Kết quả xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella nhiễm trên thịt lợn theo tháng lấy mẫu 45

Bảng 3.10: So sánh giữa kết quả thực tế với chỉ tiêu vệ sinh về sự ô nhiễm của vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn 47

Bảng 3.11: Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn E coli, phân lập được 48

Bảng 3.12: Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella, phân lập được 49

Bảng 3.13: Kết quả thử độc lực của chủng vi khuẩn E coli phân lập được 50

Bảng 3.14: Kết quả thử độc lực của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 51

Bảng 3.15: Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của chủng vi khuẩn E coli phân lập được 52

Bảng 3.16: Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 53

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Hình 3.1: Chỉ tiêu tổng số VKHK nhiễm trên thịt lợn tại các chợ Tam Cờ, Phan

Thiết, Ỷ La 34

Hình 3.2: So sánh mức độ ô nhiễm của vi khuẩn E coli trên thịt lợn tại các chợ

Tam Cờ, Phan Thiết, Ỷ La 35

Hình 3.3: So sánh sự ô nhiễm của vi khuẩn E coli trên thịt lợn theo thời gian

lấy mẫu trong ngày 37

Hình 3.4: So sánh sự ô nhiễm của vi khuẩn E coli trên thịt lợn theo các tháng

lấy mẫu trong năm 39

Hình 3.5: So sánh sự ô nhiễm của vi khuẩn E coli trên 1g thịt lợn giữa các chợ

Tam Cờ, Phan Thiết, Ỷ La 41

Hình 3.6: So sánh sự ô nhiễm của vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn giữa các chợ

Tam Cờ, Phan Thiết, Ỷ La 42

Hình 3.7: So sánh sự ô nhiễm của vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn theo thời

gian lấy mẫu khác nhau trong ngày 43

Hình 3.8: So sánh sự ô nhiễm của vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn theo tháng

lấy mẫu 45

Hình 3.9: So sánh sự ô nhiễm của vi khuẩn Salmonella trên 25g thịt lợn 47 Hình 3.10 Tính mẫn của vi khuẩn E.coli đối với một số hóa dược và kháng sinh 52

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết chọn đề tài

Trong những năm gần đây vấn đề bảo đảm chất lượng và an toàn thực phẩm

đang là mối quan tâm hàng đầu của nhiều quốc gia trên thế giới Sự phát triển kinh

tế mạnh mẽ song song với quá trình đô thị hóa ngày càng một phát triển, cũng như

sự mở rộng giao thương quốc tế hàng hóa từ một nước có thể nhập và được tiêu dùng ở nhiều nước khác nhau trên thế giới, ngược lại một nước có thể nhập hàng hoá từ nhiều nước khác Với phương tiện giao thông hiện đại, thế giới như được thu nhỏ lại Do vậy sự mất an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) ở nơi này có thể lan truyền sang nơi khác rất nhanh ATVSTP là vấn đề bức xúc hàng đầu và đóng vai trò quan trọng trong đời sống cộng đồng, đặc biệt trong giai đoạn hiện nay thực phẩm an toàn có đóng góp to lớn đối với việc cải thiện sức khỏe và nâng cao chất lượng cuộc sống con người cũng như về lâu dài đối với sự phát triển của giống nòi Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) hơn 1/3 dân số các nước phát triển vẫn bị ảnh hưởng của những bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm Đối với các nước nghèo, các nước đang phát triển lại càng trầm trọng hơn nhiều, con số tử vong

do ngộ độc thực phẩm hàng năm khá cao tới hơn 2,2 triệu người, trong đó hầu hết là trẻ em

Các vụ ngộ độc thực phẩn trên thế giới có xu hướng ngày càng tăng, cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho biết mỗi năm vẫn có 76 triệu

ca ngộ độc thực phẩm (NĐTP) với 325.000 người phải nhập viện và 5.000 người tử vong, trung bình cứ 1.000 người dân thì có 175 người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm và chi phí cho một ca bị ngộ độc thực phẩm mất 1.531 đô la Mỹ Nước Úc mỗi năm vẫn có khoản 4,2 triệu ca bị ngộ độc thực phẩm và các bệnh truyền qua thực phẩm, trung bình mỗi ngày có 11.500 ca mắc bệnh cấp tính do ăn uống gây ra và chi phí cho một ca bị ngộ độc thực phẩm mất 1.679 đô la Úc (Black RE, Lanta CF, 1995) [40]

Ở Việt Nam theo số liệu của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm thuộc Bộ Y tế thì

mỗi năm có khoảng 5.000 người mắc các loại ngộ độc thực phẩm Tuy nhiên theo báo cáo của WHO thì con số này có thể lên đến 10 triệu người mỗi năm

Thực tế hiện nay các loại thực phẩm có nguồn gốc từ động vật đặc biệt là thịt lợn được bầy bán ở các khu tập trung đông dân cư, chợ và kể cả trong các siêu thị không đảm bảo chất lượng (trong thịt bị nhiễm bụi bẩn, vi khuẩn do quá trình giết

mổ, vận chuyển, bảo quản và bầy bán tại các chợ) Minh chứng cho điều ấy là hàng năm có rất nhiều các ca ngộ độc thực phẩm xảy ra Một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật và độc tố của chúng nhiễm vào trong thịt,

trong đó có vi khuẩn E coli, Salmonella và độc tố đường ruột Enterotoxin là một

trong những nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm (Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, 2009) [3]

Xuất phát từ thực tế trên đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu sự ô nhiễm vi

khuẩn Escherichia coli, Salmonella spp trên thịt lợn tại các chợ thuộc thành phố Tuyên Quang và đề xuất biện pháp khống chế”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát tình hình giết mổ, phân phối và mức độ ô nhiễm vi khuẩn E coli và

Salmonella spp trong thịt lợn tại thành phố Tuyên Quang

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli, Salmonella spp

phân lập được

- Đề xuất biện pháp khống chế ô nhiễm vi khuẩn gây bệnh và ngộ độc thực phẩm

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp dữ liệu khoa học về đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli và

Salmonella spp phân lập được trong thịt lợn tại thành phố Tuyên Quang

Xác định mối tương quan giữa đặc điểm giết mổ, phân phối thịt lợn đến nguy

cơ gây ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E coli và Salmonella spp

3.2.Ý nghĩa thực tiễn

Nắm được tình hình giết mổ, công tác kiểm tra vệ sinh thú y đối với sản phẩm thịt lợn tại thành phố Tuyên Quang

Xác định tình hình nhiễm khuẩn E coli và Salmonella spp phân lập được

trong thịt lợn tại thành phố Tuyên Quang

Đề xuất biện pháp phòng, chống hiệu quả ngộ độc thực phẩm do nhiễm khuẩn

E coli và Salmonella spp

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm hay ngộ độc thức ăn là các biểu hiện bệnh lý xuất hiện sau khi ăn, uống Người bị trúng độc, ngộ độc do ăn, uống phải những loại thực phẩm nhiễm khuẩn, nhiễm độc hoặc có chứa chất gây ngộ độc biểu hiện triệu chứng lâm sàng như nôn mửa, tiêu chảy, chóng mặt, sốt, đau bụng Ngộ độc thực phẩm không chỉ gây hại cho sức khỏe (có thể dẫn đến tử vong) mà còn khiến tinh thần con người mệt mỏi (Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, 2010) [4]

Ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh có thể chia làm 3 loại:

- Ngộ độc do độc tố đã được sinh ra trong thực phẩm Các vi khuẩn như:

Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium botulinum… trong khi phát

triển trên thực phẩm đã sinh ra các chất gây ngộ độc cho người Trong trường hợp này, thời gian ủ bệnh rất ngắn và các triệu chứng thường là đau bụng, nôn ói

- Nhiễm khuẩn không xâm nhập là trường hợp các vi khuẩn nhiễm vào thức ăn, sau khi vào cơ thể chúng vẫn còn sống sót đến ruột non và phát triển bên trong lòng ruột Tại đây, chúng sinh ra các độc tố có tác dụng cục bộ trong

ruột, gây đau bụng và tiêu chảy Các vi khuẩn dạng này thường là Vibrio

cholera gây bệnh tả, E coli, Clostridium perfringens

- Nhiễm khuẩn xâm nhập do các vi khuẩn nhiễm vào thức ăn và còn sống sót

đến ruột non, tại đây chúng xâm nhập vào các tế bào thành ruột, như vi khuẩn

Salmonella xâm nhập vào tế bào ruột non, gây viêm ruột cục bộ dẫn đến triệu chứng

nóng sốt, ớn lạnh và tiêu chảy; vi khuẩn Shigella, E coli sau khi xâm nhập vào các

tế bào ruột non gây nên các ổ ung nhọt và các vết loét trong ruột dẫn đến hội chứng

tả lỵ, trong phân có máu Một số chủng khác lại sinh ra độc tố thần kinh gây triệu chứng tê liệt và có thể dẫn đến tử vong (Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, 2009) [3]

sống kinh tế, xã hội, tập quán sinh hoạt, thói quen ăn uống của con người, do đó tỷ lệ

mắc bệnh do E coli thường thấy ở các nước chậm hoặc đang phát triển, nơi đời sống

kinh tế, xã hội, dân cư còn thấp kém [51]

E coli thuộc nhóm trực khuẩn đường ruột họ Enterobacteriaceae, có nhiều

trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc Trong đường ruột, chúng

hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng Vi khuẩn E coli

nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật Chúng gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi [51]

* Vai trò của vi khuẩn E.coli gây ô nhiễm thịt

Trực khuẩn Escherichia coli thường trú trong ruột già của động vật máu nóng,

chúng thường xuyên được bài xuất ra ngoài môi trường Nó chính là nguyên nhân

gây ra một số bệnh ở người và động vật

- Hình thái và tính chất bắt màu

E.coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, di động được do có lông, vi khuẩn không

sinh nha bào, có thể có giáp mô Đường kính ngang tế bào dưới 1µm, chiều dài thay

đổi, kích thước trung bình từ 0,3-0,6 x 2-3µm

Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu Nhuộm vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày có thể thấy giáp mô, khi soi tươi không nhìn thấy được

- Tính chất nuôi cấy

E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thong thường, có thể

sinh trưởng phát triển được từ 5,5-8, thích hợp ở 370C, pH = 7,2-7,4

+ Môi trường nước thịt: Phát triển tốt, môi trường đục, cặn màu tro lắng

xuống đáy, có mùi Indol (mùi phân thối) do phản ứng Indol dương tính

+ Trên môi trường thạch thường: Vi khuẩn phát triển, sau 24h tạo thành

những khuẩn lạc dạng S, hơi vồng, tròn trơn nhẵn, đường kính 2-3mm màu xám nhạt Nuôi lâu khuẩn lạc trở thành màu tro nhạt, mọc rộng ra, có thể quan sát thấy

cả khuẩn lạc dạng R (nhám, xù xì) và khuẩn lạc dạng M (nhầy)

+ Môi trường thạch MacConkey: Hình thành khuẩn lạc dạng S, màu đỏ cánh

sen (do lên men đường lactoza sản sinh axid), xung quanh có vùng mờ sương (do lên men đường lactoza, sinh hơi)

+ Môi trường thạch Brilliant green: Khuẩn lạc dạng S, màu vàng chanh + Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc dạng S hoặc M (nhầy), có thể dung huyết

hoặc không

+ Môi trường thạch Deoxycholate citrate: Vi khuẩn không mọc do không sử

dụng được nguồn cacbon

+ Môi trường thạch Triple Sugar Iron (TSI): Vi khuẩn phát triển nhưng không

sản sinh H2S (không làm đen môi trường)

E.coli lên men đường lactoza, maltoza, mannit, mannoza, sorbitol, xyloza,

saccaroza (26-70%), hầu hết E coli đều lên men sinh hơi đường lactoza

+ H2S (-), Indole (+), VP (-), MR (+),Ureaza (-), Citrate (-)

+ Sữa tươi: Đông tụ sau 24h/370C

- Sức đề kháng

Như các vi khuẩn không sinh nha bào khác, E coli không chịu được nhiệt độ

C/1h, 600C/30 phút, đun sôi 1000C chết ngay

Các chất sát trùng thông thường axid phenic, formol 0,3% diệt vi khuẩn sau 5 phút Ở ngoài môi trường vi khuẩn có thể tồn tại đến 4 tháng

- Tính gây bệnh

E coli có sẵn trong ruột của động vật, bệnh xảy ra do nhiễm trùng kế phát

dưới ảnh hưởng của nhiều yếu tố: Dinh dưỡng, sự thiếu hụt kháng thể sữa đầu, khí hậu thời tiết, nhiệt độ, ẩm độ, trạng thái stress, loạn khuẩn đường ruột, sự có mặt

của chủng E coli độc…

E coli có thể gây bệnh cho gia súc non (lợn, bê, dê, cừu, chó) dưới 1 tuần tuổi,

gây bệnh cho gia cầm ở mọi lứa tuổi

Thể bệnh do E coli gây ra ở gia súc, gia cầm mỗi lứa tuổi khác nhau cũng sẽ

khác nhau cả về yếu tố gây bệnh của vi khuẩn, mức độ trầm trọng, đặc điểm triệu chứng lâm sàng chẳng hạn: Gây bệnh cho lợn dưới 1 tuần tuổi ở 3 thể; thể bệnh tiêu chảy chết 90 - 100%; thể nhiễm trùng máu; thể viêm màng não, kháng nguyên bám dính F4, F5, F6, F18 Gây bệnh sau cai sữa, thể bệnh phù đầu, triệu chứng thần kinh, chết đột ngột, kháng nguyên O139, O141, yếu tố bám dính F107

Vi khuẩn E coli gây bệnh ở người như tiêu chảy, NĐTP do ăn phải thịt nhiễm

khuẩn, sản sinh độc tố gây bệnh Các triệu chứng điển hình và thể bệnh gây ra là viêm dạ dày ruột, viêm đường tiết niệu, sinh dục, viêm màng não, nhiễm trùng

huyết, nhiễm độc huyết… có 5 chủng E coli gây bệnh

Vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh 2 loại độc tố: Độc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin - ST) Những chủng E coli sản sinh độc tố là nguyên nhân gây nên

bệnh tiêu chảy ở người Trong đó, độc tố chịu nhiệt (ST) chịu được 1200C trong

vòng 15 phút

Những serotype của E coli có khả năng gây ngộ độc thức ăn như: O26, O56,

O86, O111, O119, O125, O126, O127, O157H7

E coli được coi như nhân tố chỉ điểm trong VSATTP Mặc dù E coli có xuất

hiện trên thực phẩm đặc biệt là thịt tươi sống nhưng lại không liên quan trực tiếp

đến sự xuất hiện của vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên thực phẩm đã bị nhiễm E coli

với số lượng lớn chứng tỏ mối nguy về khả năng chứa các loại vi khuẩn gây bệnh

Yếu tố gây bệnh quan trọng nhất của E coli chính là độc tố đường ruột

(Enterotoxin) Độc tố ruột kích thích sự hấp thu dịch thể vào trong lòng ruột gây ra tiêu chảy Độc tố ruột gây tiêu chảy ở lợn bao gồm:

- Độc tố chịu nhiệt (Heat stabile enterotoxin - ST): Độc tố này có trọng lượng

phá huỷ nhanh khi hấp cao áp và bền vững ở nhiệt độ thấp

ST thực hiện quá trình gây bệnh nhanh từ 1 - 2 giờ và kéo dài tới 48h ST

được chia thành hai nhóm STa và STb, cả hai nhóm đều có vai trò quan trọng gây ỉa

chảy ở bê, nghé, cừu, dê, lợn con, trẻ sơ sinh Nhưng kết quả kiểm tra PCR trên 575

mẫu E coli phân lập từ lợn cho thấy, có 141 mẫu gen quy định cho STb trong khi

đó chỉ có 51 mẫu phát hiện gen quy định cho STa (Moon và cs)

- Độc tố không chịu nhiệt (Heat labile enterotoxin - LT): Độc tố LT bị vô hoạt

ở 60oC trong 15 phút, độc tố thực hiện quá trình gây bệnh chậm, thường là từ 18 - 24h, đôi khi từ 36 - 48h

Độc tố LT có trọng lượng phân tử cao, nó gồm 5 nhóm B có khả năng bám dính

lên bề mặt ruột và một nhóm A có hoạt tính sinh học cao Độc tố tác động kích thích lên niêm mạc ruột, ảnh hưởng đến quá trình trao đổi nước và chất điện giải Kết quả

là làm xung huyết niêm mạc ruột, tăng tính thấm thành mạch, hút nước từ mạch quản vào lòng ruột gây ra tiêu chảy

Do đó với các loại thực phẩm tươi sống nhất là các sản phẩm có nguồn gốc động

vật, việc xác định tổng số E coli là việc rất quan trọng và bắt buộc Đây là một trong

những tiêu chuẩn cần thiết để đánh giá tình trạng VSATTP

1.1.2 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella spp

Salmonella spp sống trong đường tiêu hóa của gia súc và gia cầm chúng xâm

nhiễm vào thân thịt khi giết mổ, có mặt trong phân và dễ xâm nhiễm vào trứng của

gia cầm thông qua các lỗ khí nhỏ li ti trên bề mặt vỏ trứng Salmonella spp đóng vai

trò không nhỏ trong các vụ ngộ độc thực phẩm

Những loại thức ăn giầu dinh dưỡng gồm thịt, sữa, trứng dễ bị nhiễm Salmonella spp

trong quá trình chế biến và bảo quản không hợp vệ sinh Theo thống kê của Cục An toàn vệ

sinh thực phẩm cho thấy các ca ngộ độc do Salmonella spp nhiễm vào thức ăn xảy ra lẻ tẻ

quanh năm và phát triển mạnh từ tháng 6 đến tháng 9 hàng năm vì đây là thời kỳ nóng bức thuận tiện cho việc vi khuẩn sinh sôi nảy nở rất nhanh, tại các thành phố, khu đông dân cư môi trường bị ô nhiễm ruồi, nhặng, gián phát triển mạnh; sức đề kháng của cơ thể lại bị giảm sút đây chính là điều kiện thuận lợi cho các ca ngộ độc thực phẩm xảy ra

Thời kỳ ủ bệnh từ 12-24 giờ, có khi ngắn hơn hoặc kéo dài sau vài ngày Các dấu hiệu đầu tiên là buồn nôn, nhức đầu choáng váng khó chịu, thân nhiệt tăng lên ít (37-38oC) sau đó xuất hiện nôn mửa, ỉa chảy nhiều lần, phân toàn nước, đôi khi có máu, đó là triệu chứng của viêm dạ dày ruột cấp tính Ða số bệnh nhân trở lại bình thường sau 1 đến 2 ngày không để lại di chứng

* Vai trò của vi khuẩn Salmonella gây ô nhiễm thịt

Salmonella được phát hiện lần đầu tiên năm 1885 bởi Salmon và Smith là Salmonella choleraesuis Năm 1934 chính thức được đặt tên là Salmonella

Đến nay đã phát hiện hơn 2000 serotype Salmonella khác nhau, có khả năng

gây bệnh, gây ô nhiễm thực phẩm cho cả người và động vật

Trong đó phải nói đến Salmonella enteritidis và Salmonella typhimurium gây

ngộ độc thực phẩm

- Hình thái và tính chất bắt màu

Trực khuẩn Salmonella có dạng hình gậy ngắn, kích thước 0,4-0,6 x 1-3µm,

không có giáp mô, không sản sinh nha bào, di động được do có lông (từ 7-12 lông,

trừ Salmonella pullorum và Salmonella gallinarum là không có lông), vi khuẩn bắt

màu gram âm

- Tính chất nuôi cấy

Salmonella sống hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, dễ mọc trên các môi trường

+ Môi trường Xylose, Lysine Deoxycholate Agar (XLD Agar): Vi khuẩn phát

triển thành khuẩn lạc dạng S, màu đỏ, giữa có chấm đen (do sản sinh H2S)

+ Môi trường MacConkey Agar: Khuẩn lạc dạng S, màu trắng

+ Môi trường Brilliant Green Agar: Khuẩn lạc dạng S, màu đỏ

+ Chuyển hoá đường: Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số loại

đường và không đổi Salmonella lên men sinh hơi sản sinh axid, đường glucoza,

mannoza, sorbitol, mannit Tất cả các loài Salmonella đều không lên men đường

lactoza và saccaroza

+ Phản ứng đỏ metyl MR (+), H2S (+), Indone (-), Citrate (+), ure (-)

- Sức đề kháng

Salmonella tồn tại trong đường tiêu hoá của cả động vật máu nóng và máu

lạnh (các loài cá, động vật thuỷ sản), trong môi trường tự nhiên, phân, đất, nước

thải, đặc biệt trong thực phẩm có nguồn gốc động vật như bột thịt xương, bột trứng,

bột cá… tồn tài được 9 tháng hoặc lâu hơn Salmonella sống trong thịt ướp muối

29% được 4-8 tháng ở nhiệt độ 6-120C

+ Với nhiệt độ, vi khuẩn có sức đề kháng yếu, 500C bị diệt sau 1h, 700C trong

vi khuẩn

+ Ánh sáng mặt trời diệt được vi khuẩn trong môi trường nước Ở nước trong

vi khuẩn bị diệt sau 5h và sau 9h ở nước đục

+ Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn dễ dàng: Axid phenic 5%, formol 0.5% diệt khuẩn sau 15-20 phút

- Tính gây bệnh

Salmonella gây bệnh cho người và vật nuôi (gia súc, gia cầm và loài chim)

Bình thường vi khuẩn có thể được phát hiện trong đường ruột của người và gia súc khoẻ mạnh (lợn nái…) Khi sức đề kháng của vật chủ giảm sút sẽ tạo điều kiện

thuận lợi cho Salmonella tác động gây bệnh

Ngoài khả năng gây bệnh Salmonella còn là tác nhân gây NĐTP cho cả người

và động vật bằng nội, ngoại độc tố do vi khuẩn sản sinh trong khi sinh trưởng và phát triển

1.1.3 Thịt tươi và các dạng hư hỏng của thịt tươi

1.1.3.1 Thịt tươi

Thịt tươi là phần thân thịt của gia súc, gia cầm mới được mổ ra và chưa bị biến chất bởi men của bản thân nó và của vi sinh vật, làm thay đổi cảm quan và hình thành những chất có hại Thịt là một trong những sản phẩm của động vật có giá trị dinh dưỡng cao cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển và hoạt động sống của con người Thành phần hóa học của thịt rất khác nhau, nó phụ thuộc vào các yếu tố giống, loài, lứa tuổi, độ béo gầy và chế độ chăm sóc nuôi dưỡng Nhưng thành phần hóa học của thị bao gồm:

+ Nước 50-75%

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1976) [22] và Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I (1998) [38] Đánh giá cảm quan với thịt tươi, ngoài các thành phần trên thịt còn có thành phần khoáng, vitamin, các loại men và các chất dinh dưỡng khác cần thiết cho con người, cụ thể tại bảng 1.2

Bảng 1.2: Đánh giá kết quả cảm quan thịt

1 Trạng thái

3 Độ

đàn hồi

Rắn chắc, đàn hồi cao, ấn ngón tay vào thịt tạo vết lõm, nhấc tay ra không để lại vết

Hơi nhão, nhão, ấn ngón tay vào

để lại vết nhẹ (thịt kém tươi), vết

hằn sâu không mất (thịt ôi)

4 Mỡ

Màu sáng, độ rắn và mùi vị tự nhiên của thịt tươi, không có mùi lạ

Màu tối, độ rắn giảm, có vị ôi

mặt có những giọt mỡ to

Đục, mùi vị ôi, trên bề mặt có

giọt mỡ nhỏ

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1976) [22]; thịt tươi được đánh giá bằng các phản

ứng sinh hóa học dựa theo các tiêu chuẩn sau:

Bảng 1.3: Tiêu chuẩn đánh giá thịt tươi bằng các phản ứng sinh hóa học

Nước thịt đục, có cặn, sánh như keo Phản ứng tìm

Peroxydaza (thử

Benzidin)

Nước thịt ngâm, lọc

có màu xanh lá mạ, sau mấy phút chuyển màu nâu

Nước thịt ngâm, lọc không có hoặc lâu mới có màu xanh lá

mạ

Nước thịt ngâm, lọc không biến đổi màu sắc

Phản ứng Nestler

tìm NH3

Nước thịt ngâm, lọc không màu

Nước thịt ngâm, lọc

có màu vàng nhạt

Nước thịt ngâm, lọc có màu vàng

vỏ chanh Phản ứng tìm H2S

1.1.3.2 Các dạng hư hỏng của thịt

Sau khi giết mổ thịt còn mới nên chưa bị biến chất, thịt trong quá trình bảo quản có thể bị biến chất và hư hỏng trong các trường hợp như: Giữ thịt lâu chưa kịp tiêu thụ hoặc cất giữ để sử dụng dần trong các điều kiện bảo quả không đúng cách lúc này thịt sẽ bị biến chất bởi các enzyme có sẵn trong thịt và các vi sinh vật xâm nhiễm vào thịt dẫn đến ôi thiu, hư hỏng hình thành những chất có hại

Những hiện tượng hư hỏng của thịt thường thấy là: Thịt nhớt, thối rữa, lên men chua, thịt bị hóa nhầy bề mặt, thịt mốc (Lương Đức Phẩm, 2000) [19]

1.1.3.3 Ô nhiễm thực phẩm nguồn gốc động vật

Trên bề mặt da của động vật có chứa nhiều loại vi khuẩn khác nhau Trong hệ

tiêu hóa của con vật chứa một số vi khuẩn như: Salmonella, Staphylococcus,

Streptococcus, E coli các chủng vi khuẩn này dễ dàng phân lập được bằng phương

Đây là môi trường thuận lợi để chúng phát triển tăng sinh khối và dễ dàng sinh nội độc tố hoặc ngoại độc tố gây nguy hại đến sức khỏe người tiêu dùng

1.1.3.5 Ô nhiễm thịt tươi do vi khuẩn

* Ô nhiễm vi khuẩn từ người và động vật

Cơ thể sống nói chung là nơi trú ngụ của nhiều loài vi khuẩn nhất là trên da và niêm mạc của các xoang tự nhiên thông với bên ngoài và đường tiêu hóa Các vi khuẩn

chủ yếu là Staphylococcus, Salmonella, Aerobacter, E coli, Cl.perfringens (Lương

Đức Phẩm, 2000) [19] cho biết những vi khuẩn này được thải ra ngoài và xâm nhiễm

vào thịt qua nhiều con đường khác nhau

* Ô nhiễm vi khuẩn từ không khí

Trong không khí ngoài bụi, còn có rất nhiều vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc Chất lượng không khí phụ thuộc vào các thành phần có trong không khí và khác nhau giữa các vùng miền Không khí chuồng nuôi, sân bãi, nhà xưởng, khu vực giết mổ, chế biến có thể chứa một lượng lớn vi sinh vật từ phân, nước thải, nền chuồng xâm nhập vào không khí Khi không khí bị ô nhiễm thì thực phẩm dễ

bị nhiễm khuẩn, độ ẩm không khí càng cao thì số lượng vi khuẩn càng lớn Bên ngoài và bên trong khu vực chuồng nuôi, lò giết mổ có thể tìm thấy các loại vi

khuẩn: E coli, Salmonella

* Ô nhiễm vi khuẩn trong quá trình giết mổ chế biến bảo quản và lưu thông phân phối

Trong quá trình giết mổ, sự tiếp xúc của công nhân, dụng cụ pha lọc thịt như dao, thớt cũng góp phần cho vi khuẩn nhiễm vào thịt Khi các dụng cụ sử dụng trong thời gian dài không được vệ sinh làm cho số lượng vi khuẩn nhiễm trên bề mặt các dụng cụ này tăng cao quá giới hạn theo Nguyễn Ngọc Tuân (2002) [37]

Vi khuẩn có trên cơ thể của công nhân giết mổ như: Quần áo, đầu tóc, chân tay

đặc biệt những người mắc bệnh truyền nhiễm có thể truyền vi khuẩn gây bệnh vào thịt

Để hạn chế nguyên nhân này, yêu cầu người tham gia giết mổ, chế biến phải có sức

khỏe tốt, được khám sức khỏe định kỳ, được trang bị đầy đủ bảo hộ lao động

Quá trình phân phối thực phẩm là thời gian thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào thực phẩm, hệ thống giết mổ, vận chuyển, phân phối hiện nay chủ yếu là thủ công nên khó kiểm soát được nguy cơ lây nhiễm vi sinh vật theo Lã Văn Kính (2007) [17]

1.1.3.6 Ô nhiễm thịt về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí

Thuật ngữ "vi khuẩn hiếu khí" (VKHK) trong vệ sinh thực phẩm được hiểu là bao gồm cả VKHK và vi khuẩn kỵ khí tùy tiện Sự phân chia vi khuẩn thành hai nhóm dựa trên cơ sở nhiệt độ phát triển giữa chúng Hệ vi sinh vật có mặt trong thịt

được chia thành hai nhóm dựa theo nhiệt độ của chúng

- Nhóm vi khuẩn ưa nhiệt chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 370C và chúng ngừng phát triển ở 10C

- Nhóm vi khuẩn ưa lạnh chúng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ thấp hơn Ingram và Simosen (1980) [53] cho biết vi khuẩn ưa lạnh có thể phát triển ở nhiệt

Hệ VKHK ở thịt thay đổi theo thời gian và điều kiện bảo quản, vi khuẩn ưa nhiệt có thể nhiễm vào thân thịt ngay sau khi giết mổ do đó những thực phẩm có nguồn gốc động vật thường được kiểm tra loại vi khuẩn này ở nhiệt độ 35-370C (Herbert, 1991) [54] cho biết việc xác định tổng số VKHK trong thực phẩm được sử dụng như một chỉ tiêu về điều kiện vệ sinh, nhiệt độ và thời gian chế biến, vận chuyển và bảo quản thực phẩm

1.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và E coli gây ngộ độc thực

phẩm ở trong nước và trên thế giới

1.2.1 Nghiên cứu ở Việt Nam

Tại Việt Nam việc đảm bảo ATVSTP là một trong những vấn đề được quan tâm hàng đầu Tuy nhiên đây cũng là một trong những thách thức cho những nhà quản lý Một số công trình nghiên cứu của nhóm tác giả trong nước về vấn đề này

đã phản ảnh lên điều đó:

Theo Lê Văn Tạo và cs (1994) [30], khi tiến hành phân lập, xác định serotype

của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn cho biết: 50% là Salmonella cholerae suis; 12,5% Salmonella enteritidis; 6,5% Salmonella typhimurium và còn lại là các

serotype khác

Theo Trần Xuân Hạnh (1995) [12] khi nghiên cứu trên lợn từ 2-4 tháng tuổi

đã xác định được 6 serotype Salmonella với tỷ lệ nhiễm cụ thể: Salmonella cholerae

suis 35,9%; Salmonella derby 17,9%; Salmonella typhimurium và Salmonella london 10,2%; Salmonella newport 7,6%

Theo Đỗ Văn Hiệp (2007) [14] khảo sát 148 điểm giết mổ lợn và trâu, bò tại Quốc Oai, Hà Tây cho biết: 100% hộ thực hiện giết mổ trên sàn, bằng phương pháp thủ công với dụng cụ thô sơ, 89,2% hộ giết mổ dùng nước giếng khoan không qua

xử lý, 100% số hộ giết mổ không quan tâm đến việc khử trùng tiêu độc nơi giết mổ

và dụng cụ giết mổ Hoạt động giết mổ như vậy đã gây nhiễm khuẩn trầm trọng vào

thân thịt với tỷ lệ 36,5% mẫu thịt bị nhiễm Salmonella

Trần Thị Hương Giang và cs (2012) [9] đã xác định tỷ lệ nhiễm và độc lực của

vi khuẩn Escherichia coli phân lập được từ thịt (lợn, bò, gà) ở một số huyện ngoại

thành Hà Nội qua kiểm tra 90 mẫu thịt (lợn, bò, gà) lấy tại 11 chợ ở một số huyện ngoại thành Hà Nội (huyện Gia Lâm, Đông Anh và Sóc Sơn) hồi tháng 02/2012 cho thấy tỷ lệ các mẫu thịt đạt tiêu chuẩn vệ sinh (TCVS) khi kiểm tra là khác nhau giữa các loại thịt và giữa các chợ Cụ thể, tỷ lệ mẫu thịt bò và thịt lợn không đạt TCVS ở

chỉ tiêu E coli là 53,33%, cao nhất là thịt gà 60,0% Toàn bộ 100% chủng phân lập

được có độc lực cao, đều gây chết chuột bạch trong phòng thí nghiệm trong vòng

24-72 giờ Trong số các chủng E coli phân lập được, có 3 chủng thuộc về serotype O26,

O55, O157 có thể gây nguy hiểm cho sức khỏe người tiêu dùng Kết quả này góp phần cảnh báo cho người tiêu dùng cẩn trọng trong sử dụng thịt trên thị trường Tính từ 23-28/5/2013, tại Bến Tre đã có 163 người nhập viện do ăn phải bánh

mì với các triệu chứng ngộ độc như ói mửa, tiêu chảy kéo dài, sốt cao, đau bụng Kết quả kiểm nghiệm cho thấy các loại thực phẩm bên trong bánh mì này như thịt,

đồ chua, pa-tê, bơ… đều nhiễm các loại khuẩn E coli, Coliform và Shigella ở mức

cao [52]

1.2.2 Nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay ATVSTP vẫn là mối quan ngại của toàn cầu, ngay cả đối với các nước phát triển có trình độ công nghệ tiên tiến và hệ thống quản lý chất lượng rất khoa học song tỷ lệ ngộ độc thực phẩm vẫn ở mức cao Có rất nhiều nguyên nhân

để dẫn đến thực phẩm bị ô nhiễm và gây ngộ độc thực phẩm trong đó phải kể đến

sự góp mặt của vi sinh vật, độc tố vi sinh vật, nấm mốc, độc tố nấm mốc, hóa chất hiện đang được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm Một số công trình nghiên cứu của các tác giả về vấn đề này:

Năm 1885, Daniel E Salmon nhà bác học thú y ở Mỹ lần đầu tiên phát hiện

Salmonella từ ruột của một con lợn và đặt tên là Salmonella cholerae suis Vi khuẩn Salmonella sau này mới được biết là nguyên nhân gây bệnh ở người [50]

Năm 1933 hội nghị các nhà vi sinh vật học quốc tế chính thức đặt tên cho vi

khuẩn là Salmonella Năm 1934, hai nhà khoa học đã thiết lập bảng cấu trúc kháng

nguyên đầu tiên đặt tên là bảng phân loại Kauffmann – White Từ đó đến nay bảng

cấu trúc kháng nguyên của Salmonella luôn được bổ sung Ngày nay các nhà khoa học đã xác định được khoảng 3.000 serotype Salmonella và chia thành 67 nhóm

huyết thanh dựa vào cấu trúc kháng nguyên O [39]

Những năm gần đây hai serotype Salmonella typhimurium và Salmonella

enteritidis được quan tâm nhất ở Mỹ, do Salmonella kháng lại thuốc kháng sinh

thông thường khi điều trị bệnh cho người và gia súc Ngày nay để định danh vi

khuẩn Salmonella người ta sử dụng sơ đồ của Kauffmann – White do White thiết

lập, sau đó được Kauffmann bổ sung và phát triển trên hệ thống phân loại của Ewing, dựa vào khả năng gây bệnh và tính thích nghi với vật chủ là người hoặc vật

nuôi mà Salmonella có thể chia ra 3 nhóm chính:

Nhóm 1: Salmonella gây bệnh cho người gồm: Salmonella typhi và

Salmonella paratyphi A, B và C Chúng có thể gây nhiễm trực tiếp hoặc gián tiếp

qua thức ăn, nước uống, từ người này sang người khác [39]

Nhóm 2: Gây bệnh trên động vật như: Salmonella dublin ở trâu, bò;

Salmonella cholerae suis ở lợn

Nhóm 3: Gây bệnh cho nhiều loài động vật, là nguyên nhân gây lên những vụ

ngộ độc nghiêm trọng trên người và động vật trong đó điển hình là: Salmonella

enteritidis, Salmonella typhimurium Salmonella spp là tác nhân gây ngộ độc thực

phẩm trên phạm vi toàn thế giới, bệnh do chúng gây ra đang đe dọa sức khỏe cộng

đồng ở hầu hết các Quốc gia phát triển và đang phát triển

Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease

Control and Prevention-CDC) ước tính rằng có tới 76 triệu trường hợp bị bệnh do

thực phẩm hay ngộ độc thực phẩm xảy ra hàng năm ở Mỹ Các bệnh do thực phẩm

đã được xác định như nhiễm trùng, nhiễm độc bởi những tác nhân gây bệnh xâm

nhập vào cơ thể thông qua ăn uống thực phẩm bị ô nhiễm Mọi người đều có nguy

cơ mắc bệnh từ thực phẩm, mức độ tùy thuộc vào sức khỏe, tuổi tác và điều kiện sống.Vi khuẩn gây bệnh là dẫn đầu trong các nguyên nhân gây ra ngộ độc thực

phẩm ở con người Thực phẩm có thể bị ô nhiễm bởi các loại vi khuẩn như: E coli,

Salmonella, Listenia, Shigella hoặc Campylobacter

Ngày 02/7/2011, nhà chức trách Pháp xác nhận nước này đã có trường hợp tử

vong đầu tiên do khuẩn E coli, chủng vi khuẩn gây dịch tả đang hoành hành tại

châu Âu Với các triệu chứng của bệnh tăng urê huyết- huyết khó đông (HUS), triệu

chứng mà hầu hết các bệnh nhân của dịch tả do khuẩn E coli đều gặp phải, tiếp sau

đó 07 trường hợp khác vẫn đang phải điều trị tại bệnh viện sau khi phát hiện chứng

HUS Qua xét nghiệm, những trường hợp này đều được xác nhận đã nhiễm khuẩn

E coli chủng "O104" cùng chủng vi khuẩn với trường hợp đã tử vong ngày

02/7/2011 nói trên Dịch nhiễm trùng đường ruột do khuẩn E coli bùng phát ở châu

Âu đã xuất hiện ở 14 nước, cướp đi sinh mạng của ít nhất 50 người và khiến hơn 3.400 người bị lây nhiễm

Ngày 30/9/2011, Cơ quan giám sát hàng tiêu dùng Nga yêu cầu cơ quan chức năng nước này tăng cường kiểm soát việc nhập khẩu các sản phẩm thịt từ Mỹ Quyết định này được đưa ra trong bối cảnh phát hiện các trường hợp thịt bò xay của

Mỹ bị nhiễm khuẩn E coli Theo thông tin chính thức của Bộ Nông nghiệp Mỹ,

Công ty Tyson FreshMeats Inc của nước này đang tiến hành thu hồi gần 60 tấn thịt

bò xay, được sản suất tại một nhà máy ở thành phố Emporia, bang Kansas, Mỹ do

bị nghi nhiễm khuẩn E coli Nga cũng yêu cầu Belarus và Kazakhstan cần có những biện pháp thích hợp để ngăn ngừa sản phẩm nhiễm khuẩn E coli xâm nhập

vào thị trường hai nước này [55] Theo số liệu của cơ quan y tế bang Ohio, Mỹ,

những trường hợp nhiễm khuẩn E coli do sử dụng sản phẩm của cơ sở nói trên đã

được phát hiện hồi giữa tháng 9/2011 cơ quan chức năng Mỹ đã xác nhận có khuẩn

E coli trong thịt bò xay

Ca ngộ độc thực phẩm do E coli xảy ra ở Sakai Nhật Bản năm 1996 đã làm

6.500 người phải vào viện làm 07 người thiệt mạng (Lê Minh Sơn, 2003) [29] Hàng loạt các vụ NĐTP đã được ghi nhận trên toàn thế giới trong thời gian vừa qua, điều này đã minh họa bức tranh về sức khỏe cộng đồng và mức độ ảnh hưởng của bệnh này đối với toàn cầu

Chương 2 NỘI DUNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát tình hình giết mổ, phân phối và mức độ ô nhiễm vi khuẩn E coli và

Salmonella spp trong thịt lợn tại thành phố Tuyên Quang

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli, Salmonella spp

phân lập được trong thịt lợn

- Xác định độc lực của chủng vi khuẩn E coli, Salmonella phân lập được

- Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của chủng vi

khuẩn E coli, Salmonella phân lập được

- Đề xuất biện pháp khống chế ô nhiễm vào thịt do các vi khuẩn gây bệnh

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Các mẫu thịt được lấy tại các chợ trên địa bàn thành phố Tuyên Quang tỉnh Tuyên Quang

- Môi trường thông thường và đặc hiệu để nuôi cấy, phân lập và giám định

tổng số VKHK, E coli, Salmonella

Môi trường được sử dụng là những môi trường chế biến sẵn dạng tổng hợp khi dùng pha theo công thức hướng dẫn

+ Môi trường Plate Count Agar: Dùng để đếm tổng số VKHK

+ Môi trường thạch Macconkey: Dùng để phân lập vi khuẩn E coli

+ Môi trường thạch máu: Dùng để phân lập và thử khả năng dung huyết của vi

khuẩn E coli

+ Môi trường Nutrient Broth, thuốc khử Kovac's: Dùng để kiểm tra đặc tính

sinh Indol của vi khuẩn E coli

+ Nước muối sinh lý 0,9% dùng để pha loãng mẫu

- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Tủ lạnh, nồi hấp ướt, tủ ấm, buồng cấy vô trùng, pipetman, ống durham, bình tam giác các loại, đĩa petri, cân, que cấy, giá đựng, ống nghiệm đựng mẫu, bông cồn, túi nilon, cối, chày sứ và các dụng cụ thí nghiệm khác

- Khoanh giấy kháng sinh

- Động vật thí nghiệm khỏe

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Từ tháng 8/2014 - 8/2015

- Địa điểm:

+ Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

+ Viện Thú y Quốc gia (Bộ môn Vệ sinh Thú y)

+ Một số chợ trên địa bàn thành phố Tuyên Quang tỉnh Tuyên Quang

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này chúng tôi áp dụng phương pháp nghiên cứu thường

quy trong phòng thí nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn Quốc tế (ISO)

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm

Lấy mẫu thịt lợn tươi theo TCVN 4833-1:2002; TCVN 4833-2:2002, ISO 3100-1: 1991[24]

2.4.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt lợn

Xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt lợn áp dụng theo TCVN 5667:

1992 [25]

* Nguyên tắc

Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy láng, đếm vi khuẩn trên môi trường Plate count

khuẩn hiếu khí có trong 1 gram mẫu theo số khuẩn lạc đếm được trên đĩa thạch nuôi cấy theo các nồng độ khác nhau

* Môi trường và hóa chất

- Môi trường, sử dụng môi trường Plate count Agar (PCA) có pH = 7,0 ± 0,2, môi trường được pha chế theo tỷ lệ 225gram/1000ml nước cất Cho môi trường vào trong bình thủy tinh vô trùng, hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút, sau đó

cạnh ngọn lửa đèn cồn

- Dung dịch muối sinh lý 0,9% dùng để pha loãng dung dịch này được chứa trong các bình có thể tích 500ml hoặc 1.000ml, hấp khử trùng và được phân phối thành các thể tích chính xác 9ml vào các ống nghiệm vô trùng

Đối với mẫu dạng lỏng, hút 10ml dịch cho vào bình tam giác chứa sẵn 90ml

nước muối sinh lý 0,9% Sau khi đồng nhất mẫu, dung dịch thu được có độ pha loãng 10-1 so với ban đầu

Dung dịch đồng nhất tiếp tục được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman với đầu hút vô trùng chuyển 1ml dung dịch mẫu ở bình tam giác đậm

sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý 0,9%; ta thu được dung dịch

có độ pha loãng 10-2 Sau đó sử dụng pipetman có đầu hút vô trùng khác hút 1ml

Thao tác tương tự như vậy để có được các dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng 10-3,

10-4… cho đến khi có được dung dịch mẫu có độ pha loãng cần thiết

Nếu đầu hút của pipetman có nguy cơ bị nhiễm tạp khuẩn trong quá trình thao tác (chạm tay, chạm mặt ngoài ống nghiệm, mặt ngoài bình chứa,…) thì cần phải thay đầu hút vô trùng khác

- Nuôi cấy: Mẫu kiểm nghiệm nuôi cấy ít nhất 2 đậm độ liên tiếp, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch và phải dùng que cấy riêng Dùng pipetman với đầu hút vô trùng lấy 0,2ml dung dịch mẫu pha loãng ở các nồng độ khác nhau rồi nhỏ lên mặt thạch, láng đều sao cho dung dịch nuôi cấy phân bố đều trên mặt thạch Sau đó cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong thời gian 24h rồi đọc kết quả

Chọn những đĩa có tỷ lệ 15-300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 độ pha loãng liên tiếp Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa nuôi cấy phải hợp lý: Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít Nếu chênh lệch giữa các giá trị của 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 thì tính (N – Số khuẩn lạc VKHK cho 1 gram thịt) bằng cách tính trung bình cộng tổng số khuẩn lạc của các đĩa trên theo công thức sau:

- Trong đó:

+ N: Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1gram thịt

+ C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

+ n1, n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1, thứ 2

+ d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng thứ 1

+ V: Thể tích chất nuôi cấy được sử dụng trên mỗi đĩa

Sơ đồ phân lập tổng số vi khuẩn hiếu khí

2.4.3 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli và Salmonella trong thịt lợn

Áp dụng theo TCVN 5155: 1990 [26]; TCVN 5153: 1990 [27]

2.4.3.1 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli trong thịt lợn

a) Yêu cầu chung: Các dụng cụ, môi trường, thuốc thử v.v và thao tác phải vô khuẩn b) Chuẩn bị mẫu thử: Thịt lạnh đông phải giải đông tự nhiên ở nhiệt độ trong

phòng cho đến khi đạt 13-15oC, đồ hộp phải cọ rửa sạch vỏ ngoài, ủ 37 oC từ 5-7 ngày

Độ đồng nhất

Pha loãng mẫu 10-1, 10-2,10-3

Cấy láng mẫu trên Plate Count Ager

Đếm khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí

c) Chế huyễn phù ban đầu

+ Để đếm số vi khuẩn trong 1 gam sản phẩm: Cân 100 -225 gam (không lấy

mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có) nghiền trước trong cối sứ, nghiền nhuyễn tiếp trong máy xay thịt từ 2-3 phút với vận tốc 10.000 vòng/ phút, vừa nghiền vừa bổ sung dần

9 phần môi trường nước thịt (10-1)

vô khuẩn, có kích thước 5 x 5 cm đã được làm ẩm ướt bằng nước muối đẳng trương rồi dán lên bề mặt sản phẩm ở các vị trí khác nhau từ 4-8 miếng (100-200 cm2) Sau

2 phút chuyển toàn bộ số giấy thấm vào bình đã đựng sẵn 10-20 ml môi trường nước thịt và 10-15 viên bi thuỷ tinh Lắc cho tan giấy tuỳ theo khối lượng mẫu thử cần sử dụng mà pha loãng thành 1:1 (1 ml tương đương với 1m2)

d) Đếm số vi khuẩn: Từ huyễn phù ban đầu (c) tiếp tục pha loãng 10 lần (10-1,

10-2, 10-3) tuỳ mức nhiễm khuẩn mà quyết định Mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa môi trường thạch deoxycholat hoặc Macconkey một khối lượng bằng nhau trong khoảng

từ 0,1-1 ml (tuỳ mức nhiễm khuẩn mà quyết định), dàn đều trên mặt thạch hoặc trộn

C, đặt sấp đĩa môi trường, ủ 37 oC Đọc kết quả 2

lần vào 24 giờ và 48 giờ Khuẩn lạc E coli to, đục, mặt khô, màu đỏ

Căn cứ vào hình dạng, màu sắc mà đếm; chọn 5 khuẩn lạc để giám định tiếp tính chất sinh hoá và xác định tỷ lệ

e) Thử các phản ứng IMViC

+ Phản ứng Indol: Phương pháp theo TCVN 5153-90

E coli có phản ứng dương tính, lớp thuốc thử trên mặt môi trường có màu đỏ

Chú thích: E coli không điển hình (atypic) có phản ứng âm tính: màu vàng nhạt

+ Phản ứng đỏ methyl (methyl red): Cấy vi khuẩn (d) vào môi trường nước pepton glucos, ủ 37 oC từ 2-4 ngày, nhỏ 5 giọt thuốc thử đỏ methyl vào, đọc kết quả:

E coli có phản ứng dương tính: màu đỏ (âm tính: màu vàng)

+ Phản ứng Voges - proskauer: Phương pháp theo TCVN 5153-90

E coli có phản ứng âm tính, không màu hoặc vàng nhạt (dương tính: màu đỏ)

+ Trên môi trường thạch Simon xitrat: Ria cấy vi khuẩn (d) trên mặt thạch nghiêng, ủ 37oC từ 1-3 ngày E coli không sinh trưởng (-)

* Tính toán kết quả

- Căn cứ vào kết quả giám định tính chất sinh hoá

- Căn cứ vào công thức dưới đây để tính số E coli trong 1 gam hoặc trên 100

cm2 sản phẩm

thö mÉu

lo ng pha sè béi

1 x

cÊy nu«i l−îng khèi

1 x

−îc

® Õm

® l¹c khuÈn sè

= gam

X

lo ng pha sè béi

1 x

cÊy nu«i l−îng khèi

1 x

−îc

® Õm

® l¹c khuÈn sè x 00

= 100gam

2.4.3.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn

a) Yêu cầu chung: Các dụng cụ, môi trường, thuốc thử, v.v và thao tác phải vô khuẩn

b) Chuẩn bị mẫu thử: Thịt lạnh đông phải giải đông tự nhiên ở nhiệt độ trong phòng cho đến khi đạt 13 - 15oC ; đồ hộp phải cọ rửa sạch vỏ ngoài, lau khô, ủ 37oC từ

5 - 7 ngày

c) Làm phong phú vi khuẩn trong mẫu thử: Cân 25g (không lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có), nghiền trước trong cối sứ, nghiền nhuyễn tiếp trong máy xay thịt từ 2 -3 phút với tốc độ 10.000 vòng/phút, vừa nghiền vừa bổ sung dần 225 ml môi trường tetrationat, ủ 43oC từ 20 - 24 giờ

d) Giám định tính chất sinh hoá

Lấy một vòng que cấy canh trùng tetrationat (c) ria lên mặt thạch SS và thạch deoxycholat-xitrat mỗi loại 2 đĩa, hoặc dùng một trong hai loại môi trường, còn loại thứ hai cơ sở xét nghiệm được tùy ý chọn như thạch Endo, Macconkey, E.M.B, Istrati, v.v , úp sấp đĩa môi trường, ủ 37oC trong 24 giờ, đọc kết quả

Khuẩn lạc Salmonella hình tròn, đường kính từ 1-2 mm, rìa gọn, mặt lồi, không

mầu, bóng láng(dạng S) Làm đồ phiến nhuộm gram, giám định bằng kính hiển vi với vật kính dầu

e) Chọn 5 khuẩn lạc điển hình, ria cấy 2 - 4 đĩa thạch, ủ 37oC từ 18 - 24 giờ để giám định tiếp

Trên đĩa môi trường thạch sắt đường trisaccarit (TSI): Dùng que cấy đầu thẳng, ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng sau đó cắm sâu xuống đáy theo đường thẳng

C trong 24 giờ, đọc kết quả

Salmonella thể hiện: Trên mặt thạch nghiêng có màu đỏ (không phân giải lactose

và sucrose); thân và đáy có màu vàng, có bọt khí hoặc vết nứt (phân giải glucose, sinh hơi), có màu đen (H2S)

Trên môi trường thạch urê (Christensen): Ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng, ủ 37oC trong 24 giờ, đọc kết quả

Salmonella có phản ứng âm tính: không chuyển màu (dương tính: màu đỏ)

Trên môi trường lysin decacboxylas: Cấy vi khuẩn xuống dưới bề mặt môi trường hoặc sau khi cấy vi khuẩn nhỏ parafin lỏng vô khuẩn, dầy khoảng 4 - 5 mm lên môi trường, ủ 37oC trong 24 giờ, đọc kết quả Salmonella có phản ứng dương tính: màu

tím (âm tính: màu vàng)

Thử B - Galactosidas (O.N.P.G):Hoà tan một vòng que cấy khuẩn lạc từ môi trường T.S.I trong ống nghiệm có 0,25 ml nước muối đẳng trương vô khuẩn Nhỏ 1 giọt toluen, lắc đều, ủ cách thuỷ 37oC trong 15 phút; nhỏ tiếp 0,25 ml thuốc thử, lắc

tính: không chuyển màu (dương tính: màu vàng)

Thử phản ứng Indol:Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton, ủ 37oC từ 24 - 48

giờ, sau nhỏ 1 ml thuốc thử, đọc kết quả Salmonella có phản ứng âm tính: màu vàng

nhạt (dương tính: màu đỏ)

Thử phản ứng Voges- Proskauer: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton glucos, ủ 37oC trong 48 giờ, chuyển 1 ml canh trùng sang một ống nghiệm khác, rồi nhỏ 0,6 ml dung dịch cồn α-naptol, 0,2ml dung dịch 40% Kalihydroxyt, lắc đều, đọc

kết quả sau 5 - 15 phút Salmonella có phản ứng âm tính: không màu hoặc vàng nhạt

(dương tính: màu đỏ)

Nhận định tính sinh hoá đặc hiệu:

f) Giám định huyết thanh học bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính

g) Loại bỏ những vi khuẩn tự ngưng kết (e) bằng phương pháp nhỏ 1 giọt

nước muối đẳng trương lên phiến kính dùng que cấy lấy một lượng vi khuẩn vừa

đủ trộn đều thành huyền dịch, đọc kết quả

Nếu có những hạt ngưng kết thì loại bỏ, nếu huyễn dịch vẫn đục đều thì tiến hành giám định

h) Với kháng huyết thanh O đa giá Phương pháp làm theo (g) chỉ khác là

dùng kháng huyết thanh O đa giá thay cho nước muối

Nếu là Salmonella thì xuất hiện những hạt ngưng kết, tuỳ theo mức độ ngưng

kết nhiều hay ít, hạt ngưng kết to hay nhỏ, nước đục hay trong mà đánh giá từ một

đến bốn cộng Huyễn dịch vẩn đục đều là âm tính

g) Khi dương tính với O đa giá thì làm ngưng kết tiếp với O đơn giá và H

Với kháng huyết thanh O đơn giá Phương pháp làm và đọc kết quả theo (h) Chỉ khác là dùng kháng huyết thanh O đơn giá thay cho O đa giá

Với kháng huyết thanh H: Cấy chuyển vi khuẩn vào môi trường nước thịt, ủ

37oC từ 24 -48 giờ, lấy ra ly tâm 3.000 vòng/phút, trong 5 phút, chắt lấy cặn Phương pháp làm và đọc kết quả theo (h), chỉ khác là dùng kháng huyết thanh H thay cho O đa giá