Luận văn phân lập, tuyển chọn vi sinh vật sinh hương trong công nghệ sản xuất nước mắm

Nhưng sản phẩm chế biến từ các phương pháp cải tiến này đã gặp trở ngại về hương vị vì sự tạo thành hương vị của nước mắm chủ yếu là do vi sinh vật trong quá trình phân hủy cơ chất tạo t

MỞ ĐẦU

Nước mắm là một loại nước chấm quen thuộc được ưa chuộng nhất ở nước ta và không thể thiếu trong mỗi bữa ăn hàng ngày Nước mắm có giá trị dinh dưỡng cao, hấp dẫn người ăn bởi hương vị đậm đà, đặc trưng mà không loại sản phẩm nào có thể thay thế được

Nước mắm là một mặt hàng chính của ngành thủy sản Nó tiêu thụ khoảng 40-60% tổng số cá đánh bắt và được chế biến khắp nơi trên toàn quốc Nước mắm được sản xuất từ cá và muối không chỉ được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam

mà hiện nay còn được ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới Tương tự như nước mắm các nước trên thế giới cũng có một số loại nước chấm khác như: Shottusuru

ở Nhật, nampla ở Thái Lan, … Nhưng với phương pháp khác nhau thì sản phẩm

có mùi vị không giống nhau

Nước mắm sản xuất theo phương pháp cổ truyền ở Việt Nam có mùi vị thơm ngon đặc trưng Tuy nhiên nó có nhược điểm là hàm lượng nitơ không cao, chu kì sản xuất quá dài (từ 6 tháng đến 1 năm hoặc có thể lâu hơn), giá thành sản phẩm cao vì vậy không kinh tế Vài chục năm gần đây có nhiều nghiên cứu trong

và ngoài nước nhằm rút ngắn thời gian chế biến và nâng cao chất lượng, đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của thị trường trong và ngoài nước Nhưng sản phẩm chế biến từ các phương pháp cải tiến này đã gặp trở ngại về hương vị vì sự tạo thành hương vị của nước mắm chủ yếu là do vi sinh vật trong quá trình phân hủy cơ chất tạo thành, mà để tạo hương thì cần thời gian dài

Xuất phát từ yêu cầu đó chúng tôi đã tiến hành đề tài : “ Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật sinh hương trong công nghệ sản xuất nước mắm”

Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về nước mắm.

Nước mắm là sản phẩm được lên men từ các loại cá, là sản phẩm truyền thống của dân tộc Việt Nam Nước mắm đã gắn liền với đời sống hằng ngày và

là một bản sắc rất riêng của dân tộc Việt Nam

Đây là sản phẩm của nhiều quá trình phức tạp gồm quá trình đạm hóa, quá trình phân giải đường trong cá thành acid, quá trình phân hủy một phần amino acid dưới tác dụng của vi khuẩn có hại, tiếp tục bị phân hủy thành những hợp chất đơn giản như amin, amoniac, cacbonic hydrosunfua…

Nước mắm được sản xuất từ cá và muối không chỉ được sử dụng rộng rãi

ở Việt Nam mà còn được ưa chuộng tại nhiều nước trên thế giới Đặc biệt, nước mắm được sản xuất ở hầu hết các nước Châu Á Mỗi nước có điều kiện sản xuất khác nhau tạo ra sản phẩm có giá trịnh dinh dưỡng và giá trị cảm quan khác nhau.[4]

1.1.1 Giá trị dinh dưỡng của nước mắm

Hàm lượng nitơ: Chiếm chủ yếu và quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm

- Hàm lượng nitơ toàn phần: là tổng lượng nitơ có trong nước mắm (g/l), quyết định phân hạng của nước mắm

- Hàm lượng nitơ amin: là tổng lượng đạm nằm dưới dạng acid amin (g/l), quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm

- Hàm lượng nitơ amon: Lượng đạm amon càng nhiều nước mắm càng kém chất lượng

Ngoài ra trong nước mắm còn chứa đầy đủ các acid amin, đặc biệt là các

acid amin không thay thế: valin, leucin, methionin, isoleucin, phenylalanin, alanin.v.v Các thành phần khác có kích thước lớn như tripeptid, peptol, dipeptid Chính những thành phần trung gian này làm cho nước mắm dễ bị hư hỏng do hoạt động của vi sinh vật.[11]

Các chất bay hơi: Rất phức tạp và quyết định hương vị của nước mắm.Hàm lượng các chất bay hơi trong nước mắm mg/100g nước mắm

- Các chất cacbonyl bay hơi: 407-512 (formaldehyde)

- Các acid bay hơi: 404-533 (propionic)

- Các amin bay hơi: 9,5-11,3 (izopropylamin)

- Các chất trung tính bay hơi: 5,1-13,2 (acetaldehyde)

Các chất khác: Các chất vô cơ: NaCl chiếm 250-280g/l và một số các chất khoáng như: S, Ca, Mg, P, I, Br Vitamin: B1, B12, B2, PP

1.1.2 Nguyên liệu.

a, Cá

Nguyên liệu chính dùng để sản xuất nước mắm là các loại cá Tuy nhiên chất lượng nước mắm lại phụ thuộc rất nhiều vào từng loại cá Vì thế việc chọn

cá để sản xuất nước mắm là điều mà các nhà sản xuất quan tâm

Thành phần hóa học của cá gồm: nước, protide, lipid, glucid, muối vô cơ, vitamine, trong đó nước chiếm tỉ lệ rất lớn, protide và lipid chiếm một phần đáng kể, glucid trong cá thường rất ít và tồn tại dưới dạng glycogen Các thành phần này khác nhau và thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới tính, điều kiện sinh sống Ngoài ra, các yếu tố như thành phần thức ăn, môi trường sống, kích cỡ

cá và các đặc tính di truyền cũng ảnh hưởng đến thành phần hóa học, đặc biệt ở

cá nuôi Thành phần hóa học của cá ở từng cơ quan, bộ phận có sự khác nhau

Lipid: [2] Cá sử dụng chất béo như là nguồn năng lượng dự trữ để duy trì

sự sống trong những tháng mùa đông, khi nguồn thức ăn khan hiếm Hàm lượng lipid trong cá dao động nhiều (0,1-30%)

Lipid trong các loài cá xương được chia thành 2 nhóm chính: phospholipid

và triglycerit Phospholipid tạo nên cấu trúc của màng tế bào, vì vậy chúng được gọi là lipid cấu trúc Triglycerit là lipid dự trữ năng lượng có trong các nơi dự trữ chất béo, thuờng ở trong các tế bào mỡ đặc biệt được bao quanh bằng một màng phospholipid và mạng lưới collagen mỏng hơn

Lipid của cá khác với lipid của động vật có vú, chủ yếu do lipid của cá có tới 40% acid béo mạch dài (14 - 22 nguyên tử cacbon) và mức độ không no cao Trong lipid của động vật có vú, ít khi có acid béo với 2 nối kép trở lên trong khi lipid của cá có nhiều acid béo với 5 hoặc 6 nối kép [2]

- Protein: [2] Có thể chia protein của mô cơ cá ra thành 3 nhóm sau:

* Protein cấu trúc: Gồm các sợi myosin, actin, actomyosin và tropomyosin, chiếm khoảng 70 - 80% tổng lượng protein (so với 40% trong các loài động vật có vú) Các protein này hòa tan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion khá cao (> 0,5 M) Các protein cấu trúc có chức năng co rút đảm nhận các hoạt động của cơ

* Protein tương cơ: Gồm myoalbumin, globulin và các enzyme, chiếm khoảng 25-30% tổng luợng protein Các protein này hòa tan trong nuớc, trong dung dịch muối trung tính có nồng dộ ion thấp (<15M) Đa số protein tương cơ là các enzyme tham gia vào sự trao đổi chất của tế bào, như sự chuyển hoá năng lượng trong điều kiện yếm khí từ glycogen thành ATP

* Protein mô liên kết: Bao gồm các sợi collagen Chiếm khoảng 3% tổng lượng protein trong cá xương và khoảng 10% trong cá sụn Có trong mạng luới ngoại bào, không tan trong nuớc, dung dịch kiềm hoặc dung dịch muối có nồng

độ ion cao

Protein của cá có thành phần acid amin gần giống protein trong cơ thịt của

động vật có vú, mặc dù đặc tính vật lý có thể khác nhau đôi chút Điểm đẳng điện (pI) của protein cá vào khoảng pH 4,5 - 5,5 Tại giá trị pH này, protein có

độ hòa tan thấp nhất Giống như protein trong sữa, trứng và thịt của động vật có

vú, protein trong cá có tất cả các acid amin chủ yếu và có giá trị sinh học rất cao

Bảng 3: Các acid amin chủ yếu (%) trong các protein khác nhau [2]

8.11.62.65.310.27.24.44.37.6

9.31.13.84.58.25.24.22.95.0

6.81.92.25.48.47.15.53.38.1

- Hệ vi sinh vật cá: [10] Thịt cá là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của hầu hết các vi sinh vật, trong đó có cả các loài sinh bào tử cũng như gây bệnh Hệ vi sinh vật của cá rất đa dạng Trên bề mặt cá thường có một lớp nhầy chưa một lượng lớn chất protein Lớp nhầy này là môi trường dinh dưỡng tốt đối với vi sinh vật Những vi sinh vật này thường là trực khuẩn sinh bào tử hoặc

không sinh bào tử, cầu khuẩn nhỏ, Sarcina và một số nấm men, nấm mốc có ở trong nước Các vi khuẩn thường thấy ở đây là Pseudomonas fluorescens liquefaciens, Proteus vulgaris, Micrococcus roseus và E.coli.

Ở mang cá đặc biệt nhiều vi khuẩn hiếu khí Sau khi cá chết các vi sinh vật

này phát triển rất mạnh Trong số này dễ tìm thấy Pseudomonas fluorescens liquefaciens.

Trong ruột cá hệ sinh vật tương đối đa dạng và là nguồn gây thối rữa sau khi cá chết Vi sinh vật xâm nhập vào đây từ trước, từ bùn cùng với các loại thức

ăn Ở đây tìm thấy tất cả các loại vi sinh vật cư trú trong nước và bùn, kể cả các

dạng sinh bào tử Trong ruột cá có Clostridium putrificus và nhóm E.coli, cũng thấy các loại gây ngộ độc thực phẩm Salmonella và Clostridium botulinum Số

lượng vi khuẩn thường dao động rất lớn rừ vài nghìn tới vài chục triệu tế bào trên 1g chất chứa trong ruột

Nhiều kết quả nghiên cứu đã xác định thành phần hệ vi sinh vật của cá không khác biệt với hệ vi sinh vật của môi trường nước chung quanh cá sống

Trong các mô và cơ quan của cá tươi thường gặp Sarcina lutea, Sarcina flava, Sarcina alba, Micrococcus flavus, Micrococcus cereus, proteus vulgaris, Chromobacterium prodigiosum, Pseudomonas fluorescens liquefacien, Bacterium pudium, Bacillus megatherium, B mycoides, B subtilis, B mesentericus, Clostridium putrificus, Aspergiluss niger, Mucor

Trong này có thể tới khoảng 20 loài có hoạt tính proteaza Chúng có thể phân hủy protein và là nguồn gây thối rữa sau khi cá chết Trong cá tươi sống rất

ít vi khuẩn tạp nhiễm Thành phần hệ vi sinh vật tự nhiên của cá không thay đổi, nếu như loại trừ được những nguồn tạp nhiễm từ môi trường chung quanh

b Muối

Muối là nguyên liệu không thể thiếu được trong quá trình sản xuất nước chấm Trong tự nhiên muối hiện diện trong các nguồn nước biển Nhờ khả năng hút nước nên muối được dùng tồn trữ thực phẩm, ức chế

được vi sinh vật phát triển trong thực phẩm trừ các loại vi sinh vật chịu mặn

Thành phần chính của muối là NaCl, H2O, các hoạt chất hòa tan và không tan Muối được dự trữ trên 5 tháng

Các chất hoà tan gồm có: calciphosphat (CaSO4), Magiesunfat (MgSO4), Magieclorua (MgCl), Calcioxit (CaO), Manganoxit (MnO)… Các loại này có vị đắng và chát, các tạp chất này làm giảm độ thẩm thấu của muối vào cá Các tạp chất không tan gồm có: bùn, đá, sỏi, cát…[4]

1.2 Quy trình sản xuất nước mắm truyền thống

1.2.1 Quá trình thuỷ phân, lên men nước mắm

a, Cơ chế quá trình hình thành nước mắm

Bản chất của quá trình sản xuất nước mắm

Sự tham gia của enzyme trong quá trình thủy phân thường trải qua ba giai đoạn

Trong đó E là enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là hợp chất trung gian giữa enzyme và cơ chất, P là sản phẩm

Giai đoạn thứ nhất: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức chất enzyme protein, bước này xảy ra khá nhanh, liên kết không bền

Giai đoạn thứ hai: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ các mối liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng Khi đó phức chất ES đồng thời xảy ra hai quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn đến sự cực hóa của mối liên kết tham gia vào phản ứng và sự biến dạng hình học

của nối liên kết đồng hóa trị trong phân tử protein cũng như trong trung tâm hoạt động của enzyme, làm cho protein hoạt động, quá trình thủy phân dễ dàng hơn.

Giai đoạn thứ ba: Giai đoạn tạo thành các acid amin và peptid cấp thấp, giải phóng enzyme [11]

b, Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm

Gồm 3 hệ enzyme lớn

Hệ enzyme Metalo-protease (Aminodipeptidase): Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau Loại enzyme này có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid Đây là nhóm thủy phân enzyme trung tính, pH tối thích từ 5-7, nó ổn định với ion Mg2+, Ca2+

Hệ enzyme acid-protease: Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D Hệ enzyme này dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15%

nên thường nó chỉ tồn tại một thời gian ngắn ở đầu thời kỳ của quá trình thủy phân Loại enzyme này đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm

c, Vai trò của vi sinh vật

Trong ướp chượp thường chứa một lượng lớn các vi sinh vật Có thể tìm thấy hàng trăm, hàng nghìn hoặc hàng triệu tế bào trong 1 ml nước chượp Các vi khuẩn ở đây thường thuộc nhóm vi khuẩn lactic, thuộc chi Micrococus, ngoài ra còn có Spirilum, Proteus, Leuconostoc, Clostridium và nấm mốc Những vi khuẩn sinh bào tử tìm thấy trong nước chượp là Bacillus [10]

Nhiều chủng Bacillus có khả năng sinh proteaza đã được ứng dụng

trong sản xuất thực phẩm Chi Bacillus là một chi gồm các vi khuẩn hình que,

nói chung Gram dương, hầu hết có khả năng chuyển động, sinh trưởng hiếu khí hoặc hiếu khí tùy tiện, hầu hết có phản ứng catalase dương tính, tất cả đều hình

thành nội bào tử [19,20] Phần lớn Bacillus là các vi khuẩn ưa ấm với nhiệt độ

sinh trưởng tối ưu từ 300 – 450C Một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 650C Một số loại ưa lạnh có thể sinh trưởng và hình thành nội bào tử ở 00C, pH sinh trường rất khác nhau từ 2 - 11 [30]

Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong bảo quản và chế biến đa dạng các loại thực phẩm lên men [1] Lên men lactic giúp thực phẩm ngăn chăn sự phát triển của vi sinh vật gây độc hại cho thực phẩm Aicd

do quá trình lên men tạo ra cũng làm thay đổi hương của các nguyên liệu ban đầu và cải thiện giá trị dinh dưỡng [6, 26]

Vi khuẩn Lactic: Không đồng nhất về mặt hình thái, các giống khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau Nhưng nhìn chung chúng được chia thành hai loại hình cầu và hình que [12] Chúng đều là những

vi khuẩn Gram (+), không có khả năng tạo bào tử, không di động, sinh axit lactic trong quá trình phát triển, catalase, oxydase và khử nitrat âm tính, không chứa các xitocrom, hô hấp kỵ khí hoặc vi hiếu khí [5]

Hiroshi [17] khi nghiên cứu về vi sinh vật trong nước mắm Thái Lan

và nước mắm Nhật Bản ông thấy hầu hết chúng là loại vi khuẩn lên men lactic chịu được độ muối cao Một số loại nấm mốc phát triển trong môi trường có hàm lượng đường kính cao, được phát triển trong nước mắm Thái Lan lại không có trong nước mắm Nhật Bản Các loài Bacillus và Micrococcus được phân lập từ muối biển, còn Micrococcus được phân lập trong cả thành phần của muối mỏ Các vi sinh vật có mặt ngay trong thành phần nguyên liệu sản xuất là cá và muối, chúng có khả năng phát triển trên môi trường có độ muối cao Một số loại lên men lactic dị hình

được phát hiện như: Staphylococcus saprophyticus, Micrococcus varians

trong nước mắm Thái Lan, nước mắm Nhật Bản Vi khuẩn lên men lactic đồng hình như Pediococcus halophilus từ các loại nước mắm Malaixia Nghiên cứu về vi sinh vật trong nước mắm Thái Lan, Bulan phithakpol [14] nhận thấy các loài vi khuẩn thuộc nhóm Micrococcus, Pediococcus, Staphylococcus sarcina, Bacillus liên quan đến quá trình lên men

Vi sinh vật có mặt ngay từ đầu của quá trình chế biến do nguyên liệu, dụng cụ và từ môi trường nhiễm vào, nhưng do nồng độ muối cao nên chúng không hoạt động được Song cũng có nhiều loài vi sinh vật ưa mặn hoặc quen dần với muối có thể phát triển mạnh trong môi trường muối cao

Ngay trong giai đoạn ngắn đầu tiên khi muối chưa kịp tác dụng,

có một ít vi sinh vật gây thối hoạt động Với sự hình thành của nước bổi,

độ mặn tăng dần lên, khi đạt từ 12% trở lên thì vi sinh vật gây thối hầu như ngừng hoạt động và các vi khuẩn hầu như cũng bị ức chế Như vậy trong quá trình chế biến nước mắm sự tham gia của vi sinh vật trong quá trình thủy phân tương đối yếu nhưng về sự hình thành mùi vị của nước mắm trong quá trình chế biến thì vi khuẩn gây hương đã tham gia khá tích cực [4]

d, Các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình chế biến nước mắm.

Quá trình chế biến nước mắm có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến Những yếu

tố công nghệ đó là: Nhiệt độ lên men, pH, lượng muối, diện tích tiếp xúc và ảnh hưởng bởi bản thân nguyên liêu:

Nhiệt độ: Nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng, đến một nhiệt độ nào đó sẽ

không tăng nữa và có thể giảm xuống do nhiệt độ cao làm cho hệ enzyme protease mất hoạt tính, quá trình thủy phân kém Nhiệt độ 30 - 47oC thích hợp cho quá trình chế biến chượp Nhiệt độ 70oC trở lên hầu hết các hệ enzyme trong

serin-cá mất hoạt tính Nâng nhiệt độ của chượp lên bằng serin-cách phơi nắng, nấu hoặc sử dụng tôn nóng để che phân xưởng [4]

pH: Mỗi hệ enzyme có pH tối thích khác nhau, vì vậy phải xem loại

enzyme nào nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình sản xuất nước mắm để tạo pH thích hợp cho enzyme đó hoạt động

Qua thực nghiệm cho thấy: pH môi trường tự nhiên từ 5,5-6,5 enzyme tripsin và pepsin hoạt động được, đồng thời ở pH này có tác dụng ức chế một phần vi khuẩn gây thối Vì vậy ở môi trường tự nhiên có pH thích hợp cho quá

trình sản xuất nước mắm hơn.

Lượng muối: Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nước

mắm, thiếu muối nước mắm không hình thành được Yêu cầu của muối trong sản xuất nước mắm phải là loại muối ăn, càng tinh khiết càng tốt, kết tinh hạt nhỏ có

độ rắn cao, màu trắng óng ánh Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân protein nhanh hơn, chượp mau chín Nồng độ muối quá cao có tác dụng ức chế làm mất hoạt tính của enzyme, quá trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài (protein bị kết tủa bởi muối trung tính bão hòa)

Để chế biến chượp nhanh cần xác định lượng muối cho vào trong chượp là bao nhiêu và lượng muối này phải thõa mãn 2 điều kiện: Không mặn quá để tránh ức chế hoạt động của enzyme và không nhạt quá để có đủ khả năng ức chế

sự phát triển của vi khuẩn gây thối

Thường lượng muối cho vào khoảng 20-25% so với khối lượng cá Nên thực hiện phương pháp cho muối nhiều lần và cần phải xác định số lần cho muối,

tỉ lệ muối của mỗi lần và khoảng cách giữa các lần cho muối để không ảnh hưởng đến quá trình sản xuất nước mắm

Diện tích tiếp xúc: Muốn phản ứng xảy ra nhanh phải có sự tiếp xúc tốt

giữa enzyme và cơ chất Các enzyme trong cá tập trung nhiều ở nội tạng, nên để tăng tốc độ thủy phân người ta tìm cách tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme và thịt cá

Bản thân nguyên liệu: Những loài cá khác nhau, thành phần hóa học và

cấu trúc cũng khác nhau, nhất là hệ enzyme trong cá vì vậy tạo ra loại nước mắm

Xử lý nguyên liệu: Nguyên liệu phải được rửa sạch, loại bỏ tạp chất và chuẩn bị chế biến.

Ướp muối: Trước khi chế biến, phải tiến hành vệ sinh thùng chượp và tính toán lượng muối cho vào khi chượp

Cho cá và muối vào thùng Cứ một lớp cá thì một lớp muối và dùng bàn cào gỗ để dàn đều lớp cá và lớp muối Nên rãi nhiều lớp muối mỏng thay vì ít lớp nhưng dày Phủ một lớp muối mặt khá dày khoảng 2 – 3 cm trên cùng

Lấy nhiều lớp lá phủ lên lớp muối mặt Lớp lá được cột chặt vào các thanh nẹp, dùng các đòn hạ gài các thanh nẹp lại rồi dùng hai đòn thượng gác ngang qua thùng chượp để nén vỉ không bị trồi lên Mục đích của khâu gài nén là vừa giữ được vệ sinh, vừa tác dụng lực ép để nước từ thịt cá được tiết nhanh hơn

Ủ thời gian 2 ngày Đây là giai đoạn lên men khô, cả khối chượp nóng lên đến gần 400C Lên men khô yếm khí vừa có tác dụng phân giải tốt, vừa tạo hương vị thơm ngon

Giai đoạn lên men - chế biến chượp cổ truyền: Đây chính lá quá trình thủy phân protein trong cá nhờ hệ enzyme protease Sản phẩm cuối cùng là acide amin hoặc peptide cấp thấp

Có 3 phương pháp chế biến chượp cổ truyền:

- Phương pháp đánh khuấy (Đây là phương pháp của Cát Hải - Hải Phòng): Cho muối nhiều lần đã lợi dụng được khả năng phân giải của enzyme và

vi sinh vật tới mức đô cao, rút ngắn thời gian chế biến chượp Cho muối nhiều lần là tạo điều kiện để phòng thối, tiêu diệt các vi khuẩn gây thối thông thường

và không kìm hãm nhiều quá khả năng hoạt động của men Cho thêm nước lã là cung cấp cho môi trường phân giải một lượng vi sinh vật đáng kể, tạo môi trường lỏng giúp cho men và vi sinh vật hoạt động được dễ dàng, làm cho tế bào

thịt cá chóng được phân giải Lượng nước cho thêm vào nên vừa phải, nếu ít quá thì tác dụng phân giải của men kém nhưng nếu nhiều quá thì không khống chế được quá trình thối rữa, đồng thời làm giảm độ đạm trong nước mắm Vì vậy, lượng nước cho vào còn tùy thuộc đặc điểm của nguyên liệu, thường từ 20 – 30% so với cá.

- Phương pháp gài nén (Đây là phương pháp của vùng khu 4 cũ hoặc của các tỉnh phía Nam): Cá được trộn đều với muối cho đủ muối ngay từ đầu hoặc cho muối nhiều lần, sau đó ướp vào thùng hoặc bể rồi gài nén Dựa vào men trong cá để phân giải protide của thịt cá, không cho nước lã và không đánh khuấy

- Phương pháp chế biến hỗ hợp (kết hợp hai phương pháp gài nén và đánh khuấy) Lúc đầu, thực hiện phương pháp gài nén Sau đó thực hiện phương pháp đánh khuấy

Khi đã cho đủ muối thì thân cá đã ngấm đủ muối, nát đều và chìm xuống, không còn hiện tượng trương và nổi lên nữa Lúc đó, người ta nói cá đã “đứng cá” Nhờ nén chặt, nhiệt nội có trong cá làm cho men hoạt động tăng lên, trung tâm tích tụ dần khí NH3, CO2, H2S làm cho cá trương lên, thịt cá bị xé nát nhưng xương và da vẫn còn nguyên Muối thẩm thấu vào cá nước tiết ra gọi là nước bổi Khoảng 1 tháng sau thì cá chìm xuống hẳn, nước nổi lên có màu vàng, trong và xuất hiện mùi nước mắm rõ rệt, lúc đó cá đã “đứng mặt dầu” Màu sắc của nước mắm chuyển từ màu vàng nhạt sang hẳn màu vàng đậm, nước mắm trong

Sau 6 – 12 tháng, chượp đã chín hoàn toàn, có thể chiết rút

Đặc điểm của phương pháp này là chượp chín cá vẫn còn nguyên con, xương không nát nên thuận lợi cho việc kéo rút

Chiết rút: Quá trình kéo rút nước mắm là quá trình lọc liên hoàn Quá trình kéo rút là quá trình rút đạm trong bã không quá nấu bằng cách dùng lượng nước bổi hoặc nước thuộc ít đạm cho chuyển lần lượt từ thùng này qua thùng khác để tăng đạm và tăng hương vị.

Sau khi chượp chín, nước mắm chỉ có mùi thơm thuần túy, không còn mùi hỗn tạp của chượp nữa Tuy vậy, phần bã vẫn còn mùi tanh Ta rút phần nước có nàu vàng, trong phía trên (nước mắm cốt) Còn lại phần xương thịt cá chưa phân giải hết ta tiếp tục cho lên men Với mỗi lần chiết rút ta lại bổ sung nước muối vào để làm nước thuộc Quá trình lên men tiếp tục phân giải hết lượng thịt cá còn sót lại Quá trình lên men và chiết rút dừng lại khi tất cả thịt cá đã hoàn toàn được phân giải

Phối trộn: Muốn thu được nước mắm có hương vị thơm ngon và có hàm lượng nitơ như mong muốn, ta phải pha đấu các loại nước mắm có có hàm lượng nitơ khác nhau, thường pha nước mắm có có hàm lượng nitơ cao với nước mắm

có có hàm lượng nitơ thấp thành loại nước mắm có có hàm lượng nitơ trung bình

Sản phẩm nước mắm thu được theo phương pháp cổ truyền có hương vị đặc trưng nên được người tiêu dùng ưa thích Phương pháp này, trang thiết bị đơn giản, chi phí sản xuất thấp Nhưng do thời gian chế biến quá dài nên hiệu quả kinh tế không cao, lượng đạm mất đi lớn, vệ sinh an toàn thực phẩm thấp

1.3 Quy trình sản xuất nước mắm có bổ sung enzyme protease thương mại (quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày)

Dựa trên cơ sở muốn rút ngắn thời gian chế biến nước mắm ta cần bổ sung enzyme proteaza và tạo điều kiện thích hợp cho enzyme hoạt động để thúc đẩy nhanh quá trình thủy phân Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về nước mắm đã

có nhiều nha khoa học đã nghiên cứu sử dụng enzyme proteaza nhân tạo để rút ngắn quá trình thủy phân thịt cá Nguyễn Thị Dự (Viện công nghệ Thực phẩm) năm 1995 đã thực hiện đề tài cấp Bộ công nghiệp “Nghiên cứu hoàn thiện quy

trình sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng enzyme proteaza từ B subtilis” Kết

quả là rút ngắn quy trình sản xuất nước mắm từ 6 – 8 tháng xuông còn 2 tháng,

độ đạm nước mắm tăng từ 8,3% lên 20,8% hiệu xuất thu hồi đạm tăng gấp 2 lần, tiêu hao nguyên liệu giảm 13% Tuy nhiên các nguồn để thu enzyme có nguồn gốc từ thực vật, động vật, từ vi sinh vật, mặc dù mới nghiên cứu những năm gần đây, nhưng những nghiên cứu về enzyme từ vi sinh vật đã đem lại những thành tựu đáng kể, đóng góp to lớn vào thành công chung của việc nghiên cứu rút ngắn thời gian chế biến nước mắm Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật được sử dụng

ưu việt hơn các nguồn enzyme khác Ba loại enzyme vi sinh vật chính thường được sử dụng trong thuỷ phân cá là:

+ Enzyme Flavourzyme: Được sản xuất từ chủng A oryzae, chế phẩm này bao

gồm cả hoạt tính endopeptidaza và exopeptidaza pH thích hợp cho quá trình thủy phân là 5,0 – 7,0, nhiệt độ thích hợp 45 – 55oC [25]

+ Enzyme Alcalase: Được sản xuất từ chủng B licheniformis, Subtilisin A là

thành phần enzyme chính, đó là một endopeptindaza Nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động tà 55 – 70oC pH thích hợp 6,5 – 8,5 [23]

+ Enzyme Protamex: là một enzyme proteaza của Bacillus thủy phân protein

Khác với các endopeptindaza là protamex tạo ra dịch thủy phân protein không có

vị đắng ngay cả khi mức độ thủy phân rất thấp Protamex hoạt động tối ưu ở pH 5,5 – 7,5, nhiêt độ 40 – 60oC và bất hoạt ở nhiệt độ 90oC trong 5 phút [24]

1.3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất [11].

Sản phẩm Hình 1 Sơ đồ qui trình chế biến nước mắm bằng phương pháp enzyme

1.3.2 Thuyết minh quy trình

a, Xử lý nguyên liệu

Cá cần phải rửa sạch các tạp chất như bùn, rác thải, tạp chất còn lẫn trong

cá Nguyên liệu được nhập về cần tiến hành phân loại phân hạng dựa trên kích thước và chất lượng của cá, yêu cầu đặt ra với nguyên liệu làm nước mắm là đồng đều về chất lượng và kích cỡ để quá trình thủy phân diễn ra hàng loạt, đều nhau như vậy quá trình thủy phân sẽ triệt để tránh hao phí hàm lượng nitơ do còn lại trong bã gây tổn thất hàm lượng nitơ, làm giảm hiệu quả kinh tế và giảm chất lượng nước mắm Đối với những nguyên liệu cá có khối lượng và kích thước lớn

thì phải xử lý đập dập, nghiền nhỏ hoặc cắt khúc để quá trình thủy phân diễn ra hoàn thiện hơn.

Muối phải sử dụng muối ăn đã qua bảo quản, ít nhất là muối đã được bảo quản hơn một tháng và tỷ lệ muối ban đầu so với cá là 10% sau 3 ngày thì bổ sung muối một lần, mỗi lần 3% cho đến khi tổng khối lượng muối đủ 25%, thời gian thủy phân tùy theo phương pháp thủy phân

b, Tiến hành thủy phân

Nguyên liệu cá sau khi được xử lý đập dập trộn đều với 0,1% chế phẩm enzyme proteaza đảo trộn đều trong 30 phút, để enzyme khuếch tán trong nguyên liệu, sau đó trộn với muối tỉ lệ 10% so với nguyên liệu cá và cho vào thùng có nắp đậy Hằng ngày mở nắp đánh khuấy 2 lần mỗi lần khoảng 10 – 15 phút Sau khi đánh đảo xong thì đậy nắp lại tránh ánh nắng chiếu trực tiếp vào khối chượp, sau 2 – 3 ngày thì cá nát nhừ và xảy ra hiện tượng cá đòi muối (khối chượp sủi bọt, mùi tanh bốc lên) lúc này ta cho thêm 3% muối nữa, sau 1 –

2 tháng chượp đã vào giai đoạn đã ổn định, mùi không còn tanh, có mùi nước mắm nhẹ Chượp chín khi thấy nước cốt có màu vàng nâu đến màu cánh gián

Sản xuất nước mắm theo phương pháp ngắn ngày đã đáp ứng được nhu cầu ngày cảng tăng của người dân, giảm tổn thất lượng nito trong quá trình chế biến Tuy nhiên nước mắm sản xuất theo phương pháp ngắn ngày có nhược điểm

là mùi thơm kém đặc trưng do đó chưa hấp dẫn người tiêu dùng

1.4 Các nghiên cứu về hương nước mắm

Người Việt Nam đầu tiên tham gia nghiên cứu nước mắm là Đinh Minh Kha và Nguyễn Xuân Thọ Các nghiên cứu xoay quanh về chế độ hoạt động của proteaza và thành phần của nước mắm Các nghiên cứu này tập trung rất nhiều vào khu hệ vi sinh vật cá và tác dụng của chúng trong quá trình tạo ra nước mắm

1.4.1 Mối liên quan giữa nguyên liệu và hương nước mắm.

Bulan Phithakpl [14] cho biết nước mắm thượng hạng của Thái Lan được sản xuất từ cá cơm Người tiêu dùng tin tưởng rằng nước mắm từ cá cơm có hương tốt hơn nhiều so với nước mắm từ nguyên liệu khác Hầu như tất cả các loại cá biển nhỏ đều có thể tận dụng làm nước mắm ở Việt Nam, thậm chí cả cá nước ngọt cũng được các nhà nghiên cứu đưa vào thử nghiệm Thực tiễn cá nước ngọt không phải là nguồn nguyên liệu dồi dào nên chủ yếu Việt Nam vẫn sản xuất từ các loại cá biển nhỏ: Cá nục, cá thu, cá tráp…Những cơ sở sản xuất có nguồn nguyên liệu truyền thống là cá cơm ở Việt Nam đã nổi tiếng với các loại nước mắm với thương hiệu riêng: Nước mắm Phú Quốc, nước mắm Nha Trang, Phan Thiết….cơ sở sản xuất nước mắm ở miền Bắc đa số sản xuất từ các loại cá biển nhỏ (cá tạp) Thông thường ở các xí nghiệp này (ví dụ như: Xí nghiệp nước mắm của Hội Nghệ An, Xí nghiệp nước mắm Hải Thịnh - Nam Định) luôn phải tạo ra các chượp hương Các chượp này khác với các lô chượp còn lại ở chỗ nguyên liệu đưa vào là các cơm hoặc cá trích Nước mắm rút ra từ các ô bể khác trước khi đem chế biến, pha đấu tạo thành nước mắm thành phẩm cho chay qua chượp hương để tăng hương vị đặc trưng Điều này có nghĩa là trong dân gian, tuy chưa giải thích được việc tạo hương, nhưng kinh nghiệm của các nhà sản xuất đã cho thấy mối quan hệ giữa nguyên liệu là hương nước mắm

- Cá cơm là loại cá ăn nổi, hoạt động mạnh nên thành phần của cá ít mỡ Trong sản xuất không thấy nổi lên lớp váng mỡ dấy trên bề mặt bể chượp như các ô bể khác Vì vậy mùi vị ôi khét của nước mắm ít xảy ra (do oxy hóa lớp dầu

mỡ bởi oxy trong khí quyển)

- Cá cơm nói riêng và các loại cá nổi hoạt động nhiều nói chung có hoạt tính enzyme proteaza trong thịt cá, ruột cá cao hơn các cá khác nên quá trình

thủy phân xảy ra nhanh hơn Vì vậy cùng một đơn vị thời gian sản xuất 6- 12 tháng thì các ô bể có nguyên liệu là cá cơm thủy phân triệt đẻ hơn không còn mùi tanh, ngái của cá.

- Cá cơm kích thước nhỏ hơn các loại cá khác nên dễ thủy phân, có thể các chất tạo hương được hình thành từ sự phân giải thịt cá qua sự tác dụng của vi sinh vật và enzyme trong cá

1.4.2.Các thành phần hóa học của nước mắm liên quan đến hương

vị của nước mắm cổ truyền

Nước mắm không chỉ được sản xuất ở Việt Nam mà còn sản xuất ở nhiều nước khác nhau như: Thái Lan, Campuchia, Malaixia, Philippin, Hồng Kông, Trung Quốc Đã có rất nhiều công trình khoa học của các tác giả nước ngoài công bố về mối liên quan của một số thành phần hóa học trong nước mắm đến vị của nước mắm ở Thái Lan, Philippin, Hồng Kông Kết quả nghiên cứu của Doagan và Haward [18] năm 1975 đã được nhiều nhà khoa học khác như: Mitsuya Shimoda, Rossana.R.Peralta, Yutaka Osajima [22], Clifford.G.Beddows Arhes G [16] công nhận và coi như là cơ sở lý thuyết để ban đầu để lý giải chi tiết

về nguyên do phát sinh ra chúng Tóm tắt kết quả nghiên cứu của Dougan và Haward về hương nước mắm có thể tóm tắt là: Hương nước mắm được hình thành từ ba loại hương vị khác nhau

- Mùi amoniac: chủ yếu do sựu tồn tại của amoniac và trimethylamin

- Mùi phó mát được hình thành từ các acid béo bay hơi phân tử lượng thấp Các aicd béo dễ bay hơi này tồn tại theo một tỉ lệ đặc trưng cùng với sự tham gia ưu thế của ethernoic và acid butanoic

- Mùi thịt cá: nó không do một chất riêng nào mà phụ thuộc vào số lớn các chất dễ bay hơi.

Ghi nhận về sự có mặt NH3 được phát hiện lần đầu tiên bởi Rose [34] năm 1918 Sau này tầm quan trọng của NH3 trong nước mắm đã được mô tả bởi Chương Văn Chom [15] NH3 gây ra (mùi thối) nặng mùi cho nước mắm, vì vậy trong những năm gần đây hàm lượng NH3 được kiểm tra nghiêm ngặt Nó là một trong những tiêu chuẩn đánh giá chất lượng nước mắm có đạt tiêu chuẩn an toàn chất lượng thực phẩm hay không

1.4.3 Liên hệ giữa vi sinh vật và hương nước mắm

Ở trong nước việc phân lập và nhận dạng vi sinh vật có trong nước mắm

đã được tác giả Nguyễn Thị Hoa [35] bước đầu nghiên cứu nhưng ở mức độ nhỏ chưa có tính bao quát Nghiên cứu của Dương Văn Hợp [2], của Nguyễn Trọng

Cẩn [3] về vi sinh vật có liên quan đến sinh hương như Bacillus Subltilis, Clostridium Gần đây nghiên cứu của giáo sư Phạm Thành Hổ đã phân

lập được một số vi sinh vật có khả năng sinh hương như Staphylococcus intermedius, Vibrio costicola [7]

Năm 1930 Boez và Guillerm [32,33] đã phân lập được một chủng

từ cá và từ giai đoạn đầu của quá trình sản xuât nước mắm Đó là vi khuẩn yếm khí, tạo bào tử Ông cho rằng đó là một chủng mới thuộc nhóm Clostridium có liên quan đến tạo hương vị đặc biệt cho nước mắm

Vi khuẩn này có đặc tính kị khí bắt buộc, phát triển tốt trong môi trường

có đường glucoza, maltoza, fructoza và đường kính, tạo khí, nhiệt độ thích hợp từ 28 – 450C Nó có thể tạo enzyme proteaza trong môi trường

muối, chủ yếu chúng tạo ra các hợp chất chưa nitơ, dễ bay hơi trong nước mắm Sau này tác giả Trương Văn Chôm [15] đã phát hiện ra acid axetic và acid n.butanoic và giả thiết rằng có thể vi khuẩn lên men lactic liên quan đến vấn đề tạo hương Việc phân hủy protein từ cá là do hai nguyên nhân chính: Do enzyme có sẵn trong cá và do enzyme từ vi sinh vật trong nước mắm

Các sản phẩm được làm trong điều kiện vô trùng thiếu hẳn hương

vị của nước mắm Như vậy vi sinh vật tồn tại trong quá trình sản xuất một mặt thúc đẩy nhanh quá trình phân hủy bằng chính enzyme tạo ra

mà thành phần quan trọng hơn cả là tạo ra các sản phẩm hình thành hương vị đặc trưng của nước mắm

Nhiều nhà nghiên cứu khác như Saisithi và cộng sự [27] đã nghiên cứu vai trò vi sinh vật trong quá trình tạo hương nước mắm bằng cách phân tích các hợp chất bay hơi từ nước mắm Thái Lan, Melver và cộng

sự [21], Sanceda và cộng sự [28,29] đã tách các thành phần bay hơi trong nước mắm Philippin rồi so sánh chúng trong thành phần nước mắm Nhật Bản, nước mắm Việt Nam Suphson Chayovan và cộng sự [29] với kết quả phân tích thành phần axit bay hơi và axit không bay hơi, tác giả nhận thấy khó có thể chỉ ra một axit riêng rẽ nào đó mang đặc trưng của hương vị nước mắm Hương nước mắm là do ảnh hưởng của các yếu tố axit bay hơi và các axit không bay hơi tạo ra trong quá trình lên men Các hợp chất chứa nitơ có thể đóng vai trò quan trọng trong hương nước mắm Một khả năng khác cũng được dự đoán là hương nước mắm là kết quả của việc tạo ra các axit bay hơi (acid axetic, acid propionic, acid butyric, acid isobutyric, acid isovaleric) từ chủng vi khuẩn

Pediococus halophilus Hiroshi Itoh [17] cho rằng hàm lượng cao acid axetic, acid lactic trong nước mắm là kết quả của các vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men tạo nên acid lactic.

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu chính phục vụ cho quá trình nghiên cứu là các mẫu chượp ở các giai đoạn khác nhau từ các xí nghiệp sản xuất nước mắm Hải Phòng, Nghệ

An, và mẫu chượp được làm tại Viện Công Nghệ Thực phẩm

Cá cơm được cung cấp bởi cơ sở sản xuất nước mắm Nghệ An

Enzyme protease thương phẩm được lựa chọn để nghiên cứu trong đề tài

là enzyme Alacalse, Flavourzyme được cung cấp bởi hãng Novoenzyme (Đan Mạch)

2.2 Hóa chất và thiết bị.

2.2.1 Hóa chất:

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều là những hóa chất tinh khiết cho phân tích, cho nghiên cứu về sinh học phân tử hoặc dùng cho thực phẩm có xuất xứ từ Đức, Nhật, Mỹ, Pháp, Trung Quốc

2.2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Dụng cụ: Hộp petri, pipet tự động các loại, ống nghiệm, ống eppendorf, cốc đong, đèn cồn, que cấy, bình tam giác

Thiết bị cơ bản phục vụ thí nghiệm

Tên thiết bị Hãng sản xuất

- Kính hiển vi Niko, Nhật Bản

- Máy đo pH Thuỵ sỹ

- Tủ ấm, tủ sấy Liên Xô

- Máy li tâm Hettich Zentrifugen - Đức

- Cân điện phân tích Sartorius- Đức

2.3 Môi trường phân lập và nuôi cấy vi sinh vật

- Môi trường Plate Count Agar: dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí

- Môi trường LB: dùng để nuôi cấy nhóm Bacillus

Nước 1000ml

- Môi trường Place Count Agar (PCA) có bổ sung BCP: dùng để xác định

sự có mặt của nhóm vi khuẩn Lactobacillus

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp vi sinh

a Phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu chượp cá

Pha loãng dung dịch mẫu ở các cấp độ khác nhau 10-1 đến 10-7…Tùy theo số lượng vi sinh vật trong mẫu nhiều hay ít mà pha loãng đến nồng

độ cần thiết Sử dụng nước cất đã hấp vô trùng để pha loãng Lấy 100 µl

từ mỗi độ pha loãng cho vào hộp petri chứa môi trường, dàn đều bằng que trang

vô trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300C, quan sát khuẩn lạc sau 16h, 24h, 36h, 48h

Phân lập vi khuẩn Bacillus

Pha loãng dung dịch mẫu ở các cấp độ khác nhau xử lý ở 800C trong 10 phút Lấy 100 µl từ mỗi độ pha loãng cho vào hộp petri chứa môi trường (1), dàn đều bằng que trang vô trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300C, quan sát khuẩn lạc sau 16h, 24h, 36h, 48h

Xác định nhóm vi khuẩn lactic

Pha loãng dung dịch mẫu ở các cấp độ khác nhau Lấy 100 µl từ mỗi độ pha loãng cho vào hộp petri chứa môi trường PCA có chứa BCP, dàn đều bằng que trang vô trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300C, quan sát khuẩn lạc sau 16h, 24h, 36h, 48h Các khuẩn lạc nào có tạo vòng sinh axit trên môi trường BCP được các định thuộc nhóm vi khuẩn lactic

b) Định tên các chủng vi khuẩn đã phân lập và tuyển chọn

Quan sát hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào

Nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường thạch thường ở nhiệt

độ 370C Sau 2 ngày, quan sát và mô tả hình thái khuẩn lạc.

Nhuộm Gram và quan sát hình dạng tế bào

- Chuẩn bị vết bôi:

- Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí Soi kính: dùng vật kính dầu 100X

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ

Xác định khả năng sinh bào tử

Cấy vi khuẩn trên môi trường thạch thường Sau 3 ngày tiến hành xử lý nhiệt ở 800C Dùng vi khuẩn đã xử lý nhiệt cấy lại trên đĩa thạch thường đặt ở

300C Sau 24 giờ nếu xuất hiện khuẩn lạc thì kết luận chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào tử Nếu không thì kết luận ngược lại

Xác định hoạt tính catalaza

Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường thạch thường dịch thể, đặt ở 300C Sau 24 giờ, nhỏ 2 giọt H2O2 vào dịch nuôi cấy Nếu sủi bọt ta kết luận có hoạt tính catalaza Ngược lại không có hoạt tính

Xác định đặc điểm sinh học phân tử

( Phương pháp tách ADN vi khuẩn

- Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn hoà vào 200 (l TE trong ống Eppendoft

- Thêm lyzozym vào, trộn đều, sau đó ủ ở 370C trong 30 phút

- Thêm 100 (l SDS 10%, ủ ở 370C trong 30 phút

- Thêm 300 (l PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, trộn

đều trong đá lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, lấy dịch trên (Bước này được lặp lại 2 lần).

- Dùng etanol lạnh với thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tủa ADN

- Rửa tủa bằng etanol 70%

- Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không

- Thêm 30-50 (l nước, bảo quản để dùng dần

(Điện di trên gel agaroza

Đây là kỹ thuật quan trọng vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một đặc tính của axit nucleic là ở pH trung tính mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodieste của các sợi axit nucleic Điều đó

có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt trong điện trường

Kỹ thuật này được tiến hành trên một đệm gel có tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước

- Tiến hành: Đun tan 1% agaroza trong dung dịch đệm TAE 1x đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE Trộn đều 2(l dung dịch loading buffer 6x với 5(l mẫu, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 (l/ml) 20 phút vớt ra Quan sát vạch ADN trên máy soi gel

(Phản ứng khuếch đại ADN

Mồi ngược 1 (10 pmol/(l)Taq polymeraza 1,2

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Bước tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian

 Xác định hàm lượng axit nucleic

Do trong thực tế thường phải sử dụng những lượng axit nucleic rất nhỏ (thường

là micro-, nano- hoặc picogram) khi tiến hành các thí nghiệm tách dòng Không thể xác định số lượng này một cách trực tiếp mà nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm (A260) trong máy đo quang phổ

kế Một đơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm tương đương với nồng độ 50(g/ml của ADN sợi kép, hoặc tương đương với nồng độ 40(g/ml của ADN hoặc ARN mạch đơn Tỉ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol

hoặc protein Tỷ số A260/A280 là 1,8 đối với mẫu ADN sạch.

 Ph n ng khu ch ả ứ ế đạ i ADN cho gi i trình t ả ự

S d ng b kít Cycle sequencing v i h n h p ph n ng nh sau : ử ụ ộ ớ ỗ ợ ả ứ ư

Terminator Ready Reaction

c Xác định mật độ vi sinh vật:

- Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch:

Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 180v/p trong 24h, sau đó tiến hành pha loãng dịch huyền phù đến 10-7, hút 50µl dịch pha loãng, cấy gạt trên môi trường thích hợp, đặt vào tủ ấm 30 – 320C, sau 24h đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa Petri

Số lượng khuẩn lạc trong 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công

N = a x 1/K x 1/V

a: số khuẩn lạc trung bình mọc trên đĩa thạch

K: nồng độ pha loãng

V: thể tích dịch pha loãng cấy trải trên đĩa thạch

- Phương pháp đo mật độ quang học-OD

Số lượng tế bào vi sinh vật trong dịch nuôi có thể xác định gián tiếp bằng cách đo mật độ quang học Dịch nuôi được pha loãng 5 lần, đo OD ở bước sóng

620 nm

2.4.2 Phương pháp sinh hóa

a Xác định khả năng chịu mặn các chủng vi sinh vật.

Thí nghiệm được kiểm tra trong môi trường MRS, LB với độ mặn 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%

b Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của các chủng vi sinh vật.

Chúng tôi tiến hành lên men trong môi trường lỏng tại các khoảng nhiệt độ được khảo sát là: 20; 25; 30; 35 và 450C Kết quả được đo sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học - OD ở bước sóng λ = 620nm Cứ 4h lấy mẫu

ra đo một lần Kết quả cho trên đồ thị 3 ở 28h

c Xác định ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của các chủng vi sinh vật.

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của các chủng

vi khuẩn trong môi trường MRS và LB lỏng Dải pH được khảo sát từ 4 – 8, ở nhiệt độ đã lựa chọn, trong 48h Cứ 4h lấy mẫu đo OD một lần Kết quả được biểu diễn trên đồ thị 4, ở 28h

d Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống.

Chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ tiếp giống trong môi trường lỏng, với các tỷ lệ khác nhau: 1; 3; 5; 7; 10; 15; 20% giống Với môi trường có pH và nhiệt độ nuôi thích hợp, trong 24h đem đo OD

e Xác định khả năng sinh enzyme proteaza của các chủng vi sinh vật phân lập

Môi trường sơ tuyển là môi trường phân lập có nồng độ muối 10% cộng 0.5% protein (sữa tách béo) Cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào chính giữa hộp lồng với môi trường sơ tuyển Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp (48 – 72h) Nếu xung quanh vết cấy xuất hiện vòng tròn thuỷ phân trong suốt thì ta nói rằng

vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp proteaza Và đo vòng phân giải (D-d;mm) trong đó:

D: Chiều rộng của đường phân giải

d: Độ rộng của khuẩn lạc vi khuẩn

2.4.3 Phương pháp tính toán thống kê:

Thống kê kết quả bằng phương pháp ANOVA (chương trình TAGRAPHIC) cho hai nhân tố, với sự kiểm tra mức độ khác biệt có ý nghĩa của nghiệm thức qua kiểm định LSD

2.4.4 Phương pháp cảm quan [13]

Cách tiến hành:

a) Chế biến mẫu chượp bằng cá cơm theo phương pháp thủy phân

cá bằng enzyme sau đó bổ sung các chế phẩm vi sinh vật sinh hương

Cá: xay nhỏ, trộn enzyme Flavouyme 0,3%, Alacalse 0,5%, muối 10% cho vào bình gói kín để ở nhiệt độ thường 4 ngày, đưa vào điều kiện tối ưu 500C trong 2 ngày, bổ bổ sung vi sinh vật đã được tuyển chọn vào các mẫu chượp theo

tỉ lệ 105 CFU/g nguyên liệu cá, sau 3 ngày thì bổ sung muối một lần, mỗi lần 3% cho đến khi tổng khối lượng muối đủ 25% Sau khi chượp chín, cảm quan hương thơm nước mắm bằng phương pháp cho điểm.

b) Mẫu đối chứng:

Chế biến mẫu chượp bằng cá cơm theo phương pháp thủy phân

cá bằng enzyme không bổ sung các chế phẩm vi sinh vật sinh hương Các mẫu này được đánh giá cảm quan như mẫu thí nghiệm

Cảm quan mùi hương nước mắm

Chuẩn bị mẫu

Thành lập hội đồng cảm quan gồm 6 thành viên làm việc độc lập

Điểm Yêu cầu

5 Sản phẩm có mùi thơm rất đặc trưng của nước mắm, dễ

chịu

4 Sản phẩm có mùi thơm đặc trưng của nước mắm

3 Sản phẩm có mùi thơm nhẹ của nước mắm

2 Sản phẩm có mùi thơm rất nhẹ của nước mắm

1 Sản phẩm không có mùi thơm của nước mắm, không có

a, Nghiên cứu sự kết hợp các chủng vi khuẩn tới khả năng sinh hương

Các chủng vi khuẩn được được lựa chọn, bổ sung kết hợp vào các mẫu chượp

Kết hợp hai chủng vi khuẩn theo tỉ lệ 1:1

Kết hợp ba chủng vi khuẩn theo tỉ lệ 1:1:1

Kết hợp bốn chủng vi khuẩn theo tỉ lệ 1:1:1:1

Hỗn hợp vi khuẩn bổ sung vào các mẫu chượp theo tỉ lệ 105 CFU/g nguyên liệu cá Đánh giá cảm quan hương thơm nước mắm

b, Ảnh hưởng tỉ lệ vi khuẩn với khả năng sinh hương

Các mẫu chượp được chuẩn bị bao gồm Cá, muối, enzyme Lượng vi khuẩn bổ sung với các tỉ lệ 104, 105, 106

, 107 CFU/g cá Đánh giá cảm quan hương thơm nước mắm

2.4.6 Phương pháp phân tích

a Phân tích các cấu tử hương bằng GC- MS.

Mẫu xác định thành phần hương được phân tích các cấu tử trên máy MS

GC-Xử lý mẫu phân tích các cấu tử tạo hương: Lấy 300ml mẫu với 450 ml nước cất, trích ly bằng diethyl ether, làm khan, phân tích trên hệ GC-MS

Chương trình cài đặt phân tích GC-MS

- GC: Injector: 1800C; He: 2ml/ phut; Chương trình nhiệt độ 1000C –

1800C (200C/phút ); lượng mẫu bơm 0.2ul; DB5 (30m x 0,25mm x 0,25um)

- MS: Nguồn Ion: 200 0C, 70 eV; Phổ quét: 30 – 300m/z

b Phân tích protein tổng số theo phương pháp Kjeldahl[9]

Cơ sở của phương pháp: Mẫu phẩm vật được vô cơ hóa bằng aicd

sunfuric đậm đặc Hợp chất hữu cơ bị oxy hóa và tạo thành CO2 và H2O còn nitơ sau khi giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dịch theo phản ứng (1) và (2)

R –CH2N-CH2-COOH +H2SO4 NH3 + CO2+ SO2+ H2O (1)

NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 (2)Đuổi amoniac khỏi dung dịch bằng NaOH, đồng thời cất và thu bằng một lượng dư acid boric H3BO3 theo phương trình (3) và (4)

(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2H2O +2NH3 (3)2NH4OH + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7H2O (4)Định phân lượng tetraborat amon tạo thành bằng dung dịch H2SO4 chuẩn 0,1N qua đó dễ dàng tính được lượng nitơ có trong mẫu vật theo phương trình (5)

(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O = (NH4)2SO4 + 3H3BO3 (5)

Cách tiến hành

Vô cơ hóa mẫu: Cân 100 mg mẫu khô vào bình Kjeldahl sao cho phẩm vật không dính lên thành cổ bình Cho tiếp vào bình kenđan 10ml H2SO4 đậm đặc Thêm hỗn hợp xúc tác K2SO4 : CuSO4 ( 3:1) có tác dụng làm tăng nhiệt độ sôi của H2SO4 và làm tăng cường vận tốc của phản ứng

Sau khi đã thêm các chất xúc tác, đặt bình vào bộ vô cơ hóa mẫu Đun cho đến khi dung dịch hoàn toàn mất màu Trong quá trình đun, thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo sao cho không còn một vết đen nào của mẫu vật thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình Đun cho đến khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng

Cất mẫu: Sau khi vô cơ hóa mẫu xong thêm khoảng 150ml nước cất vào bình vô cơ hóa mẫu thêm 2-3 giọt chỉ thị phenolphtalein, tiếp theo thêm khoảng

40 ml NaOH 30-40% dung dịch chuyển sang màu hồng là được lắp nhanh vào

bộ cất thu NH3, ở bình hứng đã có sẵn 20 ml H3BO3 và vài giọt chỉ thị taxiro( chú ý đầu nối cong phải ngập trong dịch) Sau khi cất khoảng 30 phút nhấc bình hứng và kiểm tra lượng NH3 đã hết chưa bằng giấy quỳ, nếu đã hết ta

mang mẫu đi định phân lượng tetraborat amon tạo thành bằng dung dịch H2SO4

0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, ghi lại thể tích H2SO4 0,1N đã chuẩn

độ - a

Tính toán kết quả

X = a.1,4.100/mTrong đó X: hàm lượng nitơ tổng số tính bằng %

a: số ml H2SO4 0,1N dùng định phân

1,4- số mg Nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N

100 hệ số chuyển sang %

m-lượng mẫu cân tính bằng mg

c Phân tích hàm ẩm của mẫu

Cơ sở của phương pháp: Dùng nhiệt để loại bỏ nước ra khỏi mẫu, hiệu

số khối lượng cuả mẫu trước và sau khi sấy khô là lượng ẩm có trong mẫu

Cách tiến hành: Sử dụng máy xác định hàm ẩm Startorius (Đức) Cân 1 g

mẫu để vào trong khay giấy bạc, nhấn nút khởi động thiết bị Lúc này thiết bị sẽ

ự động gia nhiệt để đuổi nước ra khỏ mẫu Đọc kết quả khi quá trình kết thúc

c Phân tích lipit theo phương pháp chiết bằng máy soxhlet [9]

Cơ sở của phương pháp: Chiết chất béo từ nguyên liệu sấy khô bằng

dung môi hữu cơ Chất béo được chiết tách khỏi dung môi và đem cân:

- Các dung môi để chiết chất béo là ete etylic, ete petrol thường có trọng lượng riêng nhỏ, nhiệt độ sôi thấp cho phép chiết nhanh chóng chất béo

- Tốc độ và mức độ chiết chất béo hoàn toàn phụ thuộc vào mức độ nghiền nhỏ của nguyên liệu thí nghiệm và bản chất dung môi

Cách tiến hành: Cân lấy vào ống giấy 10 g nguyên liệu đã xay nhỏ và sấy

khô đến trọng lượng không Chuyển vào trụ chiết Thêm dung dịch chiết vào với