Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor lên khả năng tích lũy solasodine ở tế bào in vitro của cây cà gai leo (TT)

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN HỮU THUẦN ANH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY SOLASODINE Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO Solanum hainane

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN HỮU THUẦN ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY SOLASODINE

Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO

(Solanum hainanense Hance)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT

HUẾ - 2016

Công trình được hoàn thành tại: Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế và Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huê (2011-2014)

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc

PGS.TS Cao Đăng Nguyên

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp tại:

Vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trường đại học Khoa học, Đại học Huế

MỞ ĐẦU

T n cấp t iết c a đề t i

Theo số liệu thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn các loại dược liệu khác nhau để sử dụng trong

y học cổ truyền làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu

Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) có tên khoa học khác là Solanum procumben Lour thuộc họ Cà (Solanaceae) Trong

thành phần h a học của cà gai leo, solasodine là hợp chất ch nh, c hoạt t nh kháng vi m và ảo vệ gan, chống ại tế ào ung thư Ngoài

ra solasodine đã được nghiên cứu cho thấy có nhiều tác dụng trong y dược Tuy nhiên, từ trước đến nay cà gai eo được khai thác chủ yếu

từ nguồn hoang dại, nguồn nguyên liệu này không đủ để đáp ứng cho việc nghiên cứu và điều trị

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là phương pháp có những ưu điểm vượt trội mở ra tiềm năng ớn để tăng thu sinh khối trong thời gian ngắn, hàm ượng hợp chất thứ cấp cao, chủ động dễ điều khiển quy trình sản xuất tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết các hoạt chất sinh học trên quy mô công nghiệp, góp phần giải quyết những kh khăn n i tr n

Elicitor thực vật báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp,

bổ sung vào môi trường nuôi cấy à phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất, vừa có thể rút ngắn thời gian lại đạt năng suất cao

uất phát từ đ , chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh

ưởng c a một số elicitor lên khả năng t c lũy solasodine ở tế

bào in vitro c a cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) p

dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù tạo nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự nhiên

cho các nghiên cứu trong ĩnh vực y học Các kết quả của đề tài sẽ

àm cơ sở cho việc xây dựng qui trình sản xuất solasodine từ sinh khối tế ào để ứng dụng trong ĩnh vực dược phẩm sau này

M c tiêu c a đề t i

Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi

cấy in vitro tế bào của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance)

ng a oa ọc v t c tiễn

: Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung

cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về khả năng t ch ũy solasodine trong tế bào cà gai leo khi nuôi cấy có bổ sung các elicitor Đồng thời luận án cũng à tài iệu tham khảo hữu ích cho nghiên cứu và giảng dạy về ĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật

: Đề tài à hướng nghiên cứu có tiềm năng

ứng dụng trong ĩnh vực sản xuất hoạt chất sinh học dùng àm dược liệu bằng nuôi cấy tế bào thực vật, góp phần vào việc bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng

N ng đ ng g p i c a lu n n

Đây à công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong nuôi cấy tế bào cà gai leo Kết quả của luận án à đáng tin cậy

và có thể sử dụng để tiếp tục nghiên cứu phát triển sản xuất solasodine ở quy mô lớn hơn

P ạ vi ng iên cứu

Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện in vitro

tại Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguy n, Môi trường

và Công nghệ sinh học, Đại học Huế từ tháng 11 năm 2011 đến tháng

11 năm 2014

Các sản phẩm trao đổi thứ cấp thường chiếm một ượng nhỏ (nhỏ hơn 1% trọng ượng khô) và độc lập cao trong thời kỳ sinh lý và phát triển của thực vật Mặc dù hợp chất thứ cấp dường như không được thừa nhận vai trò trong việc duy trì quá trình sống cơ ản của thực vật - nơi mà chúng được tổng hợp, chúng có vai trò quan trọng trong sự tương tác giữa thực vật với môi trường

1 ỨNG D NG CHẤT KÍCH KH NG ĐỂ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY H P CHẤT THỨ CẤP TRONG NU I CẤY

TẾ O THỰC VẬT

Elicitor thực vật có thể được định nghĩa như à một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp Sự cảm ứng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm ượng của elicitor Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ mầm bệnh và các chất được tiết ra từ thực vật bằng phản ứng của mầm bệnh (elicitor

nội sinh) Tr n cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor có thể được phân thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học

Tại Việt Nam, việc sử dụng elicitor trong các nghiên cứu cải thiện khả năng t ch ũy các hợp chất thứ cấp khi nuôi cấy tế bào mới được quan tâm trong thời gian gần đây Trên thế giới cho đến nay đã

có rất nhiều công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng và khả năng t ch ũy hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật Hầu hết các nghiên cứu cho thấy hàm ượng hợp chất thứ cấp tăng n khi ổ sung elicitor

1 C Y C GAI LEO

Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Cà (Solanaceae), còn có tên khoa học khác là Solanum procumbens, mọc

rải rác ven rừng, lùm bụi, bãi hoang, ven đường, ở độ cao dưới 300

m Cà gai leo là một cây thuốc quý, rễ được dân gian dùng làm thuốc chữa thấp khớp, ho, dị ứng, đau nhức xương, đau răng, trị rắn cắn, đau ưng, cảm cúm… Gần đây, nhiều tác dụng khác của cà gai leo được phát hiện như: kháng vi m, ức chế xơ gan giai đoạn kịch phát, giảm nhẹ khối u

Solasodine là một loại steroid alkaloid có trong các cây họ

Cà, nó có thể thay thế cho diosgenin để tổng hợp thương mại các loại hormon steroid khác nhau Solasodine đã được báo cáo là có thể chống ung thư, ức chế độc hại nhiều loài sinh vật Solasodine alkaloid ức chế acetylcholinsterase - một enzyme quan trọng trong việc truyền xung động thần kinh Gần đây, so asodine được biết như một tác nhân hóa trị liệu mới cho điều trị ung thư đặc biệt là ung thư

da

C ương ĐỐI TƯ NG, NỘI DUNG V PHƯ NG PH P NGHI N CỨU

1 ĐỐI TƯ NG NGHI N CỨU

Tế bào cà gai leo (Solanum hainanense Hance) nuôi cấy in vitro

NỘI DUNG NGHI N CỨU

- ác định khả năng sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor đến khả năng sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo:

+ Nồng độ elicitor: MeJA (25-250 µM, 1-5 g/L YE, 50-250

µM SA)

+ Thời gian nuôi cấy: 7 tuần

+ Thời điểm cảm ứng: 7-21 ngày

- Khảo sát sơ ộ hoạt tính sinh học của dịch chiết solasodine

n khả năng ức chế co agenase

- Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế

bào in vitro của cây cà gai leo

PHƯ NG PH P NGHI N CỨU

1 P ương p p nuôi cấy ô v tế o t c v t

2.3.1.1 Nuôi cấy cây in vitro

thời điểm cảm ứng từ 7 đến 21 ngày sau khi nuôi cấy

2 3 1 4 Xá định sinh khối t bào

Định ượng Tách chiết so asodine

Thử nghiệm hoạt t nh sinh học

Nuôi cấy tế ào

Nuôi cấy callus

Nhân callus

Cây cà gai leo in vitro

ử ý các elicitor khác nhau

C ương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 SINH TRƯỞNG V TÍCH LŨY SOLASODINE CỦA TẾ BÀO CÀ GAI LEO

1.1 Sin trưởng c a tế bào

Hình 3.1 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo

1 T c lũy solasodine c a tế bào

Hình 3.2 Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo

3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR L N SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY SOLASODINE CỦA TẾ BÀO CÀ GAI LEO

3.2.1 Ản ưởng c a methyl jasmonate

ĐC: Tế bào không xử lý elicitor Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ

sự sai khác có ý nghĩa thống kê của các trung bình mẫu ở p < 0,05 (Duncan's test) Chú thích này dùng chung cho tất cả các bảng

Dịch chiết tế bào 4 tuần tuổi được phân t ch HPLC để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ MeJA (25-250 µM) n t ch ũy solasodine

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào

ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor, ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm tuổi

3.2.1.2 Thời gian nuôi cấy

Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời điểm xử ý MeJA 50 µM n sinh trưởng của

tế bào cà gai leo

Ngày cả ứng K ối lượng tế o (g)

ĐC: bổ sung MeJA 50 µM vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung MeJA 50 µM lên khả năng t ch

ũy so asodine của tế bào cà gai leo

T ời điể (ng y) H lượng ( g g)

ĐC: bổ sung MeJA 50 µM vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy

3.2.2 Ản ưởng c a dịch chiết nấm men

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của YE lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo

3.2.2.2 Thời gian nuôi cấy

Từ kết quả thăm dò nồng độ, 3 g/L YE được chọn để bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy và khảo sát thời điểm t ch ũy solasodine cao nhất của tế bào cà gai leo trong suốt 7 tuần

Lượng sinh khối tế bào cũng như hàm ượng solasodine đều tăng dần từ tuần thứ 1 và đạt cực đại vào tuần thứ 4

Hình 3.8 Đường cong sinh trưởng tế bào cà gai leo khi bổ sung 3 g/L YE

Hình 3.9 Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung

3g/L YE

3.2.2.3 Thời đ ểm cảm ứng

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng sinh

trưởng của tế bào cà gai leo

ĐC: 3 g/L YE được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng

t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo

T ời điể (ng y) H lượng ( g g)

3.2.3 Ản ưởng c a salicylic acid

3.2.3.1 Nồ độ salicylic acid

SA ở các nồng độ từ 50-250 µM được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy để khảo sát khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo sau 4 tuần

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của SA n sinh trưởng của tế bào cà gai leo Nồng độ SA

ĐC: Tế bào không xử lý elicitor

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của SA lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào

ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor, ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm tuổi

Nhìn chung, SA đã ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong tế bào cà gai leo rõ rệt hơn cả MeJA và YE Ở môi trường có bổ sung 150 µM SA, ượng solasodine trong tế ào đạt cao nhất (245 mg/g khối ượng khô), cao hơn khi xử ý 50 μM MeJA

khoảng 1,5 lần và 3 g/L YE khoảng 1,1 lần

3.2.3.2 Thời gian nuôi cấy

Hình 3.11 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung SA

150 µM

Hình 3.12 Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung

150 µM SA

3.2.3.3 Thờ đ ểm cảm ứng

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA n sinh trưởng

của tế bào cà gai leo

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA lên khả năng t ch

ũy so asodine của tế bào cà gai leo

T ời điể (ngày) H lượng (mg/g)

Bảng 3.13 Ảnh hưởng kết hợp của từng cặp elicitor n sinh trưởng và tích

ũy so asodine của tế bào cà gai leo

Elicitor K ối lượng tế o (g)

Hình 3.15 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung SA

150 µM và YE 3 g/L

Hình 3.16 Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung

150 µM SA và 3 g/L YE

Chiều dài cột gel sau 24 giờ (mm)

Chiều cao cột gel bị tiêu (mm)

Dịch chiết

solasodine 119 ± 2,1 104,0 ± 1,5 15,0 ± 0,6

ĐC: dung dịch collagenase 0,1 mg/mL.

3.4 Quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro

cây cà gai leo

Hình 3.20 Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao

từ tế bào in vitro của cây cà gai leo ở quy mô phòng thí nghiệm

Cây cà gai leo tự nhiên

1 Kh trùng:

- Ethanol 70% trong 1 phút

- HgCl 2 0,1% trong 8 phút

- Rửa 5 lần bằng nước cất vô trùng

2 Tạo cây in vitro từ đoạn thân có mắt lá trong

môi trường S 0

Cây cà gai leo in vitro

Tạo callus

3 Tạo callus từ đoạn thân, đoạn rễ và cuống

lá của cây in vitro trên môi trường S1

Nhân callus

4 Nhân callus trong môi trường S2

Nuôi tế bào huyền phù

5 Nuôi 3 g callus trong 50 mL môi trường

S2 (không agar) tốc độ lắc 120 vòng/phút

6 Nuôi 20 mL dịch tế bào trong 50 mL môi

trường S 3 tốc độ lắc 150 vòng/phút

Tăng sinh so asodine

7 Bổ sung 150 µM salicylic acid vào môi

trường S 3 lúc bắt đầu nuôi cấy tế bào, tốc độ lắc 150 vòng/phút, 4 tuần

Dịch chiết solasodine

8 Tách chiết solasodine từ tế bào theo

p ương p p Sox let

9 Địn lượng dịch chiết solasodine bằng sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

10 c định hoạt tính trên cột collagen gel

C ương 4 BÀN LUẬN

4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA METHYL JASMONATE

4.1.1 Ản ưởng c a nồng độ methyl jasmonate

Thông thường, khi bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy đều ức chế khả năng sinh trưởng của tế bào, kết quả này được công

bố trên nhiều công trình nghiên cứu trước đây Trong nghi n cứu của chúng tôi, trong môi trường c MeJA sinh trưởng của tế bào cà gai

eo kém hơn so với đối chứng không bổ sung elicitor, nồng độ elicitor càng cao thì sự sinh trưởng của tế bào càng giảm Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về sự ức chế của elicitor

n sinh trưởng của tế bào thực vật

Nồng độ elicitor đ ng vai trò rất quan trọng trong quá trình cảm ứng, sự t ch ũy các hợp chất thứ cấp sẽ đạt cao nhất ở nồng độ elicitor thích hợp Nồng độ chất k ch kháng cao gây ra hiện tượng đáp ứng quá ngư ng, dẫn đến chết tế bào Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự t ch ũy so asodine đạt cao nhất khi được xử lý MeJA ở nồng độ 50 µM (159 mg/g, gấp 1,3 lần tế ào đối chứng không bổ sung MeJA)

4.1.2 Ản ưởng c a thời gian x lý methyl jasmonate

Thời điểm xử lý elicitor cũng à một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và t ch ũy các sản phẩm thứ cấp của

tế bào thực vật Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sinh trưởng và tích lũy solasodine của tế bào ở các thời gian xử lý elicitor khác nhau đều giảm so với xử lý ở thời điểm an đầu của quá trình nuôi cấy Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự như kết quả nghiên cứu của Chong và cs (2005) về ảnh hưởng của các elicitor

khác nhau và thời điểm bổ sung elicitor vào mẫu nuôi cấy tế bào

Morinda elliptica

4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM MEN

4.2.1 Ản ưởng c a nồng độ dịch chiết nấm men

Không giống như khi xử lý bằng MeJA, khi bổ sung YE vào môi trường nuôi cấy, sinh khối tươi và khô thu được đều cao hơn so với đối chứng không bổ sung elicitor Có nghiên cứu cho rằng, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy, YE có vai trò hoạt động như một nguồn nitrogen và dưới áp lực dinh dư ng này có thể cũng đ ng một vai trò quan trọng trong sinh trưởng và kích thích tế bào thực vật tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp Từ kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, cả sinh khối và hàm ượng solasodine của tế bào cà gai

eo đều tăng ở nồng độ thích hợp (2-4 g/L) Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự như kết quả nghiên cứu của Jain và cs (2015) trên

một đối tượng khác của họ cà là S melongena

4.2.2 Ản ưởng c a thời gian x lý dịch chiết nấm men

Đối với cây cà gai leo, thời gian xử lý elicitor càng dài càng kích thích sinh khối tế bào phát triển Khi bổ sung YE vào thời điểm bắt đầu nuôi cấy cũng như sau 7 ngày tế bào có khả năng sinh trưởng tương đương nhau, ở thời điểm cảm ứng là 14 ngày chỉ số sinh trưởng tế bào bắt đầu giảm và mạnh nhất là ở 21 ngày Kết quả

nghiên cứu của Jain và cs (2015) trên cây S melongena cũng cho

thấy thời gian cảm ứng 28 ngày là tốt nhất cho phát triển sinh khối cũng như hàm ượng so asodine như trong nghi n cứu của chúng tôi

Phân tích hàm ượng so asodine t ch ũy trong tế bào cây cà gai leo cho thấy thời điểm cảm ứng tốt nhất vẫn là lúc bắt đầu nuôi cấy giống như đối với MeJA (so asodine đạt 220,5 mg/g khối ượng khô)

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA SALICYLIC ACID

4.3.1 Ản ưởng c a nồng độ salicylic acid

Trong nghiên cứu của chúng tôi, nồng độ 50 và 100 µM SA

đã c ảnh hưởng kích thích rõ rệt lên sinh khối tế bào so với đối chứng, tương tự như YE và ngược với MeJA Hiện nay, không c nhiều công trình nghi n cứu ghi nhận hiện tượng này ngoại trừ ở họ

cà Trên họ cà, nghiên cứu của Jain và cs (2015) cho thấy khi xử lý

50 µM SA trên nuôi cấy rễ tơ cây S melongena sinh khối thu được

cao hơn đối chứng khoảng 1,5 lần sau 28 ngày (5,16 g so với 3,39 g), trong khi đ hàm ượng so asodine cao hơn đối chứng khoảng 13,5 lần (89,03 µg/g khô so với 6,5 µg/g khô)

Kết quả phân tích hàm ượng solasodine trong tế bào cà gai leo cho thấy sự t ch ũy tăng dần khi bổ sung SA từ 50-150 μM, sau

đ giảm mạnh ở 200-250 μM SA Nhìn chung, SA đã ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong tế bào cà gai leo rõ rệt hơn

cả MeJA và YE

4.3.2 Ản ưởng c a thời gian x lý salicylic acid

Tương tự với khi xử lý MeJA, thời gian xử lý bằng SA càng dài thì càng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào cây cà gai leo Thời gian cảm ứng ngắn (7 ngày) ít ảnh hưởng đến sinh trưởng của tế bào Tế ào đối chứng có thời gian cảm ứng dài nhất, do đ sinh khối chỉ được 7,61 g tươi và 0,68 g khô

Ảnh hưởng của thời gian xử lý SA lên khả năng tổng hợp

so asodine cũng tương tự như đối với MeJA và YE, thời gian cảm ứng càng dài khả năng t ch ũy so asodine càng cao Kết quả khảo sát cho thấy xử ý 150 μM SA vào thời điểm 7-21 ngày sau khi nuôi cấy không đủ thời gian cảm ứng để tế bào có thể sản xuất một ượng solasodine cao Xử lý SA ngay từ lúc bắt đầu nuôi cấy vẫn cho kết

quả tốt nhất, cao hơn các trường hợp khác từ 2-3 lần

4.4 ẢNH HƯỞNG PHỐI H P CÁC ELICITOR

Nhìn chung, xử lý kết hợp các elicitor ở các nồng độ khác nhau ở nghiên cứu này đều có tác dụng tăng t ch ũy so asodine trong

tế bào cà gai leo so với đối chứng Công thức kết hợp tốt nhất cho ượng so asodine cao hơn khoảng 1,6 lần so với tế ào không được

xử lý và khoảng 8,4 lần so với rễ cây tự nhi n 1 năm tuổi Tuy nhiên,

xử lý kết hợp chỉ cao hơn chỉ xử lý với 50 μM MeJA, và thấp hơn xử

lý riêng rẽ với 3 g/L YE hay 150 μM SA

Tương tự như xử lý riêng rẽ MeJA, YE và SA, xử lý kết hợp các elicitor cũng cho thấy thời điểm bổ sung thích hợp nhất là lúc bắt đầu nuôi cấy, hay nói cách khác thời gian cảm ứng dài (4 tuần) có hiệu quả nhất Sinh trưởng của tế ào và ượng so asodine đều cao hơn so với các thời điểm cảm ứng khác (7-21 ngày sau khi nuôi cấy) tương ứng với thời gian cảm ứng là 21-7 ngày So với kết quả nghiên cứu ở tế bào của phần lớn các loài thực vật khác, tế ào cà gai eo đòi hỏi thời gian cảm ứng dài ngày hơn

4.5 SO SÁNH HIỆU QUẢ GIỮA CÁC ELICITOR

Trong nghiên cứu này, cả 3 elicitor đều àm tăng khả năng sinh tổng hợp solasodine trong tế ào cây cà gai eo, trong đ SA c vai trò cao nhất, tiếp đến là YE và cuối cùng là MeJA, ảnh hưởng của các chất này lên sự phát triển của sinh khối cũng tương tự

SA là elicitor phi sinh học có giá thành rẻ, dễ dùng n n được nhiều tác giả sử dụng, nhiều công trình cũng cho thấy SA có hiệu quả cao nhất trong kích khảng tổng hợp các HCTC ở thực vật

KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN

1 Sự sinh trưởng và t ch ũy so asodine trong tế bào huyền phù cà gai eo đạt cao nhất sau 4 tuần nuôi cấy, sinh khối tươi đạt 4,98 g/bình, sinh khối khô đạt 0,45 g/ ình và hàm ượng solasodine đạt 123,5 mg/g khối ượng khô, cao hơn trong rễ tự nhiên khoảng 5,3 lần

2 Ảnh hưởng của các e icitor đến khả năng t ch ũy

solasodine trong tế bào in vitro của cây cà gai leo:

2.1 Hàm ượng so asodine t ch ũy cao nhất khi tế bào cà gai

eo được xử lý 150 µM salicylic acid ở thời điểm bắt đầu nuôi cấy (245 mg/g khối ượng khô)

2.2 Khi bổ sung các elicitor riêng lẽ hay phối hợp,

so asodine tăng dần từ tuần thứ 2-3, đạt cực đại ở tuần thứ 4 và sau

DANH M C C C C NG TRÌNH ĐÃ C NG Ố

1 Nguyen Hoang Loc, Nguyen Huu Thuan Anh, Le Thi Minh

Khuyen, Ton Nu Thuy An (2014) Effects of yeast extract and methyl jasmonate on the enhancement of solasodine biosynthesis in cell

cultures of Solasodine hainanense Hance J BioSci Biotech 2014,

3(1): 1-6

2 Nguyễn H u Thuần Anh, Tôn Nữ Thùy An, Lê Thị Hà Thanh,

Võ Thị Viên Dung, Nguyễn Thuần Nho, Đinh Hồng Kim Cương, Nguyễn Ngọc Hiếu, Nguyễn Thanh Giang, Nguyễn Hoàng Lộc (2015) Nghiên cứu ảnh hưởng của methyl jasmonate và dịch chiết nấm men n sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo

(Solasodine hainanense Hance) Tạp chí Công nghệ sinh học 13(2A):

1-7

3 Nguyen Huu Thuan Anh, Ton Nu Thuy An, Nguyen Thuan Nho,

Vo Thi Vien Dung, Nguyen Hoang Loc (2015) Effect of salicylic acid on the biosynthesis of solasodine in cell suspension culture of

Solanum hainanense Hance Plant Cell Biotechnology and Molecular

Biology 17(1-2): 14-20