Luận văn đa dạng di truyền 5 quần thể gà nội

Nhiều giống bản địa, mà một số trong đó đang bị đe dọa tuyệt chủng, có các tính trạng như khả năng phụchồi trước áp lực khí hậu và khả năng kháng bệnh và ký sinh trùng, khiến chúng thích

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Lê Quang Nam

ĐA DẠNG DI TRUYỀN 5 QUẦN THỂ GÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2012

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Lê Quang Nam

ĐA DẠNG DI TRUYỀN 5 QUẦN THỂ GÀ NỘI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Văn Mùi

Hà Nội - Năm 2012

Trang 3

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 6

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 Nguồn gốc và phân loại gà nhà 8

1.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu 8

1.3 Các đặc điểm di truyền quần thể 10

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm thu mẫu 15

2.2 Các kỹ thuật thực nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu 17

2.3 Phân tích thống kê 25

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả tách ADN và phân tích đoạn 30

3.2 Kết quả đánh giá các đặc điểm di truyền 31

KẾT LUẬN 57

ĐỀ NGHỊ: 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Tiếng Việt 59

Tiếng Anh 59

Tiếng Pháp 63

Trang 4

DANH SÁCH HÌNH ẢNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1 Gà mái Trới 19

Hình 2 Gà trống Trới 19

Hình 3 Đàn gà Móng 20

Hình 4 Đàn gà Tè 20

Hình 5 Gà mái Tiên Yên 21

Hình 6 Gà trống Tiên Yên 21

Hình 7 Gà mái Tò 22

Hình 8 Gà trống Tò 22

Hình 9 Ảnh điện di ADN trên gel agarose 30

Hình 10 Ảnh phân tích đoạn sản phẩm mix multiplex PCR 5 mồi 31

Hình 11 Tần số alen thuộc locus MCW0295 34

Hình 12 Tần số alen thuộc locus ADL0112 34

Hình 19 Tần số alen thuộc locus LEI0094 40

Hình 34 Cây quan hệ di truyền của 5 giống gà nghiên cứu 56

2

Trang 5

-DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Các cặp mồi microsatellite được sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 2 Giả thiết H0 và đối thiết H1 trong kiểm định cân bằng Hardy - Weinberg 27

Bảng 3 Giả thiết H0 và đối thiết H1 trong kiểm định sai khác di truyền 27

Bảng 4 Giả thiết H0 và đối thiết H1 trong kiểm định khoảng cách di truyền 28

Bảng 5 Dải alen quan sát ở 5 quần thể gà 31

Bảng 6 Số alen, độ phong phú alen trên mỗi locus ở mỗi quần thể gà 32

Bảng 7 Giá trị Heobs, Heexp và Fis ở từng locus và từng quần thể gà 50

Bảng 8 Sai khác di truyền và khoảng cách di truyền giữa các quần thể gà 54

Bảng 9 Kết quả đo OD dung dịch ADN sau khi tách 64

Trang 6

CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT VÀ VIỆT HÓA

Allele: alen

Allelic richness: độ phong phú (giàu có) alen

Bottleneck effect: hiệu ứng thắt cổ chai

Gene diversity: độ đa dạng gen, tần số dị hợp tử mong đợi

Gene flow: dòng chảy gen

Gene pool: vốn gen

Genetic drift: sự lạc dòng (hoặc phiêu bạt, trôi dạt) di truyền

Genetic variation: biến dị di truyền

NST: nhiễm sắc thể

PCR: polymerase chain reaction

Multiplex PCR: PCR đa mồi

Phylogenetic tree: cây quan hệ di truyền, hoặc cây phả hệ, hoặc cây tiến hóa, hoặc câyphát sinh loài

Pivate allele: alen riêng

Topology tree: cấu trúc nhánh cây

UPGMA: unweighted pair - group method with arithmetic mean

4

Trang 7

-LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn thầy hướng dẫn, PGS TS Nguyễn Văn Mùi

đã dành nhiều thời gian và công sức tận tình quan tâm hướng dẫn em trong suốt quátrình học tập và viết luận văn này Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp thuộcPhòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật - Viện Chăn nuôi đã cónhững nhận xét, góp ý về mặt chuyên môn trong quá trình hoàn thành luận văn Cuốicùng tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã quantâm, động viên, bố trí công việc và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa họcthạc sỹ này

Trang 8

MỞ ĐẦU

Tài nguyên di truyền động vật là vốn sinh học căn bản để phát triển chăn nuôi

và quan trọng đối với an ninh lương thực và sự phát triển nông thôn bền vững Tuynhiên, các nguồn lực này thường bị bỏ quên và được quản lý kém Những năm gần đây

đã chứng kiến sự giảm sút đáng kể về đa dạng di truyền - một xu hướng mà có thể bịđẩy nhanh bởi những thay đổi nhanh chóng của môi trường ảnh hưởng đến ngành chănnuôi hiện nay

Sự phát triển chăn nuôi ở thế kỷ 20 tập trung vào một số lượng rất nhỏ cácgiống trên toàn thế giới, thường xuyên không xem xét cách ảnh hưởng của môi trườngsản xuất đến khả năng tồn tại, sản xuất và sinh sản của động vật Nhiều giống bản địa,

mà một số trong đó đang bị đe dọa tuyệt chủng, có các tính trạng như khả năng phụchồi trước áp lực khí hậu và khả năng kháng bệnh và ký sinh trùng, khiến chúng thíchnghi tốt với điều kiện địa phương, và có tầm quan trọng tiềm năng rất lớn đối với sản

Việc bảo tồn nguồn di truyền tự nhiên không chỉ phục vụ cho lý do đạo đức và

mỹ thuật mà nó còn liên quan tới cuộc sống của con người trên toàn cầu thông qua việc

sử dụng các sản phẩm từ nông nghiệp, trồng trọt và chăn nuôi Ngoài việc tạo ra nguồnthực phẩm, thì nguồn tài nguyên động vật còn được ví như “kho lưu trữ” các tính trạngquý trong quá trình sản xuất nguồn thực phẩm Các loài gia cầm bản địa là một trongnhững nguồn gen quý đã có sự thay đổi để phù hợp với các điều kiện môi trường.Những giống gà bản địa có thể có những gen hoặc alen phù hợp với các điều kiện môitrường sinh ra nó [33] Việc bảo tồn các giống bản địa đóng vai trò quan trong đối vớicông tác chọn và tạo giống hiện tại cũng như trong tương lai

Việc đánh giá các vốn gen sẽ đóng góp một phần vào công tác bảo tồn các giống

gà địa phương, đặc biệt việc sử dụng các phương pháp sinh học phân tử làm công việcđánh giá sự đa dạng di truyền là rất quan trọng [32] Hiện nay có nhiều loại chỉ thị

1 http://www.fao.org/biodiversity/geneticresources/bio-domesticanimals/en/

6

Trang 9

-phân tử được sử dụng trong công tác đánh giá các đặc điểm và mối quan hệ di truyềncủa các giống gà, trong đó các microsatellite là một trong những loại chỉ thị được sửdụng rộng rãi trên thế giới

Ở nước ta hiện nay tuy có nhiều nghiên cứu tập trung mô tả đặc điểm ngoạihình, sinh trưởng phát dục và khả năng sinh sản của các giống gà nội nhưng lại có ítnghiên cứu sử dụng các chỉ thị phân tử để xác định các đặc điểm di truyền từng giống,mối quan hệ di truyền giữa các giống, và nguồn gốc, phân loại các giống gà nội Việcnày làm giảm hiệu quả đầu tư vào công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng hiệu quảnguồn gen của các giống gà nội ở nước ta

Từ năm 1990 Bộ Khoa học - Công nghệ và Môi trường (nay là Bộ Khoa học vàCông nghệ) thay mặt Nhà nước Việt nam đã xây dựng một chương trình Bảo tồnnguồn gen động - thực và vi sinh vật Việt nam “Đề án Bảo tồn nguồn gen vật nuôiViệt nam” là một hợp phần của chương trình này và được giao cho Viện Chăn Nuôithực hiện Luận văn này là kết quả của một đề tài nhánh thuộc hợp phần trên, đượcthực hiện trên 5 giống gà nội Việt nam là gà Trới, gà Móng, gà Tè, gà Tiên Yên và gà

Tò tại các cơ sở nuôi dưỡng chúng và tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế

bào Động vật thuộc Viện Chăn nuôi Quốc gia Đề tài chúng tôi thực hiện có tên là Đa dạng di truyền 5 quần thể gà nội, có mục đích góp phần làm sáng tỏ tính đa dạng di

truyền, cấu trúc sinh sản và mối quan hệ di truyền giữa các quần thể gà nội kể trên, qua

đó cung cấp các thông tin khoa học tin cậy cần thiết cho quá trình bảo tồn nguồn gen

gà nội Việt nam

Trang 10

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc và phân loại gà nhà

Các giống gà đã được con người thuần hóa từ gà rừng hơn 2000 năm trước [11]

Gà rừng thân hình nhỏ, trứng bé, đẻ rộng theo mùa, có thể bay xa Nhìn chung gà Châu

Á thuộc chủng Gallus gallus, nhưng cũng có thể từ gà có dái tai đỏ Gallus gallus

murghi vùng ven Ấn Độ, từ Gallus gallus của Mianma, từ Gallus gallus bankiva rải rác

khắp vùng Đông Nam Á; cũng có thể là sự phối hợp của cả 3 loại đó Chính nguồn gốc

đa dạng ấy tạo nên cho gà bản địa một tiềm năng di truyền phong phú biểu hiện quakiểu hình: hình dạng, màu sắc lông, dạng mào, dái tai, dạng đuôi, kết cấu giữa cổ-ngực[2] Trong lịch sử sinh học, có một điều khá thú vị là chính những giống gà Á Đông,Đông Nam Á như gà Brahman, gà Cochinchine, gà chọi… đã tham gia vào việc hìnhthành các giống gà công nghiệp hiện nay [2]

1.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu

1.2.1 PCR

PCR là một phương pháp mang tính cách mạng được phát triển bởi Kary Mullistrong những năm 80 PCR dựa trên việc sử dụng khả năng tổng hợp sợi ADN mới bổ

sung với sợi khuôn sẵn có Do ADN polymerase chỉ có thể thêm một nucleotide vào

nhóm 3’-OH có trước, nên nó cần mồi để gắn nucleotide đầu tiên Yêu cầu này khiếncho nhà nghiên cứu có thể khuếch đại một vùng trình tự cụ thể mong muốn Kết thúc

chỉ đòi hỏi một lượng ADN làm khuôn ban đầu rất nhỏ Trong trường hợp ADN

bản sao của một gen trên NST Đối với nấm men, vi khuẩn và plasmid, lượng ADN tối

ưu được sử dụng cho mỗi phản ứng tương ứng là 10 ng, 1 ng và 1 pg [35].

1.2.2 Kỹ thuật microsatellite

Microsatellite là loại ADN lặp đi lặp lại được tạo thành từ các đoạn lặp dài từ 2

2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechPCR.shtml

8

Trang 11

-đến 8 nucleotide3 Chúng có thể có độ đa hình cao và thường là các chỉ thị phân tửtrong nghiên cứu di truyền quần thể Các microsatellite có thể tìm thấy mọi nơi trong

hệ gen, cả vùng mã hoá và không mã hoá [41] Các microsatellite được sử dụng để lậpbản đồ và nghiên cứu đa dạng di truyền trên gà ngay từ thời điểm nó được ứng dụng là

do trình tự của chúng có độ đa hình cao, phân bố rải rác toàn bộ hệ gen [37], và rấtnhiều locus microsatellite nghiên cứu trên gà đã được công bố và lập bản đồ [12], [21].Thông tin về các microsatellite gà có thể dễ dàng nhận được qua các trang web nhưhttp://www.thearkdb.org/arkdb/, http://aviandiv.tzv.fal.de/primer_table.html

1.2.3 Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật microsatellite

Microsatellite được Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc - FAO dùng làm

công cụ phân tử đầu tiên cho dự án MoDAD (Measurement of Domestic Animal

Diversity) nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền của động vật bản địa Hiện nay các

microsatellite là công cụ tốt nhất cho việc nghiên cứu các locus liên quan đến tínhtrạng số lượng và cho việc đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể vật nuôi

Kết quả nghiên cứu các giống gà nội địa Trung Quốc cho thấy khi phân tích

bằng microsatellite thì tần số dị hợp tử quan sát được là cao nhất (75.91%), tiếp theo là

phương pháp RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) (26.32%), cuốicùng là phương pháp phân tích allozyme (22.09%) [44] Dùng microsatellite khinghiên cứu trên quần thể gà có thể thu được hơn 12 alen trên một locus và tần số dịhợp tử có thể lên đến 90% [40] Khi sử dụng 14 locus microsatellite để phân tích mốiquan hệ di truyền giữa các quần thể gà bản địa khác nhau (chủ yếu từ Đức và Ucraina

với tổng số 224 cá thể của 20 quần thể) và với gà rừng, việc lập cây quan hệ di truyền

đã được tiến hành và thu được 3 nhóm chính [32] 42 chỉ thị microsatellite đã được sửdụng để phân tích 23 dòng gà cao sản của các giống gà Leghorn, gà rừng, gà Fayoumi

và gà Tây Ban Nha, qua đó tính được được khoảng cách di truyền giữa gà rừng với các

dòng gà khác [45] 22 chỉ thị microsatellite đã được sử dụng để xác định tần số dị hợp

3 http://www.nature.com/nrg/journal/v5/n1/glossary/nrg1247_glossary.html

Trang 12

tử và khoảng cách di truyền của các giống gà: Châu Phi, Châu Á và Nam Mỹ Kết quả

cho thấy các giống gà có sự đặc trưng theo từng khu vực

29 locus microsatellite đã được dùng để đánh giá sự đa dạng di truyền của gàH’mông ở Sơn La, với 36 cá thể thu từ 3 làng [13] Nghiên cứu đã chỉ ra có sự khácbiệt di truyền giữa 3 nhóm gà theo khoảng cách địa lý, các quần thể gà đều ở trạng tháicân bằng Hardy - Weinberg và không bị ảnh hưởng bởi giao phối cận huyết Việcnghiên cứu quần thể gà Hà Giang đã kết luận rằng, trong sự vắng mặt của bất cứ cấu

trúc quần thể gà nào trong phạm vi tỉnh, thì gà H’mong lại chia sẻ vốn gen chung với

các giống gà khác [8] Số lượng lớn alen chung giữa gà Hà Giang và gà rừng, cũng nhưcác kết quả phân tích cụm Bayes đã đề xuất rằng dòng chảy gen đã diễn ra từ gà rừngtới gà Hà Giang [8] Việc sử dụng 29 microsatellite khi nghiên cứu 9 giống gà nội và 2

giống gà Trung Quốc đã xác định rằng các giống gà Việt nam tạo nên vốn gen khác với các giống gà Trung Quốc, các giống gà miền Bắc tạo nên một vốn gen không có cấu

trúc [14] Sự khác biệt của các giống gà Việt nam quan sát được giữa miền Bắc vàDuyên hải miền Trung cũng như đồng bằng Cửu Long chỉ ra rằng sự phân nhóm cácgiống gà Việt nam có quan hệ tới sự phân cách về địa lý của chúng [14]

1.3 Các đặc điểm di truyền quần thể

1.3.1 Các đại lượng di truyền đặc trưng cho các quần thể gà

Độ phong phú alen ở mỗi locus và mẫu, kí hiệu là R s, và tổng thể các mẫu kí

giữa các mẫu có cỡ khác nhau Do số alen quan sát phụ thuộc cao vào cỡ mẫu nên Petit

và cộng sự [30] đã đề ra nguyên tắc ước tính số lượng dự kiến của các alen trong một

phân mẫu 2n gen, dựa trên 2N gen đã được lấy mẫu (N ≥ n), trong đó N là số nhỏ nhất

các cá thể được lập kiểu gen đối với một locus trong một mẫu

Các quần thể trong thực tế thường có sự sai khác giữa tần số dị hợp tử quan sát

và tần số dị hợp tử mong đợi Tần số dị hợp tử quan sát là tỉ lệ số cá thể dị hợp thu được trong nghiên cứu và tần số dị hợp tử mong đợi, hay còn được gọi là độ đa dạng

10

Trang 13

-gen, của một locus được tính dựa trên tần số quan sát của các alen thuộc locus đó, với

giả định quần thể nghiên cứu ở trạng thái cân bằng Hardy - Weinberg

Hệ số cận huyết (ký hiệu là F is) xét tại một locus ở một cá thể là xác xuất để 2alen thuộc locus đó, cùng sinh ra từ một alen tổ tiên, giống hệt nhau4 Giá trị F is [-1; 1]

giao phối cận huyết hoặc đồng giao, hoặc do sự chọn lọc các cá thể đồng hợp nếu có sự

cùng cha hoặc cùng mẹ, giữa chú (bác) ruột - cháu gái, cô (dì) ruột - cháu trai Giá trị

bằng Hardy - Weinberg ở mỗi giống

Định luật cân bằng Hardy - Weinberg được phát biểu như sau6: biến dị di

truyền trong một quần thể sẽ duy trì không đổi từ thế hệ này đến thế hệ khác nếu không

có các yếu tố gây rối Khi việc giao phối là ngẫu nhiên trong một quần thể lớn màkhông có các trường hợp gây rối, thì định luật dự đoán rằng cả tần số alen và kiểu gen

sẽ duy trì không đổi bởi chúng ở trong trạng thái cân bằng

Các yếu tố gây rối bao gồm đột biến, chọn lọc tự nhiên, giao phối không ngẫu nhiên, lạc dòng di truyền và dòng chảy gen Đột biến phá vỡ trạng thái cân bằng tần số alen bằng cách thêm alen mới vào một quần thể Tương tự, chọn lọc tự nhiên và giao

phối không ngẫu nhiên dẫn đến các thay đổi trong tần số gen, do một vài alen trợ giúp

hoặc gây hại tới sự thành công sinh sản của các cá thể mang chúng Sự lạc dòng di

4 identical by descend: http://www.evolution-textbook.org/content/free/glossary/glossary.html

5 How to compute an inbreeding coefficient (the path method)

http://www.braquedubourbonnais.info/en/inbreeding-calculation.htm

6 http://www.nature.com/scitable/definition/hardy-weinberg-equilibrium-122

∈

Trang 14

truyền làm tần số của một alen nào đó trở nên lớn hơn hoặc nhỏ hơn và thường xảy ra

ở các quần thể nhỏ Dòng chảy gen giữa 2 quần thể xảy ra sẽ chuyển các alen mới vào

quần thể Do các tác động gây rối này thường xảy ra trong tự nhiên, nên trạng thái cânbằng Hardy - Weinberg hiếm khi xuất hiện ở các quần thể trong thực tế Do vậy ta cóthể suy đoán được nguyên nhân gây ra hiện tượng mất cân bằng này

1.3.2 Mối quan hệ di truyền giữa các quần thể gà

Độ sai khác di truyền giữa các quần thể gà được xác định qua giá trị F st

nhau Với giá trị F st [0; 0.05] thì độ khác biệt di truyền nhỏ; giá trị F st [0.05; 0.15] thì

trọng; giá trị F st [0.25; 1] thì độ khác biệt di truyền cực kỳ quan trọng

Khoảng cách di truyền (ký hiệu là D S) được định nghĩa7 là mức độ biệt hóa ditruyền giữa 2 quần thể, được đo bằng cách so sánh tần số alen, hoặc kích thước alen

quần thể nếu ở đó có sự giao phối ngẫu nhiên và có độ lạc dòng di truyền thấp.

Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng các locus microsatellite trong việc nghiên cứumối quan hệ tiến hóa của các quần thể hoặc các loài quan hệ gần gũi, và vài đã đề xuất

các cách tính khoảng cách di truyền mới cho mục đích này Tuy nhiên, hiệu quả của những cách đo khoảng cách này trong việc thu được cấu trúc nhánh cây chính xác

Cavalli-Sforza và Edwards [9] và Nei [26] thường thể hiện xác xuất đạt được cấu trúc nhánh

cây chính xác cao hơn các cách tính khoảng cách khác [39] Trong việc ước lượng thời

7 http://www.nature.com/nrg/journal/v5/n1/glossary/nrg1247_glossary.html

12

-∈

Trang 15

theo Nei [26], [27] dựa trên giả định rằng mọi sự khác biệt giữa các quần thể đều do sự

lạc dòng di truyền và do đột biến Giá trị D S được tính theo Cavalli-Sforza và Edwards

lạc dòng di truyền Ngoài ra, cách tính giá trị D S theo Nei (1978) [27] ưu việt hơn cách

Lượng cá thể và số locus lấy mẫu có ảnh hưởng đến kết quả tính khoảng cách di

truyền, nên tối thiểu 25 cá thể mỗi quần thể phải được sử dụng và từ 25 đến 30 locus

microsatellite với 4 đến 10 alen mỗi locus phải được lập kiểu gen [7] Cùng với nhữngđiều đã trình bày ở trên, và do 5 quần thể gà nghiên cứu có sự chênh lệch lớn về cỡmẫu, gà Trới, gà Móng, gà Tè, gà Tiên Yên và gà Tò trong nghiên cứu có 60, 54, 42,

[27] là phù hợp nhất cho nghiên cứu này

Cây quan hệ di truyền là sự biểu diễn bằng độ thị mối quan hệ tiến hóa giữa các

UPGMA [38] và phương pháp neighbor joining [34] thường cho kết quả tốt nhất khi

lập cây UPGMA là phương pháp đơn giản nhất, nhưng nhược điểm lớn của nó là giả

định tốc độ tiến hoá của tất cả các quần thể giống nhau [28] Ví dụ như, tốc độ đột biến

là không đổi theo thời gian và đối với mọi dòng giống ở cây quan hệ di truyền Điều

này có nghĩa rằng mọi lá (nút đầu cuối của cây) đều cùng khoảng cách từ rễ Trong

thực tế, các nhánh cá thể rất khó có khả năng cùng tốc độ đột biến, nên UPGMA thường tạo ra cấu trúc nhánh cây sai Phương pháp này tạo ra cây có rễ, nhưng việc tái

lập rễ lại không thực hiện được Việc lập cây dựa vào phương pháp này sẽ không chính

xác khi quần thể gặp hiệu ứng thắt cổ chai (một hiện tượng tiến hóa trong đó tỉ lệ đáng

kể của quần thể hoặc loài bị giết hoặc bị ngăn chặn sinh sản), hoặc gặp hiện tượng lạc

8 http://www.nature.com/scitable/definition/phylogenetic-tree-25

Trang 16

dòng di truyền mạnh.

Phương pháp neighbor joining [34] được sử dụng rộng rãi để xây dựng cây

quan hệ di truyền từ dữ liệu khoảng cách di truyền Không như phương pháp UPGMA,

phương pháp này không yêu cầu giả định tốc độ tiến hóa không đổi nên không tạo ra

cây có rễ Mục tiêu của phương pháp neighbor joining là tối thiểu hóa chiều dài nhánh

của cây Khi cho trước khoảng cách chính xác, phương pháp này đảm bảo sẽ tạo ra cây

đúng so với thực tế Atteson [6] đã chứng minh rằng nếu khoảng cách di truyền có sai

số rất nhỏ, thì vẫn nhận được cây quan hệ di truyền đúng, nghĩa là phương pháp

neighbor joining có tính nghiêm ngặt, vững chắc Đây là một đặc điểm quan trọng mà

một vài phương pháp khác không có, ví dụ như phương pháp UPGMA [38] Phương

pháp neighbor joining còn có ưu điểm là cho giá trị bootstrap cao hơn [16].

Bootstrap là sự kiểm định đơn giản nhất về độ chính xác của cây quan hệ di truyền [17] Lập bootstrap về cơ bản là kiểm tra xem liệu tập dữ liệu có hỗ trợ hay xác

nhận cây ta vừa lập hay không Việc này được thực hiện bằng cách lấy ngẫu nhiên cácmẫu con trong tập dữ liệu, dựng cây từ chúng và tính toán tần số mà các phần khácnhau của cây được tạo ra trong những mẫu con ngẫu nhiên này Nếu nhóm X được tìm

thấy ở mọi cây lập từ các mẫu con, thì sự xác nhận bootstrap của nó là 100%, và nếu nhóm đó được tìm thấy chỉ 2/3 các cây mẫu con, thì sự xác nhận bootstrap của nó là

67% Mỗi mẫu con đều cùng cỡ với dữ liệu gốc, được tạo ra bằng việc lấy mẫu ngẫu

nhiên có hoàn lại Đây là một kiểm định đơn giản, nhưng các phân tích bootstrap của các cây quan hệ di truyền đã biết (các quần thể virus tiến hóa trong phòng thí nghiệm) chỉ ra rằng, nói chung bootstrap là một thước đo tin cậy về tính chính xác của cây

quan hệ di truyền, và giá trị 70% hoặc cao hơn cho biết xác suất cây đúng với thực tế

là trên 95% [22]

Như vậy, dùng phương pháp neighbor joining dựng cây quan hệ di truyền dựa

14

Trang 17

-Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm thu mẫu

Đối tượng nghiên cứu gồm 60 cá thể gà Trới và 59 cá thể gà Tiên Yên lấy tạiTrung tâm Chuyển giao Tiến bộ Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Hải Ninh, thị xã MóngCái - Quảng Ninh; 54 cá thể gà Móng (xuất xứ từ tỉnh Hà Nam) và 42 cá thể gà Tè(xuất xứ từ tỉnh Phú Thọ) đang được nuôi tại Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm ThụyPhương thuộc Viện Chăn Nuôi Quốc Gia, Từ Liêm, Hà nội; và 35 cá thể gà Tò lấy tạihuyện Quỳnh Phụ tỉnh Thái Bình Các cá thể gà được chọn theo nguyên tắc hạn chế tối

đa mối quan hệ huyết thống giữa chúng

2.1.1 Gà Trới

Theo Nguyễn Văn Tòng và Nguyễn Đình Duẩn [3], gà Trới (hình 1, 2) có cácmàu vàng, vàng đen, xám tro, thân hình bình thường mình dài cổ chân cao, có conchỏm lông đầu, có con chỏm lông dưới cằm Một số con không có lông đầu, cằmnhưng vẫn thể hiện thân hình ngực nở thăn chắc đặc trưng của giống Tỷ lệ nuôi sốngqua các giai đoạn cao 90-95% Khối luợng cơ thể ổn định Tuổi thành thục là 23 tuầntuổi Năng suất trứng/mái/năm là 90 - 120 quả Tỷ lệ thịt cao, thịt thơm ngon giàu a xítamin

2.1.2 Gà Móng

Theo Hồ Xuân Tùng và cộng sự [4], gà Móng (hình 3) trống có màu lông nâu

đỏ, đỏ tía; con mái có lông màu đất thó, màu bạc Cả gà trống và gà mái đều có mào

nụ, chân vàng, mỏ vàng, thân hình chắc chắn Giai đoạn từ 9 đến 20 tuần tuổi tỷ lệ nuôisống của gà Móng con trống đạt 94%, con mái đạt 98% Tuổi thành thục sinh dục trungbình của gà Móng là 161 ngày, sản lượng trứng/mái/năm đạt 83.6 quả Khối lượngtrứng bình quân của gà Móng lúc 38 tuần tuổi là 48 gam Tỷ lệ trứng có phôi khá cao,đạt 87.2%; tỷ lệ nở/trứng có phôi khá thấp, đạt 82.1%

2.1.3 Gà Tè (gà lùn)

Theo Vũ Ngọc Sơn và cộng sự [5], gà Tè (hình 4) có chân thấp, chiều cao chân

Trang 18

từ 4-5cm, da chân có màu vàng, bàn chân 4 ngón, chân không có lông Gà mái trưởngthành có màu lông vàng nâu đất hoặc vàng rơm, gà trống lông nâu đỏ và điểm xuyếtlông đen ở cánh và đuôi, kiểu mào đơn có 5 răng cưa, không có mào nụ Giai đoạn gàhậu bị từ 30 - 140 ngày tỷ lệ nuôi sống đạt 95.6% và trong giai đoạn sinh sản tỷ lệ nuôisống bình quân/tháng là 98.5% Gà Tè phát dục sớm, gà trống bắt đầu gáy lúc 58 ngàytuổi Tuổi đẻ trứng đầu lúc 132 ngày, sản lượng trứng thống kê được trong 72 tuần (52tuần sinh sản) đạt 68 - 71 quả, gà có tính ấp bóng rất cao tương tự như gà Ri, gà đẻbình quân mỗi lứa từ 15-17 trứng lại đòi ấp Khối lượng trứng cân tại tuần 38 đạt48.5gam, trứng có vỏ màu trắng hồng và chất lượng trứng thơm ngon như trứng gà Ri

2.1.4 Gà Tiên Yên

Theo Nguyễn Văn Tòng và Nguyễn Đình Dũng [3], gà Tiên Yên (hình 5, 6) có các màu vàng, vàng đen, hoa mơ mình dài xương nhỏ cổ ngắn chân thấp, chân có 4

ngón có vẩy sừng Tỷ lệ nuôi sống qua các giai đoạn cao 90 - 95% Khối lượng cơ thể

ổn định Tuổi thành thục là 21 - 22 tuần tuổi Năng suất trứng / mái / năm là 110 - 125quả Tỷ lệ ấp nở cao, tỷ lệ thịt cao, thịt thơm ngon giàu acid amin Chúng thích nghi tốtvới điều kiện khí hậu của địa phương, tỷ lệ nuôi sống ở các giai đoạn đẻ đều cao trên96%

đỏ tía, dọc chân có 2 vạch đỏ tía như gà mái nhưng đậm hơn và có 2 hàng vảy xếpsong song

Gà Tò thành thục sinh sản khá sớm 148 ngày tuổi, tuổi đẻ đạt 30% vào tuần tuổi

30 Gà Tò đẻ mỗi lần 14 - 17 quả/đợt Sản lượng trứng 120 - 140 quả/năm, tỷ lệ phôi

16

Trang 19

-trung bình đạt 91.08%, tỷ lệ ấp nở của gà Tò (nở/trứng ấp) thấp đạt 67.55% Gà Tò cóđôi chân to chắc, cao, khi ấp dễ đè vỡ trứng và dẫm chết con khi mới nở Trong quátrình nuôi dưỡng, chọn lọc và nhân thuần từ 2006 đến 2009, gà Tò càng được nhânthuần thì sức sống càng cao, với tỷ lệ nuôi sống trong giai đoạn từ 0 - 17 tuần tuổi ởcác năm 2006, 2007, 2008, 2009 lần lượt là 90.76%, 92.77%, 93.06% và 93.96% [1].

2.2 Các kỹ thuật thực nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu

2.2.1 Lấy mẫu máu, tách và đánh giá chất lượng ADN

Lấy mỗi cá thể khoảng 1 ml máu từ tĩnh mạch cánh bằng loại kim và ống lấy mẫu chuyên dụng, chuyển ngay mẫu máu sau khi lấy vào tube eppendorf 1.5 ml có nắp kín chứa 50 μl dung dịch EDTA 0.5M, lắc nhẹ cho đều sau đó chuyển mẫu vào hộp

lạnh để bảo quản

ADN được tách bằng bộ kit Quiagen (Đức) tách ADN từ máu theo qui trình sau:

lấy 50 μl máu gà và 150 μl đệm TE cho vào ống eppendorf 1.5 ml Thêm 20 μl protein

Lắc đều, rồi ly tâm nhẹ để lắng các giọt dịch trên thành ống xuống Chuyển dung dịch

thu được vào cột lọc đặt trong ống 2 ml Ly tâm 1’ tại tốc độ 8000 vòng/phút sau đó chuyển cột lọc sang ống 2 ml mới Thêm 500 μl đệm AW1, ly tâm 1’ tại tốc độ 8000 vòng/phút Chuyển cột lọc sang ống mới Thêm 500 μl đệm AW2, ly tâm 3’ tại tốc độ

12000 vòng/phút Chuyển cột lọc sang ống 1.5 ml mới Thêm 200 μl đệm TE, ủ ở nhiệt

độ phòng trong 3’, sau đó ly tâm 1’ tại tốc độ 8000 vòng/phút Bỏ cột lọc giữ lại ống có

Trang 21

Hình 1 Gà mái Trới

Hình 2 Gà trống Trới

Trang 22

Hình 3 Đàn gà Móng

Hình 4 Đàn gà Tè

20

Trang 23

-Hình 5 Gàmái Tiên Yên

Hình 6 Gàtrống TiênYên

Trang 24

Hình 7 Gà mái Tò

Hình 8 Gà trống Tò

22

Trang 25

-ADN tổng số sau khi tách sẽ được điện di trên gel agarose 1% để đánh giá Đểxác định độ tinh sạch và nồng độ của ADN, ta tính chỉ số OD của ADN ở bước sóng

260 nm và 280 nm, sau đó tính tỷ số giữa hai chỉ số OD đó Nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm trong máy quang phổ kế Một đơn vị (1.0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm (A260) tương đương với nồng độ ADN là 50mg/ml Nếu giá trị hấp thụ bước sóng 280 nm (A280) cũng

được xác định, thì tỷ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ lẫn các chất như phenol hoặcprotein Tỷ lệ A260/A280 là 1.8 - 2.0 phản ánh ADN đủ độ tinh khiết [36]

2.2.2 PCR đa mồi và xác định kích thước alen

LEI0194 được sử dụng theo Mcconnell và cộng sự [23] Thông tin chi tiết về 23 locusmicrosatellite trong nghiên cứu được thể hiện ở bảng 1

Bộ kít Multiplex Master Mix PCR của hãng Quiagen được sử dụng để thực hiệncác phản ứng PCR đa mồi khuếch đại cùng lúc nhiều locus microsatellite Các mồixuôi được gắn màu huỳnh quang là đen, lam và lục Sản phẩm PCR được đưa vào máyCEQ8000 để phân tích xác định kích thước của chúng 5 mix PCR đa mồi được chuẩnhóa để khuyếch đại các locus Mix I gồm 5 locus MCW0295, ADL0112, MCW0216,

Các alen được xác định kích thước bằng máy CEQ8000 của hãng Beckman

Coulter Thành phần trong mỗi giếng được đưa vào máy CEQ8000 gồm: 25 μl đệm SLS, 0.17 μl size standard 400, 06 - 0.8 μl sản phẩm PCR Phần mềm CEQ Genetic

System sẽ cho ra danh sách các alen của từng locus ở mỗi cá thể

9 http://aviandiv.tzv.fal.de/

Trang 26

Bảng 1 Các cặp mồi microsatellite được sử dụng trong nghiên cứu

Locus NST Trình tự mồi (5' -> 3') xuôi (ở trên), mồi ngược (ở dưới) Tmồio gắn GeneBankMã KhoảngalenMCW

TATGTATGCACGCAGATATCCADL

ATCTCAAATGTAATGCGTGCMCW

AGTTTCACTCCCAGGGCTCGMCW

GAAATGAAGGTAAGACTAGCMCW

CGATGGTCGTAATTCTCACGTMCW

TTCTCAAAACACCTAGAAGACLEI

TCTCACACTGTAACACAGTGCMCW

TGAGATTTACTGGAGCCTGCCADL

TGTCATCCAAGAACAGTGTGLEI

ACTGCATGTTCTTTGATAGGC

I, II, III: kí hiệu mix PCR đa mồi

Khoảng alen: lấy theo dự án AVIANDIV(http://aviandiv.tzv.fal.de/)

24

Trang 27

-Bảng 1 (tiếp): Các cặp mồi microsatellite được sử dụng trong nghiên cứu

Locus NST Trình tự mồi (5' -> 3') xuôi (ở trên), mồi ngược (ở dưới) Tmồio gắn GeneBankMã KhoảngalenMCW

ATTGCTTCAGCAAGCATGGGAGGAMCW

TGTCCTTCCAATTACATTCATGGGMCW

TTTCCTAACTGGATGCTTCTGADL

GAGATGTAGTTGCCACATTCCGACMCW

CTTGACAGTGATGCATTAAATGMCW

TATCCCCTGGCTGGGAGTTTMCW

AATGTTCTCATAGAGTTCCTGC

III, IV, V: kí hiệu mix PCR đa mồi

Khoảng alen: lấy theo dự án AVIANDIV (http://aviandiv.tzv.fal.de/)

2.3 Phân tích thống kê

Dữ liệu microsatellite được xử lý bởi các phần mềm FSTAT v2.9.3 [20],

Genetix v4.03 [46], Microsatellite Analyser (MSA) v4.05 [15], 2 chương trình neighbor và consensus thuộc gói phần mềm Phylip v3.69 [18]; và phần mềm Treeview v1.6.6 [29]

Trang 28

2.3.1 Các đại lượng di truyền đặc trưng cho các quần thể gà

Độ phong phú alen được tính theo công thức: , với N i là

số các alen loại i trong số 2N gen Để tính R t thì n được giữ nguyên, N sẽ là số lượng cá thể tất cả các mẫu được lập kiểu gen ở locus xem xét.

Công thức tính độ

đa dạng gen được đánh giá

là tần số của allele A i ở mẫu k và H ok là tỉ lệ dị hợp tử quan sát ở mẫu k.

Hệ số cận huyết (F is) được

tính theo công thức: , với F is k là hệ số

tần số dị hợp tử mong đợi, tính dựa trên tần số alen quan sát với giả định quần thể ở

trạng thái cân bằng Hardy - Weinberg, tại locus k ở mỗi quần thể gà.

Độ sai khác di truyền giữa các cặp quần thể gà được tính dựa trên giá trị F st theo

chương trình máy tính nên không được trình bày trong nghiên cứu này

2.3.2 Kiểm định ý nghĩa của các giá trị thống kê

thái cân bằng Hardy - weinberg Nhưng giá trị quan sát này ở các quần thể tự nhiên hầuhết đều khác 0, và ta cần phải xác định ý nghĩa thống kê của sự khác 0 đó bằng việc đặt

tương ứng với 2300, 11500 và 115000 quần thể ảo được phần mềm FSTAT giả lập phù

(1

1

221

22

u s

i n

i

N N n R

N n

Trang 29

alen giữa các cá thể ở các quần thể gà tùy theo tần số alen quan sát Một phân phối

thiết H 0 Nếu giá trị P < α, ta bác bỏ giả thiết H 0 chấp nhận đối thiết H 1: giá trị F is quan sát ≠ 0 có ý nghĩa thống kê tại mức ý nghĩa α, và quần thể không cân bằng Hardy -

sai số ngẫu nhiên, và quần thể ở trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg ở mức ý nghĩa α.

F isgà Trới ≠ 0 do sai số ngẫu nhiên F isgà Trới ≠ 0 có ý nghĩa thống kê

F isgà Móng ≠ 0 do sai số ngẫu nhiên F isgà Móng ≠ 0 có ý nghĩa thống kê

F isgà Tè ≠ 0 do sai số ngẫu nhiên F isgà Tè ≠ 0 có ý nghĩa thống kê

F isgà Tiên Yên ≠ 0 do sai số ngẫu nhiên F isgà Tiên Yên ≠ 0 có ý nghĩa thống kê

Fis gà Tò ≠ 0 do sai số ngẫu nhiên F isgà Tò ≠ 0 có ý nghĩa thống kê

tế hầu hết đều > 0, và ta cần phải xác định ý nghĩa thống kê của sự lớn hơn đó bằng

F st (Trới-Móng) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Trới-Móng) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st (Trới-Tè) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Trới-Tè) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st (Trới-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Trới-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st (Trới-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Trới-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st (Móng-Tè) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Móng-Tè) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st (Móng-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Móng-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st (Móng-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Móng-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st (Tè-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Tè-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st (Tè-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Tè-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

Fst (Tiên

Phần mềm genetix tạo một quần thể ảo bằng cách hoán vị các kiểu gen dựa theo

tần số các kiểu gen quan sát được giữa các cặp quần thể gà với nhau Sau đó nó sẽ tính

Trang 30

giá trị F st ảo, và thực hiện 10000 lần như vậy để tạo ra một phân phối 10000 giá trị F st

D S (Trới -Móng) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Trới-Móng) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Trới -Tè) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Trới-Tè) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Trới-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Trới-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Trới-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Trới-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Móng-Tè) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Móng-Tè) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Móng-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Móng-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Móng-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Móng-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Tè-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Tè-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Tè-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Tè-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

DS (Tiên

Yên-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Tiên Yên-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

Phần mềm genetix sẽ tiến hành 10000 hoán vị ngẫu nhiên các cá thể giữa 2 quần

nhận giả thiết H 0 , bác bỏ đối thiết H 1

28

Trang 31

-2.3.3 Cây quan hệ di truyền

Việc vẽ cây quan hệ di truyền được thực hiện theo quy trình sau: phần mềm

MSA tiến hành 1000 lần bootstrap tạo ra 1000 ma trận giá trị D S tính theo Nei [27];

chương trình neighbor thuộc gói phần mềm phylip dựng cây dựa vào ma trận trên theo phương pháp neighbor joining [34], dữ liệu thu được từ chương trình neighbor được

xử lý bằng chương trình consensus cũng thuộc gói phần mềm phylip; cuối cùng là phần mềm treeview được dùng để chỉnh sửa và xuất ảnh cây vừa lập được

Trang 32

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả tách ADN và phân tích đoạn

Tổng số 250 mẫu máu gà đã được tách ADN và điện di kiểm tra trên gel agarose1% Ảnh điện di (hình 9) thể hiện ADN được tập trung thành một vạch sáng rõ chứng

tỏ ADN không bị đứt gẫy trong quá trình tách Giá trị OD (260/280) thu được phần lớnđều từ 1.8 đến 2.0 nên dung dịch ADN thu được đạt yêu cầu [36]

Hình 9 Ảnh điện di ADN trên gel agaroseSản phẩm PCR đa mồi được đưa vào máy CEQ8000 để xác định kích thướctừng alen ở mỗi locus (hình 10), sau đó kết quả phân tích được tập hợp lại để tiến hànhcác phân tích thống kê

30

Trang 33

-Hình 10 Ảnh phân tích đoạn sản phẩm mix multiplex PCR 5 mồi

Hình 10 biểu thị kết quả phân tích đoạn sản phẩm PCR mix I của một cá thể gà

Tè gồm: locus MCW0295 có 2 alen (87 và 95 bp), locus ADL0112 có 2 alen (124 và130bp), locus MCW0216 có 2 alen (143 và 145bp), locus MCW0014 có 2 alen (163 và178bp), và locus MCW0098 có 1 alen (255bp)

3.2 Kết quả đánh giá các đặc điểm di truyền

3.2.1 Thống kê từng locus và quần thể gà

Dải alen quan sát được trình bày ở bảng 5, tần số alen được trình bày từ hình 11

giá trị He obs , He exp , và F is được trình bày ở bảng 7

Bảng 5 Dải alen quan sát ở 5 quần thể gà

139-141-143-145163-173-177-185255-257

97-99-101-103-105-111140-142-144

218-220-224249-255-261-263-265-273-279-283291-295-297-303-305-307-311-319111-117-119 -121

125 -129 -135 -153-157-161-167-173-179153-161-165-167-169-173

220-222-224-226-228-230-232-234-236-240266-270

Trang 34

1, 2, 3: alen riêng ở gà Trới, gà Tè và gà Tò theo thứ tự

Căn cứ vào bảng 5 ta thấy, cả năm quần thể gà nghiên cứu có 118 alen chung và

6 alen riêng trong tổng số 124 alen Quần thể gà Tò chiếm 3 alen riêng gồm alen

115bp (locus MCW0037), alen 224bp (locus MCW0206) và alen 288bp (locus

MCW0330) Quần thể gà Trới có 2 alen riêng gồm alen 106bp (locus MCW0081) và 350bp (locus LEI0166) Quần thể gà Tè có một alen riêng là alen 144bp (locus MCW0081) Hai quần thể gà Móng và gà Tiên Yên không có alen riêng nào.

Bảng 6 Số alen, độ phong phú alen trên mỗi locus ở mỗi quần thể gà

R s , R t được tính trên 29 cá thể

32

Định dạng
Số trang	69
Dung lượng	18,68 MB