Luận văn nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm

Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hô hấp tạo nêngánh nặng lớn đối với sức khỏe của cộng đồng, TCYTTG và hơn 40% quốcgia trên Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phòng vi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-o0o -NGUYỄN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến:

- TS Đỗ Tuấn Đạt, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1

- PGS TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học,trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

Là những người Thầy đã tận tình quan tâm dạy bảo cùng những kinh nghiệmquý báu và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Sinh học - trường Đạihọc Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giảng dạy và dìu dắt tôitrong suốt quá trình học tập vừa qua

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đãđộng viên, giúp đỡ và chia sẻ để tôi có đủ nghị lực hoàn thành nhiệm vụ học tập củamình

Tôi xin trân trọng cảm ơn !

Học viên

Nguyễn Thị Kim Dung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm chung của vi rút cúm 3

1.2 Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm 3

1.3 Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa 7

1.4 Quá trình nhân lên của vi rút cúm 12

1.5 Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào 14

1.6 Kỹ thuật di truyền ngược 15

1.7 Dịch tễ học bệnh cúm 17

1.8 Sinh bệnh học 22

1.9 Vắcxin cúm 22

1.10 Một số quy trình sản xuất vắcxin cúm 26

1.11 Các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin cúm 27

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

2.1 VẬT LIỆU 29

2.1.1 Tế bào 29

2.1.2 Mẫu thử nghiệm 29

2.1.3 Môi trường và hóa chất 29

2.1.4 Trang thiết bị và dụng cụ 31

2.2 PHƯƠNG PHÁP 32

2.2.1 Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) 32

2.2.2 Phương pháp chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng

kết hồng cầu 35

2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID 35

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số 38

2.2.5 Phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE 40

2.2.6 Phương pháp kính hiển vi điện tử 41

2.2.7 Phân tích xu hướng 41

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43

3.1 Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên vắcxin trong quy trình sản xuất vắcxin cúm 43

3.1.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 43

3.1.2 Kết quả kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm 49

3.2 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm 53

3.2.1 Tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất vắcxin cúm 54

3.2.2 Tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm 55

3.2.3 Tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID 58

3.2.4 Tiêu chuẩn hàm lượng protein tổng số 61

3.2.5 Tiêu chuẩn điện di trên gel SDS-PAGE……… 62

3.2.6 Tiêu chuẩn kính hiển vi điện tử………

62 KẾT LUẬN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN của vi rút cúm và chức năng 8

Bảng 1.2 Các ca nhiễm cúm A (A/H5N1) được xác định ở các nước 2003-2015 [53] 20

Bảng 1.3 Báo cáo tổng kết giám sát cúm mùa năm 2014 [3] 21

Bảng 2.1 Công thức pha môi trường MEM 32

Bảng 2.2 Công thức pha môi trường DMEM 32

Bảng 2.3 Công thức pha môi trường LH3E 33

Bảng 2.4 Pha loãng mẫu thử nghiệm và kháng nguyên chuẩn 37

Bảng 3.1 Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghiệm khác nhau (lần 1) 47

Bảng 3.2 Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghịêm khác nhau (lần 2) 47

Bảng 3.3 Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghiệm khác nhau (lần 3) 47

Bảng 3.4 Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 49

Bảng 3.5 Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hạt vi rút cúm 4

Hình 1.2 Hình ảnh vi rút cúm B 5

Hình 1.3 Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 6

Hình 1.4 Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 6

Hình 1.5 Hình ảnh vi rút cúm A/H5N1 7

Hình 1.6 Vi rút cúm A/H5N1 và quy trình vi rút cúm xâm nhập vào tế bào, nhân lên thành vi rút mới 14

Hình 1.7 Lưu hành của cúm A, cập nhật đến 17/9/2015 (thông qua các mẫu hô hấp được xác định dương tính với cúm A) 18

Hình 3.1 Tế bào MDCK kín một lớp sau 2 ngày nuôi cấy 43

Hình 3.2 Tế bào MDCK chứng và đã được gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1 sau 2 ngày, nuôi ở nhiệt độ 320C và 370C bằng môi trương MEM 44

Hình 3.3 Tế bào MDCK chứng và đã được gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1, 10-6, 10-8 sau 3 ngày, nuôi ở nhiệt độ 320C và 370C bằng môi trường MEM 45

Hình 3.4 Tế bào MDCK chứng và đã được gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1, 10-6, 10-8 sau 4 ngày, nuôi ở nhiệt độ 320C và 370C bằng môi trương MEM 46

Hình 3.5 So sánh chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm 3 loại môi trường MEM, DMEM, LH3E tại 320C sau 3 ngày, 4 ngày và 5 ngày (Trung bình 3 lần thử nghiệm) 48

Hình 3.6 Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE……….51

Hình 3.7 Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 sau 48 giờ gây nhiễm trên tế bào MDCK 52 Hình 3.8 Kết quả kính hiển vi điện tử mẫu sau tinh chế vắcxin cúm 53

Hình 3.9 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 54

Hình 3.10 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 55

Hình 3.11 Hình ảnh phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) 56Hình 3.12 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuậtngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúmA/H5N1 57Hình 3.13 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuậtngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxincúm A/H1N1 57Hình 3.14 Xác định hàm lượng kháng nguyên HA (SRID) qua phản ứng ngưng kếtmiễn dịch khuyếch tán đơn 58Hình 3.15 Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRIDtrong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 60Hình 3.16 Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRIDtrong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 60Hình 3.17 Đồ thị hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúmcủa 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 61Hình 3.18 Đồ thị hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúmcủa 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 62

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Viết tắt Tiếng Anh/ nghĩa tiếng Việt

cARN Complementary axit ribonucleic

CCID50 Cell Culture Injectious Dose 50

(Liều gây nhiễm gây hủy hoại 50% tế bào)CDC Centers for Disease Control and Prevention

(Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và dự phòng Mỹ)cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

DMEM Dulbecco’s Modififed Eagle

FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh bê bào thai)

HA Haemagglutinin (Ngưng kết hồng cầu)

HI Haemagglutination inhibitor (Ức chế ngưng kết hồng cầu)LH3E Lactalbumine Hydrolysate Eagle

(Tế bào thận chó thường trực)

MRC-5 Medical Reseach Council (Tế bào lưỡng bội phổi người)

PBS Phosphate-buffered saline

PFU Plaque Forming Unit (Đơn vị tạo đám hoại tử)

PMKC Primary monkey kidney cell (Tế bào thận khỉ tiên phát)

SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

(Điện di tren gel polyacrylamit)SRID Single Radial Immuno Diffusion

(Khuyếch tán miễn dịch vòng tròn đơn)

SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

VABIOTECH Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1

vRNP Virut ribonucleoprotein

TCYTTG Tổ chức y tế Thế giới

TPCK Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone

WHO World Health Organization

Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hô hấp tạo nêngánh nặng lớn đối với sức khỏe của cộng đồng, TCYTTG và hơn 40% quốcgia trên Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phòng vi rút cúm Do vậy, pháttriển các vắcxin cúm cho người đang đặt ra như là một yêu cầu rất cấp báchhiện nay Là một cơ sở nghiên cứu và sản xuất vắcxin cho người ở Việt Nam,Công ty TNHH MTV Vắcxin và sinh phẩm số 1 đã tiến hành xây dựng cácquy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1, cúm A/H1N1 và tiến tới

là vắcxin cúm A/H7N9 trên nuôi cấy tế bào Một trong những thông số rấtquan trọng để đánh giá chất lượng vắcxin trong phòng thí nghiệm đó là đặctính của kháng nguyên vi rút cúm có mặt trong các sản phẩm của quá trìnhsản xuất vắcxin Xây dựng các phương pháp để đánh giá, từ đó đưa ra các

1

tiêu chuẩn về chất lượng kháng nguyên là một việc làm hết sức cần thiết.Điều này giúp cho việc đánh giá được chất lượng vắcxin và kiểm tra độ ổnđịnh của quy trình sản xuất Do vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài :

“Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm” trên sản xuất vắc xin cúm

A/H5N1 và cúm A/H1N1, với 2 mục tiêu :

1 Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chấtlượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm

2 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quytrình sản xuất vắcxin cúm

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm chung của vi rút cúm

Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài,genom là ARN đơn, (-), phân đoạn, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rútcúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa Trong đó, vi rút cúm A lưu hànhphổ biến trên gia cầm, người và động vật khác như lợn, ngựa…là căn nguyên gâynên các đại dịch lớn trên toàn cầu Vi rút cúm B và C chỉ lưu hành ở người vàthường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ Các vi rút cúm A, B và C rất giốngnhau về cấu trúc Thể vi rút có chiều ngang từ 80-120 nm, và thường có hình gầnnhư tròn, ngoài ra vi rút cũng có thể hiện diện một số dưới dạng hình sợi Thể vi rútcúm được cấu tạo từ một vỏ vi rút bao gồm 2 loại glycoprotein, quấn quanh mộtphần nhân trung tâm Phần nhân trung tâm chứa bộ gene RNA và các protein khác

có chức năng đóng gói và bảo vệ thể RNA này Đối với 1 vi rút, thông thường bộgene không chỉ có 1 mảnh nucleic acid; thay vào đấy, sẽ chứa 7 hoặc 8 mảnh RNA

có chiều âm và phân đoạn Vi rút cúm A có bộ gene mã hoá cho 11 protein trên 8đoạn RNA: hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein (NP), M1,M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 và PB2

1.2 Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm

Hạt vi rút cúm có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi cóhình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm Các hạt virioncủa vi rút A và B có vỏ bao bọc Vỏ vi rút có bản chất là protein có nguồn gốc từmàng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hóa và một số proteindạng trần không được glycosyl hóa Vi rút cúm có genom nhiều đoạn, ở typ A và B

có 8 đoạn ARN(-) với tổng khối lượng 5x106, còn ở typ C có 7 đoạn Trong virion

có chứa enzyme ARN- polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme này cần cho quá trìnhphiên mã vì genom ARN chuỗi (-) Protein capsit kết hợp với ARN tạo nucleocapsitđối xứng xoắn

3

Hình 1.1 Cấu trúc hạt vi rút cúm Error: Reference source not found

Nucleocapsit được bao bọc bởi màng protein nền M1 (M: matrix), phía ngoàimàng được bao bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chấtcủa tế bào chủ Protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênhion, làm cho pH của endosom thay đổi

Bề mặt vi rút có hai loại gai mọc nhô ra: hemaglutinin (H) và neuraminidaza(N) Gọi là hemaglutinin vì vi rút gây ngưng kết hồng cầu ở một số loài

Gai H dài 10 nm gồm 3 tiểu đơn vị glycoprotein giống nhau gộp lại (trimer).Mỗi tiểu đơn vị cấu tạo gồm 2 chuỗi polypeptit kí hiệu là HA1 và HA2, gắn vớinhau bởi cầu nối disunphua Trong hạt vi rút, phân tử hemaglutinin gắn vào mànglipit của vỏ ngoài ở vùng kỵ nước, phía đầu –COOH của HA2 Epitop của khángnguyên hemaglutinin rất dễ bi biến đổi do luôn có sự biến đổi trong ARN genom,làm thay thế axit amin tại một số vị trí trên phân tử HA1 Sự thay đổi này nằm ở vịtrí gắn hemaglutinin vào thụ thể của tế bào HA chứa peptit dung hợp, khi ở pHtrung tính vùi vào trong gai, nhưng ở pH thấp thì peptit lại nhô ra ngoài Các peptitdung hợp tạo lỗ, lồng vào lớp lipit kép của màng tế bào chủ làm cho màng tế bàochủ và vỏ ngoài của vi rút dung hợp với nhau.

Xen giữa các gai H là các N hình nấm Đầu gai có cấu trúc hình hộp do 4 tiểuđơn vị có dạng hình như cầu giáp nối với nhau mà thành Đầu được nối với cuốngchứa vùng kỵ nước, nhờ thế mà gai N cắm sâu vào vỏ ngoài của vi rút

Thụ thể của tế bào dành cho hemaglutinin có cấu tạo từ axit sialic (còn gọi làneuraminic) liên kết với gốc đường trong glycol protein bằng dây nối glycozit.Enzym neuraminic (silidaza) phân giải thụ thể ở màng nhầy đường hô hấp bằngcách cắt liên kết glycozit, giải phóng axit neuraminic Động tác này cho phép vi rút

đi qua màng nhầy và thoát khỏi các chất ức chế “không đặc hiệu” Neuraminidazaphá hủy thụ thể của hemaglutinin trên bề mặt hồng cầu mặc dù tế bào này khôngphải là đối tượng gây nhiễm Neuraminidaza cũng tham gia vào giải phóng vi rút rakhỏi tế bào

Vi rút typ A có 16 loại gai H và hầu hết các loại gai này có ở vi rút gâynhiễm ở động vật (chim, gà, vịt, ngỗng, gà tây, lợn ngựa và một số loại động vật có

vú khác) Ba loại gai H quan trọng có ở vi rút gây bệnh cho người là H1, H2 và H3.Trước đây có H0 và HW (H lợn), nhưng về sau 2 gai này được coi là H1

Có 9 loại gai N, trong đó N1 và N2 là quan trọng nhất vì gây bệnh chongười

5

Hình 1.2 Hình ảnh vi rút cúm

B Error: Reference source not found.

Vi rútcúm B vớivirion dạng hìnhcầu điển hình với đường kính hạt vi rút thay đổi từ 80- 120nm Bên ngoài vỏ baongoài hạt vi rút là các gai ngắn dài khoảng 12nm rõ nét bám xung quanh NhuộmPTA 0,25% (thước đo 100nm)

Hình 1.3 Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 Error: Reference source not

found.

Hình 1.4 Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 Error: Reference

source not found.

Vi rút cúm A/H1N1 đadạng về hình thái (hình cầu- 1.3.;hình que- 1.4.) và kích thước thay đổi, đường kính hạt vi rút từ 80-120nm, dài đến

1μm Trên bề mặt hạt vi rút là các gai ngắn xếp đều đặn Nhuộm PTA 0,25% (thước

đo 100nm)

Reference source not found

Vi rút cúm A/H5N1 với hình dạng và kích thước thay đổi: hình cầu, hình

que, đường kính hạt vi rút khoảng 100nm, dài đến 1μm Các gai ngắn sắp xếp đềutrên bề mặt hạt vi rút với chiều dài của gai khoảng 17nm Nhuộm PTA 0,25%(thước đo 100nm)

1.3 Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa

Hệ gen của vi rút cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi vi rút cúm C có 7đoạn gen ( không có gen NA) Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm đã được tìm hiểu nhờ

kỹ thuật phân tích điện di virion ARN vi rút trên gen polyacrylamit Cấu trúc gencủa vi rút cúm như sau: Đọan gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn gen 2 mã hóa cho PB1,đoạn gen 3 mã hóa cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2 Trình tự nucleotit của ARN vi rút cúmPR8/34 và rất nhiều phân typ khác được công bố từ năm 1982 Error: Referencesource not found Vi rút R8/34 có 13.588 nucleotit

7

Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN của vi rút cúm và chức năng Error: Reference source

Chiều dàichuỗipolypeptit(axit amin)

Sốphân tửtrên 1virion

Chức năng

Tìm thấy trong quá trình tổnghợp ARNtt Đóng vai trò làmenzyme phiên mã: gắn kết, kéodài, tham gia vào quá trình sinhtổng hợp vi rút thế hệ mới trong

tế bào chủ

3 PA 84 200 2233 716 30-60 Tìm thấy trong quá trình tổng

hợp ARN virion (vARN)

Phân tử có cấu trúc trimer, cắtbởi enzyme thủy phân thànhHA1 và HA2, là cơ sở cho khảnăng nhiễm trùng HA gắn với tếbào túc chủ, dung hợp giảiphóng phức hợp RNP, mở đầucho quá trình nhân lên của vi rút

Là thành phần protein chủ yếucủa phức hợp RNP, chứa mộttrong các khàng nguyên đặc hiệutyp, phân biệt 3 typ cúm A,B,C

6 NA 50 087 1413 454 100

Phân tử có cấu trúc tetramer,thủy phân bằng protease, chophép vi rút tiến qua lớp niêmmạc tới các tế bào của đường hôhấp trong quá trình nhiễm trùng.Loại bỏ phân tử axit sialic củaphân tử HA từ các virion mớiđược tổng hợp, làm lộ HA rangoài, tăng khả năng nhiễmtrùng

tế bào nhiễm vi rút

130-200

Đoạn ARN đơn của vi rút cúm C mã hóa cho protein liên kết

haemaglutinin-esteraza (HEF) có chức năng gắn dính vào thụ thể (receptor), hoạt động hòa mạng

của HA và phá hủy thụ thể của NA, trong khi ở vi rút cúm A và B những đặc tính

do các đoạn gen riêng biệt mã hóa Chiều dài của các đoạn gen và các protein mã

hóa được liệt kê trong bảng trên Đoạn gen ngắn không mã hóa ở mỗi đầu bao gồm

9

chuỗi 11-13 nucleotit tại đầu 5’ và 9-12 nucleotit tại đầu 3’ có tính ổn định cao hơn

so với các đoạn gen khác và giống nhau ở cả 3 loại vi rút A, B và C Error:Reference source not found

Ba gen lớn nhất mã hóa cho các thành phần của ARN polymeraza PB1, PB2

và PA của vi rút A và vi rút cúm B, C Error: Reference source not found Đoạn gen

1 và 2 đều dài 2341 nucleotit mã hóa cho protein PB2 gồm 759 axit amin và PB1

757 axit amin Đoạn gen 3 dài 2233 nucleotit mã hóa cho protein PA có 716 axitamin

NP là protein cấu trúc chính tạo thành RNP NP còn là kháng nguyên đặchiệu typ, khác nhau giữa vi rút cúm A, B và C NP được đoạn ARN 5 dài 1565nucleotit mã hóa Error: Reference source not found NP chứa 498 axit amin và cótrọng lượng phân tử 56.101 dalton NP của vi rút cúm B chứa 560 axit amin vàtương đồng 47% so với vi rút cúm A trong khi NP của vi rút cúm C có 565 axitamin và có một số vùng tương đồng với vi rút cúm A và B Error: Reference sourcenot found

Tên gọi của protein HA (hemagglutinin) xuất phát từ khả năng gây ngưngkết hồng cầu của vi rút bằng cách gắn với các thụ thể đặc biệt có chứa axit sialic

HA có 3 vai trò quan trọng trong quá trình sao chép vi rút:

1 HA gắn với thụ thể có chứa axit sialic trên bề mặt tế bào và tạo thành sự gắnkết giữa vi rút và tế bào

2 HA chịu trách nhiệm cho sự xâm nhập của vi rút vào tế bào bằng cách giántiếp tạo nên sự hòa mạng endocytose của vi rút và màng nội bào làm chonucleocapsit vi rút giải phóng vào trong bào tương

3 HA là kháng nguyên chính tạo nên kháng thể trung hòa và các vụ dịch cúmđều liên quan đến sự thay đổi cấu trúc kháng nguyên

Đoạn ARN 4 có chiều dài 1.742 đến 1.778 nucleotit và mã hóa cho 562 đến

566 axit amin HA do đoạn ARN 4 mã hóa và được tổng hợp nên ribosom gắnmàng và di chuyển vào lumen của lưới nội chất (ER) tế bào bị nhiễm như làpolypeptit đơn HA0 (trọng lượng phân tử 76.000 dalton) Phụ thuộc vào phân typ vi

rút, loại tế bào chủ và điều kiện nuôi cấy HA tồn tại cả 2 dạng: Dạng tiền thânkhông phân tách HA0 hoặc dạng phân tách với hai chuỗi có cầu nối disulfit (HA1 cótrọng lượng 47.000 dalton và HA2- 29.000 dalton) Quá trình phân tách là điều kiệnquyết định để vi rút có khả năng lây nhiễm và do vậy liên quan đến độc tính và khảnăng lây truyền Error: Reference source not found HA chính là đoạn gen đầu tiêncủa vi rút cúm được xác định trình tự HA1 có từ 319 đến 326 axit amin và HA2 có

từ 221 đến 222 axit amin Tùy thuộc vào các phân typ HA, số lượng các axit amin

bị phân tách giữa HA1 và HA2 là 1 đến 6 HA nguyên vẹn có thể tách chiết từ hạtvirion vi rút cúm hoặc từ tế bào bị nhiễm bằng chất tẩy hòa tan màng, khi chất tẩy

bị loại bỏ, vùng transmembrane kỵ nước kết hợp lại và tạo thành HA hình hoa thị.Tuy nhiên, xử lý vi rút bằng promelin sẽ giải phóng ra HA bảo toàn tính khángnguyên và cấu trúc ba chiều, có khả năng hòa tan trong nước và chứa toàn bộ HA1

cùng với 175 axit amin đầu tiên trong số 221 axit amin của HA2 Error: Referencesource not found Vị trí gắn thụ thể HA nằm ở vùng ngoại biên của các tiểu đơn vịphân tử Cấu trúc vị trí đó có tính đồng dạng cao giữa các phân typ (Tyr- 98, Tyr –

153, His – 183, Glu – 190, Leu – 194) Bởi vì tính đặc hiệu gắn thụ thể khác nhaugiữa khí quản người (α 2, 3) và khí quản lợn (α 2, 3 và α 2, 6), số lượng các phân tử

có thể chuyển từ loài này sang loài khác và có thể bị giới hạn Sự phân tác HA0

thành HA1 và HA2 là cần thiết để chuyển dạng pH thấp và do vậy cần thiết đối vớihoạt tính gây nhiễm của vi rút Những HA đó đều chứa chuỗi R-X-K-/R-R ở cầu nốipeptit và được phân tách trong tế bào bằng furin, một proteaza của mạng trans-Golgi HA chỉ có arginnine đơn ở cầu nối peptit không bị phân tách khi nuôi cấytrên tế bào (trừ chủng A/WSN/33) nhưng sẽ bị phân tách bởi tpypsin ngoại sinh.Khi nuôi cấy trên trứng gà có phôi, HA có arginine đơn ở cầu nối peptit sẽ bị phântách do proteaza Error: Reference source not found Nhiều nghiên cứu cho rằng vịtrí phân tách có liên quan đến độc tính vi rút và chủng vi rút độc lực có chứa kiểunhận biết furin trong khi chủng vi rút không độc lực chỉ chứa arginine đơn Tuynhiên cũng có một số chủng cúm H5 không độc lực có vị trí nhận biết furin Nhữngchủng không độc lực này có chuỗi oligosaccharit ở gần vị trí phân tách, điều này có

11

ảnh hưởng đến hoạt tính của proteaza khi phân tách và chuỗi này không tìm thấy ởnhững chủng H5 độc lực

Trong các chủng vi rút cúm người chỉ có A/WSN/33 có khả năng nuôi cấytrên nhiều loại tế bào mà không cần có trypsin và các nghiên cứu về hệ gen đã chothấy NA của WSN cần thiết cho sự phân tách HA của WSN

NA là glycoprotein thứ hai đặc hiệu cho phân typ của vi rút cúm A, B.NA/PR/8/34 đoạn gen ARN 6 có 1413 nucleotit mã hóa cho 453 axit amin

Đoạn ARN thứ bảy mã hóa cho 2 protein M1 và M2 Đoạn có 1027 nucleotit

mã hóa cho M1 có 252 axit amin, trọng lượng phân tử 27.801 dalton Error:Reference source not found M1 là kháng nguyên đặc hiệu typ của vi rút cúm và cótính ổn định giữa các phân typ của vi rút cúm và có tính ổn định giữa các phân typError: Reference source not found Protein M2 có hoạt động kênh trao đổi ion nhờhoạt hóa pH Kênh này được chặn đặc hiệu bởi thuốc kháng vi rút cúm amantadin.Hoạt động của kênh ion cần thiết cho việc bỏ lớp ngoài của vi rút trong khoang nộibào của tế bào bị nhiễm Đột biến của vùng M2 liên quan đến việc kháng amantadinError: Reference source not found

Đoạn ARN 8 của vi rút cúm A, B và đoạn ARN 7 của vi rút cúm C mã hóacho 2 loại protein NS1 và NS2 NS1 protein có trọng lượng phân tử 26.000 dalton.NS1 là protein đa chức năng trong chu trình sống của vi rút cúm NS2 protein cótrọng lượng phân tử 11.000 tồn tại trong virion (130-200 phân tử) và tạo thành phứchợp với M1

1.4 Quá trình nhân lên của vi rút cúm

Trước hết gai H của vi rút gắn vào thụ thể có chứa axit neuraminic của tế bàochủ, rồi tiến hành nhập bào tạo endosom Tiếp đó, xảy ra quá trình dung hợp giữa

vỏ ngoài của vi rút với màng endosom Điều này thực hiện được nhờ gai H chồi lênkhi pH trong endosom thấp Sau khi dung hợp ribonucleprotein và ARN-polymeraza chui vào tế bào chất Việc “cởi áo” làm hoạt hóa ARN- polymeraza của

vi rút Phân tử mARN được phiên mã trong nhân từ các chuỗi ARN khuôn đơn, (-)của vi rút khi sử dụng mồi là đoạn 10 – 13 nucleotit cắt ra tử đầu 5’ của mARN có

gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi PolyA cũng lấy từ mARN của tế bào chủ.Enzym cắt mồi là endonucleaza do vi rút mang theo Phân tử mARN mới hoàn thiệncủa vi rút ra khỏi nhân, vào tế bào chất để tiến hành sao chép genom trong nhân.

Kết quả quá trình phiên mã từ 8 đoạn ARN genom (-) tạo ra 10 phân tửmARN, bởi vì đoạn 7 và 8 mỗi đoạn phiên mã tạo ra 2 phân tử mARN 6 phân tử (1– 6) dịch mã cho ra 6 protein, còn 2 phân tử (7 – 8) do có 2 khung đọc nên mỗiphân tử tạo ra 2 phân tử protein Điều này được thực hiện không phải do sử dụngmARN đa gen (polycistronic) thật sự như ở prokaryota, bởi vì riboxom ở eukaryotechỉ nhận diện bộ ba khởi đầu AUG nằm sát đầu 5’ của mARN

Như vậy từ 1 ARN đã cho ban đầu, chúng chỉ tạo ra được 1 protein Haiđoạn 7 và 8 tiến hành phiên mã cho ra 2 mARN có chiều dài đủ Mỗi trường hợptổng hợp một loại protein bổ sung cho dịch mã từ mARN đã được chế biến nhờ bộmáy cắt ghép (splicing) của tế bào chủ Giống như các gen chồng lớp, một lần nữađây là ví dụ cho thấy các vi rút ARN đã tận dụng tối đa genom nhỏ bé của mình nhưthế nào

Khác với đa số vi rút ARN, protein cấu trúc sau khi được tổng hợp lại đượcchuyển vào nhân và quá trình lắp rắp ribonucleoprotein xảy ra trong nhân Cácglycoprotein HA và NA được tổng hợp trên mạng lưới nội chất hạt sau đó được dichuyển tới các vùng chuyên biệt trên màng sinh chất Protein M cũng di chuyển đếnmàng và liên kết với màng nhờ gai HA và NA Ribonucleoprotein và ARN-polymeraza cũng từ nhân di chuyển ra tế bào chất rồi tới màng sinh chất, nơi đã cóprotein M và các gai HA, NA Virion ra khỏi tế bào chất theo lối nảy chồi với sựtham gia của neuraminidaza Nếu enzyme này bị ức chế thì virion không được giảiphóng

Genom phân nhiều đoạn của vi rút cúm là nguyên nhân dẫn đến sự thay đổikháng nguyên liên tục Có 2 kiểu thay đổi kháng nguyên:

- Thay đổi lớn: Hiện tượng hoán vị kháng nguyên (antigenic shift) xảy rakhi có hai hay nhiều chủng vi rút, với nhiều đoạn ARN khác biệt nhau về mặt ditruyền, cùng lúc xâm nhiễm vào một tế bào Các đoạn genom hoán vị với nhau Ví

13

dụ: thay đoạn mã hóa cho hemaglutinin của người bằng đoạn của động vật, kết quả

là tạo ra chủng vi rút mới với kháng nguyên H thay đổi, làm cho vi rút kháng lạikháng thể đã được hình thành trong đáp ứng miễn dịch lần trước

Biến chủng vi rút có thể lây nhiễm vào vật chủ mới mà chủng bố mẹ chúngkhông có khả năng gây nhiễm Sự hoán vị kháng nguyên được coi là nguyên nhângây ra các vụ đại dịch cúm

- Thay đổi nhỏ: Một khái niệm khác liên quan đến sự thay đổi khángnguyên nhưng ở mức độ thấp gọi là biến thể kháng nguyên (antigenic drift) Do độtbiến kháng nguyên xảy ra ở gen mã hóa cho hemaglutinin dẫn đến sự thay đổi một

số axit amin trong protein hemaglutinin (mặc dù về cơ bản hemaglutinin vẫn làprotein như cũ) Chủng vi rút biến thể kháng nguyên trở thành chủng được chọ lọctrong quần thể do chúng có khẳ năng nhiễm vào ký chủ chưa miễn dịch Hiệntượng biến thể kháng nguyên tăng lên từ mùa này sang mùa khác đã gây khó khăncho việc sản xuất vắcxin hữu hiệu phòng ngừa dịch cúm Sự biến thể kháng nguyên

là nguyên nhân gây ra các vụ dịch nhỏ, tản phát Error: Reference source not found

Hình 1.6 Vi rút cúm A/H5N1 và quy trình vi rút cúm xâm nhập vào tế bào,

nhân lên thành vi rút mới 1.5 Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào

Vi rút cúm đầu tiên được nuôi trên trứng gà có phôi Sau này, các vi rút cúm

có thể được nuôi trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiênphát Việc nuôi cấy vi rút trên trứng gà có phôi vẫn được lựa chọn làm quy trình sảnxuất vắcxin cúm trên thế giới Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào như thận khỉ tiênphát (PMKC) hay thận chó Madin- Darby (MDCK) thường được dùng để phân lập

vi rút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người Tế bào MDCK có độ nhạy 100% trongphân lập vi rút cúm A trong khi đó độ nhạy của Vero chỉ 71,4% và MRC-5 là57,1%

Sự phát triển của vi rút trên nuôi cấy tế bào và tạo các đám hoại tử trong một

số dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận bê, thận chuột đồng, thận gà.Ngoài ra nếu sử dụng các dòng tế bào thường trực thì trypsin phải được bổ sung đểhoạt hóa các phân tử protein HA trong quá trình xâm nhập vào tế bào chủ của vi rút

1.6 Kỹ thuật di truyền ngược

Giống như hầu hết các loại vi rút ARN sợi (-), vi rút cúm nhân lên trongnhân của tế bào bị nhiễm Sau khi dung hợp với màng tế bào, phức hợp củaribonucleoprotein của vi rút (vRNP) được phóng thích vào tế bào chất Phức hợpvRNP, bao gồm ARN của vi rút (vARN), nucleoprotein (NP) và 3 loại proteinpolymeraza (PA, PB1, PB2), được chuyển vào nhân và quá trình phiên mã tái bảndiễn ra tại đây, vARN sợi (-) không thể trực tiếp làm khuôn tổng hợp protein màvARN được bao bọc trong NP phải được phiên mã thành mARN nhờ phức hợppolymeraza của vi rút Trong quá trình tái bản vARN được sử dụng làm khuôn đểtổng hợp sợi ARN bổ sung (cARN), sợi cARN này lại được làm khuôn để tổng hợpsợi vARN Như vậy, đơn vị chức năng tối thiểu để vi rút cúm có thể tái bản làvRNP

Những nỗ lực tạo ra vi rút cúm trong phòng thí nghiệm từ những năm 1980khi Plotch và Beaton, Krug tinh khiết được vRNP từ những vi rút bị phá hủy bằng

chất tẩy rửa và từ tế bào bị gây nhiễm Đến cuối thập niên 80, Parvin và sau đó làHonda đã thành công trong việc tái tạo phức hợp RNP có hoạt tính trong phòng thínghiệm từ những thành phần polymeraza NP riêng lẻ Từ đấy rất nhiều hệ thống ditruyền ngược để tạo ra vi rút cúm đã được phát triển Hệ thống di truyền ngược đầutiên được Palese và cộng sự thiết lập vào năm 1989 Error: Reference source notfound

Một đoạn ARN tách chiết từ vi rút hoặc phiên mã từ cDNA trong phòng thínghiệm được ủ với polymeraza của vi rút (PA, PB1, PB2) và nucleoprotein (NP)tinh sạch để tái tạo ra phức hợp vRNP Phức hợp rRNP này được biến nạp vào tếbào eukaryote đã bị gây nhiễm bằng một chủng vi rút cúm trợ giúp từ trước, vi rútcúm trợ giúp có nhiệm vụ cung cấp các vRNP còn lại Kết quả tạo ra một chủng virút cúm tái tổ mới mang 7 đoạn ARN của vi rút cúm trợ giúp vào một đoạn ARNđược biến nạp vào Năm 1994, Hobom và các đồng nghiệp Error: Reference sourcenot found đã sử dụng enzyme ARN polymeraza I để tổng hợp ARN của vi rút cúmbên trong tế bào, thiết lập một hệ thống khác để tạo ra vi rút cúm mà vẫn sử dụngtới vi rút trợ giúp Tuy nhiên công trình này đã thúc đẩy việc ứng dụng kỹ thuật ditruyền ngược trong các nghiên cứu về vi rút cúm

Trong các kỹ thuật di truyền ngược sau này, vARN được tạo dòng cDNAtrong các plasmid có khả năng tổng hợp vARN và các protein của vi rút cúm Vìvậy các gen của vurus cúm có thể được chủ động làm biến đổi theo ý muốn Cácplasmit mang các cDNA được biến nạp vào tế bào Bên trong tế bào, vARN và cácprotein của vi rút được tổng hợp, sự lắp ráp các vARN và các protein dẫn đến sựhình thành vi rút mới bên trong tế bào Các vi rút này có khả năng nhân lên và pháttriển bình thường như một vi rút được phân lập Năm 1999, Neumann và cộng sự

đã tạo ra thành công vi rút cúm từ 17 plasmit ( 8 plasmit mã hóa tổng hợp 8 ARNcủa vi rút, 9 plasmit biểu hiện tổng hợp 9 loại protein) Sau đó hệ thống này đượccải tiến, rút số plasmid phải sử dụng xuống 12

Năm 2000, Hofmann và cộng sự đã cải biến hệ thống ARN polymeraza Ithành hệ thống ARN polymeraza I/II Đoạn cDAN được cài đặt giữa trình tự

17

promoter ARN polymeraza II (cytomegalovi rút early promoter) và trình tự poly(A) Do đó, quá trình phiên mã bằng ARN polymeraza I tạo ra ARN sợi âm của virút, còn quá trình phiên mã bởi ARN polymeraza II tạo ra sợi mARN Như vậy cảvARN và mARN được tổng hợp cùng từ một khuôn, kết quả đã làm giảm số lượngplasmid cần dùng từ 12 xuống 8 Vì vậy, hệ thống này có thể sử dụng cho nhiềudòng tế bào hơn Đến năm 2005, Neumann và cộng sự đã thiết lập được một hệthống di truyền ngược mới chỉ sử dụng từ 3 đến 4 plasmit Đây là hệ thống mà rấtnhiều cấu trúc phiên mã bởi ARN polymeraza I được kết hợp lại với nhau trongcùng một plasmid, cũng như các cấu trúc phiên mã bởi ARN polymeraza II đượckết hợp vào một plasmid khác.

Sự thành công của hệ thống các plasmid mang nhiều trình tự AND mã hóacho nhiều ARN, đã gợi ý rằng có tạo ra một hệ thống di truyền ngược mới chỉ cómột plasmid bằng cách kết hợp hệ thống trên và hệ thống ARN polymeraza I/II Khi

đó, plasmid duy nhất được thiết kế gồm 4 đơn vị phiên mã ARN polymeraza I/IIcho các cDNA mã hóa PA, PB1, PB2, NP; 4 đơn vị phiên mã ARN polymeraza Icho 4 cDNA mã hóa cho HA, NA, M, NS

Trong những năm gần đây kỹ thuật di truyền ngược đã được áp dụng để tạo

ra các chủng vi rút cúm có sự sắp xếp lại các đoạn gen và có khả năng nhân lên rấtmạnh Tùy từng trường hợp, các chủng vi rút cúm có tỷ lệ sắp xếp lại gen theo tỷ lệ6:2 đã được tạo ra Trong đó các đoạn gen HA và NA của nhiều chủng vi rút cúmhoang dại khác nhau (bao gồm các chủng cúm người và gia cầm như A/H1N1,A/H3N2, A/H5N1 và H5N3) còn 6 đoạn còn lại là của chủng PR8 Quy trình kỹthuật di truyền ngược có sự tham gia của các tế bào động vật như các tế bào 293T,hỗn dịch tế bào 293T/MDCK và tế bào Vero Error: Reference source not found.Tuy nhiên nếu chủng vi rút được tạo ra nhằm mục đích làm chủng sản xuất thì theoTCYTTG khuyến cáo, không sử dụng tế bào 293T trong kỹ thuật di truyền ngượcError: Reference source not found

Kỹ thuật di truyền ngược đã được ứng dụng vào nhiều nghiên cứu, lĩnh vựckhác nhau Những chủng vi rút giảm độc lực được tạo bởi kỹ thuật di truyền ngược

có thể được sử dụng như là vắcxin sống để tạo kháng thể bảo vệ kháng lại vi rúthoang dại Vi rút cúm tạo miễn dịch dịch thể, đáp ứng miễn dịch niêm mạc và miễndịch tế bào mạnh Hơn nữa, vi rút cúm là vi rút không gây ung thư Kháng thểkháng lại các phân typ khác nhau của vi rút cúm không có hoặc rất ít miễn dịchchéo do vậy có thể dễ dàng vượt qua hàng rào bảo vệ của kháng thể có sẵn đối vớicác vector trong vật chủ Những đặc tính quý nêu trên đã mang lại khả năng có thể

sử dụng vi rút cúm như một vector vắcxin tiện lợi Để tiêm chủng nhắc lại có hiệuquả, có thể dùng các phân typ vi rút cúm khác nhau sản xuất ra cùng một loại khángnguyên Một vị trí đã được xác định có thể dung hòa kháng nguyên ngoại lai là vị tríkháng nguyên B của phân tử HA Vi rút cúm phân typ H1 và H3 đã được sử dụng

để biểu thị trình tự kháng nguyên ELDKWAS của vi rút HIV Vi rút cúm cũng được

sử dụng như là vector biểu thị kháng nguyên sốt rét và Pseudomonas aeruginosa

Chủng vi rút cúm tạo bởi kỹ thuật di truyền ngược còn được sử dụng để nghiên cứuchức năng vi rút

1.7 Dịch tễ học bệnh cúm

Dịch cúm xảy ra theo xu hướng khác nhau ở các năm, thường xảy ra vàomùa đông ở bắc và nam bán cầu, nhưng xuất hiện hàng năm ở khu vực nhiệt đới Virút cúm có khả năng tấn công cao, nên tỷ lệ mắc bệnh do vi rút cúm trong dân số làtương đối cao Tăng tỷ lệ mắc và tử vong do cúm xảy ra ở cực trị của nhóm tuối và

ở người đang mắc sẵn một bệnh khác

Mô hình dịch tễ phản ánh sự thay đổi đặc điểm kháng nguyên của vi rút cúm,

và sự lây lan của bệnh phụ thuộc vào nhiếu yếu tố, bao gồm khả năng lây nhiễm và

sự mẫn cảm của nhóm dân cư Đặc biệt ở vi rút cúm A có khả năng thay đổi định kỳlớp vỏ kháng nguyên glycoproteins như hemagglutinin và neuraminidase Trong sốcác vi rút cúm nhóm A ảnh hưởng đến sức khỏe ở người có ba phân typ chính củahemagglutinin (H1, H2, và H3) và ba phân typ chính của neuraminidase (N1 và N2)

đã được công bố Vi rút cúm B ít có sự thay đổi về đặc điểm kháng nguyên

TCYTTG ước tính hàng năm có khoảng 3-5 triệu người mắc và 250.000 –500.000 người tử vong vì cúm Error: Reference source not found Cúm liên tục lưu

19

hành ở Nam bán cầu, tăng cường ở châu Đại Dương, đạt đỉnh hoạt động tại Nam

Mỹ, và giảm ở Nam Phi Error: Reference source not found

Hình 1.7 Lưu hành của cúm A, cập nhật đến 17/9/2015 (thông qua các mẫu

hô hấp được xác định dương tính với cúm A) Error: Reference source not

found

Ở các nước thuộc Nam bán cầu, hoạt động của virut cúm vẫn ở mức thấp,thường xảy ra vào thời điểm giao mùa Cúm A được phát hiện rải rác Error:Reference source not found

Trong vùng nhiệt đới châu Á, các quốc gia ở Nam Á và Đông Nam Á chobiết cúm lưu hành ở mức độ thấp mặc dù Ấn Độ đã báo cáo có sự gia tăng nhỏ củacúm A (A/H1N1) Ở miền nam Trung Quốc, cúm A (A/H3N2) chiếm ưu thế Error:Reference source not found Các nước ôn đới Nam Mỹ, ILI và SARI lưu hành ở

mức thấp và xu hướng giảm tiếp tục, ngoại trừ ở Chile hoạt động của virus đường

hô hấp vẫn cao Vi rút cúm A chiếm ưu thế trong khu vực Error: Reference sourcenot found Ở Nam Phi, độ lưu hành của cúm giảm, với các loại cúm B chiếm ưu thếtrong những thời gian gần đây Error: Reference source not found Ở Australia, cúm

A (A/H3N2) và B dường như vẫn tăng Tại New Zealand, hoạt động của cúm có thể

đã đạt đỉnh vào tuần thứ hai của tháng tám với cúm A (A/H3N2) và cúm B Error:Reference source not found

Trung tâm Cúm Quốc gia (NIC) và các phòng thí nghiệm cúm quốc gia khác

từ 77 quốc gia, hoặc vùng lãnh thổ đã báo cáo dữ liệu cho FluNet trong khoảng thờigian từ 10/8/2015 đến 23/8/2015 (số liệu tính đến ngày 07/9/2015)

TCYTTG đã xác nhận nhiễm cúm A/H5N1 ở các nước Azerbaijan,Bangladesh, Cambodia, Canada, China, Djibouti, Egypt, Indonesia, Iraq, Laos,Myanmar, Nigeria, Pakistan, Thailand, Turkey, và Việt Nam Một phụ nữ ởCanada nhiễm cúm A (A/H5N1) đã tử vong vào tháng 1/2014 sau khi trở về từ BắcKinh (Trung Quốc) Error: Reference source not found Tuy nhiên số trường hợpnhiễm cúm A (A/H5N1) được báo cáo nhiều nhất ở Ai Cập từ 12/2014 đến nay là

116 trường hợp, trong đó có 36 ca tử vong (từ giữa 1/2015 đến cuối 3/2015) Error:Reference source not found

Tháng 12/2013, nhiễm cúm A (H10N8) đầu tiên được phát hiện ở một ngườiphụ nữ 73 tuổi sống ở Trung Quốc Bốn ngày trước khi phát bệnh, bệnh nhân đã đichợ nơi có bán chim sống Bệnh nhân đã bị viêm phổi nặng và qua đời sau khi nhậpviện vài ngày Trước đây, cúm A châu Á (H10N8) được phát hiện ở chim hoang

dã và chim nuôi sống ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ, Canada, Ý, và ThụyĐiển Các gen của vi rút phân lập ở người bệnh đều có nguồn gốc châu Á, trong đó

6 gen có nguồn gốc từ chủng vi rút cúm A/H9N2 lưu hành ở gia cầm Trung Quốc,gen H10 và H8 phát hiện ở chim Nhiễm vi rút cúm A châu Á (H10N7) cũng đượcphát hiện ở Ai Cập và Australia Error: Reference source not found

Cúm A châu Á H7N9 đầu tiên được xác định ở miền đông Trung Quốc vào19/2 2013 Error: Reference source not found Sau đó các trường hợp nhiễm H7N9

21

được phát hiện ở Trung Quốc, Hồng Công, Đài Loan, Malaysia, và Canada Bệnhnhân ở Malaysia và Canada đều nhiễm H7N9 sau khi du lịch ở Trung Quốc Error:Reference source not found Từ tháng 2/2013 đến 5/2013 có 133 ca nhiễm cúmH7N9 Error: Reference source not found, số nhiễm cao nhất ở tháng 4/2013 vàgiảm dần Tăng số ca nhiễm mới xuất hiện cuối 2013 và đầu 2014, cuối 2014 vàđầu 201 Kể từ khi ca bệnh đầu tiên được công bố cho tới nay có trên 570 ca nhiễmH7N9 được xác định.

Bảng 1.2 Các ca nhiễm cúm A (A/H5N1) được xác định ở các nước 2003-2015

Error: Reference source not found

Nhiều tài liệu lịch sử ghi nhận rằng đại dịch cúm đầu tiên được xác định xảy

ra vào năm 1510 (6) Đại dịch là dịch bệnh toàn cầu Đại dịch cúm xảy ra khi mộtloại vi cúm mới xuất hiện và con người không có khả năng miễn dịch đối với loại virút này Trong lịch sử, thế kỷ 20 chứng kiến ba đại dịch cúm Đại dịch cúm bùngphát năm 1918 đặc biệt nghiêm trọng về độc tính và phạm vi lây nhiễm do chủngvirut cúm A hoán chuyển kháng nguyên hemagglutinin (H1) và neuramidase (N1),

vi rút cúm A (H11N1) làm chết ít nhất 40 triệu người trên Đại dịch cúm chấu Ánăm 1957 do chủng vi rút cúm A (H2N2) làm chết khoảng 2 triệu người Đại dịch

cúm năm 1968 do chủng vi rút cúm A (A/H3N2) bùng phát từ Hồng Kông lan rachâu Á làm chết khoảng 700.000 người Chủng vi rút cúm A (A/H3N2) sau khi gâyđại dịch thì giảm dần độc lực và trở thành một chủng cúm mùa hiện nay.

Năm 2011, Trung Tâm Kiểm Soát và Phòng Ngừa Dịch Bệnh (CDC, Mỹ)thông báo về 300 ca bệnh do một biến chủng vi rút cúm A (A/H3N2) hình thành từ

sự tổ hợp di truyền giữa vi rút cúm A (A/H3N2) ở lợn với vi rút cúm A (A/H1N1)(10-16) Tuy nhiên, vi rút cúm A (A/H3N2) không thấy truyền trực tiếp từ ngườisang người Tất cả các bệnh nhân đều tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với lợn

Tại Việt Nam hội chứng cúm (Influenza like illness ILI) là một trong 26bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ mắc cao nhất trong các bệnh truyền nhiễm gây dịch ởnước ta Từ năm 2006 đến nay, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương đã triển khai hệthống giám sát cúm trọng điểm để phát hiện và xác định các chủng vi rút cúm gâybệnh hàng năm ở 15 điểm trên toàn quốc

Bảng 1.3 Báo cáo tổng kết giám sát cúm mùa năm 2014 Error: Reference

source not found

43 (27.9)

73 (41)

71 (40.1)

54 (24.5

19 (13.2)

19 (9.3)

54 (17.9)

62 (18.7)

37 (14.3)

31 (14.1)

542 (22.0)

4 (9.3)

24 (32.9)

37 (52.1)

41 (75.9)

6 (31.6)

5 (26.3)

6 (11.1)

2 (3.2)

5 (13.5)

4 12.9)

156 (28.8)

23 53.5)

18 (24.7)

3 (4.2)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

3 (8.1)

4 (12.9)

169 (12.7)

23

2 (4.7)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

1 (5.3)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

3 (0.6)

1.8 Sinh bệnh học

Nhiễm trùng gây ra bởi vi rút cúm đầu tiên là viêm đường hô hấp trên Vi rútphát triển trên tế bào biểu mô đường hô hấp và phá hủy nhung mao, nơi được coi làhàng rào bảo vệ đầu tiên, quan trọng của cơ thể trong hệ thống hô hấp Kèm theo sựnhân lên của vi rút, interferon được phát hiện trong giai đoạn cấp tình của bệnhtrong một thời gian ngắn là nguyên nhân của sự nguy hiểm do nhiễm vi rút cúm

Nhiễm trùng gây ra bởi vi rút cúm A thường để lại những dấu hiệu sinh bệnhhọc tại đường hô hấp dưới Các chứng viêm thanh quản, khí quản, phế quản cấpxuất hiện cùng các triệu chứng viêm long đường hô hấp và phù nề Nhiễm trùng gây

ra bởi vi rút cúm A/H5N1 bao gồm triệu chứng máu khó đông, thăn hư, tan hạchbạch huyết và tổn trương phổi

Nhiễm trùng đường hô hấp dưới trên nền viêm phổi cấp có tỷ lệ tử vong cao

Viêm phổi thường là tình trạng bội nhiễm vi khuẩn như Streptococcus pneumonia,

Staphyloccus aureus và Hemophilus influenza, trong đó Staphyloccus aureus là

nguyên nhân thường gặp và rất nguy hiểm, gây nên suy hô hấp, thiếu oxy và diễnbiến nặng sau 2-3 ngày sau khi nhiễm bệnh

1.9 Vắcxin cúm

Vi rút là tác nhân gây bệnh cúm Miễn dịch ngừa cúm là phương pháp cănbản để kiểm soát cúm ở mức độ cá nhân và cộng đồng Vắcxin cúm được phát triển

và được cấp phép sử dụng ở người dưới dạng vi rút sống giảm độc lực và vi rút bấthoạt Các phương pháp chủng ngừa cúm có chung mục tiêu là kích thích miễn dịchđối với hemagglutinin (HA) và có thể đối với neuraminidase (NA), do đó thànhphần của vắcxin cúm thường xuyên được thay đổi sao cho tương thích nhất vớichủng vi rút đang lưu hành đã được tiên lượng trước Vai trò kích thích các đáp ứngmiễn dịch khác của vắcxin trong phòng ngừa bệnh vẫn chưa được hiểu biết mộtcách đầy đủ

Vắcxin cúm an toàn, hiệu quả, và được TCYTTG khuyến cáo sử dụng chophụ nữ có thai, trẻ từ 6 đến 59 tháng tuổi, người già, người đang mắc bệnh “đặcbiệt”, và cán bộ y tế

Thành phần của vắcxin thay đổi phản ánh tiến hóa không ngừng của vi rútcúm Từ năm 1977, vắcxin cúm đã chứa các thành phần kháng nguyên đại diện chocúm A/H3N2, A/H1N1, và cúm B, gọi là vắcxin ngừa cúm 3-valent (TIV: trivalentinfluenza vaccine) Từ năm 2004, hai dòng vi rút cúm B khác biệt về bản chấtkháng nguyên đã đồng thời lưu hành, dòng Victoria và dòng Yamagata Do đó,vắcxin cúm TIV được bổ sung thêm hai kháng nguyên của cúm B-Victoria và cúmB-Yamagata đã được cấp phép sử dụng ở Mỹ từ năm 2012, vắcxin này được gọi làvắcxin ngừa cúm 4-valent Error: Reference source not found

Nuôi cấy vi rút dựa trên trứng gà là phương pháp được ưa chuộng trong sảnxuất vắcxin sống và vắcxin bất hoạt hàng thập kỷ qua Tuy nhiên, phương pháp này

có một số bất cập như hạn chế về: nguồn cung cấp trứng, khả năng mở rộng quy môsản xuất, lựa chọn chủng vi rút cúm thích hợp với môi trường nuôi cấy trứng có thểlàm thay đổi bản chất kháng nguyên so với chủng hoang dại Do đó, các phươngpháp sản xuất vắcxin đã được tìm hiểu nghiên cứu áp dụng như hệ thống nuôi cấy tếbào động vật có vú, tế bào côn trùng, và tế bào thực vật

Năm 1943, vắcxin cúm đầu tiên được thử nghiệm thành công trong lâm sàng

ở Mỹ và được cấp phép sử dụng năm 1945 Vắcxin là vi rút cúm được lấy từ túi

25

niệu của trứng gà có phôi, rồi bất hoạt bằng formalin Chế phẩm tương đối thô nàythường gây phản ứng cục bộ hoặc phản ứng toàn thân nhưng đạt 70% hiệu quảngừa cúm A (A/H1N1) Error: Reference source not found

Các nhà sản xuất vắcxin đã nắm bắt những tiến bộ của công nghệ đang nổilên trong sản xuất, nhu cầu sử dụng vắcxin ngày càng gia tăng, đa dạng về kiểu loạivắcxin, và một số tiến bộ về hiệu quả ngừa cúm sau khi dùng vắcxin, nhiều loạivắcxin đã được phép đưa ra thị trường cho các nhóm tuổi khác nhau (như vắcxintiêm trong cơ, tiêm trong da, vắcxin xịt mũi, vắcxin liều đơn, vắcxin đa liều, vắcxin0.5 mL, vắcxin 0.25 mL) Chỉ riêng ở Mỹ có 9 vắcxin cúm dạng bất hoạt do 6 nhàsản xuất cung cấp trong năm 2012 – 2013 Error: Reference source not found Error:Reference source not found

Xây dựng một cơ sở sản xuất vắcxin cúm dạng bất hoạt dựa trên tế bào trứng

có phôi hoặc dựa trên nuôi tế bào kéo dài ít nhất 4-5 năm, nhưng có thể ngắn hơnđối với sản xuất vắcxin cúm giảm độc lực dựa trên trứng có phôi Error: Referencesource not found

Sản xuất vắcxin cúm đã tăng gấp đôi trong thập kỷ đầu tiên của thế kỷ 21 vớihơn 450 triệu liều trong năm 2009 Error: Reference source not found Tuy nhiên,75% số liều vắcxin này chỉ dùng ở 12 nước Bắc Mỹ và châu Âu, 25% còn lại đượcchuyển đến Tây Thái Bình Dương chủ yếu cho Nhật Bản và Australia Sử dụngvắcxin cúm ở các nước đang phát triển rất hạn chế Error: Reference source notfound

Hiệu quả sản xuất vắcxin cúm phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong nhữngyếu tố quan trọng nhất là chủng vi rút được sử dụng Chủng vi rút này sẽ quyết định

số liều được tạo ra Chủng vi rút cúm A hoang dại thường có đặc điểm tăng trưởngchậm, nên từ những năm đầu 1970 kỹ thuật HGRs (high growth reassortants) đãđược phát triển nhằm tăng hiệu quả của chủng vi rút giống Sự sắp xếp lại di truyền

sẽ tạo dòng vi rút cúm mang gen mã hóa protein bề mặt HA và NA của các chủng virút kiểu dại và một trong 6 gene của một vi rút có tốc độ mọc nhanh (ví dụ như genA/PR/8/34 ở vi rút cúm A hoặc gene B/Lee/40 hoặc gene B/Panama/45/90 ở vi rút

cúm B) Các gene này được tái tổ hợp bằng cách đồng thời gây nhiễm cho trứng virút cúm kiểu dại và vi rút PR8 hoặc vi rút B/Lee khi có mặt kháng huyết thanhchống lại protein bề mặt của vi rút PR8 hoặc vi rút B/Lee Sau đó, chọn dòng vi rútcúm tái tổ hợp dựa trên đặc điểm mọc nhanh so với các vi rút mọc chậm hơn Error:Reference source not found.

Các hạt vi rút thường mọc ở các tốc độ khác nhau, bao gồm cả các chủng virút tạo bằng kỹ thuật HGR Do đó, thành phần kháng nguyên của các hạt vi rút cóthể thay đổi lớn phụ thuộc vào đặc điểm mọc của chủng vi rút Để đảm bảo mỗi liềuvắcxin chứa tối thiểu 15 µg HA, cần một thử nghiệm nhằm chuẩn hóa nồng độ HAtrong vắcxin Cuối những năm 1970, thử nghiệm SIRD (the single radial immunoDiffusion) đã được phát triển để đánh giá vắcxin cúm SRID đã được xác lập vàonăm 1979 sau thử nghiệm lâm sàng vắcxin ở Mỹ và Anh lần đầu tiên chứng minhrằng hàm lượng kháng nguyên HA của vắcxin cúm bất hoạt được xác định bởiSRID tương quan tốt với tính sinh miễn dịch của vắcxin SRID phụ thuộc vàokháng huyết thanh và kháng nguyên chuẩn độ tiêu chuẩn cúa mỗi thành phầnvắcxin Các kháng huyết thanh này được cung cấp toàn cầu từ bốn phòng thínghiệm chịu trách nhiệm điều tiết phát triển vắcxin của thế giới Error: Referencesource not found

Sự phát triển của vắcxin cúm đạt được dựa trên nhiều yếu tố và được thúcđẩy từ nhu cầu nâng cao chất lượng vắcxin về hiệu quả, độ an toàn cũng như sựphong phú về kiểu loại, làm tăng nhu cầu sử dụng vắcxin, đặc biệt trong thập kỷ đầutiên của thế kỷ 21, và nỗ lực để nâng cao năng lực sản xuất Tuy nhiên, vắcxinchiếm lĩnh thị trường vắcxin cúm hiện vẫn là vắcxin giảm độc lực nuôi cấy dựa trên

tế bào trứng gà có phôi Khi nguồn trứng gà vẫn được ổn định và chất lượng tốt thìvắcxin cúm dựa trên tế bào trứng gà có phôi vẫn là một sản phẩm thương mại rấtcạnh tranh trong một vài năm tới

Hiện nay có 5 vắcxin cúm giảm độc lực nuôi cấy dựa trên trứng gà có mặttrên thị trường vắcxin, một loại sản xuất ở Nga Error: Reference source not found

và 4 loại sản xuất ở một số quốc gia châu Mỹ, châu Âu, châu Á, và Trung Đông

27

Hơn 100 triệu người lớn và trẻ em đã được ngừa cúm bằng vắcxin của Nga tronghơn 30 năm qua Cả hai chủng vắcxin cúm này đều có nguồn gốc từ các chủng virút giảm độc lực thích nghi tốt ở nhiệt độ 250C nhưng hạn chế mọc ở nhiệt độ 37-

390C Do đó, các chủng vi rút này nhân lên ở đường hô hấp trên nhưng không nhânlên ở đường hô hấp dưới Chủng cho ở vắcxin Nga là A/Leningrad/134/17/57(H2N2) và B/USSR/60/69, ở vắcxin Mỹ là A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) và B/AnnArbor/1/66

Sản xuất vắcxin giảm độc lực dựa trên nuôi cấy dòng tế bào liên tục gặpnhiều nhiều thách thức và đang được một số nhóm nghiên cứu phát triển

Hiện nay trên thị trường có khoảng 110 loại vắcxin cúm bất hoạt và 5 loạivắcxin cúm giảm độc lực Các loại vắcxin giảm độc lực dùng đường xịt mũi, còncác loại vắcxin bất hoạt dùng đường tiêm Error: Reference source not found

Việt Nam đã có nhiều cách tiếp cận khác nhau trong nghiên cứu sản xuấtvắcxin cúm như tế bào thận khỉ tiên phát (VABIOTECH), trên trứng gà có phôi(IVAC), trên tế bào Vero (Viện Pasteur TP HCM), trong đó VABIOTECH đã hoànthành 3 đợt thử nghiệm lâm sàng và kết quả cho thấy vắcxin cúm A/H5N1 doVABIOTECH sản xuất là an toàn trên người tình nguyện Các chỉ số sinh hóa học ởnhững người tình nguyện sau tiêm vắcxin là bình thường Vắcxin A/H5N1 sản xuấttrên dây truyền công nghệ đã nghiên cứu cho kết quả đáp ứng tốt ở tất cả các đốitượng được tiêm từ liều 7,5µg trở lên và đáp ứng tiêu chuẩn của châu Âu Từ nhữngkinh nghiệm có sẵn trong sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 VABIOTECH cũng đã xâydựng được một quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 có tính ổn định

và hiệu suất cao Người Việt Nam sẽ được sử dụng vắcxin cúm do Việt Nam sảnxuất trong một ngày không xa

Chủng sản xuất được nuôi cấy trên trứng gà có phôi với nhiệt độ dao động từ35-37oC tùy thuộc vào từng chủng, sau đó được làm lạnh ở 4oC và gặt nước niệuđệm từ những trứng phôi còn sống Nhiều nhà sản xuất bất hoạt vi rút sau khi ly tâmnhưng cũng có một số quy trình bất hoạt vi rút ở bước cuối cùng Hóa chất thườngđược sử dụng để bất hoạt vi rút là formaldehyde và β- propiolactone Tiếp theo, virút được tinh khiết bằng sắc ký cột hoặc siêu ly tâm phân vùng.

Vắcxin hạt vi rút vỡ (split vaccine)

Tiếp theo quá trình tinh khiết như trên, vi rút được xử lý bằng chất tẩy hoặcdung môi như diethyl ether, tween 80, triton X100 và ammonium deoxycholate đểphá vỡ màng lipit Một số quy trình tiếp tục các bước loại bỏ chất tẩy bằng cáchsiêu ly tâm, phân tách phase, thẩm tích…

Vắcxin tiểu đơn vị (subunit vaccine)

Quy trình sản xuất sử dụng chất tẩy như SDS, triton N101, enzymebromelain để phân tách hai thành phần kháng nguyên HA và NA Vi rút tinh khiếtbằng siêu ly tâm phân vùng trong sucrose được tiếp tục chạy qua lớp gradientsucrose khác có chứa triton N101 để phân tách HA và NA

Vắcxin bất hoạt sản xuất trên tế bào

Hầu hết các vắcxin cúm thông thường đều sản xuất trên trứng gà có phôi.Tuy nhiên đã có một số nghiên cứu phát triển văc xin trên các dòng tế bào Vero,BHK-21, MDCK và PMKC Các quy trình này đều cố gắng phát triển vắcxin tế bào

sử dụng công nghệ nuôi cấy trên micro carrier

Vắcxin tái tổ hợp và hấp phụ

Kháng nguyên HA của vi rút cúm được biểu thị trên tế bào côn trùng bằngbaculovi rút tái tổ hợp Toàn bộ dòng cDNA của đoạn gen HA được cài đặt vào hệthống đó và HA tái tổ hợp được tinh khiết trong điều kiện không làm biến tính cho

độ tinh khiết đạt 95% Một số tá chất đã được nghiên cứu để bổ sung vào thànhphần vắcxin làm tăng khả năng đáp ứng miễn dịch cũng như làm giảm hàm lượngkháng nguyên như: nhôm, MF59, AS02, AS03

Vắcxin sống giảm độc lực

29

Vắcxin sống cũng được sản xuất trên trứng gà có phôi giống như vắcxin bấthoạt Điểm khác biệt chủ yếu là vắcxin này không được bất hoạt do vậy cần đảmbảo không có các yếu tố ngoại lai Điều lưu ý là vắcxin này không cần phải có tinhkhiết cao vì sử dụng theo đường mũi nhưng thử nghiệm an toàn phải xác địnhkhông có các yếu tố ngoại lai Vắcxin này thường ở dạng đông khô để tăng tính ổnđịnh Vắcxin giảm độc lực thích ứng lạnh cũng đã được Cục quản lý thực phẩmdược phẩm Mỹ (FDA) cấp phép lưu hành Vi rút cúm được giảm độc lực bằng cáchcấy truyền trên tế bào (tế bào thận gà) và trên trứng gà có phôi ở nhiệt độ 25oC.

1.11 Các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin cúm

Kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm

- Từng mẻ gặt đơn chứa vi rút cần được chuẩn độ hiệu vi rút cúm CCID50 (liều virút gây hủy hoại 50% tế bào) hoặc tạo đám hoại tử (PFU) tùy từng chủng cúm vàtừng hãng sản xuất

- Nhận dạng: Xác định các kháng nguyên đặc hiệu bằng phản ứng khuyếch tán miễndịch hoặc ứng chế ngưng kết hồng cầu sử dụng các kháng thể đặc hiệu

- Xác định hàm lượng kháng nguyên HA: Hàm lượng kháng nguyên HA trong bánthành phẩm và bán thành phẩm cuối cùng được xác định bằng phương pháp miễndịch khuyếch tán vòng tròn đơn (SRID) Nếu là vắcxin cúm có chất hấp phụ, thửnghiệm xác định hàm lượng kháng nguyên HA phải tiến hành trước khi bổ sungchất hấp phụ

- Thử nghiệm về các nguyên liệu tồn dư: các nhà sản xuất phải chứng minh cácnguyên liệu tồn dư khác sử dụng trong sản xuất phải giảm qua quá trình tinh chếbằng phương pháp chạy SDS-PAGE nhưng vấn phải giữ nguyên đặc tính khángnguyên bằng phương pháp kính hiển vi điện tử

- Hàm lượng Protein tổng số được xác định bằng phương pháp Lorry Hàm lượngProtein tổng số không được vượt quá 6 lần hàm lượng kháng nguyên HA Đối vớivắcxin cúm mùa hiện nay, theo quy định hàm lượng Protein tổng số không đượcvượt quá 100µg cho một chủng vi rút cho một liều tiêm cho người và tổng số bachủng không vượt quá 300 µg cho một liều tiêm cho người

Kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin thành phẩm

- Thử nghiệm nhận dạng: Thử nghiệm nhận dạng được thực hiện với ít nhất 1 lọ chomỗi loạt vắcxin

- Hàm lượng kháng nguyên HA: Yêu cầu hàm lượng kháng nguyên HA đối với cúmmùa hiện nay là 15 µg/chủng/liều tiêm

- Thử nghiệm an toàn chung: Mỗi loạt thành phẩm đều phải thử nghiệm về độc tínhkhông mong muốn (độc tính bất thường) sử nghiệm các thử nghiệm an toàn chungtrên chuột lang và chuột nhắt trằng theo yêu cầu của Kiểm định Quốc gia

- Thử nghiệm chất gây sốt: Mỗi loạt thành phẩm đều phải thử nghiệm về chất gâysốt trên thỏ trưởng thành theo tiêu chuẩn của Kiểm định Quốc gia

- Thử nghiệm công hiệu: Mỗi loạt thành phẩm đều phải đánh giá đáp ứng miễn dichtrên chuột và khỉ theo tiêu chuẩn của Kiểm định Quốc gia

31