Mục đích nghiên cứu Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di truyền trên những bệnh nhân bạch
Trang 1MỞ ĐẦU
Trang 21 Tính cấp thiết của luận văn
Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào và thể bệnh bạch cầu cấp dựa trên một trong hai tiêu chuẩn là FAB và WHO Tiêu chuẩn FAB do các nhà Huyết học Pháp-Anh-Mỹ đưa ra năm 1976 là tổng hợp kết quả hình thái học và hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn này đã bổ sung thêm kết quả miễn dịch và di truyền [15, 17]
Trang 3Nhuộm hóa học tế bào gồm 8 kỹ thuật: Periodic-Acid Schiff (PAS), sudan black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF và không ức chế, photphataza kiềm và axit.
Ưu điểm của phương pháp nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành chỉ bằng 1/4 so với phương pháp miễn dịch và bằng 1/10 so với phương pháp
di truyền, không cần máy móc hiện đại, dễ triển khai Hiện nay, các bộ kít nhuộm có bán trên thị trường là các kít đơn, giá thành cao và có những nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình nhuộm khác nhau về thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau, bước tẩy màu của kỹ thuật nhuộm Sudan và Periodic - Acid Schiff khó đồng nhất, nhuộm nền thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan trong dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu bản nhiều lần Tại Việt Nam, các thuốc thử hầu hết là tự pha kết hợp với các yếu điểm trên nên độ nhạy,
độ đặc hiệu còn thấp Theo Trần Ngọc Vũ và cộng sự (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán giữa hình thái học-hóa học tế bào và miễn dịch là 89,1%, giá trị dự báo đối với bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là 88,88% và độ đặc hiệu là 73,77% [25] Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn thì việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch
và di truyền [19] Hiện nay, tác giả Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học- Truyền máu, Bộ Công an đã nghiên cứu và chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC gồm 10 kỹ thuật: Giemsa, Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axit, Perls Bộ kít đã cơ bản khắc phục được các yếu điểm ở trên Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của bộ kít, tiến
tới có thể thay thế hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa
Trang 4có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế - xã hội cấp thiết.
2 Mục đích nghiên cứu
Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986).
3 Nội dung nghiên cứu:
- Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân được chọc tủy lầnđầu tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương
- Đánh giá tính phù hợp của phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộHICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch và ditruyền trên các bệnh nhân đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB
- Đánh giá giá trị của kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC, khi nhuộmphotphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls trên bệnhnhân bạch cầu cấp
4 Bố cục của đề tài
Đề tài gồm 71 trang, trong đó có 65 hình vẽ, đồ thị, 26 bảng biểu, chưa kể
41 trang phụ lục và 57 tài liệu tham khảo Ngoài phần mở đầu và kết luận, đềtài được chia làm ba chương: chương 1 – Tổng quan tài liệu, gồm 25 trang;chương 2 –Phương pháp nghiên cứu, gồm 9 trang; chương 3 – Kết quả vàbàn luận, gồm 33 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang
Liên quan đến nội dung đề tài đã đăng 1 bài trên Tạp chí Y học thành phố
Trang 5bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axít Các kỹ thuật này dựa trên banguyên lý chính là phản ứng hóa học (PAS), khuếch tán vật lý (Sudan B) vàenzym (6 kỹ thuật còn lại) Hai kỹ thuật nhuộm PAS và Sudan B ít có cảitiến, riêng các kỹ thuật nhuộm enzym đã phát triển mạnh kể từ khi tìm raphản ứng tạo chất màu với sự xúc tác của enzym theo nguyên lý hình thànhphẩm màu azo vào những năm 50 của thế kỷ XX.
1.2 Nghiên cứu trong nước về nhuộm hóa học tế bào
Từ đầu những năm 1970, bộ môn Huyết học-Truyền máu đã triển khai các
kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào tại khoa Huyết học-Truyền máu Bệnh việnBạch Mai Một số tác giả như: Lê Đức Ngọc, Nguyễn Đình Triệu, Lưu VănBôi đã tiến hành một số nghiên cứu về cơ chế phản ứng, tổng hợp cơ chất,đánh giá mối tương quan giữa hoạt tính-cấu trúc và cải tiến các phương phápđánh giá các phương pháp nhuộm hóa học tế bào Các kết quả đã giúp nângcao chất lượng của các kỹ thuật nhuộm ứng dụng trong chẩn đoán dòng tếbào phục vụ cho công tác điều trị bệnh bạch cầu
1.3 Kít nhuộm hóa học tế bào
Các bộ kít thường tiến hành qua các bước chính như sau:
Tế bào bạch cầuchưa cố định
Tế bàobạch cầu
đã cố định
Nhuộmlênmàu cácchất
Nhuộm nềnhồng cầu
Như vậy, nhuộm hóa học tế bào là dùng các phản ứng hóa màu hoặc phản
Làm tiêu bản
Cố định
Nhuộm nền Phản ứng
hóa học
Trang 6ứng dưới xúc tác của enzym để phát hiện các chất hóa học có trong tế bào Sựxuất hiện màu chứng tỏ có chất cần phát hiện và cường độ màu phụ thuộc vàonồng độ của chúng có trong tế bào Các kỹ thuật này cần đạt được độ nhạy và
độ đặc hiệu cần thiết để đảm bảo tính chính xác của kết quả xét nghiệm
1.4 Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học
8 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào là cơ sở để chẩn đoán phân biệt bệnhbạch cầu kinh với nhiễm trùng bạch cầu đơn nhân và dòng tế bào trong bệnhbạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB
1.5 Các công cụ toán học sử dụng trong nghiên cứu y học
Kế hoạch hóa thực nghiệm nhằm tìm điều kiện tối ưu để đạt được kết quảnhuộm tốt nhất phải dựa trên các công cụ toán học Các phương pháp tối ưuhóa thực nghiệm đơn hình và khảo sát mặt mục tiêu thường hay được sửdụng trong nghiên cứu Hiện nay các phần mềm thống kê như: SPSS, Modde,Excel đã hỗ trợ tốt cho việc xử lý dữ liệu và kế hoạch hóa thực nghiệm
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 202 bệnh nhân có chỉ định chọc tủy tại Viện Huyếthọc-Truyền máu trung ương
2.2 Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong nghiên cứu
- Nghiên cứu mô tả cắt ngang
- Phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang
Nhuộm 10 kỹ thuật theo hướng dẫn của bộ kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC sản phẩm của đề tài cấp bộ mang mã số: BH - 2011 - BV198 - 11
Trang 7− Kỹ thuật nhuộm peroxidaza bạch cầu bằng cơ chất là benzidin;
AS-D 2-cloaxetat;
naphtol AS axetat;
axetat với chất ức chế NaF;
AS-BI photphat ở pH axit;
AS-BI photphat ở pH kiềm;
bằng Kali Feroxyanua
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân được nghiên cứu
Bệnh bạch cầu cấp là bệnh lý ác tính của hệ tạo máu được đặc trưng bởi sựtăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương Trong tổng số 202mẫu chọc tủy lần đầu tại viện Huyết học - Truyền máu Trung ương có 142trường hợp được chẩn đoán ban đầu mắc bạch cầu cấp trong đó có 60 trườnghợp kết luận đúng thể bệnh, như vậy chỉ dựa vào lâm sàng mức độ chẩn đoánđúng thể bệnh đạt tỷ lệ rất thấp (42,3%) Do đó cần kết hợp nhiều phươngpháp chẩn đoán khác nhau Tiêu chuẩn FAB (1986) sử dụng kết quả hình tháihọc-nhuộm hoá học tế bào, marker và di truyền làm cơ sở để phân loại thểbệnh và dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp nhằm chẩn đoán và lựa chọnphác đồ điều trị cho bệnh nhân đạt hiệu quả cao nhất [33, 36, 37, 39, 40]
Bảng 3.1 Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp
Trang 8Bảng 3.2 Phân loại bạch cầu cấp theo giới tính
Về giới: Tỷ lệ mắc bệnh của nữ giới là 53,3%, cao hơn nam giới và cao hơn
so với công bố của Siegel M P H R., và cộng sự ghi nhận tại Mỹ năm 2014
là 0,756 (23.370 nữ/30.900 nam) [52] Sự khác nhau có thể là do ảnh hưởngcủa môi trường sống cũng như thói quen sinh hoạt của người Mỹ và Việt Namcũng như số lượng mẫu thu thập có thể còn thấp chưa mang tính đại diện
Trang 9tuổi lao động (20,0%).
3.2 Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho
3.2.1 Đặc điểm chung về nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho
Bảng 3.3 Bảng phân loại bạch cầu cấp dòng lympho theo giới tính
Hình 3.3 Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo độ tuổi
Về độ tuổi: Mẫu nghiên cứu có tuổi thấp nhất là 1 tháng tuổi và cao nhất là
93 tuổi, bệnh gặp ở mọi lứa tuổi Theo tiêu chuẩn quy định độ tuổi lao độngcủa người Việt Nam: độ tuổi lao động của nam giới từ 18-60 tuổi, độ tuổi laođộng của nữ giới từ 18 - 55 tuổi Qua hình 3.3 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh bạchcầu cấp dòng lympho < 18 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (60%) Kết quả này phùhợp với các công bố của các tác giả trong và ngoài nước Theo Trần ThịHồng Hà (2004), độ tuổi mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho hay gặp nhất
từ 4-5 tuổi [5] Nguyễn Công Khanh (1987) thấy rằng gần 50% trẻ mắc bệnhdưới 5 tuổi và tỷ lệ này cũng giảm dần ở trẻ lớn [8] Theo Bùi Ngọc Lan
Trang 10(2007), độ tuổi mắc bệnh trung bình là 6,0 ± 3,8 [9] Đối với người trên 16tuổi, nhiều nghiên cứu cho thấy ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc bệnh trẻ tuổichiếm tỷ lệ khá cao Nghiên cứu của Phạm Quang Vinh (2003), có trên 256bệnh nhân có 40,0% số bệnh nhân dưới 30 tuổi [24].
3.2.2 Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho sử dụng bộ kit nhuộm
HICYTEC
a) Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo tiêu chuẩn FAB
Bảng 3.4 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho
tỷ lệ cao trong bạch cầu cấp dòng lympho [10] Tuy vậy, khác với nghiên cứucủa tác giả C H Pui (2001) tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho hầuhết có phân loại theo FAB thuộc thể L1 chiếm tới 70% [48]
b) Đánh giá mức độ phù hợp phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho bằng bộ kít nhuộm đồng bộ HICYTEC so với kết quả chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương
Bảng 3.5 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng bộ kít HICYTEC và kết chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu
trung ương trên từng bệnh nhân
Trang 11TT Mã BN Họ và tên Năm
sinh Ngày XN
Kết luận của viện HH- TM TW
Kết luận thể bệnh
sử dụng kit HICYTEC
Tổng hợp lại kết quả ở trên được bảng phân loại thể bệnh trên bảng 3.6
Bảng 3.6 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho
Chẩn đoán xác định Kết quả bộ kít Sai khác
Trang 12Thể
bệnh
Số lượng Tỷ lệ (%)
Số lượng
Tỷ lệ (%)
Số lượng
Tỷ lệ (%)
sa, peroxidaza, sudan B, PAS và esteraza không đặc hiệu tự pha thì độ nhạy
là 100%, độ đặc hiệu là 73,77%, giá trị dự báo phân loại dòng lympho là88,88% Sự phù hợp chẩn đoán giữa hình thái-hóa học tế bào và miễn dịch tếbào là 89,10% [25]
3.2.3 Kết quả nhuộm photphataza axit bạch cầu xác định loại lympho T
trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho
Bảng 3.7 Kết quả nhuộm photphataza axit phân loại dòng lympho T
là không thể phân biệt được dòng B và T như kỹ thuật miễn dịch tế bào
Trang 13Trong khi đó dựa vào hóa học tế bào nhuộm photphataza axit bạch cầu có thểphân loại được dòng tế bào lympho B và T Điều này có ý nghĩa rất lớn vàcần thiết cho các bác sĩ trong việc chẩn đoán, tiên lượng bệnh và lựa chọnphác đồ điều trị.
3.3 Nhóm bạch cầu cấp dòng tủy
3.3.1 Phân nhóm bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính và tuổi
Trong số 202 bệnh nhân tự đến có các triệu chứng lâm sàng định hướngchẩn đoán bệnh bạch cầu cấp hoặc được chẩn đoán bạch cầu cấp bởi các bệnhviện khác gửi đến viện Huyết học-Truyền máu trung ương, đã phát hiện14,85% bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Bảng phân bố bệnh bạchcầu cấp theo giới tính được thể hiện trên bảng 3.8
Bảng 3.8 Bảng phân bố bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính
Bảng 3.9 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính
Trang 14Kết quả trên bảng 3.9 cho thấy thể bệnh M4 chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả haigiới (chiếm 43,33%) Không gặp thể M0 ở nam và thể M7 ở cả hai giới Mộttrường hợp bệnh nhân thể M0 và 3 trường hợp M5 đều gặp ở bệnh nhân nữ.Bên cạnh đó chỉ gặp một trường hợp mắc thể M6 ở nam giới Đối với thểM1, M2, M3 và M4 gặp cả ở nam và nữ trong đó thể M2, M3 có sự chênhlệch rõ về số trường hợp mắc: thể M2 thì tỷ lệ nữ/nam=5/1, thể M3 cónam/nữ= 2/1.
Về độ tuổi: Kết quả nghiên cứu cho thấy bệnh bạch cầu cấp dòng tủy gặp
ở mọi lứa tuổi và gặp cao nhất ở tuổi 18-60 Kết quả này cũng phù hợp vớikết quả nghiên cứu của Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Hữu Toàn (1999)khi cho rằng bệnh bạch cầu cấp gặp ở mọi độ tuổi, tỷ lệ mắc bệnh bạch cầucấp chủ yếu trên độ tuổi 15 chiếm 77,8% [19, 20]
3.3.2 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo kết quả chẩn
đoán tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương
Kết quả phân loại thể bệnh tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ươngdựa trên 3 phương pháp: hình thái học-hóa học tế bào, miễn dịch và di truyền.Kết quả chẩn đoán tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương cho thấy: Tỷ lệbệnh nhân mắc thể M4 cao nhất là 43,4%, gấp khoảng 2 lần so với số trườnghợp mắc thể M2 và gấp khoảng 4 lần so với các thể bệnh M1, M3 và M5.Không có trường hợp nào bệnh nhân mắc thể M7 (xem hình 3.14)
Trang 15Kết quả này khác với nghiên cứu của Phan Nguyễn Thanh Vân (tỷ lệmắc bệnh bạch cầu cấp dòng tủy chủ yếu gặp ở thể M2 chiếm 66,1% khithống kê trên cỡ mẫu là 162 mẫu) [21] Sự sai khác này có thể do cỡ mẫutrong nghiên cứu này nhỏ (30) nên chưa có tính đại diện cao vì thời giannghiên cứu ngắn.
3.3.3 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng kit nhuộm
HICYTEC
Bảng 3.10 Kết quả phân loại thể bệnh bằng bộ kit nhuộm HICYTEC
Thể bệnh Kết quả sử dụng bộ kit HICYTEC
3.3.4 Mức độ phù hợp về chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy bằng
bộ kít HICYTEC và kết luận của viện Huyết học-Truyền máu TW
Trang 16Bảng 3.11 Kết quả chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy bằng bộ kít HICYTEC và
kết luận của viện Huyết học-Truyền máu TW từng đôi một
sinh
Ngày xét nghiệm
Kết luận của viện HH- TM TW
Kết luận thể bệnh
sử dụng kit HICYTEC
Trang 17TT Mã BN Họ và tên Năm
sinh
Ngày xét nghiệm
Kết luận của viện HH- TM TW
Kết luận thể bệnh
sử dụng kit HICYTEC
sự (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán giữa hình thái học-hóa học tế bào và miễndịch là 89,1 [25] và của Nguyễn Hữu Toàn (1999) là 29,7% [19]
3.4 Phân loại dòng tế bào bạch cầu cấp thể lai lympho - tủy (Lai L-T)
Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho - tuỷ bằng bộ kítHICYTEC và kết chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu trungương trên từng bệnh nhân thể hiện trên bảng 3.12
Bảng 3.12 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho-tủy
sinh Ngày XN
Kết luận của viện HH-TM TW
Kết luận thể bệnh sử dụng kit HICYTEC
Trang 18TT Mã BN Họ và tên Năm
sinh Ngày XN
Kết luận của viện HH-TM TW
Kết luận thể bệnh sử dụng kit HICYTEC
Kết quả nhuộm hóa học tế bào bằng kít nhuộm HICYTEC cho thấy có
5 trường hợp bạch cầu cấp thể lai lympho-tủy chiếm 8,3% (xem bảng 3.4)
Tỷ lệ này cao hơn so với nghiên cứu của Nguyễn Triệu Vân và cs (2004)bạch cầu cấp thể lai tủy-lympho chiếm 6,2% [22] Đây là thể hỗn hợp giữa 2dòng tế bào là dòng lympho và dòng tủy Khó khăn lớn nhất trong việc phânloại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho - tủy khi sử dụng phương pháp hìnhthái học - hóa học tế bào dùng để phân loại thể bệnh là tỷ lệ tế bào dònglympho và dòng tủy rất biến động trong các mẫu tủy Một số tế bào do độtbiến có thể mất một số chất hóa học hoặc enzym trên nguyên sinh chất tế bàonên dẫn đến không nhận định được kết quả
3.5 Kết quả nhuộm photphataza kiềm bạch cầu
Bảng 3.13 Kết quả nhuộm photphataza kiềm trên bệnh nhân bạch cầu cấp
Trang 19giảm điểm nhuộm (71,7%) dưới 20 điểm, chỉ có một trường hợp tăng điểm
và như vậy có định hướng nhiễm trùng (xem Bảng 3.13)
Nhuộm photphataza kiềm bạch cầu dùng để phân biệt bệnh bạch cầukinh và bệnh bạch cầu cấp cũng như hội chứng nhiễm trùng bạch cầu đơnnhân Nếu là bệnh bạch cầu kinh thường có hiện tượng giảm điểm nhuộm (cóthể giảm đến mức 0 điểm Trong trường hợp bạch cầu cấp điểm nhuộm củacác mẫu tuỷ thường nằm trong mức giảm vừa do có sự tăng cao của các tếbào blast Nếu trong trường hợp bị nhiễm trùng (một trong những triệu chứngcủa bệnh) thì điểm nhuộm của mẫu sẽ tăng lên và là chỉ dấu giúp các bác sỹlâm sàng theo dõi tiên lượng bệnh Tuy vậy, do sự biến động rất lớn của các
tế bào và thành phần tế bào trong mẫu tuỷ của các bệnh nhân bạch cầu cấpnên xét nghiệm này thường ít có giá trị và chỉ có giá trị khi theo dõi mangtính động học [40]
Hình 3.56 thể hiện phản ứng nhuộm photphataza kiềm dương tính,nguyên sinh chất tế bào bắt màu đỏ trên nền nhân và hồng cầu màu xanh
Hình 3.56 Ảnh nhuộm
photphataza kiềm mẫu tủy
của bệnh nhân Trần Văn
