Luận văn nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (docynia indica)

2.2.4 Bảo quản giống 212.2.5 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học-OD 212.2.6 Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn của vi khu

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được gửi lời cảm ơn chân

thành tới TS Bùi Thị Việt Hà, chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa

học Tự Nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội Người đã luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn vàtạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ của bộ môn Vi sinh vật học,trường ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội Trong quá trình làm luậnvăn, tôi đã luôn nhận được sự chỉ bảo trực tiếp và được tạo điều kiện thuận lợi nhất

Đồng thời, tôi chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo tại khoa Sinh họcnói chung và bộ môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐH Quốc gia

Hà Nội nói riêng đã tận tình dạy dỗ tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và toàn thểcác bạn trong nhóm Những người luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong thờigian học tập

Học viên

Nguyễn Thị Minh Thư

MỤC LỤC

1.2 Moraxella catarrhalis VÀ BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP TRÊN 5

1.2.2 Vai trò của M.catarrhalis trong bệnh nhiễm khuẩn hô hấp 5

1.2.3 Tính kháng kháng sinh của M catarrhalis 8

2.2.4 Bảo quản giống 212.2.5 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học-OD 212.2.6 Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và hoạt tính

kháng khuẩn của vi khuẩn

3.1 HOẠT TÍNH KHÁNG Moraxella catarrhalis CỦA DỊCH LÊN MEN

QUẢ TÁO MÈO

28

3.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật kháng Moraxella catarrhalis 29

3.3 ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO SINH TRƯỞNG VÀHOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

3.3.7 Khả năng sinh enzym ngoại bào của TM5.2 393.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT TÁO MÈO

VÀ DỊCH LÊN MEN VI KHUẨN

39

3.4.1 Khảo sát hệ dung môi rửa giải và pha rắn hấp phụ 403.4.2 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn của dịch lên men vi khuẩn 403.4.3 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo 413.4.4 Sắc ký bản mỏng các phân đoạn kháng khuẩn của dịch lên men chủng

TM5.2 và dịch chiết táo mèo

DANH SÁCH BẢNG BIỂU, BIỂU ĐỒ

Bảng 1.1: Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh viêm họng mạn tính 7

Bảng 1.2: Tỷ lệ kháng kháng sinh của M.catarrhalis 9

Bảng 1.4: So sánh bacteriocin và chất kháng sinh 13

Bảng 3.1: Hoạt tính kháng M.catarrhalis của dịch lên men quả táo mèo 28

Bảng 3.2: Hoạt tính kháng M.catarrhalis của 4 chủng vi khuẩn 29Bảng 3.3: Hoạt tính kháng khuẩn của chủng TM5.2 lên các chủng vi khuẩn

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, hoạt tính kháng khuẩn

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và

hoạt tính kháng khuẩn của TM5.2

38

Hình 3.7: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và

hoạt tính kháng khuẩn của TM5.2

39

Bảng 3.11: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn tách từ dịch

chiết lên men

40

Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis của cao dịch

chiết táo mèo tại các nồng độ khác nhau

41

Bảng 3.13: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis của các phân

đoạn từ dịch chiết táo mèo

42

Bảng 3.14: Kết quả thử định tính các nhóm hợp chất của dịch chiết quả táo

mèo và các phân đoạn

43

MỞ ĐẦU

Nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp là bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu trong số

10 bệnh lý nhiễm khuẩn ở các nước có thu nhập thấp Chương trình toàn cầu vềphòng chống nhiễm khuẩn hô hấp cấp đã được WHO phát động, tại Việt Namchương trình này đã được triển khai từ năm 1984 Kiểm soát và phòng chống bệnhđược ưu tiên hàng đầu tại các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, nhưng đã

và đang chịu tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng khángsinh của vi khuẩn gây bệnh

Bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp gồm nhiễm khuẩn đường hô hấp trên

và nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới Tỷ lệ mắc bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấptrên chiếm phần lớn so với các bệnh về hô hấp khác, là bệnh thường gặp, mắc hàngnăm, theo mùa nhưng có thể gây nhiều biến chứng nặng như viêm tai giữa, viêmmàng não, áp xe não, áp xe sau thành họng Khi mắc viêm đường hô hấp trên có thểlây nhiễm xuống đường hô hấp dưới gây viêm khí, phế quản và viêm phổi nặng Cóthể thấy bệnh gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe đặc biệt với trẻ em, người già vàgây thiệt hại kinh tế

Moraxella catarrhalis là căn nguyên gây ra phần lớn các trường hợp mắc

bệnh nhiễm khuẩn hô hấp, đặc biệt hiện nay được coi như tác nhân gây bệnh viêm

tai giữa phổ biến thứ ba sau Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae Trong khi đó M catarrhalis hiện đã kháng lại hầu hết các chất kháng sinh thuộc

nhóm beta-lactam, chỉ còn nhạy cảm với cephalosporin thế hệ 2, 3 và ciprofloxacin

thuộc họ quinolon Thực trạng kháng kháng sinh của M catarrhalis nói riêng, các

vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói chung đã và đang đem đến gánh nặng kinh tế,

xã hội trong việc thay thế kháng sinh thế hệ cũ bằng kháng sinh thế hệ mới đắt tiền.Với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học hiện đại đem lại một triển vọng lớncho nền Y học khi tìm kiếm thêm những hợp chất tự nhiên hỗ trợ cho việc phòng vàđiều trị bệnh trên Các hợp chất này góp phần giảm tác dụng phụ không mong muốn

của các hợp chất tổng hợp, giảm gánh nặng về mặt kinh tế cho người bệnh và xãhội.

Từ ngàn xưa, ông cha ta đã lưu truyền rất nhiều bài thuốc dân gian từ cây, cỏchữa các bệnh đường hô hấp và rất nhiều bệnh khác Hiện nay táo mèo và các sảnphẩm chế biến từ táo mèo đặc biệt là giấm táo mèo được lan truyền rộng rãi trongcộng đồng như một bài thuốc chống béo phì, tăng cường miễn dịch, kháng khuẩn,giảm chứng suy hô hấp Trên thế giới cây táo mèo phân bố tại Trung Quốc, Ấn

Độ, Myanma, tại Việt Nam tập trung ở các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Lào Cai, Lai Châu

và Lâm Đồng Năm 2010 đã có những nghiên cứu sơ bộ với kết quả khả quan về tác

dụng kháng khuẩn, trong đó có M catarrhalis gây bệnh hô hấp của dịch lên men

quả táo mèo đã mở ra một hướng nghiên cứu mới cũng như định hướng ứng dụngcủa dịch lên men quả táo mèo trong việc hỗ trợ và nâng cao thể trạng cho conngười Với mục tiêu góp phần chứng minh và làm sáng tỏ vai trò chủ đạo của cáctác nhân có trong dịch lên men quả táo mèo theo kinh nghiệm dân gian, đặc biệt làcông dụng kháng vi khuẩn gây viêm đường hô hấp trên đã kháng kháng sinh thông

dụng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica)”.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 BỆNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP Ở NGƯỜI

Nhiễm khuẩn hô hấp là tình trạng một hoặc một số bộ phận thuộc bộ máy

hô hấp bị viêm nhiễm do vi khuẩn hoặc virut gây ra

Về phương diện lâm sàng, nhiễm khuẩn hô hấp gồm hai loại: nhiễm khuẩn

hô hấp trên và nhiễm khuẩn hô hấp dưới

Nhiễm khuẩn hô hấp trên không phải là một bệnh lý riêng biệt mà gồmnhiều bệnh lý (các bệnh tai mũi họng) như:

Bệnh nhiễm khuẩn hô hấp dưới được coi là bệnh cảnh nặng nhưng trên thực

tế bệnh chiếm tỷ lệ thấp và không dễ mắc Trong khi đó nhiễm khuẩn hô hấp trên làchứng bệnh thường gặp hàng năm, mắc tái diễn theo mùa, tái mắc nhiều lần trongnăm, dễ gây biến chứng nặng nề và chiếm tỷ lệ lớn so với các bệnh về hô hấp khác.Theo thống kê của các tổ chức y tế Hoa Kỳ, trung bình người trưởng thành có thể bịviêm đường hô hấp trên khoảng 2 – 4 lần mỗi năm và con số này cao hơn rất nhiều

ở trẻ em, trong đó trẻ có thể nhiễm đến 10 lần Mỗi năm tại Hoa Kỳ, nhiễm khuẩn

hô hấp trên gây giảm khả năng làm việc trong 170 triệu ngày, 23 triệu ngày trẻ phảinghỉ học, 18 triệu ngày phải nghỉ làm Điều này cho thấy dù là loại bệnh được cho

là tự khỏi nhưng chúng đã gây ra những thiệt hại đáng kể không chỉ về sức khỏe màcòn cả về kinh tế xã hội

Đối tượng mắc bệnh chủ yếu là trẻ em Ước tính trên toàn cầu mỗi năm cókhoảng trên 2 tỷ lượt trẻ bị bệnh nhiễm khuẩn hô hấp cấp, chiếm 15 -20% số tửvong trong độ tuổi dưới 5 Tại khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam bệnhtrên là nguyên nhân cao nhất (25%) gây tử vong ở trẻ, tiếp theo là tiêu chảy và sơsinh kết hợp với các bệnh khác, còn lại là do các nguyên nhân khác [22] Ở trẻ embệnh nhiễm khuẩn hô hấp trên gây biến chứng nặng viêm tai giữa (29 – 50%), viêmxoang (5 – 10%) [38].

Vi sinh vật gây bệnh thường gặp là virut (chiếm 80%) và vi khuẩn (20%), cụthể như sau:

- Tác nhân virut gây bệnh gồm có:

+) Rhinovirus là một picornavirut, phân lập được hơn 110 serotyp- thường

gặp hơn cả (khoảng 50%)

+) Coronavirus: 20-25%.

+) Orthomyxovirus: gây bệnh cúm

+) Paramyxovirus : virut hợp bào, quai bị

+) Adenovirus, thường là các typ 1, 2, 3, 5, 6.

- Tác nhân vi khuẩn thường gặp là Streptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenzae và Moraxella catarrhalis [24, 33,37]

Ngoài vi khuẩn trên còn có các vi khuẩn không điển hình như Mycoplasma

pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila.

Bệnh nhiễm khuẩn hô hấp trên gia tăng khi gặp các yếu tố thuận lợi như: + Theo lứa tuổi: chủ yếu ở trẻ em và người già

+ Sức đề kháng yếu của con người: sinh non, suy dinh dưỡng,

+ Điều kiện khí hậu, thời tiết: ở Việt Nam có khí hậu nóng ẩm tạo điều kiệnthuận lợi cho các vi sinh vật gây bệnh đường hô hấp nói riêng và các bệnh nhiễmkhuẩn nói chung phát triển Việt Nam được coi là một trong các quốc gia có tỷ lệ

các bệnh nhiễm khuẩn cao nhất nên việc điều trị và phòng bệnh càng trở nên cầnthiết.

+ Do ô nhiễm môi trường sống, đời sống kinh tế xã hội kém

1.2 Moraxella catarrhalis VÀ BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP TRÊN

1.2.1 Đặc điểm hình thái và nuôi cấy

Moraxella catarrhalis lần đầu tiên được mô tả vào năm 1896, gọi là Micrococcus catarrhalis sau đó đổi thành Neisseria catarrhalis đến năm 1984 đổi

là Moraxella (Branhamella) catarrhalis thuộc chi Moraxella, họ Moraxellaceae

[27]

Đây là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, dạng song cầu khuẩn, sống cộng sinhtại đường hô hấp trên, một số có pili hoặc lông nhung giúp cho chúng có thể bám

vào ống hô hấp [38] Không chỉ sống cộng sinh bình thường trong hệ hô hấp mà M.

catarrhalis còn là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất đối với

đường hô hấp của con người [36]

Quá trình phân lập M catarrhalis được tiến hành theo tiêu chuẩn WHO:

Bệnh phẩm lấy từ vùng họng của bệnh nhân, tiến hành nhuộm Gram và cuối cùngđem nuôi cấy trong môi trường thạch máu 5% hoặc thạch sôcola với điều kiện 370C+ CO2 5% [38]

1.2.2 Vai trò của Moraxella catarrhalis trong bệnh nhiễm khuẩn hô hấp

Nhiều nghiên cứu trên thế giới và trong nước đã chỉ ra rằng M catarrhalis

là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất đối với đường hô hấp

 Các nghiên cứu trên thế giới:

Trên thế giới có nhiều nghiên cứu chỉ ra M catarrhalis là nguyên nhân phổ biến gây bệnh viêm đường hô hấp M catarrhalis là vi khuẩn cộng sinh phổ biến ở

vòm họng của trẻ em [41], một nghiên cứu trên 120 trẻ sơ sinh đã cho thấy 66% trẻ

một tuổi mang vi khuẩn, tăng lên đến 77,5% ở trẻ hai năm tuổi, điều này cho thấytrẻ em có nguy cơ cao bị các bệnh đường hô hấp, đặc biệt là hô hấp trên [20].Những nghiên cứu khác cũng cho thấy 48,9% gặp ở trẻ độ tuổi từ 3-12 [32] và 54%

ở trẻ dưới 4 tuổi [22] Tuy nhiên ở người lớn tỷ lệ này thấp hơn với 1% trong 561 caphụ nữ trong tuổi lao động nhập viện [32], 5,8% ở người lớn khỏe mạnh và tăngđến 26,5% ở người có độ tuổi trên 60 [48] và tăng cao vào mùa đông Timothy [47]

đã đưa ra các biểu hiện lâm sàng và dịch tễ học của M catarrhalis, đặc biệt sự liên

quan giữa bệnh viêm tai giữa ở trẻ em và bệnh COPD ở người lớn, hai căn bệnh

truyền nhiễm phổ biến nhất gây ra bởi M catarrhalis Viêm tai giữa là bệnh hay

gặp nhất trong thời thơ ấu của con người và là lý do phổ biến nhất mà trẻ em được

kê đơn kháng sinh, trung bình khoảng 80% trẻ em trong 3 năm đầu đời mắc bệnh

Trong đó M catarrhalis chiếm 15-20% nguyên nhân gây các đợt bệnh viêm tai giữa cấp tính, rất nguy hiểm với trẻ em nếu không phát hiện và điều trị kịp thời M.

catarrhalis còn là nguyên nhân gây ra một loạt các bệnh về hô hấp khác như: viêm

xoang cấp, viêm vòm họng, viêm phế quản mãn tính Catlin [26] đã chỉ ra những

bằng chứng cho thấy M catarrhalis đã gây ra bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng

não, viêm nội tâm mạc Đặc biệt trong các báo cáo tổng hợp lại về các bệnh viêm

phổi, viêm tai giữa và AIDS chỉ ra rằng M catarrhalis là nguyên nhân thường gặp

gây ra nhiễm trùng máu [44] Nhiễm trùng bệnh viện là vấn đề đang rất được quan

tâm và M catarrhalis được xác định là một trong những vi khuẩn bị lây truyền,

nhất là ở những khu phòng quá tải bệnh nhân và trong những tháng mùa đông

Các nghiên cứu tại Việt Nam

Việt Nam với đặc điểm khí hậu nóng ẩm, trong những năm gần đây lại chịutác động mạnh của biến đổi khí hậu đã tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vậtgây bệnh phát triển Trên thế giới, Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệcác bệnh nhiễm khuẩn cao nhất, trong đó nhiễm khuẩn đường hô hấp trên chiếm tỷ

lệ cao Ngay từ năm 1984 chương trình chống nhiễm khuẩn hô hấp cấp đã chính

thức bắt đầu tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về bệnh hô hấp xác nhận M.

catarrhalis là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu Tại bệnh viện Bạch Mai

vào năm 1987 [17] xác nhận tỷ lệ M catarrhalis chiếm 3,5%, đến năm 1998 Lê Bá

Nhàn và cộng sự khi nghiên cứu bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới ở trẻ em tại

phường Kim Long, thành phố Huế đã phân lập được M catarrhalis với tỷ lệ 19,2%.

Nghiên cứu của Đào Đình Đức và cộng sự [8] tại bệnh viện Bạch Mai trong 5 năm(1990-1994) cho thấy chủng vi khuẩn này gây nhiễm bệnh hô hấp với tỷ lệ trungbình là 2,2% Tại trạm y tế phường Huế thành phố Hà Nội, năm 1991 đã phân lập

được 36 chủng M catarrhalis chiếm 18,8% tổng số vi khuẩn gây bệnh cho trẻ em,

tại bệnh viện Việt Nam- Cuba tỷ lệ lên đến 23,72% [34] Khi nghiên cứu tác nhân visinh gây bệnh viêm phổi cộng đồng tại bệnh viện Chợ Rẫy từ ngày 01/03/2005 đếnngày 30/06/2006 đã cho thấy tác nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn Gram âm, trong

đó tần suất gặp cao là Haemophilus influenzae (25%) sau đó là M catarrhalis với

17% Cũng với khảo sát tương tự diễn ra tại bệnh viện Nguyễn Tri Phương trongkhoảng thời gian từ tháng 1/2005 đến tháng 9/2006 do Phạm Hùng Vân phụ trách

đã cho kết quả M catarrhalis chiếm 8% trong tổng số vi sinh vật gây bệnh Theo

Đỗ Quyết [19] từ tháng 6/2007 đến tháng 6/2008 tại khoa lao và bệnh phổi, bệnhviện 103 Hà Nội trên 40 bệnh nhân trong đợt bùng phát bệnh phổi tắc nghẽn mãn

tính cho thấy M catarrhalis chiếm 14,3% nguyên nhân gây bệnh Cũng theo

Nguyễn Minh Hải (2006) [10] tỷ lệ gây bệnh tương tự là 51,6%, theo Nguyễn NgọcBích (2007) chiếm 30,75% số vi khuẩn gây bệnh Thống kê của viện dịch tễ trung

ương và bệnh viện nhi Thụy Điển về tình hình nhiễm khuẩn đường hô hấp, M.

catarrhalis chiếm tỷ lệ 18,8-29,6% trong tổng số các chủng phân lập được [2] Phân

lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân mắc bệnh viêm họng mạn tính tạibệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương cho bảng kết quả sau [13]:

Bảng 1.1: Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh viêm họng mạn tính

5 P.aeruginosa 14 10,37

Những kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy M catarrhalis

là một trong những tác nhân chủ yếu gây ra các bệnh hô hấp với tỷ lệ gây bệnh cao

và mức độ nguy hiểm của chúng đối với sức khỏe con người, đặc biệt là với trẻ em,người già Một vấn đề rất được quan tâm và chú trọng nghiên cứu hiện nay chính làtính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh hô hấp, trong đó đặc biệt là

của M catarrhalis.

1.2.3 Tính kháng kháng sinh của Moraxella catarrhalis

Vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổitrội ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam với gánh nặng của các bệnhnhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằngkháng sinh mới đắt tiền Cùng với bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, bệnh lâynhiễm qua đường tình dục và nhiễm khuẩn bệnh viện, bệnh nhiễm khuẩn đường hôhấp là một trong những nguyên nhân hàng đầu có tỷ lệ mắc và tử vong cao ở cácnước đang phát triển Thực tế việc kiểm soát bệnh này đã và đang chịu sự tác độngbất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn

M catarrhalis là vi khuẩn Gram âm, có khả năng tổng hợp enzym

β-lactamaza Enzym này làm mất hoạt tính kháng sinh của nhóm kháng sinh β- lactambằng cách thủy phân vòng β- lactam

Trước đây khi điều trị các bệnh nhiễm khuẩn M catarrhalis ampicillin vẫn

được coi là kháng sinh đặc trị hữu hiệu Tuy nhiên hiện nay kháng sinh điều trị theo

kinh nghiệm này đã được ghi nhận là bị M catarrhalis đề kháng với tỷ lệ cao lên

đến 100% như ở Thái Lan [30], hay 79% như ở Malaysia [46] Theo báo cáo gầnđây cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh thuộc thế hệ kháng sinh quinolon mới có phổ

kháng rộng của M catarrhalis cao nhất là với ofloxacin (29,4%), tỷ lệ kháng thấp

hơn với ciprofoxacin, levofloxacin, moxiloxacin

Tại Việt Nam, khi phân tích các chủng M catarrhalis về tỷ lệ và xu hướng

của kháng kháng sinh trong số tất cả các vi khuẩn gây bệnh phổ biến trong chươngtrình Quốc gia giám sát kháng kháng sinh, Phạm Văn Ca [4] cho thấy cho thấy tỷ lệkháng kháng sinh của vi khuẩn này thấp vào trước năm 2000(dưới 2,5%), nhưnghiện đã cao hơn 13% Tỷ lệ kháng kháng sinh ampicillin có xu hướng ngày càngtăng (16,1%) Các kháng sinh có tỷ lệ bị kháng cao nhất là tetracycline và co-trimoxazole với trên 30% Khi khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh thông dụng thườngđược dùng trong cộng đồng, dạng uống, Phạm Hùng Vân cho biết có 50% - 60% vikhuẩn kháng ampicillin với cơ chế tiết β-lactamaza ngày càng tăng và chỉ còn nhạycảm với cephalosporin thế hệ II, III và ciprofloxacin thuộc họ quinolon Theo

nghiên cứu của Nguyễn Hồng Lâm (2008) – (Bảng 1.2) cho thấy M catarrhalis đã

kháng lại hoặc nhạy cảm thấp với hầu hết kháng sinh thuộc nhóm β-lactam nhưngnhạy cảm rất cao với cefoperazol (Cephalosporin thế hệ III) với tỷ lệ 100%,cefotaxime (cephalosporin thế hệ III) đạt tỷ lệ 98,04%, ceftriaxone đạt tỷ lệ 96,08%,cefuroxime (cephalosporin thế hệ III) đạt tỷ lệ 78,43%

Bảng 1.2: Tỷ lệ kháng kháng sinh của M catarrhalis

STT Tên kháng sinh Ký

hiệu

Số chủng

Tỷ lệ phần trăm %

Nhạy (S) Trung

gian (I)

Kháng (R)

Bảng 1.3: Tỷ lệ các loài có khả năng sinh CKS [9]

1.3.2 Chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn

1.3.2.1 Khái quát lịch sử nghiên cứu

Từ rất xa xưa, với sự tìm tòi, khám phá và tích lũy kinh nghiệm thực tiễn,con người đã phát hiện, ứng dụng hiệu quả nhiều nguồn dược liệu vào mục đíchđiều trị y học Và một kỷ nguyên mới trong y học đã được mở ra với phát minh vĩđại của Alexander Fleming vào năm 1928 khi ông phát hiện ra penicillin – một chất

kháng sinh có nguồn gốc từ nấm Penicillium notatum [7] Năm 1942, quy trình sản

xuất penicillin G procain được phát minh bởi Howard Florey (1898-1968) và ErnstChain (1906-1979) Penicillin lúc này đã được bán như một loại thuốc Fleming,Florey và Chain đã cùng được trao giải Nobel Y học vào năm 1945 cho thành tựucủa mình Nhà vi sinh vật học Mỹ, Selman Waksman (1888-1973) năm 1943 đã tìm

ra chất kháng sinh streptomycin từ vi khuẩn đất, được sử dụng để điều trị các bệnhnhư lao, viêm màng não Và đây là một trong những kháng sinh có phổ rộng có khảnăng kháng được cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương

Những năm 1940-1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của chất kháng sinh,hàng loạt chất được tách chiết và xác định: actonomixin (Waksman, 1940),chloramphenicol (Erhlich, 1947), chlotetracylin (Dugar, 1948), tetracyclin (LloydConover, 1955), nystatin (1957) dùng trong điều trị bệnh nhiễm nấm Ngày nay, sốlượng chất kháng sinh đã được phát hiện lên tới trên 10.000 chất, trong đó hàngtrăm chất được dùng trong y học thực tiễn Năm 1981, amoxicillin ra đời, là mộtkháng sinh bán tổng hợp và lần đầu tiên được bán vào năm 1998 dưới tên thươngmại là amoxicillin, amoxil và trimox

Tại Việt Nam, vào những năm 1951-1952 giáo sư Đặng Văn Ngữ đã nghiêncứu sản xuất dịch lọc penicillin để rửa vết thương cho các thương binh [7] Trườngđại học Dược Hà Nội đã tiến hành rất nhiều nghiên cứu, ứng dụng khoa học kỹthuật để sản xuất các chất kháng sinh như: clotetracilin, oxytetracilin, erythromixin,neomicin,…và cũng đã thu được những kinh nghiệm nhất định

1.3.2.2 Phân loại

Chất kháng sinh được phân loại theo nhiều cách khác nhau, tùy theo mụcđích nghiên cứu và cách sử dụng chất kháng sinh

 Dựa vào mức độ tác dụng: kháng sinh diệt khuẩn, kháng sinh ức chế kìmhãm vi khuẩn.

 Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh: chất kháng sinh phổ hẹp, chất khángsinh phổ rộng

 Dựa vào nguồn gốc: chất kháng sinh từ sinh vật: vi sinh vật, thực vật ,chất kháng sinh tổng hợp hay bán tổng hợp

 Dựa vào cơ chế tác dụng

 Dựa vào cấu trúc phân tử và các nhóm chức đặc trưng: đây là nguyên lý

cơ bản được sử dụng để phân loại chất kháng sinh vì chúng đóng vai tròquyết định hoạt tính kháng sinh

 Bacteriocin

Hiện nay con người đang phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh” bởi tìnhtrạng kháng thuốc, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc, sự thiếu hụtcác nhóm kháng sinh mới [35] Trong bối cảnh này song song với việc phát triểncác chất kháng sinh phổ rộng thì việc nghiên cứu bacteriocin là vấn đề rất đángđược quan tâm

Bacteriocin là peptit hoặc protein do vi khuẩn tổng hợp, có hoạt tính khángkhuẩn [29], thuật ngữ này được đề xuất từ năm 1953 [28] Tiếp tố “in” hoặc “cin”dùng để biểu thị các peptit có hoạt tính kháng khuẩn tiết ra từ vi khuẩn Tiếp tố này

được viết thêm vào tên chi hoặc tên loài Ví dụ, bacteriocin tiết ra từ E coli được gọi là colicin, từ Bacillus subtilis được gọi là subtilin Các chữ cái đứng sau tên

bacteriocin chỉ thứ tự bacteriocin được tìm ra ở cùng một loài Bacteriocin đượcphát hiện ở hầu hết các loài vi khuẩn, đặc biệt một số loài có khả năng tiết hàngchục, thậm chí hàng trăm loại [45] Chúng rất đa dạng về chủng sản xuất, kíchthước phân tử, tính chất vật lý, hóa học, độ bền, phổ kháng khuẩn và cơ chế tácđộng Tập hợp các gen cấu trúc, gen điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin ở vi khuẩnrất đa dạng, cớ thể nằm trong hệ gen hoặc plasmit hoặc trong cả transposon

Bacteriocin được phân chia thành 2 nhóm lớn là bacteriocin của vi khuẩnGram âm và bacteriocin của vi khuẩn Gram dương [45] Vi khuẩn Gram dươngtổng hợp bacteriocin phong phú và đa dạng hơn nhiều so với vi khuẩn Gram âm Đaphần các bacteriocin có phổ kháng khuẩn không rộng, chủ yếu ức chế hoặc tiêu diệtcác vi khuẩn khác có mối quan hệ gần gũi hoặc tương đồng, có sự cạnh tranh trựctiếp về nơi sống và nguồn dinh dưỡng [39] Phổ kháng khuẩn của bacteriocin của vikhuẩn Gram dương rộng hơn so với của vi khuẩn Gram âm

Bảng 1.4 So sánh bacteriocin và chất kháng sinh dùng trong y tế [14]

Yêu cầu tương tác Đôi khi cần cắt ngắn phân tử Đích đặc hiệu

Phương thức hoạt

động

Hầu hết là tạo lỗ trên màng

tế bào chất (một số ít có thểảnh hưởng đến sinh tổng hợpthành tế bào)

Màng tế bào hoặc các đíchnội bào

Độc tính/tác dụng phụ Chưa thấy Có

1.3.3 Chất kháng khuẩn thực vật

Từ thời cổ đại, con người đã biết dùng thực vật làm thuốc chữa bệnh, trongnhững năm gần đây, ngành dược phẩm và các nhà khoa học đã dành mối quan tâmlớn đến dược liệu và phân tích thành phần kháng sinh thực vật bổ sung vào nguồnkháng sinh nhằm khắc phục tình trạng kháng thuốc hiện nay, đem lại những sản

phẩm với giá thành thấp hơn Ước tính có 14- 28% các loài thực vật được sử dụnglàm dược liệu trong y học và 74% đã được phát hiện có hoạt tính sinh học [31].

1.3.3.1 Khái niệm

Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trongthực vật có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật Các chấtkháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng

độ thường rất nhỏ [50]

Những tính chất này có thể thuộc nhiều cấu trúc hóa học khác nhau như:ankaloit, tannin, flavonoit, tinh dầu

1.3.3.2 Khái quát lịch sử nghiên cứu

Trên trái đất ước tính có từ 250.000 đến 500.000 loài thực vật [25], nhưngchỉ một tỷ lệ tương đối nhỏ (1- 10%) trong số này được sử dụng như thực phẩm cho

cả con người và động vật Thực vật cũng được sử dụng như là nguồn dược liệu quýgiá cho con người từ ngàn xưa Vào cuối thế kỷ thứ V trước Công nguyên,Hippocrates đã đề cập 300 đến 400 dược liệu từ thực vật Theo Moerman [44]người Mỹ bản xứ tại Bắc Mỹ đã sử dụng 1.625 loài thực vật làm thực phẩm, trongkhi đó có đến 2.564 loài được dùng làm thuốc Uớc tính có 14-28% các loài thực vật được sử dụng trong y học và 74% đã được phát hiện là có hoạt tính sinh học [31] Châu Á là khu vực có nền y học cổ truyền phát triển từ lâu đời đặc biệt là tại Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam…

Với tình trạng kháng thuốc kháng sinh hiện nay việc nghiên cứu, phát triển sản xuất các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ thực vật đang là mối quan tâm lớn của các nhà khoa học, ngành y học, dược học Việt Nam với điều kiện khí hậu và thảm thực vật đa dạng, phong phú đã và đang phát triển các nghiên cứu về các hoạt chất có tính kháng khuẩn từ thực vật dựa vào những bài thuốc cổ truyền từ ngàn xưa để lại Theo các số liệu thống kê mới đây, thảm thực vật tại Việt Nam có trên 12000 loài, trong số đó có trên 3200

loài được sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền [16] Tại Việt Nam đã có nhiều đề tài nghiên cứu về hợp chất kháng khuẩn từ thực vật và đã thu được những kết quả nhất định trên các đối tượng như: tỏi, đu đủ, anh đào, lá dứa, thanh long, lá lốt, dừa cạn, dâm bụt, sống đời, xoan, bồ công anh Việt Nam, diệp hạ châu, đinh lăng…

1.3.3.3 Phân loại các hợp chất kháng khuẩn của thực vật

Thực vật có khả năng tổng hợp chất thơm, hầu hết là phenol hoặc dẫn xuất oxy Chúng đều là hợp chất thứ cấp, hiện nay đã phân lập được khoảng

12000 loại, chiếm tỷ lệ ước tính dưới 10% tổng số hợp chất thứ cấp [42] Trong đó đa số các hợp chất thứ cấp có vai trò bảo vệ cây trồng chống lại những sinh vật hại chúng như: vi sinh vật, côn trùng, động vật Ví dụ như nhóm terpenoid tạo mùi hôi, nhóm quinon và tannin tạo sắc tố trên thực vật, một số chất tạo hương vị và một số được dùng làm dược phẩm và thực phẩm cho con người

Các hợp chất kháng khuẩn thực vật gồm có:

 Ankaloit: berberin, piperin

 Phenol và polyphenol: phenol, axit phenol, catechol, pyrogallol, quinon, flavon, flavonoit….

 Terpenoit: tinh dầu, saponin

 Và một số hợp chất khác như: lectin, polyacetylen

1.3.4 Cơ chế kháng khuẩn

Chất kháng sinh có thành phần và cấu trúc hóa học đặc trưng nên không có một cơ chế tác dụng chung đối với vi sinh vật Đặc tính và cơ chế phụ thuộc vào bản chất hóa học của từng chất, nồng độ và cấu trúc của vi sinh vật Nhìn chung chất kháng sinh có các cơ chế tác dụng như sau:

 Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào vi khuẩn: penicillin, bacitracin, vancomycin Do tác dộng lên quá trình tổng hợp thành tế bào nên làm cho vi khuẩn dễ bị phá vỡ do thay dổi áp suất thẩm thấu

 Ức chế chức năng của màng tế bào: colistin, polymycin, gentamicin, amphoterricin Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân

tử có khối luợng lớn và các ion bị thoát ra ngoài, vi khuẩn bị tiêu diệt

 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein:

- Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosom làm cho quá trình dịch mã không chính xác

- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosom ức chế enzym peptidyltransferaza dẫn đến không kéo dài chuỗi.

- Nhóm macrolid và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosom sẽ ức chế giải phóng axit amin khỏi phức hợp aa-tARN-riboxom-mARN

 Ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic:

- Nhóm refampin gắn với enzym ARN polymeraza ngăn cản quá trình sao mã tạo thành ARN thông tin

- Nhóm quinolon ức chế tác dụng của enzym DNA gyraza làm cho hai mạch đơn của ADN không thể duỗi xoắn, ngăn cản quá trình nhân đôi của ADN

- Nhóm sulfamid có cấu trúc giống PABA (axit p- aminobenzoic)

có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp axit nucleic

- Nhóm trimethoprim tác động vào enzym xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic.

1.4 CÂY TÁO MÈO VÀ DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ TÁO MÈO

1.4.1 Đặc điểm thực vật học

Cây táo mèo hay còn gọi là cây chua chát, tên khoa học là Docynia indica,

thuộc họ hoa hồng (Rosaceae)

Dạng sống là dạng bụi hoặc gỗ nhỏ, ưa sáng, chiều cao 5-10 mét, cây phâncành sớm, tán tròn, trên nhánh và thân non có gai, mọc rải rác trong rừng ở độ cao1300-2000 mét

Lá mọc so le, hình thuôn, gốc tròn đầu nhọn, mép lá nguyên, mặt dưới cólông bạc mịn, mặt trên màu xanh lục, có 2 lá kèm rụng sớm Rụng lá hoàn toàn vàocuối mùa đông, ra lá non vào tháng 3

Mùa ra hoa vào tháng 2-4, hoa màu trắng, mọc thành cụm 3- 5 hoa ở nách láhoặc đầu cành, cuống ngắn, đài dày có lông trắng, hoa mỏng manh và không cólông, nhị ngắn, vòi nhụy dài…[6]

Quả chín vào tầm tháng 8- 9-10, quả thịt hình trứng, chín có màu vàng nhạt,

vị chua chát và có mùi thơm đặc trưng

1.4.2 Sự phân bố

Cây táo mèo là cây ưa sáng, ưa khí hậu ẩm mát của vùng nhiệt đới núi cao,nhiệt độ trung bình năm 15- 180C, lượng mưa 1.500 – 3.800mm/năm và độ ẩmtrung bình khoảng 85%

Trên thế giới cây có ở một số nước như: Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma, TháiLan Tại Việt Nam, cây phân bố tại: Ðiện Biên (Tuần Giáo, đèo Pha Ðin), Lai Châu(Sìn Hồ), Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Ðồng Van, Quản Bạ, Mèo Vạc); Yên Bái (MùCang Chải) [6]

1.4.3 Tác dụng dược lý

Quả táo mèo được dùng phổ biến trong Đông y, có thể dùng thay thế haytương tự như vị thuốc sơn tra với nhiều tác dụng như làm thuốc bổ tỳ, vị, kích thích

tiêu hóa, giúp ăn ngon, dễ tiêu chống đầy bụng, ợ chua, giúp tăng cường miễm dịch,giảm cholesterol, hạ mỡ máu, đại tiện xuất huyết, chữa toàn thân đau mỏi dướidạng thuốc sắc, cao lỏng hoặc tán bột uống

Điều đáng chú ý nhất táo mèo có tác dụng hạ huyết áp nhờ làm giãn mạchngoại vi Mặt khác còn giúp hạ mỡ máu, chống huyết khối làm giãn động mạchvành, cải thiện sức co bóp của cơ tim, phòng chống tích cực các biến chứng do caohuyết áp gây ra

Ngoài ra, chúng còn có tác dụng ức chế các trực khuẩn: thương hàn, bạchhầu, lị, tụ cầu vàng, giảm chứng suy hô hấp…

Trong dân gian, táo mèo dùng ngâm với rượu uống để tăng cường sức khỏe,kích thích tiêu hóa và dùng làm siro táo mèo hay chế biến ruợu vang Dịch lên menquả táo mèo - giấm táo mèo gần đây được lan truyền và phổ biến rộng rãi trongcộng đồng với tác dụng phòng chống béo phì,tăng cường khả năng miễn dịch vàkhả năng kháng khuẩn, chữa bệnh viêm đường hô hấp: ho, viêm amidan

1.4.5 Tình hình nghiên cứu táo mèo tại Việt Nam

Hiện nay trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về cây táo mèo Docyniaindica, đặc biệt là về tác dụng kháng khuẩn của quả táo mèo

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Loan [15] cho thấy tác dụng chống béo phì và giảm trọng luợng của dịch chiết quả Táo mèo Docynia

indica (Wall.) Decne trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm Theo Vũ ThịHạnh Tâm [20] nghiên cứu và ghi nhận vai trò hạ lipit và đường huyết của dịchchiết quả táo mèo trên chuột Hoàng Thị Minh Tân [21] quả và lá táo mèo có khả năng chống rối loạn trao đổi gluxit và lipit Vũ Thị Huê, Bùi Thị Việt Hà[49] đã có những nghiên cứu sơ bộ ghi nhận về tác dụng kháng khuẩn của dịch lênmen quả táo mèo.

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Nguồn giống

Các chủng Vi sinh vật kiểm định lấy từ Bảo tàng Giống chuẩn VSV, Viện

VSV và Công Nghệ Sinh học - ĐH Quốc gia Hà Nội, gồm các chủng; Shigella

flexneri Klebsiella 814;E coli 883; Salmolella typhi

VTCC-B-897; Vibrio VTCC-B-652, Moraxella catarrhalis ATCC 43617.

Chủng Moraxella catarrhalis kháng kháng sinh, Staphylococcus aureus phân

lập tại Bệnh viện Tai – Mũi – Họng Trung ương

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

 Hóa chất

- Các thành phần hóa chất dùng làm môi trường

- Các hóa chất dùng trong tách chiết hợp chất thiên nhiên: DMSO, silicagel,florisil 100- 200 U.S.mesh,ethylaxetat, metanol, n-Butanol,…

 Thiết bị: tủ ấm, máy lắc ổn nhiệt, máy đo pH, máy ly tâm lạnh, máy cô chânkhông, thiết bị đông khô, hệ thống chiết pha rắn, cột sắc ký…

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phương pháp lên men quả táo mèo

Sử dụng 1kg quả táo mèo tươi, rửa sạch, cắt thành các phần nhỏ, để nguyênhạt, cho vào bình thủy tinh Bổ sung 3 lít nước đun sôi ấm (khoảng 400C), 300 gđường, 30 g muối , đậy kín bình bằng vải màn Sau một tháng thu dịch lên men quảtáo mèo – giấm táo mèo

2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Dịch lên men quả táo mèo đã thu được nhỏ vào các giếng thạch trên đĩa petri

có chứa sẵn vi khuẩn Moraxalla catarrhalis Để trong tủ lạnh từ 4-8 giờ, sau đó để

vào tủ ấm Kết quả sau 72 giờ cho thấy giấm táo mèo có khả năng ức chế sự sinh

trưởng của vi khuẩn M catarrhalis Vì vậy, tiến hành phân lập vi khuẩn từ dịch lên

men quả táo mèo Pha loãng dịch giấm bằng nước cất khử trùng theo hệ thập phân ởcác nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-6 và tran đều trên đĩa petri chứa môi trườngthạch thường để tìm chủng vi khuẩn có hoạt tính mong muốn

2.2.3 Xác định hoạt tính kháng sinh và enzym

2.2.3.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch

Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm địnhtrong đĩa petri Dịch nuôi vi khuẩn 2 ngày ở nhiệt độ thích hợp được ly tâm với tốc

độ 6000 vòng/phút, ở 4oC trong 15 phút sau đó được nhỏ với lượng 0,1 ml vào mỗi

lỗ thạch Đọc kết quả sau 2 ngày hoạt tính kháng sinh xác định dựa vào kích thướcvòng vô khuẩn (D-d, mm) Trong đó, D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đườngkính lỗ khoan

2.2.3.2 Xác định hoạt tính enzym

Xác định khả năng sinh enzym ngoại bào (proteaza, kitinaza, xenlulaza,amylaza) trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp khuếch tán trên thạch chứa 1% cơchất tương ứng (cazein, kitin, CMC, tinh bột tan)

Môi trường gồm cơ chất và thạch được khử trùng ở 1atm trong 30 phút, sau

đó được đổ vào các đĩa petri đã được vô trùng, với độ dày thạch khoảng 3mm, đợinguội, dùng khoan nút chai để đục các lỗ thạch trên môi trường Nhỏ 200µl dịchnuôi cấy vi sinh vật vào các lỗ thạch, rồi để vào tủ lạnh 4-5h cho enzym khuếch tánvào thạch, sau đó chuyển vào tủ ấm 30-32oC Sau 24 giờ đem ra hiện vòng phân giảibằng cách nhuộm màu các đĩa bằng dung dịch Lugol (với cơ chất là CMC, kitin,tinh bột) và bằng axit triclo axetic với cơ chất là cazein

Hoạt tính enzym được xác định qua kích thước vòng phân giải theo côngthức: Hoạt tính enzym = D-d (mm) Trong đó: D là đường kính vòng phân giải, d làđường kính lỗ khoan

2.2.4 Bảo quản giống

Vi khuẩn được nuôi trong ống thạch nghiêng thạch thường, nuôi ở nhiệt độphòng Sau khoảng 10-14 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt cất vào tủ mát ở nhiệt độ 4-

6oC Sau 1-2 tháng cấy truyền lại một lần

Nhằm bảo quản được giống lâu hơn, để giống trong ống cát, trong paraffinlỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được từ 6 thángđến 2 năm

2.2.5 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học-OD

Số lượng tế bào VSV trong dịch nuôi có thể xác định gián tiếp bằng cách đo

mật độ quang học Dịch nuôi được pha loãng 5 lần, đo OD ở bước sóng 620nm 2.2.6 Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn

Vi khuẩn được lên men trên môi trường dịch thể trong bình nón dung tích250ml với các thành phần và các yếu tố liên quan như sau:

 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp

Chủng nghiên được nuôi cấy lắc 220 vòng / phút trên các môi trường khácnhau ở nhiệt độ và pH thích hợp Sau 2 ngày xác định pH sau nuôi cấy, mật độ tếbào và hoạt tính kháng khuẩn

 Ảnh hưởng của pH

Nuôi lắc vi khuẩn 220 vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp sau khi đã điều chỉnh

pH ban đầu của môi trường ở các giá trị pH khác nhau với bước nhảy bằng 1 Xácđịnh OD, pH, hoạt tính kháng khuẩn sau nuôi cấy

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Bổ sung vào môi trường nuôi cấy thích hợp 1% các nguồn cacbon khác nhaulà: kitin, tinh bột tan, dextrin, glucoza, CMC, lactoza, bột ngô Tiến hành nuôi cấy

lắc vi khuẩn với vận tốc 220 vòng/phút Sau 2 ngày xác định OD, pH sau khi nuôicấy, hoạt tính kháng khuẩn.

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Bổ sung nguồn nitơ khác nhau vào môi trường thích hợp với các hàm lượng1%: NaNO2, NaNO3, (NH4)2SO4, bột đậu tương, cao nấm men, peptone Các bướctiếp theo tiến hành tương tự như trên

 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trên môi trường với nguồn cacbon, nitơ, pH thíchhợp, cứ sau 24h lại lấy mẫu để xác định OD, pH, hoạt tính enzym, hoạt tính khángkhuẩn

2.2.7 Tách chiết các hợp chất trong dịch lên men vi khuẩn và dịch lên men quả táo mèo [18]

2.2.7.1 Phương pháp đông khô

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ởtrạng thái lạnh sâu Ở đây mẫu được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết

bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định (mẫuđược hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không) Đây là phương pháp phổbiến có hiệu quả cao dùng để bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấmsợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut nhưng đôi khi cũng được sử dụng để đưadịch chiết thành dạng cao chiết

2.2.7.2 Phương pháp sắc ký cột

 Khảo sát hệ dung môi rửa giải và pha rắn hấp phụ

Nhồi pha hấp phụ rắn (Silicagel 0,063-0,2mm, Florisil 100-200 U.S.mesh)vào cột xilanh cỡ 1 (d = 5mm) từng lượng nhỏ, lắc đều, thông số thiết kế cột đượctrình bày ở bảng 2.1:

Bảng 2.1: Thông số thiết kế cột nhồi

Pha hấp phụ Khối lượng (g) Chiều cao cột nhồi (cm)

Pha mẫu vào methanol nồng độ khoảng 0,01 g/ml rồi đưa lên cột 0,2 ml dungdịch này Đưa cột lên hệ thống chiết pha rắn và thử nghiệm sơ bộ để khảo sát chấthấp phụ và hệ dung môi rửa giải

Hệ dung môi rửa giải được thử nghiệm là:

n-Hexan, Cloroform, Ethylaxetat, n-Butanol n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanoln-Hexan, n-Butanol, Aceton, NướcKết quả nghiên cứu sơ bộ thấy chất hấp phụ silicagel và hệ dung môi rửa giảin-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol có thể tách phân đoạn tương đối tốt và phùhợp Do đó ta đi khảo sát quá trình tách phân đoạn dịch chiết táo mèo và dịch lênmen trên cột sắc ký nhồi to hơn

 Phân đoạn dịch chiết trên sắc ký cột

- Nhồi cột: Silicagel được sấy ở 3000C trong 2h và để nguội trong bình hút

ẩm sau đó nhồi cột có đường kính 1cm, chiều cao là 22cm

- Luyện cột: dùng metanol để hoạt hóa pha rắn, làm ướt để pha rắn có thể

sẵn sàng tiếp xúc và tương tác với các chất tan Tránh không làm khô pha rắn trong

và sau khi luyện cột

- Cân bằng cột: tương tự như bước 2 (nhưng phải dùng chính dung môi chứa

mẫu như ban đầu để cho vào cột) dùng metanol

- Đưa mẫu vào cột: pha các mẫu cao chiết trong methanol ở nồng độ 0,01g/

ml Đưa 5ml dung dịch trên lên cột nhồi

- Rửa giải trên cột: dùng hệ dung môi rửa giải là: n-Hexan, Cloroform,

Aceton, methanol với tỷ lệ phối trộn khác nhau sao cho mức độ phân cực tăng dần.Tốc độ dòng điều chỉnh sao cho thời gian tiếp xúc giữa dung môi rửa và pha rắn kéodài trong 1-2 phút

Kiểm tra các phân đoạn trên sắc ký bản mỏng để thu gom các phân đoạn cókết quả triển khai tương tự nhau trong cùng một hệ dung môi có kết quả gần giốngnhau

2.2.7.3 Phương pháp kiểm tra phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng

Sấy bản mỏng rồi cắt thành từng tấm theo kích thước nhất định Đánh dấuđường xuất phát cách mép dưới 0,5 –1 cm Dùng ống mao quản hút dung dịch mẫuthử rồi chấm lên bản mỏng Vết chấm phải tròn, gọn và đưa được lượng mẫu phùhợp Sau đó đặt bản mỏng đã chấm vào bình triển khai sắc ký với hệ dung môi triểnkhai đã được bão hòa, đậy nắp bình Sau khi dung môi chạy đến cách đầu trêncủa bản khoảng 0,5-1 cm thì lấy ra, đánh dấu mức dung môi trên bản mỏng, sấy khôbản mỏng rồi soi UV hoặc phun các thuốc thử hiện màu như dung dịch H2SO4 10%rồi sấy khô cho dung môi bay hết để vết triển khai trên bản mỏng được hiện rõ.Các hệ dung môi triển khai đã thử nghiệm khi nghiên cứu các phân đoạn trênbản mỏng bao gồm:

1 TEAF - Tuluen: Ethylacetae: Acetone: Acid Focmic = 5:3:1:1

2 Ethylaxetat: axit focmic: nước = 8:1:1

3 Toluen: Ethylaxetat: axit focmic = 5:4:1

4 [Axit acetic (2,4%) – Etanol –Acetonitril (35: 5: 10)] - Metanol : (70: 30)

5 Metanol – Axit acetic – Nước (36,7%: 0,3%: 63%)

6 Axit acetic (0,28%) – Metanol – Acetonitril (35: 5: 10)

7 n-Butanol – Axit acetic – Nước (85: 5: 10)

8 n-Butanol – Etyl acetat – Dimetyl formamit – Nước (10: 6: 3: 2)

9 Toluen – Etyl acetat – Aceton – Axit formic (15: 2: 2: 1)

10 Benzen – Aceton (4:1): Benzen – Pyridin – Axit formic (36: 9: 5)

2.2.8 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết quả táo mèo và phân đoạn kháng khuẩn

2.2.8.1 Thử định tính flavonoit

Phản ứng Shinoda Pha mẫu thử trong ethanol với một lượng thích hợp, bổ

sung vài giọt axit clohidric đặc và chia dung dịch thành hai ống nghiệm

Phản ứng với axit sulfuric: cũng tiến hành pha và chia dung dịch mẫu thử

tương tự như trên

Phản ứng gelatin/ NaCl: Cũng tiến hành tương tự như trên nhưng bổ sung

vào ống 2 vài giọt thuốc thử gelatin/NaCl Kết quả dương tính khi ống nghiệm cóhiện tượng vẩn đục

Phản ứng với acetate chì: Bổ sung vài giọt thuốc thử acetat chì 10% vào

dung dịch mẫu thử với cách pha tương tự như trên Kết quả là dương tính thì sẽ xuấthiện kết tủa

Phản ứng với FeCl 3 1% trong nước Cách pha mẫu và phân chia mẫu tương

Phản ứng Dragendrorff cải tiến.

Lấy lượng 0.01g cao dịch chiết trong 1ml CH3COOH 2%, lọc để thu dịchlọc Lấy khoảng 1ml mẫu thử cho vào ống nghiệm

Ống 1 : Dùng làm đối chứng

Ống 2: nhỏ từ từ thuốc thử vào ống 2 Thành phần thuốc thử gồm có Bi(NO3)3 vàKI trong dung dịch acid axetic Kết quả dương tính sẽ cho kết tủa màu đỏ

da cam hay đỏ gạch