Luận văn nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Bệnh lao đang trởnên nghiêm trọng hơn với sự xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc Multi-DrugsResistant - MDR, tức là thể lao với vi khuẩn kháng ít nhất hai loại thuốc chố

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lời cảm ơn!

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học – người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thái Sơn Học viện Quân y cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận.

Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh học và các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, trường Đại học KHTN đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập

và nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.

Học viên

Nguyễn Văn Bắc

: Deoxyribonucleotide Triphosphate: Extensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng): Ethambutol.

: Ba loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin: Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin và ethambutol: Isoniazid

: Isopropyl-thio-β-D-galactoside: Kilo base

: Luria - Bertani: Multidrugs resistant (Kháng đa thuốc) : Paraminosalicylic acid

: Pyrazinamid: Polymerase Chain Reaction: Rifampicin

: Acid Ribonucleic : Rifampin resistance determining region (Vùng quyết định kháng rifampicin)

: Thermus aquaticus DNA polymerase

: Tổ chức Y tế Thế giới: Volume (thể tích): 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN 3

1.1 BỆNH LAO 3

1.2 TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC 3

1.3 VI KHUẨN LAO 5

1.3.1 Cấu tạo 5

1.3.2 Cơ chế gây bệnh 8

1.3.3 Đặc điểm hệ gen 9

1.4 CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO 9

1.4.1 Kháng sinh trong điều trị lao 9

1.4.2 Nguyên nhân gây kháng thuốc 10

1.4.3 Rifampicin và cơ chế kháng 12

1.4.4 Isoniazid và cơ chế kháng 15

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC 16

1.5.1 Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng 16

1.5.2 Xác định kiểu hình 18

1.5.3 Xác định kiểu gen 18

1.5.4 Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR 19

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 23

2.1.3 Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 25

2.2.2 PCR nhân đoạn gen đích 26

2.2.3 Tạo dòng gen 27

2.2.4 Multiplex real-time PCR 28

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 30

3.1.1 Kết quả nhân gen katG và rpoB từ DNA tách từ vi khuẩn lao 30

3.1.2 Kết quả tách dòng gen 31

3.1.3 Kết quả phân tích trình tự gen katG 34

3.1.4 Kết quả phân tích trình tự gen rpoB 36

3.2 TỐI ƯU HÓA PHẢN ỨNG MULTIPLEX REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 41

3.2.1 Thiết kế các primer và probe cho phản ứng multiplex real-time PCR 41 3.2.2 Kết quả tối ưu thành phần và chu trình phản ứng multiplex real-time PCR phát hiện đột biến liên quan kháng thuốc 44

KẾT LUẬN 60

KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 69

MỞ ĐẦU

Bệnh lao và vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) đã được biết rõ từ một

thế kỷ nay Hiện nay tỷ lệ nhiễm lao được ước tính là 1/3 dân số thế giới, khoảng 9triệu người mắc lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm Bệnh lao đang trởnên nghiêm trọng hơn với sự xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc (Multi-DrugsResistant - MDR), tức là thể lao với vi khuẩn kháng ít nhất hai loại thuốc chống laomạnh nhất là isoniazid (INH) và rifampicin (RMP) Theo số liệu thống kê của chươngtrình chống lao Quốc gia năm 2007, thế giới có khoảng 511.000 trường hợp nhiễm laokháng đa thuốc, trong đó có hơn 130.000 trường hợp tử vong Do những khó khăntrong việc điều trị những bệnh nhân mang các chủng lao kháng thuốc phổ rộng và đakháng mà việc phát hiện sớm các chủng lao kháng đa thuốc sẽ trở nên rất quan trọngtrong điều trị bệnh lao

Hiện nay nhiều nơi chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc vẫn dựa vào phươngpháp nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ là chủ yếu, tuy nhiên, việc ứng dụng sinhhọc phân tử cũng đang tạo ra những đột phá trong phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc

Cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn lao là do trong quá trình tiến hóa, có nhiều đột biến

xuất hiện trong một số gen chức năng, trước hết là ở gen rpoB và katG Thời gian chẩn

đoán có thể rút ngắn chỉ còn vài ngày, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiệncho kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩnđoán lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do xuất hiện các đột biếntrên gen tương ứng chịu trách nhiệm Chính vì vậy việc xác định các trường hợp nhiễmlao kháng thuốc thường đi kèm với những chẩn đoán phát hiện đột biến gen đối với cácchủng lao phát hiện được Các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid là do có liên quan

tới đột biến tại codon 315 trên gen katG, đối với các chủng kháng rifampicin do xuất hiện các đột biến ở một vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung tâm của gen rpoB

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát

hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”

Với mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng

thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR.

Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành một số nội dung nghiêncứu như sau:

1 Xác định trình tự gen rpoB và katG.

2 Phân tích đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân

lập tại Việt Nam trên cơ sở trình tự nucleotide của hai gen rpoB và katG.

3 Tối ưu hóa thành phần và chu trình bộ kit multiplex real-time PCR pháthiện nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc

được bác sĩ Robert Koch đã phát hiện vào ngày 24/3/1882 Trong thời gian này ở Mỹ

và châu Âu, cứ 7 người thì có 1 người chết vì lao, do vậy, phát hiện của Robert Koch làmột bước ngoặt quan trọng trong việc khống chế và loại trừ căn bệnh này Trước đây,lao được xem là một trong những căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới,lưu hành với tỷ lệ mắc bệnh khá cao, đặc biệt ở các nước thuộc châu Phi và khu vựcchâu Á, trong đó có Việt Nam

Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu.Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc vàPhilippines về số bệnh nhân lao, cũng như số bệnh nhân lao xuất hiện hằng năm Hiệnnay nguy cơ nhiễm lao ở nước ta hằng năm được ước tính là 1,5% dân số (ở các tỉnhphía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%) Trên thực tế chỉ số nguy cơ nhiễm laohàng năm có thể cao hơn 1,5%, như vậy, các con số nêu trên còn có thể lớn hơn Điều

đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác phòng chống lao không những trong cácnăm tới mà có thể trong thời gian khá dài, có thể đến hàng chục năm, ngay cả khi ởthiên niên kỷ mới [3, 35]

1.2 TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC

Bệnh lao ngày càng trở nên phức tạp và có ảnh hưởng nặng nề khi xuất hiệnthêm vi khuẩn lao kháng thuốc tạo nên một dạng bệnh khó phòng chống Các chủng

lao kháng thuốc được chia làm hai thể, đó là lao kháng đa thuốc (Multidrugs resistant MDR) và lao kháng thuốc phổ rộng (Extensively drug resistant - XDR), những chủng

-vi khuẩn lao kháng thuốc này là nguồn lây nhiễm và là mối đe dọa cho sức khỏe củacộng đồng Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 42vạn người mắc lao kháng đa thuốc, chiếm số lượng lớn nhất là ở khu vực Tây TháiBình Dương có 15 vạn trường hợp, kế đến là khu vực Đông Nam Á và sau đó là khuvực Châu Phi và Đông Âu Một số chủng lao vừa kháng đa thuốc vừa kháng thuốc phổ

rộng, có thể coi là loại siêu kháng thuốc [17] Tình hình lao siêu kháng thuốc cũng

ngày càng trở nên trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến 11/2005, WHO và Trungtâm Kiểm soát Bệnh Hoa Kỳ đã phân tích 17.890 mẫu đờm gửi từ 40 quốc gia trên toànthế giới, và thấy rằng có 20% trường hợp là kháng đa thuốc và 2% trường hợp là khángthuốc phổ rộng Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Chương trình Chống lao Quốc giathì có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới mang vi khuẩn lao kháng thuốc [1, 3]

Vi khuẩn lao kháng thuốc là một thách thức lớn, đe dọa công cuộc phòng chốnglao trên toàn cầu, vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn laokháng lại nhất là kháng đa thuốc [10] Thuốc chống lao có nhiều loại, tác dụng của mỗithuốc trên trực khuẩn lao không giống nhau Hiện nay người ta chia thuốc chống laothành hai loại: (1) các thuốc chống lao chủ yếu (còn gọi là các thuốc chống lao loạimột, thuốc chống lao hàng đầu), (2) các thuốc chống lao thứ yếu (còn gọi là các thuốcchống lao loại hai, thuốc chống lao hàng thứ hai) Trong khi các thuốc chống lao loạimột là những thuốc có hiệu quả nhất và cũng ít độc tính nhất, thì các thuốc chống laohàng thứ hai là những thuốc có tác dụng kém hơn lại có độc tính cao và giá thành rấtđắt Ở New York, chi phí điều trị bệnh nhân nhạy với thuốc chỉ mất 2.000 USD trongkhi đó điều trị bệnh nhân kháng thuốc hết 250.000 USD Hiện nay số tử vong hàngnăm do lao trên thế giới còn lớn hơn số tử vong do HIV, sốt rét và các bệnh nhiệt đớicộng lại Tổ chức Y tế Thế giới đã nhận định bệnh lao hiện nay đã quay trở lại và trở

Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng vài nămsau khi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy hiện tượng đề kháng lạistreptomycin của vi khuẩn lao Sau đó các kháng sinh chống lao khác tiếp tục ra đời:para – aminosalysilic, isoniazid, rifampicin nhưng đều không mang lại hiệu quả saumột thời gian điều trị nhất định [7] Nghiên cứu tìm kiếm hoá dược mới có hiệu quảđiều trị lao, đặc biệt là lao kháng thuốc luôn luôn được thực hiện và càng ngày càng

có nhiều hợp chất chống lao mới được đưa vào sử dụng, ví dụ, gần đây là linezolid[43] Tuy nhiên, theo cơ chế và áp lực, vi khuẩn không ngừng biến đổi tạo nên nhiềuchủng mới hơn có khả năng kháng thuốc nhanh chóng hơn [52] Khả năng điều trịthành công có thể đạt 95-100% đối với những bệnh nhân mắc lao thông thường, trongkhi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc chỉ là 20 – 30%, thậm chícòn không điều trị được khi mắc lao kháng đa thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù

đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao Vì vậy, việc phát hiện và ngănchặn sự lan truyền các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điềutrị lao hiện nay [7, 10, 35]

1.3 VI KHUẨN LAO

1.3.1 Cấu tạo

Trực khuẩn lao có dạng hình que, thân mảnh dẻ, không có nha bào, kích thước 2

- 3 µm, dày 0,3 µm, kháng cồn, kháng acid (hình 1.1) Khi được nhuộm bằng phươngpháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, do không bị cồn và acid làmmất màu carbonfuchsin Ở môi trường nuôi cấy có độ acid đậm đặc nhất định, trựckhuẩn lao vẫn phát triển được, vì vậy, chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, khángtoan (acid fast bacilli - AFB), đây là đặc điểm nổi bật của vi khuẩn thuộc chimycobacteria Đặc điểm này rất quan trọng để phát hiện trực khuẩn lao bằng phươngpháp hình thái học (nhuộm màu) trong các mẫu bệnh phẩm Một số giả thiết cho rằng

mức kháng acid là do độ dài của các chuỗi mycolic acid M tuberculosis có khả năng

thể hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, amino acid và các enzymecofactor thiết yếu của tế bào Mycobacteria có cấu trúc gần giống với vi khuẩn Gramdương nhưng chúng không được xếp vào loại vi khuẩn Gram dương do các phân tử gắnvới thành tế bào là lipid chứ không phải protein hay polysaccharide Do đó, chúngkhông giữ lại tinh thể màu tím xuất hiện trong nhuộm Gram [2, 5, 37, 38].

Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất ở 37oC và dưới áp suất của O2 là

100 mmHg Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn thường hay mắc lao nhất vì có ápsuất O2 từ 120 – 130 mmHg (khi đứng) rồi đến thân xương và đầu xương vì áp suất O2

ở đây là 100 mmHg Lách, gan, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn vì áp suất O2 thấp

Trực khuẩn lao sinh sản rất chậm, cứ 20 giờ mới có một lần phân chia tế bào,

trong điều kiện phòng thí nghiệm thì cứ 12 đến 24 giờ M tuberculosis phân chia một

lần trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng Loewenstein [46] Tốc độ phát triểnchậm có thể là do tính thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ chất dinhdưỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome (Hình 1.2)

- Lớp trong cùng có cấu trúc màng, có thành phần chủ yếu là các phospholipidgồm 2 nhóm: nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kỵ nước quay ra ngoài Cấutrúc này tạo nên màng sinh học có tác dụng giúp trực khuẩn điều hòa sự thẩm thấu của

vỏ ngoài trực khuẩn, màng còn chứa các protein chức năng khác như các protein truyềntín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liênquan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng, các chất mang làm trung gian choquá trình vận chuyển các chất dinh dưỡng và các ion Các enzyme xuyên màng và tổnghợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia tế bào, tập hợp và tiết một số enzymengoại bào, sao chép DNA [2, 4, 37, 38]

- Lớp tiếp theo là peptidoglucan liên kết với đường arabinose và các phân tửmycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn có

độ cứng nhất định Thành tế bào của mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất được biết

ở prokaryote, có một số thành phần hóa học và liên kết chéo bất thường, mức độ liên

kết giữa peptidoglucan ở thành tế bào M tuberculosis là 70 - 80% trong khi ở vi khuẩn

E coli là 20 - 30% [38]

- Lớp ngoài được tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các chấtphức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc phức tạp làmtăng khả năng chống thấm nước của thành tế bào vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn tạilâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị hủy diệt bởi đại thực bào và các tếbào miễn dịch [38]

- Lớp vỏ ngoài cùng có vai trò rất quan trọng, có cấu trúc peptidoglyolipid

Nó đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững với hiệntượng thực bào, giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu nên khi vào cơ thể trực khuẩnkhó bi tiêu diệt

Hình 1.3 Cấu tạo thành tế bào

của M tuberculosis

(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis/Research/basicResearch/biologycell.htm§)

1.3.2 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn lao có thể xâm nhập vào cơ thể qua nhiều con đường khác nhau:thường là đường hô hấp, hoặc có thể qua đường tiêu hóa, da, kết mạc mắt Sau khi gâytổn thương tiên phát, vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu đểđến gây tổn thương thứ phát ở các cơ quan khác: Phổi, thận, màng não, xương, hạchnhưng thường bị hơn cả là đỉnh phổi, nơi có áp suất oxy là 120 mmHg vì đây là điều

kiện hoạt động tốt cho vi khuẩn lao Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord

factor” (trehalose - 6,6’- dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu,

gây nên những u hạt mạn tính [7]

Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể, trong cơ thể xuất hiện đáp ứng miễn dịchqua trung gian tế bào Lúc này, đại thực bào, các tế bào lympho T, lympho B và cácnguyên bào sợi kết tập lại tạo các u hạt, với các tế bào lympho vây quanh đại thực bào

Chức năng của các u hạt không chỉ ngăn cản sự lan tỏa của tế bào M tuberculosis mà

còn tạo môi trường tại chỗ cho các tế bào của hệ miễn dịch trao đổi thông tin [23] Bên

trong các u hạt, tế bào lympho T tiết ra các cytokine, như γ interferon, hoạt hóa đạithực bào khiến chúng diệt khuẩn tốt hơn Tế bào lympho T cũng tiêu diệt trực tiếp các

tế bào bị nhiễm Nhưng điều quan trọng là vi khuẩn không bị u hạt loại trừ hoàn toàn

mà trở nên bất hoạt tạo dạng nhiễm khuẩn “tiềm ẩn” (latent tuberculosis) [18]

1.3.3 Đặc điểm hệ gen

Toàn bộ hệ gen của vi khuẩn lao M tuberculosis chủng H37Rv được giải trình

tự, phân tích và công bố năm 1998 gồm 4.411.529 bp, với đặc tính là chứa nhiềuguanine và cystosine (G + C khoảng 65 %) Trên 90% trình tự được dự đoán là có mãhóa cho protein và chỉ có 6 gen giả (pseudogene - gen không mang thông tin ditruyền mã hóa cho protein) [28, 38, 44] Dữ liệu hệ gen của một số vi khuẩn thuộc chi

Mycobacterium, trước hết là của vi khuẩn lao (M tuberculosis) và vi khuẩn phong

(M leprae) có tầm quan trọng đặc biệt trong nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử

hỗ trợ dịch tễ học, di truyền học và nghiên cứu kháng thuốc, số liệu đã được lưu giữtại một số trung tâm và có thể sử dụng một số chương trình để truy cập khám phá và

sử dụng [11, 53]

1.4 CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO

1.4.1 Kháng sinh trong điều trị lao

Thuốc chống lao có nhiều loại, và tác dụng của chúng lên trực khuẩn lao cũngkhông giống nhau Hiện nay người ta chia thuốc chống lao làm hai loại: (1) Các thuốcchống lao chủ yếu: gồm năm thuốc chủ yếu đó là: isoniazid (INH), rifampicin (RMP),ethambutol (EMB), pyrazinamid (PZA), streptomycin (SM) Đây là những thuốc khánglao hiệu quả và cũng ít độc tính nhất (2) Các thuốc chống lao thứ yếu: là những thuốcchống lao có tác dụng kém hơn và có độc tính cao, không được dùng trong phác đồđiều trị lao nhưng lại được dùng trong các trường hợp điều trị thất bại do vi khuẩn laokháng lại các loại thuốc chống lao loại một Các thuốc này gồm có: ethionamide,

prothionamide, paraminosalysilic acid (PAS), cycloserine, kanamycin, capreomycin,thiacetazone, ofloxacin, các quinolone…

Các thuốc isoniazid, cycloserine, kanamycin có tác dụng ức chế tổng vách tếbào Các thuốc streptomycin, kanamycin, capreomycin có tác dụng ức chế tổng hợpprotein Các thuốc rifampicin và ethambutol có tác dụng ức chế sự tổng hợp nucleicacid Thuốc paraminosalicylic acid có tác dụng chống chuyển hóa [7, 35, 37, 38]

1.4.2 Nguyên nhân gây kháng thuốc

Vi khuẩn lao kháng thuốc là khi chúng không chịu sự tác động của các loại khángsinh dùng điều trị chúng Thường nói tới vi khuẩn lao kháng thuốc là nói tới nhữngtrường hợp vi khuẩn lao kháng với một trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất:isoniazid, rifampicin, pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin [7, 35]

Tính kháng thuốc bao gồm chủ yếu 3 nguyên nhân chính:

- Thuốc hoặc các gen đích bị làm biến đổi trong các chủng kháng thuốc do đócác thuốc không còn tác dụng nữa trong việc tiêu diệt vi khuẩn

- Sản phẩm của gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc được vi khuẩnsản xuất thừa ra, do đó lượng thuốc mà bệnh nhân uống vào không đủ để ứcchế hoàn toàn vi khuẩn lao

- Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vàobên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạttới nồng độ tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh

Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn lao có thể xảy ra trước khi xâm nhập (tiênphát) hoặc sau khi nhập vào cơ thể người bệnh (thứ phát) Vi khuẩn lao kháng thuốc tiênphát là hiện tượng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đềkháng tự nhiên Vì vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩnlao xâm nhập vào cơ thể đã có sự đề kháng với thuốc đang sử dụng Còn hiện tượng

kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùngthuốc chống lao không đúng quy định, không đúng liều lượng, thời gian sử dụng thuốc

do đó đã chọn lọc vi khuẩn lao khang thuốc [1, 38]

Các chủng vi lao kháng thuốc được chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng

đa thuốc (MDR – TB): Là trường hợp khi các chủng vi khuẩn lao kháng đồng thời haithuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin (2) Các chủng laokháng thuốc phổ rộng (XDR – TB): Là trường hợp khi vi khuẩn lao đã ở tình trạngkháng đa thuốc và có thêm tính kháng một trong ba loại thuốc chống lao làcapreomycin, kanamycin, amikacin [49]

Ngày nay khi nghiên cứu về sinh học phân tử, người ta đã xác định được cơ chếkháng lại nhiều loại kháng sinh có liên quan đến các gen tương ứng Trong hình 1.4 mô

tả các cơ chế phân tử của hiện tượng kháng đa thuốc ở vi khuẩn lao Trong đó, kháng

isoniazid được cho là liên quan đến các gen: KatG, inhA, aphC và kasA Kháng streptomycin có thể là do đột biến ở gen rpsL Kháng pyrazinamid có thể liên quan đến gen pncA Kháng quinolone có thể liên quan tới gen gyrA Kháng rifampicin được xác định là liên quan đến đột biến ở vùng gần lõi của gen rpoB, gen mã hóa tiểu phần β của

RNA polymerase [7, 25] Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu cơ chếkháng đa thuốc, tức là trường hợp vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc chống laomạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin, điều đó đồng nghĩa với việc nghiên cứu

các đột biến trên gen rpoB với katG.

Hình 1.4 Cơ chế kháng đa thuốc của vi khuẩn lao

(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis§)

1.4.3 Rifampicin và cơ chế kháng

Rifampicin tên khoa học là 3 –[[(4 – methyl – 1 – pipeainyl) imino] methyl]

(hình 1.5A) Rifampicin là dẫn xuất bán tổng hợp từ rifampicin B, một kháng sinh

được chiết xuất từ nấm Streptomyces mediterranei, là thuốc có hoạt tính diệt khuẩn

mạnh, tiệt khuẩn, thuốc diệt vi khuẩn lao trong và ngoài tế bào Rifampicin không có

hiện tượng kháng thuốc chéo với các loại thuốc chữa lao khác Nồng độ ức chế tối

thiểu (minimum inhibitory concentration - MIC) đối với vi khuẩn là 5 - 200 ng/ml (in

vitro) Đây là thuốc ức chế RNA polymerase mạnh nhất [29, 48].

Cơ chế tác động của rifampicin liên quan đến khả năng ức chế hoạt độngcủa RNA polymerase Enzyme này là một phức hợp oligomer gồm bốn tiểu đơn

vị khác nhau (α, β, β’, ω), và được mã hóa tương ứng bởi các gen rpoA, rpoB,rpoC, rpoD [7, 20]

Khi rifampicin gắn với tiểu đơn vị β của RNA polymerase (rpoB), làm ức chếcác hoạt động sao chép tạo ra các mRNA của vi khuẩn lao và do đó làm ngưng trệ cáchoạt động sống của vi khuẩn lao Đây là cơ chế cơ chế tác dụng của RMP đối với vikhuẩn lao (hình 1.6)

Hình 1.6 Cấu trúc tinh thể liên kết giữa rifampicin và RNA polymerase [20]

Gen rpoB có kích thước 3519 bp, mã hóa cho tiểu phần β của RNA polymerase

(Tuberculosis, 2007) Những đột biến kháng kháng sinh rifampicin thường xảy ra trên

đoạn gen rpoB, nhất là đoạn nằm gần trung tâm của gen dài 81 bp được giới hạn từ bộ

biến ở bộ ba thứ 526, 516, 531, cho kết quả đề kháng với rifampicin cao; đột biến ở bộ

ba 510, 515 và 512 thì cho khả năng kháng rifampicin ở mức độ thấp hơn [47] Đoạnnucleotide của vùng nóng gồm:

507-GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AACCCG CTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG-533

Mỗi nucleotide trên đoạn này có thể bị thay thế, hoán đổi vị trí, mất đi, thêm vào

để tạo ra các đột biến được thể hiện trên hình 1.7 như sau: [41]

Hình 1.7 Trình tự nucleotide và các vị trí có khả năng xảy ra đột biến trên đoạn “nóng”

của gen rpoB [41]

- Khi xảy ra đột biến gần vùng lõi của gen rpoB sẽ làm thay đổi cấu trúc tiểu

phần β của RNA polymerase mà nó mã hóa nên làm cho khả năng kết hợp của RMPvới tiểu phần này giảm đi Kết quả là tác dụng của rifampicin đối với vi khuẩn lao giảm

hoặc mất đi Như vậy đột biến trên vùng gen này của rpoB đã làm cho vi khuẩn lao trở

nên kháng thuốc với rifampicin

- 90 - 95 % các chủng M tuberculosis kháng rifampicin được xác định là do các đột biến trên vùng gen nóng 81 bp này của rpoB Như vậy còn 5 - 10 % các chủng vi khuẩn lao không có đột biến trên vùng này của gen rpoB Điều này cho thấy cần phải xác

định thêm những đột biến khác trên gen này hoặc những gen khác có liên quan để xác địnhchính xác và toàn bộ cơ chế kháng rifampicin của vi khuẩn lao [19, 37]

1.4.4 Isoniazid và cơ chế kháng

Isoniazid có tên khoa học là isonicotinylhydrazine (INH) (hình 1.5B), là thuốc

chống lao đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại M tuberculosis và các loại

Mycobacterium không điển hình khác như M bovis, M kansasii Isoniazid diệt khuẩn

phụ thuộc vào nồng độ thuốc ở vị trí tổn thương và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn Cơchế tác dụng của isoniazid có liên quan tới sự hình thành phức hệ acyl isonicotinic-NADH và như đã trình bày ở trên chúng ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần chothành tế bào vi khuẩn lao

Gen katG có kích thước 2223 bp mã hóa catalase – peroxidase Enzyme này

hoạt hóa INH bằng cách kết hợp acyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ acylisonicotinic-NADH Phức hệ này liên kết chặt chẽ với ketoenoylreductase (mã hóa bởi

gen InhA), theo đó làm ngăn cản sự hình thành cơ chất enoyl-AcpM và hoạt động tổng

hợp acid béo Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho thành tế bào

vi khuẩn lao

Hình 1.8 Cơ chế kháng INH ở vi khuẩn lao

hay ACA) sẽ dẫn đến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của catalase peroxidase,

do đó M tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc INH (hình 1.8) [14] Do đó phát hiện sự thay đổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M tuberculosis kháng isoniazid.

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC

1.5.1 Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng

*) Xét nghiệm lâm sàng

- Phản ứng Tuberculin: thường thì phản ứng da ở những bệnh nhân kháng thuốc tiên

phát có mức độ mạnh hơn so với những bệnh nhân có vi khuẩn nhạy cảm với thuốc.Đối với kháng thuốc mắc phải, đặc biệt là kháng đa thuốc ở bệnh nhân đồng nhiễmHIV (+) thì tỷ lệ phản ứng này âm tính khá cao

- Hình ảnh X Quang: khi chụp phổi thẳng, kết quả cho thấy hình ảnh về bệnh laophổi giữa trường hợp lao kháng thuốc tiên phát với trường hợp nhạy cảm vớithuốc không có sự khác biệt Nhưng những trường hợp kháng thuốc mắc phải thìgặp nhiều là thể xơ hang, diện tích phổi tổn thương nhiều hơn và có nhiều hang,kích thước của hang lớn hơn

- Xét nghiệm vi khuẩn:

+ Về hình thể: các vi khuẩn bình thường có cấu tạo thành tế bào 3 lớp nhưng ở

vi khuẩn kháng thuốc thành tế bào có cấu tạp 4 lớp (vi khuẩn có thêm một lớppeptidoglycolipid ở ngoài cùng) Vi khuẩn kháng với rifampicin có thành tế

bào cũng dày hơn hẳn so với vi khuẩn nhạy với thuốc Khuẩn lạc của vikhuẩn kháng thuốc có thể không điển hình khi nuôi cấy, mọc cằn cỗi [7]+ Về số lượng vi khuẩn khi soi kính và nuôi cấy: những bệnh nhân kháng thuốcthứ phát có số lượng vi khuẩn khi soi kính cao hơn nhiều so với bệnh nhânthông thường Không có sự khác nhau nhiều giữa bệnh nhân kháng thuốc tiênphát và bệnh nhân thông thường Khi nuôi cấy trên môi trường đặc số khuẩnlạc mọc ở bệnh nhân kháng thuốc mắc phải là cao hơn và thời gian mọcnhanh hơn so với kháng thuốc tiên phát và ở những bệnh nhân này số khuẩnlạc lại cao hơn ở bệnh nhân thông thường [7].

+ Về đặc điểm kháng sinh đồ: kháng thuốc tiên phát thường kháng hay khángvới nồng độ thấp, kháng thuốc mắc phải thường kháng với nồng độ cao hơn.Kháng thuốc tiên phát hay gặp với một thuốc, kháng thuốc thứ phát thường tỷlệ kháng cùng lúc với nhiều thuốc cao hơn [7]

Như vậy không thể dựa vào lâm sàng hay thời gian điều trị hiệu quả để chẩnđoán bệnh nhân lao kháng thuốc được Các xét nghiệm cận lâm sàng khác chỉ có giá trịgợi ý Chẩn đoán bệnh lao kháng thuốc hiện nay vẫn phải lấy kết quả kháng sinh đồlàm tiêu chuẩn

1.5.2 Xác định kiểu hình

Gồm các phương pháp sau: Phương pháp xác định tương quan, phương phápxác định tỷ lệ kháng, phương pháp đo màu, phương pháp khử nitrate và nhiều phươngpháp khác [13] Các phương pháp này đều xác định khả năng phát triển của vi khuẩnlao trong môi trường nuôi cấy có kháng sinh, từ đó đưa ra kết luận về khả năng khángthuốc của chủng vi khuẩn lao đang nghiên cứu [12] Nhược điểm của các phương phápnày là vi khuẩn lao mọc chậm, trên môi trường Lowenstein-Jensen thường mất 4-6tuần Sử dụng hệ thống môi trường lỏng được cải tiến như MGIT, BATEC cũng mất 2tuần Điều này làm cho công tác điều trị và kiểm soát tình hình bệnh lao cũng như bệnhlao kháng thuốc còn khó khăn

1.5.3 Xác định kiểu gen

Hiện nay có nhiềuphương pháp xác định kiểu gen được ứng dụng để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc[1, 4], giải trình tự gen [6], lai trên pha rắn [36], Real – time PCR [14]

Các phương pháp chẩn đoán xác định kiểu gen dựa trên cơ sở phát hiện đột biếnở các gen có liên quan tới tính kháng thuốc tương ứng [51], sử dụng các kỹ thuật cao,đòi hỏi thiết bị hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình độ chuyên sâu nhưng thờigian chẩn đoán bằng phương pháp này nhanh hơn, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Để xác định đột biến trên gen có liên quan tới kháng thuốc (gen rpoB và katG)

hiện nay giải trình tự gen vẫn là phương pháp xác định cơ bản, chính xác nhất và thờigian cho kết quả từ 3 - 5 ngày Sau khi giải trình tự đoạn gen vừa được tách dòng từchủng lao nghiên cứu ta sẽ so sánh trật tự sắp xếp các nucleotide ở mẫu thí nghiệm vớitrật tự nucleotide chuẩn để biết được các vị trí sai lệch [22, 16]

Việc xác định các đột biến có liên quan kháng thuốc rifampicin và isoniazidbằng kỹ thuật giải trình tự cho biết chính xác vị trí đột biến cũ và mới trên gen cầnnghiên cứu, mang lại hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng của cấu trúc quần thể vi khuẩn laoở bệnh nhân lao kháng thuốc, đánh giá được tỷ lệ đột biến liên quan kháng thuốc trêncác chủng lao phân lập từ các vùng địa lý khác nhau Qua đó làm tiền đề xây dựng mộtsố bộ kit real-time PCR, nhằm phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng rifampicin vàisoniazid tại Việt Nam

1.5.4 Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị đượcngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên với real-time PCR ngườilàm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các bước thí nghiệm để đọc và phân tíchkết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của

phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại.Như vậy, nên có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ốngnghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trongống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thínghiệm có thể thấy được.

Chìa khóa của kỹ thuật real-time PCR chính là hóa chất và thuốc thử có trongphản ứng, trong đó chất huỳnh quang được thêm vào hỗn hợp phản ứng là yếu tố đầutiên mà người làm real-time PCR cần quan tâm Chất huỳnh quang này phải làm thếnào để ống phản ứng có thể phát được huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kíchthích một khi trong ống phản ứng này có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại từDNA đích, và sẽ không thể phát được huỳnh quang nếu không có sản phẩm khuếch đạitrong ống Cho đến nay, nhiều chất huỳnh quang như vậy đã được tìm ra và sử dụngrộng rãi Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi chỉ xin trình bày chất huỳnh quangthường được sử dụng nhất đó là Taqman probe [8]

Probe hay còn gọi là “đoạn dò” là những đoạn oligonucletides sợi đơn có trình

tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích (trong PCR, đó làsản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích) Đoạn dò này với đầu 5’ có gắn chất pháthuỳnh quang (gọi là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất dập tắt huỳnh quang tương ứng(gọi là quencher) để dập tắt được ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter Cơchế của sự phát tín hiệu huỳnh quang khi có sản phẩm khuếch đại là nhờ hoạt tính 5’-3’

exonuclease của enzyme Taq polymerase có khả năng cắt bỏ các probe khi các probe

bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi để tổng hợp sợibổ sung (hình 1.9)

Hình 1.9 Nguyên lý hoạt động của real- time PCR sử dụng Taqman probe (http://www.asuragen.com/Services/services/gene_expression/ab_taqman.aspx)

Trênhình 1.9minh họanguyên lýhoạt độngcủa Taqman probe trong real-time PCR Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếchđại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn

nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ

sung, do vậy reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnhquang khi nhận được nguồn sáng kích thích Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuấthiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnhquang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát

xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn cònnguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher của probe hấpphụ (dập tắt tín hiệu) do đó ống thử nghiệm sẽ không phát được tín hiệu huỳnh quangkhi nhận được nguồn sáng kích thích [8].

Multiplex real-time PCR là một dạng thay đổi của phản ứng real-time PCRthông thường, ở đó trong cùng một lúc hai hay nhiều gen đích được khuyếch đại bằngcách sử dụng đồng thời các cặp mồi và các probe khác nhau

Kỹ thuật multiplex real-time PCR cho phép tiết kiệm thời gian, công sức vàđóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen,tính đa hình DNA và phân tích định lượng, phản ứng multiplex real-time PCR rất hữu

ích cho việc phát hiện trực tiếp các đột biến của M tuberculosis từ các mẫu lâm sàng

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn lao nhạy cảm với thuốc kháng sinh, kháng đơn thuốc(kháng một loại thuốc INH hoặc RIF), kháng đa thuốc (kháng ít nhất hai loại thuốcdòng thứ nhất là INH và RIF) và siêu kháng thuốc (kháng tất cả các thuốc chống laohiện tại) được thu thập từ các vùng miền khác nhau như Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch(TP Hồ Chí Minh), Bệnh viện Trung ương Huế và bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trungương Các chủng lao được phân lập từ các loại bệnh phẩm của bệnh nhân lao như:đờm, dịch màng phổi, dịch rửa phế quản, dịch màng bụng Ngoài ra, trong nghiên cứu

có sử dụng chủng chuẩn quốc tế H37Rv làm đối chứng

DNA tổng số của các chủng lao nghiên cứu được tách chiết tại Học viện Quân

y Nồng độ DNA được đo trên máy NanoDrop® để tính và tạo các nồng độ DNA củacác mẫu như nhau để khi đưa vào hỗn hợp phản ứng PCR cùng một thể tích DNAkhuôn, và đạt khoảng 100 ng/thể tích 25µl phản ứng

Kết quả đo nồng độ DNA tổng số của từng mẫu nghiên cứu được trình bàytrong phần phụ lục 2

2.1.2 Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Bảng 2.1 Các sinh phẩm hóa chất chính

Tên hóa chất Hãng sản xuất

1 H/c sinh phẩm dùng trong tách dòng

Pepton

Yeast Extract

Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)

*) Các máy và thiết bị chính

Bảng 2.2 Các máy và thiết bị chính

Tên máy, thiết bị Hãng sản xuất

Tủ ấm ổn nhiệt

Máy PCR (GenAmp PCR System 9700)

Máy ly tâm (Biofuge Primo R)

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)

Máy chụp ảnh Gel-Doc

Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire

Máy quang phổ tử ngoại khả biến NanoDrop

Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100-Avant

Sanyo (Nhật Bản)Applied BioSciences (Mỹ)Heraeus (Mỹ)

Thommas Scientific (Mỹ)Dolphin (Mỹ)

Nuaire (Mỹ)Analitika (Đức)Applied BioSciences (Mỹ)

2.1.3 Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Dựa trên trình tự gen rpoB và katG của chủng dại H37Rv (Accesion:

NC_000962) đã được công bố trên ngân hàng giữ liệu gen quốc tế NCBI Trên cơ sở

đó, các mồi đặc hiệu được thiết kế:

Bảng 2.3 Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Gen

KT(bp)

684

Trong đó, cặp mồi katG-F và katG-R nhân đoạn gen katG có chứa codon 315 liên quan kháng thuốc isoniazid, cặp mồi rpoB-F và rpoB-R nhân đoạn gen rpoB có

chứa đoạn nóng 81 bp liên quan tới kháng thuốc rifampicin

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

DNA vi khuẩn lao

PCR

gen đích

Gắn genđích vàovector pBT

BamHI BamHI

2.2.2 PCR nhân đoạn gen đích

Phản ứng PCR nhân đoạn gen katG và rpoB đặc hiệu được thực hiện:

Bảng 2.4 Thành phần cho một phản ứng PCR

6 Taq polymerase (5 unit) 1,25 unit 0,25

Tổng 25

Theo chu kỳ nhiệt như sau

Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kì

1 Biến tính 95 5 phút 1

2 Biến tính 94 1 phút

3 Gắn mồi 56 45 giây 32

4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút

5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1

6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng chạy điện di trên gel agarose 0,8% Để phục

vụ cho giải trình tự gen, đoạn gen katG và rpoB được tinh sạch và dòng hóa vào vector

tách dòng pBT để tạo vector tái tổ hợp

2.2.3 Tạo dòng gen

*) Tạo sản phẩm nối ghép

Bảng 2.6 Thành phần hỗn hợp phản ứng nối ghép

*) Biến nạp và nuôi cấy

*) Tách chiết Plasmid và kiểm tra

Khuẩn nuôi qua đêm sẽ được thu lại bằng ly tâm và tách plasmid theo protocolcủa bộ kit AccuPrep Plasmid mini Extraction (Bioneer – Hàn Quốc) Plasmid tái tổ hợp

được kiểm tra có đoạn gen nghiên cứu qua phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế BamHI.

Kết quả sau khi thực hiện phản ứng cắt sẽ thu được hai phần: tạo 1 band trên ảnh điện

di có kích thước 684 bp (đối với gen katG) hoặc kích thước 528 bp (đối với gen rpoB)

và một band là phần còn lại của plasmid khoảng 2,7 kb

*) Phân tích kết quả

Kết quả xác định trình tự trên máy ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer.Khai thác dữ liệu từ genbank, thiết lập chủng wild type để so sánh: Chủng

H37Rv trên genbank (ID: 83332, ACCESSION NC_000962) với gen katG và rpoB đã

được công bố ký hiệu lần lượt là Rv1908c và Rv0667

Xử lý, phân tích các trình tự đoạn gen katG 684bp và rpoB 528bp của các chủng

vi khuẩn lao nhạy và kháng bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit So sánh đốichiếu với các dữ liệu ngân hàng gen để có kết quả các vị trí đột biến của từng chủngnghiên cứu

2.2.4 Multiplex real-time PCR

Sau khi tách dòng và giải trình tự đoạn gen katG và rpoB của các chủng vi

khuẩn lao nghiên cứu được phân lập tại các vùng miền khác nhau tại Việt Nam, quaphân tích các đột biến, các probe sẽ được thiết kế nhằm phát hiện các đột biến có liênquan kháng INH và RIF ở vi khuẩn lao bằng phản ứng multiplex real-time PCR Dotrong phản ứng multiplex real-time PCR sử dụng 2 probe khác nhau trong cùng mộtphản ứng nên việc lựa chọn 2 probe này phải gắn 2 reporter (chất phát huỳnh quang)khác nhau để có thể phân biệt ở các bước sóng khác nhau

Probe dùng cho phản ứng real-time PCR sử dụng cho nghiên cứu này được thiết

kế theo công nghệ TaqMan MGB (Minor Groove Binding) probe (TaqManR

Chemistry) của hãng Applied Biosystems dạng TaqMan này có ưu điểm đó là có thểthực hiện phản ứng real-time PCR ở nhiệt độ cao, từ đó làm tăng độ đặc hiệu của cácprobe Hơn nữa các loại probe thuộc dạng này được dễ dàng phân biệt dựa trên nhiệt

độ nóng chảy Chính vì vậy các loại probe này thường được dùng để thực hiện cácphản ứng multiplex real-time PCR với độ đặc hiệu và độ nhạy cao TaqMan hayphương pháp nuclease đầu 5’ là một trong những thí dụ về các loại probe thủy phân, tínhiệu huỳnh quang phát ra do sự thủy phân các đoạn probe được dùng để phát hiện cácđoạn sản phẩm PCR Các đoạn probe được gắn với một reporter ở đầu 5’ và mộtquencher (chất dập tắt tín hiệu huỳnh quang) ở đầu 3’ Trong nghiên cứu chúng tôi sửdụng 2 probe có gắn 2 reporter khác nhau, reporter gắn FAM cho phép phát tín hiệuhuỳnh quang khi đo ở bước sóng 530 nm và reporter còn lại được gắn VIC pháthuỳnh quang ở bước sóng 560 nm Các quencher được gắn ở đầu 3’ của mỗi probe làcác BHQ phát nhiệt, các BHQ phát nhiệt hiện nay được ưa chuộng sử dụng vì khảnăng hấp thụ huỳnh quang rất mạnh, các BHQ được xem như các lỗ đen (black holequencher – BHQ) hút lấy tất cả các huỳnh quang từ reporter không cho bất cứ huỳnhquang nào phát ra được từ reporter, đồng thời rất dễ dàng để thiết kế các Taqmanprobe dùng cho multiplex real-time PCR mà không lo đến phổ huỳnh quang của cácreporter có bị trùng với phổ huỳnh quang của quencher vì quencher không hề pháthuỳnh quang

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ

3.1.1 Kết quả nhân gen katG và rpoB từ DNA tách từ vi khuẩn lao

Hai gen katG và rpoB được khuếch đại từ tổng số 93 chủng vi khuẩn lao, trong

đó gồm có một chủng chuẩn quốc tế H37Rv, miền Bắc có 9 chủng đơn kháng và 13chủng đa kháng; miền Nam có 10 chủng nhạy, 11 chủng kháng đơn, 14 chủng kháng

Đặc tính kháng thuốc của từng chủng thuộc các miền khác nhau được trình bày trên

Chú thích: S: Streptomycin, H: Isoniazid, E: Ethambutol, R: Rifampicin, Ofx:

Ofloxacin, Th: Thioacetazone, Eto: Ethionamide, Cs: Cycloserine, Km: Kanamycin,

PAS: P-aminosalicylic acid

Kết quả nhân hai gen katG và rpoB bằng kỹ thuật PCR được trình bày trong

hình 3.1A và 3.1B Kết quả ở hình 3.1A là kết quả đại diện sản phẩm PCR nhân gen

katG, còn hình 3.1B là kết quả đại diện của sản phẩm PCR nhân gen rpoB.

M: Marker 1 kb

500 250

bp

1-6: Thứ tự tên các mẫu nghiên cứu tương ứng

3.1.2 Kết quả tách dòng gen

Bước đầu tiên của quá trình tách dòng là thực hiện phản ứng ghép nối gen đíchvào vector tách dòng pBT, Phản ứng nối được xúc tác bởi T4 DNA ligase Sau khi đoạngen đích đã được gắn vào vector pBT, để làm gia tăng số lượng bản sao của vector táitổ hợp này một cách nhanh chóng, chúng tôi tiến hành biến nạp plasmid tái tổ hợp vào

trong tế bào khả biến E.coli DH5 và nuôi cấy trên môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/

phút ở 370C trong 1 giờ để làm phục hồi tế bào E.coli mang plasmid tái tổ hợp đó Sản

phẩm biến nạp sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinhchọn lọc ampicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml và IPTG 100 mM và được nuôi tĩnh ở

370C trong 18h Kết quả biến nạpđược trình bày ở hình 3.2

Hình 3.2 Chọn dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp trên môi trường

LB có bổ sung

ampicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml và IPTG 100 mM.

Sau 18 giờ nuôi cấy, trên môi trường LB thạch có chứa kháng sinh ampicillin,X-gal và IPTG, xuất hiện hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màutrắng Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã được biến nạp plasmid chứagen kháng kháng sinh ampicillin, tuy nhiên chỉ có những khuẩn lạc màu trắng làmang plasmid tái tổ hợp Do đó, chúng tôi lựa chọn các khuẩn lạc trắng này đem nuôicấy qua đêm ở 370C, lắc 200 vòng/phút trong môi trường LB lỏng có bổ sung khángsinh phù hợp Sản phẩm nuôi cấy được ly tâm để thu khuẩn phục vụ cho quá trìnhtách plasmid