Nghiên cứu tạo một số chế phẩm sinh học từ Chitosan tách chiết từ vỏ tôm bằng phương pháp thuỷ phân enzyme

Với đặc tính sẵn có như kháng nấm, kháng khuẩn, tăng cường khả năng miễn dịch, tác động tích cực đến quá trình chuyển hóa lipid trong cơ thể, chống lại tế bào u mà chitin/chitosan và dẫn

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC

TỪ CHITOSAN TÁCH CHIẾT TỪ VỎ TÔM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN ENZYME

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Thiết

HÀ NỘI, 2011

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi tới thầy PGS.TS Nguyễn Văn Thiết

đã giao đề tài và trực tiếp hướng dẫn để em hoàn thành khóa luận này

Đồng kính gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn Trần Thị Hoa Lý, người

đã cùng tôi làm đề tài và các thầy cô làm việc tại Phòng Hóa Sinh Thực Vật- Viện Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện khóa luận này

Em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến các thầy, các cô trong Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các thầy, các cô trường Cao đẳng Thủy sản nơi mà em đang công tác, các bạn lớp K13 cao học sinh học thực nghiệm, gia đình và người thân đã luôn bên em trong suốt thời gian qua!

Hà Nội, tháng 11 năm 2011

Học viên

Nguyễn Thị Hạnh

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 11 năm 2011

Học viên

Nguyễn Thị Hạnh

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

CHƯƠNG 1 5

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu về chitin/chitosan 5

1.1.1 Phân bố 5

1.1.2 Cấu tạo và tính chất của chitin 5

1.1.3 Cấu tạo và tính chất của chitosan 7

1.1.4 Công dụng của chitosan 8

1.2 Các enzyme có khả năng thủy phân chitosan 13

1.2.1 Quá trình phân giải chitin và chitosan trong tự nhiên 13

1.2.2 Các enzyme thuỷ phân chitosan 15

1.3 Vai trò sinh học của Glucosamine 16

1.4 Vai trò sinh học của nanochitosan và các oligochitosaccharide 20

CHƯƠNG 2 22

VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 22

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.2 Hóa chất 22

2.1.3 Thiết bị 22

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm 22

2.2.2 Phương pháp đo độ nhớt xác định khối lượng phân tử trung bình của chitin 24

2.2.3 Phương pháp chuyển chitin thành chitosan 26

2.2.4 Các phương pháp xác định đường khử với antron 27

2.2.5 Các phương pháp nghiên cứu động học quá trình thủy phân chitosan 28

2.2.6 Phương pháp tủa với ethanol thu các sản phẩm khác nhau từ dịch thủy phân chitosan 29

2.2.7 Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử trên thiết bị FPLC 30

CHƯƠNG 3 31

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1.3 Đánh giá chất lượng các mẫu chitin và chitosan thu được 33

3.1.3.1 Kết quả đo độ nhớt 34

3.1.3.2 Xác định khối lượng phân tử của chitin và chitosan 36

3.2 Kết quả thuỷ phân chitosan bằng phương pháp enzyme 37

3.2.1 Kết quả nghiên cứu động học thuỷ phân chitosan bằng chitosanase 37

3.2.1.1 Nghiên cứu động học quá trình thuỷ phân chitosan bởi chitosanase bằng phương pháp đo độ nhớt 37

3.2.1.2 Nghiên cứu động học quá trình thuỷ phân chitosan do chitosanase xúc tác bằng phương pháp xác định đường khử 40

3.2.2 Kết quả nghiên cứu thuỷ phân chitosan bằng chitinase 47

3.2.2.1 Đánh giá khả năng thuỷ phân chitosan bởi chitinase bằng phương pháp đo độ nhớt 48

3.2.2.2 Nghiên cứu động học quá trình thuỷ phân chitosan bằng chitinase bằng phương pháp đo đường khử 49

3.2.3 Kết quả nghiên cứu thuỷ phân chitosan bằng cellulase 56

3.2.3.1 Đánh giá quá trình thuỷ phân chitosan bởi enzyme cellulase bằng phương pháp đo độ nhớt 56

3.2.3.2 Nghiên cứu động học quá trình thuỷ phân chitosan bởi cellulase bằng phương pháp đo đường khử 58

3.3 Đánh giá khả năng thu nhận các chế phẩm sinh học từ chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme 64

3.3.1 Đánh giá khả năng thu nhận chế phẩm glucosamine từ chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme 65

3.3.2 Đánh giá khả năng thu nhận các chế phẩm sinh học khác từ chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme 71

3.4 Phân tích sản phẩm bằng phương pháp sắc kí FPLC 74

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

PHẦN PHỤ LỤC 85

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam là quốc gia ven biển, nằm trong khu vực Đông Nam Á có khí hậu ấm áp quanh năm, có đường bờ biển dài hơn 3.260 km với 112 cửa sông, lạch, có diện tích vùng nội thủy và lãnh hải rộng 226.000 km2 [6] cùng với nhiều nguồn sinh vật đa dạng và phong phú Chính vì thế mà hiện nay, ngành đánh bắt và nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam rất phát triển, một trong những ngành mũi nhọn ở nước ta là nuôi tôm và chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu

Hàng năm, các nhà máy chế biến tôm đã thải ra một lượng lớn phế liệu (phụ phẩm) đầu và vỏ, khoảng 70000 tấn [16], chiếm tới 40% lượng nguyên liệu ban đầu Nguồn phụ phẩm này chủ yếu được sử dụng làm thức ăn cho gia súc hay đôi khi bị thải ra môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọng Vì vậy việc tìm ra các giải pháp tận dụng tối đa nguồn phụ phẩm này trong chế biến thủy sản đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới Thành phần chính của nguồn phế thải này là chitin, một polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose

Trở ngại lớn nhất trong ứng dụng chitin là tính chất khó hòa tan của chúng trong nhiều dung môi, kể cả các dung môi hữu cơ Từ chitin có thể tạo

ra chitosan – một polysaccharide mà trong thành phần chứa chủ yếu là các gốc glucosamine (GlcN) để ứng dụng cho nhiều ngành kinh tế: nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và đặc biệt là trong ngành dược phẩm, chitosan là nguyên liệu để bào chế ra nhiều loại sản phẩm thuốc chữa bệnh khác nhau Một trong các loại thuốc đó là glucosamine, chất này tham gia vào quá trình tổng hợp nhiều thành phần của sụn khớp, đóng vai trò quan trọng trong duy trì sức mạnh và tính đàn hồi của khớp Nó có tác dụng kích thích tế bào của sụn khớp tổng hợp ra các proteoglucan, ức chế một số enzyme gây

phá hủy sụn khớp, giảm các gốc tự do gây hại cho tế bào sinh sụn, tăng sản sinh chất nhầy ở dịch khớp, làm trơn dịch khớp và giảm hiện tượng thoái hóa khớp

Nước ta có nhiều nguồn nguyên liệu chứa chitin phong phú Trong động vật thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chiếm

tỉ lệ khá cao, từ 14 - 35% so với trọng lượng khô [7] Với đặc tính sẵn có như kháng nấm, kháng khuẩn, tăng cường khả năng miễn dịch, tác động tích cực đến quá trình chuyển hóa lipid trong cơ thể, chống lại tế bào u mà chitin/chitosan và dẫn xuất của chúng đã được nghiên cứu sử dụng vào nhiều lĩnh vực khác của cuộc sống: công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, xử lý nước thải… và đặc biệt là trong lĩnh vực y học Từ chitosan người ta đã bào chế ra nhiều loại thuốc điều trị các bệnh như nhiễm xạ, chữa bỏng, giảm đau, đặc biệt đối với bệnh nhân đái tháo đường chitosan có khả năng kích thích cơ thể tiết ra insulin [17] Mặc dù chitin/chitosan có rất nhiều, được coi là hợp chất không độc, rất ít gây dị ứng nhưng quá trình nghiên cứu chitin – chitosan chỉ thực sự có hệ thống vào giữa thế kỷ 20 [54] Các công trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới đã chứng minh trong vỏ tôm có chứa 27% chất chitin, từ chitin họ có thể nhận được chitosan – một polysaccharide mà trong thành phần chứa chủ yếu là các gốc glucosamine

Trên thế giới và cả nước ta ngày càng có xu hướng sử dụng chế phẩm chiết xuất từ nguồn gốc thiên nhiên Vì vậy việc tạo ra các chế phẩm sinh học

từ chitosan và các sản phẩm chế biến từ các polysaccharide này là cần thiết

Xuất phát từ những nhu cầu trên, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu tạo một

số chế phẩm sinh học từ chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme”

2 Mục đích nghiên cứu

Tạo một số chế phẩm sinh học từ vỏ tôm bằng phương pháp thủy phân enzyme

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Đề tài có các nội dung nghiên cứu sau đây:

1) Thu nhận chế phẩm chitin từ vỏ tôm

2) Chuyển hóa chitin thành chitosan và xác định kích thước phân tử của chitin thông qua đo độ nhớt của chế phẩm chitosan nhận được

3) Nghiên cứu động học của quá trình thủy phân chitosan bằng các enzyme khác nhau để tìm điều kiện tối ưu cho việc tạo ra một số chế phẩm sinh học từ chitosan: Nhóm sản phẩm chính thứ nhất là chitosan kích thước phân tử nhỏ (bao gồm chitosan khối lượng phân tử thấp, nanochitosan); nhóm sản phẩm chính thứ hai (bao gồm các oligochitosaccharide mạch dài, các oligochitosaccharide mạch ngắn) gọi là oligochitosaccharide, còn nhóm sản phẩm chính thứ ba – monosaccharide (glucosamine)

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu:

Chitin, chitosan khối lượng phân tử thấp, nanochitosan, oligochitosaccharide mạch dài, các oligochitosaccharide mạch ngắn và monosaccharide (glucosamine)

* Phạm vi nghiên cứu:

Nghiên cứu quá trình thủy phân chitosan bằng các enzyme khác nhau: chitinase, chitosanase, cellulase ở các nồng độ, nhiệt độ và thời gian khác nhau

5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm;

- Phương pháp đo độ nhớt xác định khối lượng phân tử trung bình của chitin;

- Phương pháp chuyển chitin thành chitosan;

- Các phương pháp xác định đường khử với antron;

- Các phương pháp nghiên cứu động học quá trình thủy phân chitosan;

- Phương pháp tủa với ethanol thu các sản phẩm khác nhau từ dịch thủy phân chitosan;

- Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử trên thiết bị FPLC

6 Dự kiến đóng góp mới

Chỉ ra bằng phương pháp thủy phân enzyme sẽ tạo ra được một số chế phẩm sinh học có giá trị giá tăng cao từ chitosan

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chitin/chitosan

1.1.1 Phân bố

Mặc dù chitin được phát hiện ra từ khá sớm nhưng con người đã phải mất hơn một thế kỷ mới có thể hiểu được rõ về cấu tạo hóa học, tính chất và chức năng sinh học của nó Chitin được Braconnot phát hiện lần đầu vào năm

1811 trong cặn dịch chiết từ một loại nấm [18] và chất này được gọi là

“fungine” Đến năm 1823, Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin nhưng không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó Sau đấy Children, Lassaigne và Payen đã xác định được sự có mặt của nitơ trong chitin Cho đến năm 1876, Ledderhose đã thủy phân chitin của động vật chân đốt thu được glucosamine và acid acetic; như vậy cấu trúc của chitin đã dần được xác định Chitin là một polysaccharide mạch thẳng đứng thứ hai trong tự nhiên về số lượng chỉ sau cellulose [21, 31, 35, 50, 57], là thành phần sinh hóa không thể thiếu trong vỏ của các loài giáp xác Chitin có mặt ở gần như tất cả các lớp động vật [14] Chitin tồn tại tự nhiên trong cơ thể động vật dưới chức năng bảo vệ [20, 31, 35, 50], nó có ở lớp vỏ của các loài giáp xác (vỏ cua, vỏ tôm, mai mực, bọ cánh cứng… ), vỏ của các loại côn trùng, thành tế bào vi khuẩn, thành tế bào nấm, nấm men, vỏ của một số loài động vật ở sâu đáy biển 2600m (Rifitia pachyprila) Người ta xác định 50% đến 80% các hợp chất hữu cơ trong vỏ của động vật giáp xác và các biểu bì của côn trùng có

chứa chitin [28]

1.1.2 Cấu tạo và tính chất của chitin

- Cấu tạo của chitin: Chitin có cấu trúc polymer tuyến tính từ các đơn vị N-acetyl-β-D-glucosamine nối với nhau nhờ cầu nối β–1, 4-glucoside

O

n Chitin

- Tính chất của chitin:

Chitin có màu trắng, không tan trong nước, môi trường kiềm, acid loãng và các chất dung môi hữu cơ như este, rượu… nhưng nó lại hòa tan trong dung dịch đặc nóng của muối LiSCN (thiocyanate lithium) và Ca(SCN)2 (thiocyanate calcium) tạo thành dung dịch keo

Chitin tương đối ổn định với các chất oxi hóa khử, như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước javen (NaClO) hay Ca(ClO)2… Lợi dụng tính chất này, người ta sử dụng các chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin

Khi đun nóng trong HCl đậm đặc thì chitin sẽ bị thủy phân hoàn toàn tạo thành D- glucosamine và acid acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở mối nối glucoside, sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (–CO – CH3)

(C32H54N4O21) x + 2H2O → (C28H50N4O19) x + 2 (CH3 – COOH) xKhi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan

Chitin + NaOH (đđ) Chitosan + nCH3COOH

Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng: λ= 884 ÷ 890 µm

Nhìn chung các phản ứng hóa học của chitin là không đa dạng, điều này dễ dàng giải thích được do cấu tạo chitin có các nhóm tương đối trơ, hơn nữa cấu trúc bề mặt của chitin phẳng lì và rất chặt chẽ đã gây khó khăn cho sự

Đun nóng

tiếp xúc của nó với các tác nhân phản ứng Tính không tan trong nước và các dung môi hữu cơ thông thường nên chitin khó tham gia các phản ứng hóa học thông thường, vì điều này mà khả năng ứng dụng của chitin đã bị hạn chế rất nhiều Các nhà khoa học đã cố gắng nghiên cứu biến đổi hóa học tạo ra các dẫn xuất khác nhau của chitin để có thể hòa tan trong các dung môi thông thường tiện lợi hơn trong quá trình sử dụng Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan, một dẫn xuất thu được bằng phản ứng đeacetyl hóa chitin biến đổi nhóm N – acetyl thành nhóm amine ở vị trí C2 [2], được coi là dẫn xuất quan trọng nhất Hiện nay người ta đã biết được chitosan có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng đa dạng trong thực tế [19]

1.1.3 Cấu tạo và tính chất của chitosan

Chitosan là một polymer hữu cơ có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị β – D-glucosamine liên kết với nhau nhờ liên kết β–1, 4 glucoside

Công thức phân tử: [C6H11O4]n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161.07)n

Công thức cấu tạo:

Chitosan ở dạng bột có màu trắng ngà, còn ở dạng vẩy có màu trắng hơi vàng Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, kiềm nhưng hòa tan trong acid acetic loãng tạo thành dung dịch keo dương, nhớt và trong suốt, nhờ đó mà keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như Pb, Hg…

Do chitosan còn cặp electron tự do linh động trên nguyên tử (N) nên có khả năng tạo phức với ion kim loại [28], tạo liên kết với các acid hữu cơ, anhydride hữu cơ

Chitosan kết hợp với aldehyde trong điều kiện thích hợp, hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme

Chitosan phản ứng với acid đậm đặc, tạo thành muối khó tan, tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng màu tím, phản ứng này có thể dùng để phân tích định tính chitosan

1.1.4 Công dụng của chitosan

Công dụng trực tiếp của chitin nói chung là không nhiều và thường chuyển qua dẫn xuất chitosan rồi tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng Nhờ đặc tính sinh học quý giá mà chitosan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: Nông nghiệp [4, 5], y – dược học [34, 56, 57], xử lí nước thải, công nghiệp nhuộm, giấy, mỹ phẩm [57], thực phẩm [31]… Hiện nay các nhà khoa học Việt Nam cũng đã và đang tập trung nghiên cứu nhiều về ứng dụng của chitin/chitosan và các dẫn xuất của chúng trong y – dược học, trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường

Trong nông nghiệp:

Oligoglucosamine ảnh hưởng sinh trưởng của rau cải và đậu cove và các loại rau khác, có tác dụng tăng năng suất, tăng khả năng kháng bệnh, hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật góp phần bảo vệ môi trường và thực hiện chương trình rau sạch, rau an toàn

Chitosan được sử dụng để bọc nang các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt [4] Hiện nay chế phẩm oligoglucosamine và oligochitin đã được nghiên cứu bởi PGS.TS Trần Thị Luyến – Trường đại học Nha Trang

Kích thích tăng trưởng, tăng năng suất: Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của lúa mạ, ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng Nitơ tổng số, đồng thời hàm lượng các enzyme như amylase, catalase hay peroxidase cũng tăng lên, vì vậy làm tăng năng suất cây trồng Ngoài ra trong nông nghiệp còn sử dụng chitosan để bảo quản thực phẩm, trái cây, do dịch keo chitosan (keo dương) có tác dụng chống mốc, chống sự phá hủy của một số nấm mem, vi sinh vật gram âm trên các loại hoa quả Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng

Trong Y học:

Tạo da nhân tạo: Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin được gọi là Beschitin W, nó giống như một tấm vải và được bọc lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi Tấm Beschitin W bị phân hủy sinh học từ từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới Nó có tính chất kháng khuẩn, lành da, tạo biểu bì mới, giảm đau, giúp cho các vết sẹo phục hồi nhanh chóng [2] Ở lĩnh vực này nước ta cũng trở thành quốc gia thứ hai sau Nhật Bản chế tạo thành công màng da nhân tạo chữa các tổn thương về da từ chitin Sản phẩm được mang tên Vinachitin do tập thể các nhà khoa học thuộc Viện Hóa học (Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia) và đại học Y Hà Nội [1]

Tạo chỉ khâu phẫu thuật, tự hủy: Trường Đại học Delaware đã chế tạo thành công chỉ khâu phẫu thuật tự tiêu từ chitin nhờ phát hiện ra một dung môi đặc biệt có khả năng hòa tan chitin ở nhiệt độ thường mà không phá hủy cấu trúc polymer [2]

Sản xuất thuốc trị viêm loét dạ dày, tá tràng từ chitosan Và mới đây Viện Vacxin Nha Trang đã sản xuất thành công hai sản phẩm là Chitovac chữa béo phì và Glusivac điều trị thoái hóa khớp Hai loại thuốc này đã được

Bộ Y tế cấp phép lưu hành toàn quốc vào đầu tháng 6/2005 [42] Giá thành của hai loại thuốc trên rẻ hơn một nửa so với giá thuốc ngoại nhập Chitosan có tác dụng chữa béo phì nhờ tính năng ngăn cản lipid vào máu, hút các chất béo không cho chúng hấp thụ vào máu và thải ra ngoài bằng đường tiêu hóa [55]

Một trong những tính năng quan trọng và hữu ích nhất của chitosan là khả năng tạo phức: Chitosan liên kết chọn lọc với cholesterol [39], các acid béo, protein và các tế bào u, kích thích sản sinh bạch cầu Vào năm 2003, nhóm các bác sĩ Bệnh viện K Hà Nội đã thí nghiệm thực hiện trên 60 bệnh nhân tuổi từ 35 – 76 và đưa ra kết luận chitosan có khả năng khống chế sự gia tăng của tế bào ung thư Hay như Sirica và Woodman [39] khi thử nghiệm khả năng kết tụ tế bào u của chitosan đã chỉ ra rằng, chitosan có khả năng kết

tụ một cách có chọn lọc tế bào u trong ống nghiệm, tạo ra khối kết tụ đặc, bao quanh và ức chế sự phát triển của tế bào Một số chuyên gia ở Trung tâm Huyết học thuộc Viện Hàn lâm Y học Nga cũng đã phát hiện chitosan có thể ngăn chặn sự phát triển của chứng nhồi máu cơ tim và bệnh đột qụy

Trong công nghệ sinh học:

Làm chất mang để cố định enzyme và cố định tế bào: Enzyme cố định

đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzyme trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích Enzyme cố định được sử dụng lâu dài, nên không cần thay đổi chất xúc tác Sử dụng chitosan làm chất mang để cố định enzyme và

tế bào được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ làm sạch nước, làm trong nước quả…

Trường Đại học Nha Trang đã nghiên cứu phối trộn chitosan và

alginate để làm chất mang cố định tế bào Saccaromyces cerevisiae để lên men

rượu từ glucose Kết quả đã làm tăng độ bền của các hạt gel microcapsule, tăng chu kỳ lên men [16] trong quá trình sản xuất rượu đem lại hiệu quả kinh

tế cao

Trong công nghệ thực phẩm:

Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng kết dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg… do đó chitin được sử dụng tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm Chitosan được sử dụng như một polymer-catinonite trong sản xuất agarose từ agar – agar có chất lượng kém Chitin có tính tẩy màu mà không hấp thụ mùi

và các thành phần khác nên nó được ứng dụng vào việc khử màu nước uống (đồ uống nước trái cây), dầu cá, nước mắm xuất khẩu Bùi Văn Miên và Nguyễn Anh Trinh, khoa Công nghệ thực phẩm thuộc Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu tạo ra màng chitosan bằng các sử dụng các chất phụ gia khác nhau nhưng có cùng bản chất hóa học (thường là các chất dẻo hóa học) được sử dụng để tăng tính dẻo dai và đàn hồi của màng

Ví dụ như: EG, PEG… Những vỏ bọc đầu tiên ra đời được chế tạo để nhồi xúc xích, lớp màng này còn có tác dụng đặc biệt là không làm mất màu và mùi đặc trưng của xúc xích Từ thành công này, các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu sử dụng vỏ bọc chitosan để bảo quản thủy sản tươi và khô

Bên cạnh đó chitosan còn được ứng dụng trong rất nhiều các ngành công nghiệp khác như hóa chất, mỹ phẩm, dệt… Năm 1961, nhà khoa học Nga Boris Beloisov đã khởi xướng việc bào chế thuốc chống nhiễm xạ từ chitosan Kết quả thử nghiệm tiêm thuốc cho chó và khỉ trước khi chúng bị nhiễm xạ cho thấy khả năng sống sót tới 45% Các hãng mỹ phẩm trên thế giới cũng đã ứng dụng thành phần chitosan như là các tác nhân tạo gel và giữ

ẩm cho hàng loạt các sản phẩm của mình như kem đánh răng, kem chống nắng, nước xúc miệng… Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô

da do chitosan có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –

CH3

+

Các nhóm này liên kết với các tế bào sừng hoá của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da

chống nắng bằng cách ngăn các tia cực tím bởi các nhóm – CH3

+ [15] Hãng

mỹ phẩm Wella đã dùng chitin/chitosan trong ít nhất 15 sản phẩm bảo vệ tóc

và hãng Shiseido cũng đã dùng chất này trong 13 sản phẩm Chitosan được sử dụng là thành phần của keo xịt tóc, do chitosan là polyamine (tích điện dương) có thể kết hợp với các protein của tóc và nhờ độ keo của nó khi khô sẽ làm cho toc cứng giữ được nếp của tóc Do có cấu trúc tương tự như cellulose nên chitin/chitosan được nghiên cứu bổ sung vào nguyên liệu sản xuất giấy,

nó làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn [9] Qua nghiên cứu người ta thấy rằng nếu xử lý bề mặt giấy với dung dịch chitosan 1% thì độ bền của giấy sẽ tăng lên khi bị ướt hay tăng độ nét khi in Trong công nghệ sản xuất vải người ta cũng sử dụng chitosan để thay thế hồ tinh bột trong quá trình hồ vải, nó có tác dụng làm cho sợi tơ bền, mịn, bóng đẹp và cố định hình in Chitosan có thể kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, sản xuất vải col, vải chitosan được nghiên cứu bởi các nhà khoa học Trường Đại học Nha Trang

Theo Tiến sĩ (TS) Trang Sĩ Trung, Trưởng bộ môn Hóa sinh - Vi sinh thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang thì việc kết hợp enzyme Flavourzyme trong quy trình sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu vỏ đầu tôm sẽ giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng, đồng thời thu được 2 sản phẩm chính chứ không phải

1 như những quy trình hiện nay Từ năm 2006 đến 2008, TS Trang Sĩ Trung

và các cộng sự đã tập trung nghiên cứu cải tiến quy trình theo hướng kết hợp

xử lý hóa học với sinh học, đồng thời hoàn thiện quy trình theo hướng bổ sung các công đoạn tận thu protein và astaxanthin, nâng cao chất lượng chitin-chitosan Việc kết hợp sử dụng enzyme chứ không chỉ dùng hóa chất trong quá trình sản xuất chitin-chitosan có ưu thế hơn so với phương pháp hóa học truyền thống là giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng và thải ra môi trường Mặt khác, quy trình cải tiến với sự vượt trội về chất lượng chitin, chitosan thu

được và thu hồi sản phẩm protein-astaxanthin có giá trị dinh dưỡng và sinh học, làm hạn chế các chất hữu cơ chứa trong nước thải, giảm thiểu chi phí xử

lý môi trường Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trầm trọng do các cơ sở chế biến chitin-chitosan gây ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu thủy sản Đây là một hướng đi cho phương pháp sản xuất sạch hơn Bên cạnh đó, việc kết hợp sinh học và hóa học còn đảm bảo vấn đề giá thành sản xuất hợp lý, cơ hội cho mở rộng sản xuất với quy mô lớn

1.2 Các enzyme có khả năng thủy phân chitosan

1.2.1 Quá trình phân giải chitin và chitosan trong tự nhiên

Chitin và chitosan là những biopolymer bền, nhưng vẫn có một loại enzyme do một số vi khuẩn và nấm trong đất tạo ra có thể phân huỷ được Do vậy, loại polymer này sẽ tan rã nhanh chóng trong môi trường sau khi bị vứt

bỏ Hàng năm trên trái đất có khoảng 1010 – 1011 [17, 57] tấn chitin được tổng hợp, so với lượng cellulose là 1011 tấn/năm [18] và cũng một lượng chitin như vậy bị phân huỷ Quá trình phân huỷ chitin/chitosan xảy ra trong tự nhiên ở cả điều kiện có oxy và không có oxy

Ở nhóm sinh vật có khả năng sử dụng chitin/chitosan làm cơ chất, sản phẩm cuối cùng của quá trình phân giải chitin/chitosan là GlcN - nguồn cacbon cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng Các sinh vật này đều tiết ra các enzyme chitinolytic/chitosanolytic để phân giải chitin/chitosan Trong số các enzyme này phải kể tới chitinase (exochitinase và endo-chitinase), chitin deacetylase, chitosanase, N-acetylglucosamineidase, glucosaminidase và acetylase

Trong tự nhiên có 2 đường phân giải chitin: Theo đường thứ nhất chitin

bị tác động trực tiếp bởi enzyme (hệ enzyme) chitinase, còn theo đường thứ hai đầu tiên chitin được deacetyl hoá thành chitosan dưới xúc tác của enzyme

chitin deacetylase, sau đó chitosan bị thuỷ phân bởi chitosanase Sản phẩm trung gian trong quá trình phân giải chitin và chitosan là các chitooligosaccharide + N, N1-diacetylchitobiose và oligo-GlcN + chitobiose tương ứng

Ngoài nhóm sinh vật sử dụng chitin làm nguồn carbon thì các nhóm sinh vật tổng hợp chitin và không tổng hợp chitin khác cũng tạo ra chitinase Tuy nhiên, chức năng của enzyme chitinase ở các nhóm sinh vật này hoàn toàn khác chức năng của chitinase ở nhóm sinh vật thứ nhất Nếu như ở nhóm sinh vật thứ nhất chức năng sinh lí của chitinase là tiêu hoá, mục đích hoạt động chính của enzyme là tạo ra GlcN phục vụ cho nhu cầu năng lượng và vật liệu của cơ thể thì ở nhóm sinh vật tổng hợp chitin, chức năng sinh lí của chitinase là tự phân (autolytic), làm cho sợi nấm định hướng lại sự sinh trưởng của nó hoặc côn trùng xây dựng lại khung xương ngoài của chúng (sự lột xác) [27] Ngoài ra, các chitinase còn có chức năng sinh học là tấn công hay tự vệ Vai trò tấn công của chitinase là rất rõ ràng trong trường hợp các tác nhân gây bệnh ở nhóm cơ thể tổng hợp chitin, nó giúp cho các tác nhân gây bệnh (như nấm, protozoa và vi khuẩn) xâm nhập được vào cơ thể các động vật chân khớp, giun hay côn trùng Còn vai trò tự vệ của chitinase là chung cho giới thực vật, nơi mà các chitinase được tổng hợp cảm ứng trong trường hợp bị nhiễm trùng hay tổn thương để chống lại các tác nhân gây bệnh

là nấm Ở các loài cây ăn thịt côn trùng, hệ thống tự vệ (nhờ chitinase) được biến đổi thành chức năng tiêu hoá [24] Vai trò tự vệ của các chitinase cũng

có cả ở động vật: hoạt tính chitinolytic cao có trong huyết thanh của các động vật nhai lại và cá bơn [27] Tuy nhiên để kháng được nấm thực vật phải có cả

1 tổ hợp kháng nấm phòng thủ, trong đó không chỉ có endochitinase, mà còn

có cả lysozyme và β-1, 3-glucanase Chỉ tổ hợp từ 3 enzyme này mới có khả năng làm ngừng quá trình nảy mầm của bào tử nấm và làm giảm sự sinh trưởng của sợi nấm

1.2.2 Các enzyme thuỷ phân chitosan

Như chúng ta đã biết sản phẩm cuối cùng của quá trình phân giải chitin/chitosan trong tự nhiên là GlcN, nó chính là cơ chất, là nguồn cung cấp năng lượng và nguyên liệu ban đầu xây dựng nên các thành phần khác của cơ thể ở nhiều nhóm sinh vật Các enzyme tham gia vào các quá trình phân giải chitin/chitosan thành GlcN được gọi là các enzyme chitinolytic

Có 2 quy trình chuyển hoá chitin thành glucosamine tương ứng với 2 đường phân giải chitin trong tự nhiên

Ở quy trình thứ nhất, chitin chuyển hoá thành glucosamine dưới tác động trực tiếp của hệ enzyme chitinase, N-acetyl-glucosaminidase và deacetylase Dưới tác động của các enzyme này, đầu tiên chitin sẽ được thuỷ phân thành các chitooligosaccharide, sau đó bị cắt tiếp thành N, N1-diacetylchitobiose Tiếp theo N, N1-diacetylchitobiose được chuyển hoá thành GlcNAc dưới tác động của enzyme N-acetyl-glucosaminidase Cuối cùng GlcNAc được chuyển thành GlcN, phản ứng do enzyme deacetylase xúc tác

Trong quy trình thứ 2, đầu tiên chitin được chuyển hoá thành chitosan dưới tác động của enzyme chitin-deacetylase, sau đó được thuỷ phân tiếp thành disaccharide chitobiosse do enzyme chitosanase xúc tác Cuối cùng chitobiose được chuyển hoá thành GlcN dưới tác động của enzyme β-glucosidase (glucosaminidase) Như vậy, về mặt enzyme học quy trình thứ nhất chuyển hoá chitin thành GlcN phức tạp hơn quy trình thứ hai, vì phải sử dụng nhiều enzyme hơn quy trình hai Mặt khác, trong quy trình hai, phản ứng chuyển hoá chitin thành chitosan ta có thể thay bằng phản ứng hoá học thông thường: đun chitin trong dung dịch kiềm đặc ở nhiệt độ cao

Ngoài các enzyme chitosanase là những enzyme thuỷ phân đặc hiệu chitosan, còn có rất nhiều (nhóm) enzyme khác cũng có hoạt tính thuỷ phân

đối với chitosan như là các chitinase [5, 22, 23, 33, 36, 42], cellulase [46], lysozyme [37, 42] và các enzyme: hemicellulase [46], protease, lipase và các

β-1, 3-1, 4-glucanase [30] Các oligosacharide nhận được từ thuỷ phân chitosan bằng các enzyme chitosanase có thể được cắt tiếp thành monosaccharide bởi các enzyme glucosaminidase và các enzyme N-acetylglucosaminidase Chính vì vậy trong đề tài này, ngoài 2 enzyme chitinase và chitosanase ra, chúng tôi sẽ sử dụng một enzyme trong số các enzyme có khả năng thuỷ phân chitosan được liệt kê ở trên là cellulase Cellulase thuỷ phân được các liên kết glucoside β-1 →4 trong chitosan với hiệu suất rất cao Cellulase là một hệ gồm 3 enzyme là endoglucanase - thuỷ phân ngẫu nhiên các liên kết glucoside β-1 →4 bên trong mạch cellulose, exoglucanase còn có tên gọi là cellobiohydrolase - cắt mạch cellulose từ đầu không khử với tạo thành disaccharide cellobiose (enzyme này còn có nhiều tên khác như C1 cellulase, exo- cellobiohydrolase) và enzyme thứ 3 là β-Glucosidase - thuỷ phân cellobiose thành glucose (enzyme này cũng có nhiều tên gọi khác nhau phụ thuộc vào cơ chất mà nó thuỷ phân, ví dụ một trong các tên gọi cũ là cellobiase)

1.3 Vai trò sinh học của Glucosamine

Glucosamine (GlcN) là tiền chất của N-acetylglucosamine (NAG) – đơn vị cấu trúc của chitin, thành phần cấu trúc chính của khung xương ngoài (exoskeleton) ở nhiều nhóm động vật không xương sống và thành tế bào của nấm và tảo NAG/GlcN còn là đơn vị cấu trúc của nhiều polymer sinh học quan trọng khác như các glycoprotein, glycolipid và các loại muco-polysaccharide khác nhau Galactosamine là dẫn xuất của GlcN có trong thành phần của nhiều mucopolysaccharide ở động vật, thực vật và vi khuẩn Những chất chứa cacbonhydrate này được tìm thấy trong gân, dây chằng, sụn, hoạt dịch lỏng, màng nhày, cấu trúc của mắt, van tim, mạch máu Chitin và

chitosan là 2 nguồn tồn trữ chính của GlcN Trong thế giới động vật, ngoài chitin, GlcN có cả trong thành phần của nhiều polysaccharide khác như acid hyaluronic, heparin và keratan-sulfate, còn galactosamine lại có trong thành phần của các glycolipid và polysaccharide chính của sụn là chondroitin-sulfate

Mucopolysaccharide là thành phần của các proteoglycan – các chất chính tạo thành chất nền giữa các tế bào của mô liên kết Các proteoglycan chiếm tới 30% trọng lượng khô của mô liên kết, chúng có tên gọi là muco-polysaccharide (hay còn gọi là glycosaminoglycan) vì chúng được tìm thấy chủ yếu trong các chất nhầy GlcN và galactosamine là một trong hai aminosaccharide - đơn vị cấu trúc của các glycosaminoglycan

GlcN là đường amine được tổng hợp trong tế bào từ glucose thông qua con đường sinh tổng hợp hexosamine bởi phản ứng amide hoá (amidation) glucose 6-phosphate và nó có thể được biến đổi tiếp bằng acetyl hoá thành NAG hoặc isomer hoá thành galactosamine, và sau đó là đi vào các thành phần khác nhau của tế bào

Trong cơ thể động vật, sụn là một loại mô liên kết cấu tạo từ các tế bào sụn (chondrrocyte), các sợi protein Các mạch bên liên kết này chủ yếu là các polysaccharide chondroitin-sulfate và keratan-sulfate GlcN là thành phần chính của keratan-sulfate, và cũng là thành phần của acid hyaluronic - một glycosaminoglycan tìm thấy trong sụn, dịch khớp và trong các mô liên kết khác Các glycosaminoglycan hút nước rất mạnh, tăng khả năng giữ nước của các cluster proteoglycan làm cho sụn có các tính chất chắc và đàn hồi, nó cũng cho phép các chất dinh dưỡng chảy vào sụn và các chất thải chảy ra

Vai trò của GlcN trong cơ thể không chỉ đơn giản là “nguyên liệu ban đầu”, từ đó tạo thành nhiều nhóm chất quan trọng mà trên thực tế GlcN còn là một phân tử tín hiệu có chức năng điều hoà nhiều chiều trong cơ thể người Vào năm 1953, Quastel và Cantero đã chứng minh rằng GlcN có hoạt tính ức chế

ung thư Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng GlcN có hoạt tính ức chế miễn dịch và có thể được sử dụng như là tác nhân ức chế miễn dịch: O'Neill

và Parish đã chứng ming rằng các monosaccharide, đặc biệt là các amineosaccharide, có khả năng ức chế chức năng gây độc tế bào (cytotoxic function) của bạch cầu T trong mô nuôi cấy Trong vòng 5 - 7 năm trở lại đây, GlcN đã gây được sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu có lẽ là do nó được coi

là một tác nhân có lợi trong điều trị chứng viêm khớp Các chế phẩm GlcN và cùng vớichondroitin sulfate đã được bán không cần có đơn thuốc và các nhà sản xuất cho rằng các hiệu ứng có lợi của các chất này liên quan tới sự tái tạo sụn khớp, mà một trong các thành của nó là GlcN ở dạng các glycoprotein của các proteoglycan cấu trúc Những nghiên cứu gần đây trên người đã chứng minh các hiệu ứng có lợi của GlcN trong chứng viêm khớp.Cơ chế thực sự mà nhờ đó GlcN có lợi cho các bệnh nhân vẫn chưa được biết rõ

Hiện nay, chứng viêm khớp là một trong các bệnh vào loại phổ biến nhất trên thế giới, ảnh hưởng lên một bộ phận lớn dân cư ở khắp mọi nơi trên trái đất Theo nhận định của giới chuyên môn của Mĩ, viêm khớp là nguyên nhân bệnh tật chính ở Mĩ, gây thiệt hại cho nền kinh tế hơn 124 tỉ đôla trong 1 năm chi phí cho chữa trị và chăm sóc các bệnh nhân với chứng viêm xương khớp Trong nhiều năm qua các loại thuốc được dùng để điều trị các bệnh viêm xương khớp ở nước ta chủ yếu là các loại thuốc thuộc nhóm steroid như cortisone, hydrocortisone, prednisolone… Việc dùng các loại thuốc thuộc nhóm steroid trong điều trị bệnh viêm xương khớp có ưu điểm là mang lại hiệu quả tức thời, giảm đau nhanh, nhưng vẫn không trị được hết mầm bệnh, và dùng các loại thuốc bản chất steroid còn gây tác động phụ tới gan, thận và dạ dày trong trường hợp dùng thuốc kéo dài Trong cơ thể người, GlcN cần thiết cho tạo thành các proteoglycan - thành phần quan trọng của sụn bình thường (sụn khoẻ), GlcN đóng vai trò quan trọng trong duy trì sức mạnh và tính đàn

hồi của khớp Các nghiên cứu cho thấy sử dụng một mình hoặc cùng với chondroitin sunfate, muối GlcN sẽ làm dịu đau và viêm của những người bị viêm khớp mãn tính và nó cũng có rất nhiều ảnh hưởng có ích trong thoái hoá khớp Như vậy chế độ có bổ sung thêm GlcN và chondroitin sunfate là một thị trường tiềm năng của 40 triệu dân Mỹ, những người bị viêm khớp mãn tính, vận động viên, những người phải thường xuyên sử dụng đến thuốc chữa xương khớp Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng bổ sung các tiền chất của proteoglycan (là GlcN hoặc chondroitin sulfate) làm phục hồi (tái tạo) sụn khớp, do đó dẫn tới giảm đáng kể đau và (khô) cứng khớp, tốt hơn dùng ibuprofen Các kết quả thử nghiệm cho thấy các bệnh nhân sử dụng GlcN ở dạng bổ sung có tác dụng làm dịu đau, giảm viêm ở mức độ như trường hợp dùng các thuốc chống viêm không có bản chất sreroid như aspirin và ibuprofen Việc sử dụng thuốc GlcN (dạng sulfate hoặc chloride) trong điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp được quan tâm ở châu Âu đã từ lâu, nhưng mới được sử dụng ở

Mĩ trong thời gian gần đây trong điều trị Viện Vacxin Nha Trang đã bước đầu sản xuất được thuốc glucovac từ chitin để chữa bệnh viêm khớp Thị trường cho việc bổ sung GlcN và chondroitin sunfate rất lớn Giữa 7/1998 và 9/1999, việc bán lẻ ở Mỹ được ước lượng hơn 500.000.000 USD Một lượng lớn đồ uống bắt đầu được sản xuất có thêm glucosamine là nước giải khát, ví dụ như hãng Pepsi với Sobe Sport System có chứa glucosamine được đẩy mạnh tiêu thụ trong giới vận động viên trẻ Năm 2000, Sobe Sport System trở thành thức uống phổ biến ở Mỹ, nhiều loại nước giải khát với những hương vị khác nhau chứa GlcN cũng đang được sản xuất bởi các hãng như Coca-Cola, Procter và Gamle Theo International Nomenclature of Cosmetic Ingredients thì GlcNAc được sử dụng như mỹ phẩm dưỡng da Nó cũng là thành phần của kem, chất giữ ẩm cải thiện da, tóc, móng tay

1.4 Vai trò sinh học của nanochitosan và các oligochitosaccharide

Như chúng ta đã biết rằng, cả chitosan và chitin đều có khả năng hấp thụ nhiều chất khác nhau, đây là tính chất quan trọng nhất của chúng, làm cho chúng được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau Cả hai polysaccharide này đều không tan trong nước, chitin chỉ tan trong một số dung môi hữu cơ, chitosan có tính tan tốt hơn, tan được trong một số dung dịch acid loãng Nguyên nhân chính tính khó tan của chitin là các mạch polysaccharide dài của nó tạo thành các dạng sợi với cấu trúc tinh thể Cho nên khi sử dụng chitin có cấu trúc mạch dài sẽ không phát huy được hết tác dụng hấp phụ của nó (đối với chitosan cũng vậy), sự chuyển hóa thành nanochitin làm cho nó phân tán được tốt hơn (đồng nghĩa với làm tăng tính tan của chitin) và do đó phát huy được hết khả năng hấp phụ của chitin Đây chính là lí do cần phải chuyển hóa chitin thành nanochitin Tương tự, đối với chitosan cũng vậy Tuy tính tan của chitosan cao hơn nhiều so với chitin, nhưng khi được chuyển hóa thành nanochitosan thì tính tan của nó sẽ tăng lên nhiều, phân tán tốt hơn so với chitosan mạch dài và nanochitosan sẽ có các tính chất hấp phụ tốt hơn Như vậy có thể hiểu một cách đơn giản rằng nanochitin là các đoạn mạch chitin có kích thước phân tử nhỏ vẫn giữ được các tính chất hấp phụ của chitin

Cũng như chitosan, nanochitosan không độc, không gây dị ứng, có tính kháng vi sinh vật, có tính dung nạp sinh học rất tốt và khả năng phân hủy sinh học, được ứng dụng rộng rãi trong y học để làm lành vết thương và giải phóng thuốc có kiểm soát [55] Theo những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nga, chitin nhận được bằng phương pháp điện hóa và chế phẩm nanochitin tương ứng có khả năng hấp phụ nhiều chất như các peptide độc (thường tạo thành khi bị nhiễm khuẩn, nhiễm trùng) và các kim loại nặng, ure

và creatitine (những chất thải tích tụ trong máu khi bị suy thận), cholesterin

và triglyceride, vì vậy chúng là những biosorbent rất tốt, có thể sử dụng trong

thẩm tích ruột (enterodialysis) để thải các chất độc trong ngộ độc thực phẩm,

để trợ giúp các bệnh nhân bị suy thận và làm giảm mỡ máu ở các bệnh nhân

bị bệnh béo phì… [44, 48, 49]

Các oligochitosaccharide tan mạch ngắn (có mức độ polymer hóa CD < 10) và các oligochitosaccharide mạch dài hơn tan được trong acid Các oligochitosaccharide có khả năng làm tăng tính miễn dịch của cơ thể nhất là cây trồng Các oligochitosaccharide đóng vai trò như các elicitor gây ra ở thực vật các đáp ứng miễn dịch đa (multiple), bao gồm tạo thành các chất kháng sinh cảm ứng – các phytoalexin, cảm ứng các PR protein, các inhibitor của các proteinase, các dạng hoạt động của oxy và nitơ, sự làm dày thêm của thành tế bào bằng con đường tổng hợp lignin, callose và các glycoprotein với hàm lượng cao hydroxyprolin

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Các chế phẩm sinh học: chitosan khối lượng phân tử thấp, oligochitosaccharide mạch dài, mạch ngắn và glucosamine được sản xuất từ chitosan; chitosan nhận được từ chitin và nguyên liệu ban đầu cho sản xuất

chitin và chitosan là nguồn phụ phẩm vỏ tôm sú (Penaeus monodon)

2.1.2 Hóa chất

NaOH, HCl, HNO3, H2SO4, H3PO4, ferricianide, ZnSO4… và acid oxalic của Trung Quốc, KMnO4 của Việt Nam, mark công nghiệp, ethanol tuyệt đối của Việt Nam, các mẫu chitosan chuẩn của Hàn Quốc Chitinase và chitosanase do Phòng Sinh hóa thực vật Viện Công nghệ sinh học cung cấp, cellulase và antron của hãng Sigma

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu: pH-meter, máy li tâm lạnh, máy quang phổ UV-Visable Spectrophotometer SIMADZU UV-1601, Termostat, bếp cách cát, tủ hút, tủ cấy vô trùng, máy lắc…

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm

Chitin được tách chiết và làm sạch bằng phương pháp hóa học truyền thống, đây là phương pháp chính được sử dụng rộng rãi trên thế giới cũng như

ở nước ta để nhận chế phẩm chitin từ phế liệu vỏ tôm và các nguồn nguyên liệu chứa chitin khác

Phương pháp này gồm các công đoạn sau:

Bước 1: Xử lí nguyên liệu với acid

Cho một lượng thích hợp dung dịch acid HCl 1 ÷ 1,2N vào nguyên liệu đã được rửa sơ bộ bằng nước máy để loại bớt thịt, ngâm trong 1 giờ, sau đó rửa cặn bằng nước máy đến pH trung tính; lặp lại việc xử lí như vậy 2 lần nữa (đến khi cho acid vào không thấy sủi bọt khí nữa là được) Bước xử lí này loại được hết các chất khoáng và một phần đáng kể protein trong vỏ tôm

Bước 2: Xử lí với kiềm

Ngâm sản phẩm thu được ở bước 2 với dung dịch NaOH 4% ở nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định (thường là 15 ÷ 30 phút, hoặc có thể ngâm qua đêm), sau đó đun sôi 1 giờ rồi rửa sạch bằng nước máy đến pH trung tính Việc xử lí kiềm này được lặp lại thêm 2 lần nữa Trong công đoạn này tất cả các protein cấu trúc (liên kết bền vững) của vỏ tôm đều bị loại, sản phẩm thu được là chế phẩm chitin thô còn chứa các chất màu

Bước 3: Loại bỏ các chất màu (tẩy mầu sản phẩm)

Các chất màu trong chế phẩm chitin thô được tẩy đầu tiên bằng xử lí với dung dịch KMnO4 (thuốc tím)nồng độ 0,1% (ngâm trong 15 phút sau đó rửa sạch bằng nước máy), sau đó là với dung dịch acid oxalic (C2H2O4) nồng

độ 1% [9]: ngâm từ 1 đến 2 giờ cho đến khi sản phẩm có màu trắng thì lấy ra rửa sạch bằng nước máy, phơi khô (hoặc sấy ở nhiệt độ dưới 50oC) sẽ thu được chế phẩm chitin sạch

Chúng tôi đã tiến hành tách chiết và tinh chế chitin từ bột vỏ tôm theo quy trình trên ở quy mô thí nghiệm với khối lượng mẫu vỏ tôm là 1kg Toàn

bộ quá trình tách chiết được tiến hành trong 1 ngày Chế phẩm chitin thu được được sấy hoặc phơi khô đến trọng lượng không đổi để tính hiệu suất thu hồi chitin

2.2.2 Phương pháp đo độ nhớt xác định khối lượng phân tử trung bình của chitin

a) Cơ sở lí thuyết: Có nhiều phương pháp đo phân tử lượng (Mr) của polymer, trong đó phương pháp đo độ nhớt là một phương pháp khá đơn giản

về mặt thực nghiệm Theo phương pháp này phân tử lượng của polymer được tính theo công thức Mak - Euvin:

[η] = KMr α

Trong đó [η] là độ nhớt đặc trưng, K và α là các hằng số phụ thuộc vào bản chất của dung môi và nhiệt độ, α có giá trị trong khoảng 0,5 ÷ 0,8 Độ nhớt đặc trưng - theo định nghĩa - là giới hạn của độ nhớt rút gọn khi nồng độ của dung dịch tiến tới 0:

Hình 2.1 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của độ nhớt rút gọn vào nồng độ (trái) của

polymer trong dung dịch được đo trên nhớt kế Otvan (phải)

Như vậy, về thực chất việc xác định độ nhớt đặc trưng được quy về xác định thời gian chảy của dung dịch polymer và dung môi qua mao quản của nhớt kế

Trên thực nghiệm độ nhớt đặc trưng được xác định như sau: Pha một loạt dung dịch chất polymer có nồng độ phần trăm từ rất bé rồi tăng dần lên (nồng độ cao nhất không quá 1 g/ 100 ml), sau khi đo độ nhớt của mỗi dung dịch và dung môi, tính độ nhớt rút gọn cho mỗi dung dịch rồi xây dựng đồ thị chuẩn biểu diễn mối phụ thuộc của tỉ số ηriêng/C đối với một loạt dung dịch polymer có nồng độ tăng dần vào nồng độ C của dung dịch (tính bằng g/100ml), rồi ngoại suy giá trị của tỉ số này khi nồng độ polymer tiến tới không: C→0 (hình 2.1, bên trái)

b) Cách tiến hành:

Độ nhớt của các dung dịch chitosan được đo bằng nhớt kế Otvan (hình 2.1, bên phải) ở nhiệt độ phòng có điều hoà nhiệt độ là 250C Quá trình đo độ nhớt được tiến hành theo các bước sau:

- Pha một loạt dung dịch chitosan trong acid acetic 1% (hoặc 0,5% hay 0,2%) với các nồng độ 0,01; 0,03; 0,05, 0,07 và 0,1%, đi từ dung dịch 1% đã được chuẩn bị từ trước

- Tráng nhớt kế vài lần bằng dung dịch acid acetic 1%

- Dùng pipet hút 5 ml dung dịch acid acetic cho vào nhánh phải của nhớt kế, rồi dùng quả bóp cao su hút lên ngập quá mức A một chút rồi tháo quả bóp cao su cho dung dịch acid acetic chảy tự nhiên và dùng đồng hồ bấm giây đo thời gian dung dịch chảy từ ngấn A đến ngấn B Đo 4 ÷ 5 lần, lấy giá trị trung bình Giá trị đo được là thời gian t0

- Tiến hành đo các dung dịch còn lại như đã làm ở trên Cứ mỗi lần đo dung dịch mới, phải tráng nhớt kế bằng chính dung dịch ấy ít nhất 2 lần

Khi làm xong thí nghiệm, các kết quả thí nghiệm được ghi vào bảng mẫu dưới đây:

đối với 3 trường hợp này là 0,62; 0,67 và 0,67) Trong trường hợp tính khối lượng phân tử của chitosan theo độ nhớt của các dung dịch chitosan, chúng tôi

sử dụng các giá trị K = 5.10-3 và α = 0,62

2.2.3 Phương pháp chuyển chitin thành chitosan

Chitin được chuyển thành chitosan bằng phương pháp hóa học: ngâm chitin trong dung dịch kiềm (NaOH) 40 ÷ 60%, sau đó đun sôi trong thời gian

40 ÷ 60 phút, rồi rửa bằng nước máy đến pH trung tính, thu được chế phẩm chitosan có độ deacetyl hóa cao

2.2.4 Các phương pháp xác định đường khử với antron

Nguyên lí của phương pháp:

Hóa chất: 1) Dung dịch antron 0,2%, chuẩn bị trên dung dịch H2SO495%, dung dịch được chuẩn bị vào ngày đo 2) Dung dịch chuẩn glucose (chứa 40 µg glucose/ml)

Cách tiến hành: Đặt các ống nghiệm vào bồn đá, sau đó lần lượt cho các thành phần phản ứng vào theo trình tự sau: 2,5 ml dung dịch mẫu nghiên cứu chứa lượng đường khử tương đương với từ 10 đến 100 µg glucose, 5 ml dung dịch antron (dung dịch sử dụng 1 lần, chuẩn bị trước khi dùng) Chú ý: khi cho dung dịch antron vào phải lắc mạnh Đun sôi cách thuỷ 10 phút rồi làm lạnh trong bồn đá, sau đó so màu ở bước sóng 620 nm (dung dịch của hỗn hợp phản ứng có màu xanh)

Đồ thị chuẩn xác định đường khử

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

[Glc], mcg/mẫu

OD 620

Hỡnh 2.3 Đồ thị chuẩn để xỏc định đường khử bằng phương phỏp với antron

2.2.5 Cỏc phương phỏp nghiờn cứu động học quỏ trỡnh thủy phõn chitosan

Động học của phản ứng thủy phõn chitosan được nghiờn cứu bằng hai phương phỏp: phương phỏp đo độ nhớt và phương phỏp xỏc định đường khử Bằng cả hai phương phỏp này đều nghiờn cứu cỏc mối phụ thuộc sau:

2.2.5.1 Nghiờn cứu động học bóo hũa enzyme bởi cơ chất (động học P – [S])

Cỏc đường cong P – [S] được khảo sỏt khi phản ứng thủy phõn được xỳc tỏc bởi cỏc lượng enzyme khỏc nhau và lượng đường khử được đo tại cỏc thời điểm khỏc nhau của quỏ trỡnh thủy phõn

2.2.5.2 Nghiờn cứu động học tớch lũy sản phẩm theo thời gian (động học P- t)

Khi xõy dựng cỏc đường cong P – t phản ứng thủy phõn được tiến hành

ở cỏc nồng độ cơ chất khỏc nhau và do cỏc lượng enzyme khỏc nhau xỳc tỏc

2.2.5.3 Nghiờn cứu mối phụ thuộc của phản ứng thủy phõn chitosan vào nồng độ của enzyme (động học P – [E])

Khi khảo sỏt mối phụ thuộc giữa tạo thành sản phẩm (đường khử) và nồng độ enzyme trong hỗn hợp phản ứng, lượng đường khử cũng được đo tại

các thời điểm khác nhau và phản ứng thủy phân cũng được tiến hành ở các nồng độ cơ chất khác nhau

2.2.5.4 Phương pháp tuyến tính hóa các đồ thị P – [S] (hay v – [S])

Đã sử dụng phương pháp hai giá trị nghịch đảo (Linewer-Burk) {1/v; 1/[S]} để xác định các thông số Km và Vm

2.2.6 Phương pháp tủa với ethanol thu các sản phẩm khác nhau từ dịch thủy phân chitosan

Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, dịch phản ứng là một hỗn hợp chứa nhiều sản phẩm khác nhau với kích thước phân tử giảm dần trong dãy sau: (i) chitosan khối lượng phân tử thấp, (ii) nanochitosan, (iii) oligochitosaccharide mạch dài, (iv) các oligochitosaccharide mạch ngắn và (v) monosaccharide (glucosamine) Phương pháp tủa phân đoạn với ethanol

đã được sử dụng để phân tách các nhóm sản phẩm này ra khỏi hỗn hợp phản ứng Trong phạm vi luận văn này các sản phẩm (i) và (ii) được thu gộp với nhau thành nhóm sản phẩm chính thứ nhất gọi chung là chitosan kích thước phân tử nhỏ (CTSL); các sản phẩm (iii) và (iv) được thu gộp lại thành nhóm sản phẩm chính thứ hai, gọi là oligochitosaccharide (OLCS), còn nhóm sản phẩm chính thứ ba – monosaccharide được kí hiệu là MNCS

Cách tiến hành:

Bước 1 Thu nhận sản phẩm CTSL từ dịch thủy phân chitosan: cho từ

từ 30% thể tích ethanol 96% vào hỗn hợp phản ứng, khuấy đều để 30 phút sau

đó li tâm hay lọc thu cặn tủa thứ nhất

Bước 2 Thu nhận sản phẩm OLCS: cho tiếp 30% thể tích ethanol 96% vào dịch lọc hay li tâm thu ở bước 1, khuấy đều 30 phút, sau đó li tâm hay lọc, thu lấy cặn thứ hai

Bước 3 Thu so đường khử MNCS: cho tiếp 30% thể tích ethanol 96% vào dịch lọc hay li tâm thu ở bước 1, khuấy đều 30 phút, sau đó li tâm hay lọc, thu lấy cặn thứ ba

2.2.7 Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử trên thiết bị FPLC

Nguyên lí phương pháp: Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử (hay còn gọi là sắc kí lọc gel) dựa trên sự khác biệt trong hình dạng và kích thước của các phân tử khác nhau trong một hỗn hợp Khi cho một hỗn hợp các phân tử

có kích thước khác nhau đi qua cột lọc gel, thì những phân tử có kích thước lớn hơn lỗ của các hạt gel sẽ không đi vào bên trong các hạt gel, và ra khỏi cột trong cái gọi là thể tích tự do của cột; còn những phân tử có kích thước phân

tử nhỏ hơn kích thước lỗ của các hạt gel, chúng sẽ đi vào bên trong các hạt gel, tức là chúng được phân bố giữa 2 pha – bên trong và bên ngoài các hạt gel với các hệ số phân bố tương ứng Các phân tử này sẽ đi ra khỏi cột lọc gel theo thứ tự ngược với kích thước phân tử của chúng, tức là các phân tử nào có kích thước lớn thì ra khỏi cột trước và những phân tử nào có kích thước nhỏ hơn sẽ ra sau, các chất muối (thường có mặt trong nhiều chế phẩm) ra khỏi cột sau cùng (chính vì vậy mà cột lọc gel thường được sử dụng để loại muối khỏi các dung dịch protein và các đại phân tử khác) [41, 42]

Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử cũng được tiến hành tự động trên thiết bị sắc kí FPLC

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả tách chiết chitin từ vỏ tôm và chuyển hóa chitin thành

chitosan

3.1.1 Kết quả tách chiết chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học

Nếu xét bản chất của các quy trình tách chiết và làm sạch chitin thì chúng ta thấy cả 2 nhóm phương pháp hóa học và sinh học tách chiết chitin (từ vỏ tôm nói riêng và từ các nguồn nguyên liệu khác nói chung) đều bao gồm các bước (giai đoạn) xử lí nguyên liệu để đạt được các mục đích cụ thể là loại bỏ 3 nhóm chất sau: 1- Các chất khoáng; 2- Protein; 3- Pigment và các chất màu khác, tuy trình tự các giai đoạn có thể phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể Điểm khác nhau căn bản của 2 nhóm phương pháp này là ở cách loại protein: Trong các phương pháp sinh học protein bị loại trong những điều kiện rất “mềm” nhờ sử dụng các enzyme proteolytic (protease hay proteinase), chỉ các protein cấu trúc liên kết rất bền vững mới bị loại bỏ bằng đun với kiềm ở nhiệt độ cao, còn trong các phương pháp hóa học protein bị loại bằng kiềm

Trong phạm vi luận văn này, tôi chọn phương pháp hóa học để tách chiết chitin từ vỏ tôm, bởi vì phương pháp này đơn giản, mất ít thời gian, và đây cũng là phương pháp thông dụng nhất tách chiết chitin hiện nay, toàn bộ lượng chitin thương phẩm trên thế giới hiện nay đều được sản xuất bằng phương pháp hóa học

Chitin được tách chiết từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học theo quy trình gồm 3 công đoạn như đã mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu

Chitin Chitosan Hình 3.1 Ảnh chế phẩm chitin từ vỏ tôm và chế phẩm chitosan tương ứng của nó Quy trình tách chiết chitin theo phương pháp hóa học đã được thực hiện ở quy mô thí nghiệm 1 kg nguyên liệu (đầu vỏ tôm khô), đã thu được chế phẩm chitin có độ sạch cao, màu trắng đẹp (hình 3.1), với hiệu suất thu hồi chitin đạt khoảng 7,5%

3.1.2 Chuyển hóa chitin thành chitosan

Quá trình chuyển hóa chitin thành chitosan đã được thực hiện bằng phương pháp hóa học thông thường, đây là phương pháp duy nhất hiện nay để sản xuất chitosan từ chitin Như chúng ta biết rằng, dưới tác động của dung dịch kiểm (NaOH) đặc (nồng độ từ 40 đến 60%) ở nhiệt độ cao [58, 59, 60, 61], chitin dễ dàng bị deacetyl hóa thành chitosan Quá trình này cũng có thể thực hiện ở cả nhiệt độ thường [16]

Trong nghiên cứu này các mẫu chitin được chuyển hóa thành chitosan bằng phương pháp thông dụng đã được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng là: Đầu tiên các mẫu chitosan được ngâm 1 h trong dung dịch NaOH 50-60%, rồi

đun sôi 1 h trong dung dịch kiềm này, sau đó rửa sạch kiềm bằng nước máy đến giá trị pH trung tính sẽ thu được các mẫu chitosan tương ứng

Các mẫu chitosan nhận được theo phương pháp hóa học xử lí với kiềm đặc ở nhiệt độ cao như trên tan được trong acid acetic loãng 0,2-1% sẽ có độ deacetyl hóa (DD) cao Theo một số tác giả khi xử lí chitin từ mai mực với NaOH 40% hoặc 50% ở nhiệt độ thường trong 48 h, thì nhận được các chế phẩm chitosan có độ deacetyl hóa tương ứng là 92 và 96%; còn khi xử lí chế phẩm chitin với NaOH 30% ở nhiệt độ thường trong 96 h, lại nhận được chế phẩm chitosan với độ deacetyl hóa tới 98% [16] Do vậy chúng tôi có cơ sở để cho rằng chế phẩm chitosan nhận được khi xử lí với NaOH 50-60% ở nhiệt độ cao sẽ có DD > 90%

3.1.3 Đánh giá chất lượng các mẫu chitin và chitosan thu được

Sau khi tách chiết được chitin từ vỏ tôm, chúng tôi đã tiến hành đánh giá chất lượng của chế phẩm chitin thu được theo các chỉ tiêu về cảm quan (như màu sắc của chế phẩm) và một số chỉ tiêu quan trọng như độ nhớt, khối lượng phân tử và khả năng tạo gel, độ tan trong acid acetic…

Đo độ nhớt của các dung dịch polymer thẳng nói chung là một trong các phương pháp quan trọng trong nghiên cứu các polymer, bởi vì thông qua giá trị

độ nhới của các dung dịch polymer, có thể đánh giá được khối lượng phân tử trung bình của các mẫu (chế phẩm) polymer đó Khối lượng phân tử trung bình (Mr) của các chế phẩm chitin nhận được ở các quy mô khác nhau và các mẫu chitosan tương ứng đã được xác định bằng phương pháp đo độ nhớt, thông qua khối lượng phân tử trung bình của mẫu chitosan có thể đánh giá được khối lượng phân tử trung bình của mẫu chitin tương ứng Để đạt được mục đích này đầu tiên các chế phẩm chitin đã được chuyển thành các chế phẩm chitosan tương ứng (xem phần 3.1.2), sau đó đo độ nhớt của các chế phẩm chitosan

nhận được, rồi từ đó tính được Mr của chitosan (cũng chính là giá trị Mr của chitin) theo công thức Mac-Euvin (xem phần phương pháp nghiên cứu)

Bảng 3.1 Kết quả đo thời gian chảy của các dung dịch chitosan có nồng độ

khác nhau trên nhớt kế Otvan (tính trung bình theo 3 lần đo)

Nồng độ dung dịch chitosan Mẫu

HH 18,87 ± 0,55 33,12 ± 0,18 52,42 ± 0,35 100,37 ± 0,18 HQ1 25,50 ± 0,50 48,33 ± 1,04 84,90 ± 0,10 238,20 ± 0,40 HQ2 27,00 ± 0,00 50,50 ± 0,50 82,50 ± 1,32 205,13 ± 0,42

(Các mẫu chitosan thu được từ các mấu chitin tách chiết bằng phương pháp hóa học ở các quy mô khác nhau và từ các mẫu nguyên liệu khác nhau

có thời gian chảy trong nhớt kế gần trùng nhau, tức là đều có kích thước phân

tử như nhau)

Từ các kết quả đo thời gian chảy của các dung dịch chitosan khác nhau

đã tính được giá trị của độ nhớt riêng, độ nhớt tương đối và độ nhớt rút gọn của từng mẫu chitosan Các kết quả tính toán này được trình bày trong bảng 3.2 và từ các số liệu này đã xây dựng được đồ thị trên hình 3.2