Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của bộ kít, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” là đề

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận văn

Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào và thể bệnh bạch cầu cấp dựa trên một trong hai tiêu chuẩn là FAB và WHO Tiêu chuẩn FAB do các nhà Huyết học Pháp-Anh-Mỹ đưa ra năm 1976 là tổng hợp kết quả hình thái học và hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn này đã bổ sung thêm kết quả miễn dịch và

di truyền [15, 17]

Nhuộm hóa học tế bào gồm 8 kỹ thuật: Periodic-Acid Schiff (PAS), sudan black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF và không ức chế, photphataza kiềm và axit Ưu điểm của phương pháp nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành chỉ bằng 1/4 so với phương pháp miễn dịch và bằng 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc hiện đại, dễ triển khai Hiện nay, các bộ kít nhuộm có bán trên thị trường là các kít đơn, giá thành cao và có những nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình nhuộm khác nhau về thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau, bước tẩy màu của kỹ thuật nhuộm Sudan và Periodic - Acid Schiff khó đồng nhất, nhuộm nền thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan trong dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu bản nhiều lần Tại Việt Nam, các thuốc thử hầu hết là tự pha kết hợp với các yếu điểm trên nên độ nhạy, độ đặc hiệu còn thấp Theo Trần Ngọc Vũ và cộng sự (2014) tỷ

lệ phù hợp chẩn đoán giữa hình thái học-hóa học tế bào và miễn dịch là 89,1%, giá trị dự báo đối với bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là 88,88% và

độ đặc hiệu là 73,77% [25] Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn thì việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền [19] Hiện nay, tác giả Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học- Truyền máu,

Bộ Công an đã nghiên cứu và chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC gồm 10 kỹ thuật: Giemsa, Periodic-Axit Schiff (PAS),

Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axit, Perls

Bộ kít đã cơ bản khắc phục được các yếu điểm ở trên Nhằm đánh giá giá trị

sử dụng của bộ kít, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng

bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế - xã hội cấp thiết

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986)

3 Nội dung nghiên cứu:

- Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân được chọc tủy lần đầu tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương

- Đánh giá tính phù hợp của phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch và di truyền trên các bệnh nhân đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB

- Đánh giá giá trị của kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC, khi nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls trên bệnh nhân bạch cầu cấp

4 Bố cục của đề tài

Đề tài gồm 71 trang, trong đó có 65 hình vẽ, đồ thị, 26 bảng biểu, chưa kể

41 trang phụ lục và 57 tài liệu tham khảo Ngoài phần mở đầu và kết luận, đề tài được chia làm ba chương: chương 1 – Tổng quan tài liệu, gồm 25 trang; chương 2 –Phương pháp nghiên cứu, gồm 9 trang; chương 3 – Kết quả và bàn luận, gồm 33 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang

Liên quan đến nội dung đề tài đã đăng 1 bài trên Tạp chí Y học thành phố

Hồ Chí Minh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào

Trong ngành Huyết học thường sử dụng phổ biến 8 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào như sau: Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axít Các kỹ thuật này dựa trên ba nguyên lý chính là phản ứng hóa học (PAS), khuếch tán vật lý (Sudan B) và enzym (6 kỹ thuật còn lại) Hai kỹ thuật nhuộm PAS và Sudan B ít có cải tiến, riêng các kỹ thuật nhuộm enzym đã phát triển mạnh kể từ khi tìm ra phản ứng tạo chất màu với sự xúc tác của enzym theo nguyên lý hình thành phẩm màu azo vào những năm 50 của thế kỷ XX

1.2 Nghiên cứu trong nước về nhuộm hóa học tế bào

Từ đầu những năm 1970, bộ môn Huyết học-Truyền máu đã triển khai các

kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào tại khoa Huyết học-Truyền máu Bệnh viện Bạch Mai Một số tác giả như: Lê Đức Ngọc, Nguyễn Đình Triệu, Lưu Văn Bôi đã tiến hành một số nghiên cứu về cơ chế phản ứng, tổng hợp cơ chất, đánh giá mối tương quan giữa hoạt tính-cấu trúc và cải tiến các phương pháp đánh giá các phương pháp nhuộm hóa học tế bào Các kết quả đã giúp nâng cao chất lượng của các kỹ thuật nhuộm ứng dụng trong chẩn đoán dòng tế bào phục vụ cho công tác điều trị bệnh bạch cầu

1.3 Kít nhuộm hóa học tế bào

Các bộ kít thường tiến hành qua các bước chính như sau:

Tế bào bạch cầu chưa cố định

Tế bào bạch cầu

đã cố định

Nhuộm lên màu các chất

Nhuộm nền hồng cầu

Làm tiêu bản

Cố định

Nhuộm nền Phản ứng

hóa học

Như vậy, nhuộm hóa học tế bào là dùng các phản ứng hóa màu hoặc phản ứng dưới xúc tác của enzym để phát hiện các chất hóa học có trong tế bào Sự xuất hiện màu chứng tỏ có chất cần phát hiện và cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ của chúng có trong tế bào Các kỹ thuật này cần đạt được độ nhạy và

độ đặc hiệu cần thiết để đảm bảo tính chính xác của kết quả xét nghiệm

1.4 Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học

8 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào là cơ sở để chẩn đoán phân biệt bệnh bạch cầu kinh với nhiễm trùng bạch cầu đơn nhân và dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

1.5 Các công cụ toán học sử dụng trong nghiên cứu y học

Kế hoạch hóa thực nghiệm nhằm tìm điều kiện tối ưu để đạt được kết quả nhuộm tốt nhất phải dựa trên các công cụ toán học Các phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm đơn hình và khảo sát mặt mục tiêu thường hay được sử dụng trong nghiên cứu Hiện nay các phần mềm thống kê như: SPSS, Modde, Excel đã hỗ trợ tốt cho việc xử lý dữ liệu và kế hoạch hóa thực nghiệm

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 202 bệnh nhân có chỉ định chọc tủy tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương

2.2 Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong nghiên cứu

- Nghiên cứu mô tả cắt ngang

- Phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang

Nhuộm 10 kỹ thuật theo hướng dẫn của bộ kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC sản phẩm của đề tài cấp bộ mang mã số: BH 2011 -BV198 - 11

 Kỹ thuật nhuộm hình thái tế bào bằng thuốc nhuộm giemsa;

 Kỹ thuật nhuộm glycogen bạch cầu bằng thuốc thử Schiff;

 Kỹ thuật nhuộm lipit bạch cầu bằng thuốc thử Sudan B;

 Kỹ thuật nhuộm peroxidaza bạch cầu bằng cơ chất là benzidin;

 Kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu bằng cơ chất là naphtol

AS-D 2-cloaxetat;

 Kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu bằng cơ chất là naphtol AS axetat;

 Kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu bằng cơ chất là naphtol AS axetat với chất ức chế NaF;

 Kỹ thuật nhuộm photphataza axit bạch cầu bằng cơ chất là naphtol

AS-BI photphat ở pH axit;

 Kỹ thuật nhuộm photphataza kiềm bạch cầu bằng cơ chất là naphtol AS-BI photphat ở pH kiềm;

 Kỹ thuật nhuộm nguyên hồng cầu hoặc các tế bào lưới nội mô ứ sắt bằng Kali Feroxyanua

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân được nghiên cứu

Bệnh bạch cầu cấp là bệnh lý ác tính của hệ tạo máu được đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương Trong tổng số 202 mẫu chọc tủy lần đầu tại viện Huyết học - Truyền máu Trung ương có 142 trường hợp được chẩn đoán ban đầu mắc bạch cầu cấp trong đó có 60 trường hợp kết luận đúng thể bệnh, như vậy chỉ dựa vào lâm sàng mức độ chẩn đoán đúng thể bệnh đạt tỷ lệ rất thấp (42,3%) Do đó cần kết hợp nhiều phương pháp chẩn đoán khác nhau Tiêu chuẩn FAB (1986) sử dụng kết quả hình thái học-nhuộm hoá học tế bào, marker và di truyền làm cơ sở để phân loại thể bệnh và dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp nhằm chẩn đoán và lựa chọn phác đồ điều trị cho bệnh nhân đạt hiệu quả cao nhất [33, 36, 37, 39, 40]

Bảng 3.1 Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp

Trong tổng số 202 trường hợp chọc tủy lần đầu tại viện Huyết học Truyền máu Trung ương trong đó có 60 trường hợp có kết luận đúng thể bệnh chiếm 29,7% Tỷ lệ này tương đương với công bố của Trần Thị Minh Hương và cộng sự (32.1%) tại Bệnh viện Bạch Mai [1]

Bảng 3.2 Phân loại bạch cầu cấp theo giới tính

Về giới: Tỷ lệ mắc bệnh của nữ giới là 53,3%, cao hơn nam giới và cao hơn

so với công bố của Siegel M P H R., và cộng sự ghi nhận tại Mỹ năm 2014

là 0,756 (23.370 nữ/30.900 nam) [52] Sự khác nhau có thể là do ảnh hưởng của môi trường sống cũng như thói quen sinh hoạt của người Mỹ và Việt Nam cũng như số lượng mẫu thu thập có thể còn thấp chưa mang tính đại diện

Hình 3.1 Biểu đồ phân loại bạch cầu cấp theo độ tuổi và giới tính

Về độ tuổi: Qua hình 3.1 cho thấy bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, tuy vậy đối với nam tần suất mắc bệnh tỷ lệ nghịch với độ tuổi, dưới tuổi lao động chiếm tỷ

lệ cao nhất (21,5%) Ngược lại, ở nữ giới thì độ tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là ở ngoài độ tuổi lao động (20,0%)

3.2 Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho

3.2.1 Đặc điểm chung về nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho

Bảng 3.3 Bảng phân loại bạch cầu cấp dòng lympho theo giới tính

Về giới tính: bệnh gặp ở cả 2 giới Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho ở nam cao hơn nữ, nam chiếm 56,0%, nữ chiếm 44,0 % (nam/nữ =1,3)

Hình 3.3 Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo độ tuổi

Về độ tuổi: Mẫu nghiên cứu có tuổi thấp nhất là 1 tháng tuổi và cao nhất là

93 tuổi, bệnh gặp ở mọi lứa tuổi Theo tiêu chuẩn quy định độ tuổi lao động của người Việt Nam: độ tuổi lao động của nam giới từ 18-60 tuổi, độ tuổi lao động của nữ giới từ 18 - 55 tuổi Qua hình 3.3 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho < 18 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (60%) Kết quả này phù hợp với các công bố của các tác giả trong và ngoài nước Theo Trần Thị Hồng Hà (2004), độ tuổi mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho hay gặp nhất

từ 4-5 tuổi [5] Nguyễn Công Khanh (1987) thấy rằng gần 50% trẻ mắc bệnh dưới 5 tuổi và tỷ lệ này cũng giảm dần ở trẻ lớn [8] Theo Bùi Ngọc Lan (2007), độ tuổi mắc bệnh trung bình là 6,0 ± 3,8 [9] Đối với người trên 16 tuổi, nhiều nghiên cứu cho thấy ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc bệnh trẻ tuổi chiếm tỷ lệ khá cao Nghiên cứu của Phạm Quang Vinh (2003), có trên 256 bệnh nhân có 40,0% số bệnh nhân dưới 30 tuổi [24]

3.2.2 Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho sử dụng bộ kit nhuộm HICYTEC

a) Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo tiêu chuẩn FAB

Bảng 3.4 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Thể bệnh

Kết quả bộ kít HICYTEC

Kết quả bảng 3.4 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp thể L2 gặp nhiều nhất (chiếm 92%), tiếp đến là thể L1 (chiếm 8%) và không gặp trường hợp nào thể L3 Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh An (1995) [1], Lâm Thị Mỹ và cộng sự (2004) đều thấy thể L2 chiếm

tỷ lệ cao trong bạch cầu cấp dòng lympho [10] Tuy vậy, khác với nghiên cứu của tác giả C H Pui (2001) tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho hầu hết có phân loại theo FAB thuộc thể L1 chiếm tới 70% [48]

b) Đánh giá mức độ phù hợp phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho bằng bộ kít nhuộm đồng bộ HICYTEC so với kết quả chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương

Bảng 3.5 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng bộ kít HICYTEC và kết chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu

trung ương trên từng bệnh nhân

sinh Ngày XN

Kết luận của viện HH-TM TW

Kết luận thể bệnh

sử dụng kit HICYTEC

1 15010165 Nguyễn Thị L 1949 30/04/2015 L2 L2

2 15013692 Dương Ngọc L 2013 28/05/2015 L2 L2

3 15013057 Nguyễn Sơn H 2013 22/05/2015 L2 L2

4 15012072 Nguyễn Mạnh D 2007 14/05/2015 L2 L2

5 14034835 Lưu Kế X 1954 01/10/2014 L2 L2

6 15011022 Nguyễn Thị Đ 1936 11/05/2015 L2 L2

7 15011378 Vũ Trung T 2010 11/05/2015 L2 L2

8 15010693 Vũ Thị Đ 1947 13/05/2015 L2 L2

9 15011337 Phùng Thị A 2012 08/05/2015 L2 L2

10 15011154 Ngô Văn Tr 2008 07/05/2015 L2 L2

11 15009721 Tô Phương L 2008 30/04/2015 L2 L2

12 14035107 Trương Thị T 1994 27/04/2015 L2 L2

13 15010527 Trần Đức A 2013 28/04/2015 L2 L2

14 14019748 Đỗ Minh T 2013 27/04/2015 L2 L2

15 15008709 Lê Ngọc Bảo P 2015 27/04/2015 L2 L2

16 15010257 Nguyễn Hữu T 2000 24/04/2015 L2 L2

17 856 Nguyễn Văn T 1992 31/03/2015 L2 L2

18 14037484 Nguyễn Hiền A 2012 10/10/2014 L2 L2

19 14037438 Giàng Thị N 2012 10/10/2014 L2 L2

TT Mã BN Họ và tên Năm

sinh Ngày XN

Kết luận của viện HH-TM TW

Kết luận thể bệnh

sử dụng kit HICYTEC

20 14038058 Lê Phạm V 1963 17/10/2014 L2 L2

21 14038278 Trần Hoàng Th 1997 21/10/2014 L2 L2

22 14035789 Doãn Hữu T 1922 26/09/2014 L1 L1

23 14087493 Nguyễn Ngọc A 2013 10/10/2014 L2 L2

24 14035765 Nguyễn Trọng T 1998 22/09/2014 L1 L1

25 14035113 Hoàng Mai P 2009 15/09/2014 L2 L2

Tổng hợp lại kết quả ở trên được bảng phân loại thể bệnh trên bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Thể

bệnh

Chẩn đoán xác định Viện HH-TMTW

Kết quả bộ kít

Số lượng Tỷ lệ (%)

Số lượng

Tỷ lệ (%)

Số lượng

Tỷ lệ (%)

Tổng

Như vậy, mức độ phù hợp phân loại thể bệnh theo phương pháp hình thái học-hóa học tế bào bằng kít nhuộm đồng bộ HICYTEC so với kết quả chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương dựa trên 3 phương pháp: miễn dịch, di truyền và hình thái học-hóa học tế bào đạt 100% theo tiêu chuẩn FAB ( bảng 3.6) Kết quả này cao hơn so với nghiên cứu của

Trần Ngọc Vũ và cộng sự (2014) khi sử dụng 5 phương pháp nhuộm: Giem

sa, peroxidaza, sudan B, PAS và esteraza không đặc hiệu tự pha thì độ nhạy

là 100%, độ đặc hiệu là 73,77%, giá trị dự báo phân loại dòng lympho là 88,88% Sự phù hợp chẩn đoán giữa hình thái-hóa học tế bào và miễn dịch tế bào là 89,10% [25]

3.2.3 Kết quả nhuộm photphataza axit bạch cầu xác định loại lympho T trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho

Bảng 3.7 Kết quả nhuộm photphataza axit phân loại dòng lympho T

Bảng 3.7 cho thấy, tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp lympho dòng B (80%) cao hơn so với dòng T (20%) Kết quả này tương tự so với tác giả C H Pui [48], nhưng cao hơn so với nghiên cứu của Bùi Ngọc Lan (2007) tỷ lệ dòng lympho B chiếm 70,1%, dòng lympho T chiếm 25,8% [9] Tủy đồ có hạn chế

là không thể phân biệt được dòng B và T như kỹ thuật miễn dịch tế bào Trong khi đó dựa vào hóa học tế bào nhuộm photphataza axit bạch cầu có thể phân loại được dòng tế bào lympho B và T Điều này có ý nghĩa rất lớn và cần thiết cho các bác sĩ trong việc chẩn đoán, tiên lượng bệnh và lựa chọn phác đồ điều trị

3.3 Nhóm bạch cầu cấp dòng tủy

3.3.1 Phân nhóm bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính và tuổi

Trong số 202 bệnh nhân tự đến có các triệu chứng lâm sàng định hướng chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp hoặc được chẩn đoán bạch cầu cấp bởi các bệnh viện khác gửi đến viện Huyết học-Truyền máu trung ương, đã phát hiện 14,85% bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Bảng phân bố bệnh bạch cầu cấp theo giới tính được thể hiện trên bảng 3.8